CN112745379A - 具有氨基酸结构rdnkktriipr的生物活性肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白领域，具体涉及具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽及其制备方法和应用，生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，生物活性肽RDNKKTRIIPRHL的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRH LQ的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。经过体外免疫功能调节实验，发现具体涉及具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽具有很好的免疫调节功能。本发明具体涉及具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽可促进巨噬细胞活化并释放细胞因子，提高其在正常巨噬细胞静息状态下的作用，同时促进淋巴细胞增殖，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，提高生命的质量，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。

Description

具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及蛋白领域，尤其是涉及具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽及其制备方法和应用。
背景技术
生物活性肽因其具有很多潜在的生物功能，所以引起人们越来越多的关注，成为科学研究的热点之一。目前很多生物活性肽的有益效果也已经得到了很好的证明，如抗癌、降血压、抗菌、降胆固醇、抗糖尿病等等特性。当前最权威的生物活性肽数据库BIOPEP-UMW中已报告了3000多个不同的生物活性肽，但是由于生活肽的数量实在是太多，所以，还有非常多的多肽有待研究其相关性能。
目前对于生物活性肽的研究多集中于食物衍生多肽，对非食物衍生多肽研究和报道较少。且已经有研究结果证实，与食物衍生的生物活性肽相比，非食物衍生的生物活性肽具有更高的亲和力并能有效发挥其生物活性功能。
当多肽未从蛋白质中酶解分离时，这些蛋白质本身往往是不具备免疫调节活性的。如何从已知氨基酸序列的种类繁多的蛋白质中寻找具有特定功能的生物活性肽，并研究这些多肽的功能是蛋白领域研究的方向之一。
Histone H2A type 3蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；Histone H2A type 1-E蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：5。目前，现有技术中并没有关于Histone H2A type 3蛋白和Histone H2A type 1-E蛋白多肽片段相关功能的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽及其制备方法和应用，具体而言，涉及三种结构高度相似的生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL和生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面，提供具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽，选自以下生物活性肽中的一种或几种的组合：生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ；
生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR的氨基酸序列为Ala-Gly-Asn-Ala-Ala-Arg-Asp-Asn-Lys-Lys-Thr-Arg-Ile-Ile-Pro-Arg，如SEQ ID NO：1所示；
生物活性肽RDNKKTRIIPRHL的氨基酸序列为Arg-Asp-Asn-Lys-Lys-Thr-Arg-Ile-Ile-Pro-Arg-His-Leu，如SEQ ID NO：2所示；
生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的氨基酸序列为Leu-Glu-Tyr-Leu-Thr-Ala-Glu-Ile-Leu-Glu-Leu-Ala-Gly-Asn-Ala-Ala-Arg-Asp-Asn-Lys-Lys-Thr-Arg-Ile-Ile-Pro-Arg-His-Leu-Gln，如SEQ ID NO：3所示。
较优的，所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ为小鼠脾脏来源淋巴细胞肽。具体AGNAARDNKKTRIIPR和RDNKKTRIIPRHL来源于Histone H2A type 3蛋白，LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ来源于Histone H2A type 1-E蛋白，并且分别为Histone H2A type 3蛋白第67～82位、第72～84位和Histone H2A type 1-E蛋白第56～85位的氨基酸残基。Histone H2A type3蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；Histone H2Atype 1-E蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：5。
Histone H2A type 3和Histone H2A type 1-E蛋白的氨基酸序列以及对应的核苷酸序列为既有技术，编码Histone H2A type 3蛋白第67～82位、第72～84位和HistoneH2A type 1-E第56～85位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、RDNKKTRIIPRHL和LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ。
较优的，所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ具有抗炎功能和免疫调节功能。
本发明还提供编码所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的多核苷酸。
本发明第二方面，提供所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从细胞中通过分离纯化的方法直接获得，可以直接通过化学合成制备。
通过基因工程的方法人工合成所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ是本领域技术人员能够实现的技术方案，例如可以是以DNA重组技术为基础，通过合适的DNA模板来控制多肽的序列合成。
关于从细胞中通过分离纯化的方法直接获得的方式可以为：基于给定的生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的氨基酸序列，采用生物学技术上常规的酶解、纯化方法从小鼠脾脏来源淋巴细胞获得所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ。
本发明第三方面，提供了具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽在制备具有抗炎功能的药物或化妆品中的应用，具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽选自以下生物活性肽中的一种或几种的组合：生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ。
具体而言，本发明：生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ可以用于制备具有抗炎的药物。
本发明第四方面，提供了具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽在制备具有免疫调节功能的食物或药物中的应用，具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽选自以下生物活性肽中的一种或几种的组合：生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ。
具体而言，本发明生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ中的一种或几种的组合在制备促进巨噬细胞活化并释放细胞因子的食物或药物中的应用。
具体而言，本发明生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ中的一种或几种的组合在制备促进淋巴细胞增殖的食物或药物中的应用。
本发明第五方面，提供了一种抗炎产品，包括生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ中一种或几种的组合或所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的衍生物中的一种或几种的组合；所述的抗炎产品包括抗炎药物或抗炎化妆品。
本发明第六方面，提供了一种具有免疫调节功能的产品，包括生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ中一种或几种的组合或所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的衍生物中的一种或几种的组合；所述具有免疫调节功能的产品包括具有免疫调节功能的食品或具有免疫调节功能的药物。
本发明中，所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的衍生物，是指与所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ相同的活性或更优的活性。
本发明中，所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的衍生物，是指在所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的生物活性肽衍生物。
本发明具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽的有益效果为：本发明具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽具有较好的抗炎活性；本发明具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽可促进巨噬细胞活化并释放细胞因子，提高其在正常巨噬细胞静息状态下的作用，同时促进淋巴细胞增殖，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，提高生命的质量，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。
附图说明
图1：质荷比为357.0117的片段的一级质谱图(m/z＝357.0117)；
图2：质荷比为357.0117的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
图3：质荷比为412.5044的片段的一级质谱图(m/z＝412.5044)；
图4：质荷比为412.5044的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
图5：质荷比为575.3286的片段的一级质谱图(m/z＝575.3286)；
图6：质荷比为575.3286的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、RDNKKTRIIPRHL和LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的人工合成
一、生物活性肽的合成
1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。
2. 2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。
3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。
4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
5.称取氨基酸Ala适量和1-羟基-苯并三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
6. 2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA:DCM＝1:1:2,v:v:v)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。
7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
9.称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
10. 1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。
11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
12.按照步骤9-11依次接上氨基酸Ala、Gly、Asn、Ala、Ala、Arg、Asp、Asn、Lys、Lys、Thr、Arg、Ile、Ile、Pro、Arg。
13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)将生物活性肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)离心沉降四次。
至此，人工合成了生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR。
生物活性肽RDNKKTRIIPRHL和LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的合成方法参考上面方法，只需在第5步、12步连接特定生物活性肽对应的氨基酸。
二、生物活性肽的确认
1)UPLC分析
UPLC条件如下：
仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱仪
色谱柱规格：BEH C18色谱柱
流速：0.4mL/min
温度：50℃
紫外检测波长：210nm
进样量：2μL
梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈
Figure BDA0002912639050000081
2)质谱分析
质谱条件如下：
离子方式：ES+
质量范围(m/z)：100、1000
毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0
采样锥(V)：35.0
离子源温度(℃)：115
去溶剂温度(℃)：350
去溶剂气流(L/hr)：700.0
碰撞能量(eV)：4.0
扫描时间(sec)：0.25
内扫描时间(sec)：0.02
根据以上分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、RDNKKTRIIPRHL和LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ进行色谱分析和质谱分析。生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR一级质谱图如图1所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为357.0117，保留时间是6.62min。生物活性肽RDNKKTRIIPRHL的质量色谱提取图如图3所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图4所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为412.5044，保留时间是7.21min。生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的质量色谱提取图如图5所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图6所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为575.3286，保留时间是50.75min。
3)结果
由图2可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比357.0117的片段序列为Ala、Gly、Asn、Ala、Ala、Arg、Asp、Asn、Lys、Lys、Thr、Arg、Ile、Ile、Pro、Arg(AGNAARDNKKTRIIPR)，记为SEQ ID NO：1。该片段与Histone H2A type 3蛋白第67～82位的残基序列相对应，Histone H2A type 3蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAC38786.1，序列见SEQ ID NO：4。
由图4可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比412.5044的片段序列为Arg、Asp、Asn、Lys、Lys、Thr、Arg、Ile、Ile、Pro、Arg、His、Leu(RDNKKTRIIPRHL)，记为SEQ ID NO：2。该片段与Histone H2A type 3蛋白第72～84位的残基序列相对应，Histone H2A type 3蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAC38786.1，序列见SEQ ID NO：4。
由图6可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比575.3286的片段序列为Leu、Glu、Tyr、Leu、Thr、Ala、Glu、Ile、Leu、Glu、Leu、Ala、Gly、Asn、Ala、Ala、Arg、Asp、Asn、Lys、Lys、Thr、Arg、Ile、Ile、Pro、Arg、His、Leu、Gln(LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ)，记为SEQ ID NO：3。该片段与Histone H2A type 1-E蛋白第56～85位的残基序列相对应，Histone H2A type 1-E蛋白氨基酸序列的GenBank编号为AAH58544.1，序列见SEQ ID NO：5。
实施例2生物活性肽的免疫调节活性实验
一、生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6、8周龄)，上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源性生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR；ELISA细胞因子快速试剂盒(IL-1β和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：LRH、250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL、22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24小时时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48小时，炎症组在培养终止前24小时加入LPS至终浓度100ng/ml。培养终止后，离心收集细胞培养液上清液。在已包被细胞因子抗体的酶标板中加入100μl上清液，37℃反应90分钟后，加入生物素标记抗体，37℃反应60分钟，PBS洗涤后，加入亲和素、过氧化物酶复合物，反应30分钟。PBS洗涤后加入显色液，反应20分钟。加入显色终止液后，使用酶标仪在波长450nm下测定吸光度值(OD450)。
3.实验结果及分析：
表1生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR对巨噬细胞细胞因子水平影响的测定
实验分组 IL-1β IL-6
细胞空白 0.458±0.062 1.198±0.048
生物活性肽(0.2mg/ml) 0.473±0.048 1.221±0.573
生物活性肽(0.5mg/ml) 0.594±0.028** 2.573±0.483**
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)
从表1中可知，在IL-1β和IL-6这两种细胞因子的实验结果中，在0.5mg/ml出现了极显著性差异(P＜0.01)，而在0.2mg/ml时与空白组并未有显著差别，说明生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR在低浓度时对细胞的作用不大，证明了一定浓度下的生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR可促进小鼠腹腔巨噬细胞活化并释放IL-1β和IL-6，提高这些细胞因子在正常巨噬细胞静息状态下的作用，从而调节机体的免疫力。
二、生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)
1.实验材料与仪器：
试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(CorolasePP，购自AB公司)。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱，Heraeus公司；DragonWellscan MK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。
2.实验方法：
无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行原代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×106个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入：100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL生物活性肽样品。另外，设置空白对照组(pH7.2～7.4，3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA)，研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5％CO2 37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。
体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：
Figure BDA0002912639050000111
式中：A1为空白对照在570nm处下的吸光值；A2为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A3为实验组在570nm处下的吸光值。
3.实验结果及分析：
表2生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR对体外淋巴细胞增殖的影响
实验分组 刺激指数SI
BSA 1
生物活性肽 1.364±0.0265**
注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；
**号标记为与阴性对照比较，有极显著性差异(P＜0.01)。
实验结果见表2。由表2可知，在生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR的质量浓度为100μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.364，和阴性对照组具有极显著差异(P<0.01)。因此，可以认定该生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。
三、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6、8周龄)，上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源性生物活性肽RDNKKTRIIPRHL；ELISA细胞因子快速试剂盒(IL-1β和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：LRH、250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL、22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24小时时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48小时，炎症组在培养终止前24小时加入LPS至终浓度100ng/ml。培养终止后，离心收集细胞培养液上清液。在已包被细胞因子抗体的酶标板中加入100μl上清液，37℃反应90分钟后，加入生物素标记抗体，37℃反应60分钟，PBS洗涤后，加入亲和素、过氧化物酶复合物，反应30分钟。PBS洗涤后加入显色液，反应20分钟。加入显色终止液后，使用酶标仪在波长450nm下测定吸光度值(OD450)。
3.实验结果及分析：
表3生物活性肽RDNKKTRIIPRHL对巨噬细胞细胞因子水平影响的测定
实验分组 IL-1β IL-6
细胞空白 0.443±0.058 1.176±0.039
生物活性肽(0.2mg/ml) 0.465±0.031 1.112±0.048
生物活性肽(0.5mg/ml) 0.639±0.047** 2.483±0.064**
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)
从表3中可知，在IL-1β和IL-6这两种细胞因子的实验结果中，在0.5mg/ml出现了极显著性差异(P＜0.01)，而在0.2mg/ml时与空白组并未有显著差别，说明生物活性肽在低浓度时对细胞的作用不大，证明了一定浓度下的生物活性肽RDNKKTRIIPRHL可促进小鼠腹腔巨噬细胞活化并释放IL-1β和IL-6，提高这些细胞因子在正常巨噬细胞静息状态下的作用，从而调节机体的免疫力。
四、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)
1.实验材料与仪器：
试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽RDNKKTRIIPRHL；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(Corolase PP，购自AB公司)。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱，Heraeus公司；DragonWellscan MK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。
2.实验方法：
无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行原代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×106个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入：100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL生物活性肽样品。另外，设置空白对照组(pH7.2～7.4，3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA)，研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5％CO2 37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。
体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：
Figure BDA0002912639050000141
式中：A1为空白对照在570nm处下的吸光值；A2为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A3为实验组在570nm处下的吸光值。
3.实验结果及分析：
表4生物活性肽RDNKKTRIIPRHL对体外淋巴细胞增殖的影响
实验分组 刺激指数SI
BSA 1
生物活性肽 1.223±0.017**
注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；
**号标记为与阴性对照比较，有极显著性差异(P＜0.01)。
实验结果见表4。由表4可知，在生物活性肽RDNKKTRIIPRHL的质量浓度为100μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽RDNKKTRIIPRHL一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.223，和阴性对照组具有极显著差异(P<0.01)。因此，可以认定该生物活性肽RDNKKTRIIPRHL具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。
五、生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6、8周龄)，上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源性生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ；ELISA细胞因子快速试剂盒(IL-1β和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：LRH、250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL、22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24小时时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48小时，炎症组在培养终止前24小时加入LPS至终浓度100ng/ml。培养终止后，离心收集细胞培养液上清液。在已包被细胞因子抗体的酶标板中加入100μl上清液，37℃反应90分钟后，加入生物素标记抗体，37℃反应60分钟，PBS洗涤后，加入亲和素、过氧化物酶复合物，反应30分钟。PBS洗涤后加入显色液，反应20分钟。加入显色终止液后，使用酶标仪在波长450nm下测定吸光度值(OD450)。
3.实验结果及分析：
表5生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ对巨噬细胞细胞因子水平影响的测定
实验分组 IL-1β IL-6
细胞空白 0.465±0.042 1.185±0.036
生物活性肽(0.2mg/ml) 0.453±0.041 1.137±0.033
生物活性肽(0.5mg/ml) 0.663±0.035** 2.392±0.043**
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)
从表5中可知，在IL-1β和IL-6这两种细胞因子的实验结果中，在0.5mg/ml出现了极显著性差异(P＜0.01)，而在0.2mg/ml时与空白组并未有显著差别，说明生物活性肽在低浓度时对细胞的作用不大，证明了一定浓度下的生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ可促进小鼠腹腔巨噬细胞活化并释放IL-1β和IL-6，提高这些细胞因子在正常巨噬细胞静息状态下的作用，从而调节机体的免疫力。
六、生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)
1.实验材料与仪器：
试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(Corolase PP，购自AB公司)。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱，Heraeus公司；DragonWellscan MK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。
2.实验方法：
无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行原代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×106个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入：100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL生物活性肽样品。另外，设置空白对照组(pH7.2～7.4，3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA)，研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5％CO2 37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。
体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：
Figure BDA0002912639050000161
式中：A1为空白对照在570nm处下的吸光值；A2为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A3为实验组在570nm处下的吸光值。
3.实验结果及分析：
表6生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ对体外淋巴细胞增殖的影响
实验分组 刺激指数SI
BSA 1
生物活性肽 1.139±0.021*
注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；
**号标记为与阴性对照比较，有极显著性差异(P＜0.01)。
实验结果见表6。由表6可知，在生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的质量浓度为100μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.139，和阴性对照组具有显著差异(P<0.05)。因此，可以认定该生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江辉肽生命健康科技有限公司
<120> 具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽及其制备方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile Pro Arg
1 5 10 15
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile Pro Arg His Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala
1 5 10 15
Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile Pro Arg His Leu Gln
20 25 30
<210> 4
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Ser Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
20 25 30
Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ser Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala
35 40 45
Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu
50 55 60
Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile
65 70 75 80
Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys
85 90 95
Leu Leu Gly Arg Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile
100 105 110
Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Ala Lys
115 120 125
Gly Lys
130
<210> 5
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
20 25 30
Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ser Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala
35 40 45
Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu
50 55 60
Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile
65 70 75 80
Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys
85 90 95
Leu Leu Gly Arg Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile
100 105 110
Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Ala Lys
115 120 125
Gly Lys
130

Claims (10)

1.具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽，其特征在于，选自以下生物活性肽中的一种或几种的组合：生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ；生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR的氨基酸序列如SEQID NO：1所示，生物活性肽RDNKKTRIIPRHL的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.编码生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的多核苷酸。
3.生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的制备方法，其特征在于，通过基因工程的方法人工合成，从细胞中通过分离纯化的方法直接获得，或直接通过化学合成制备。
4.具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽在制备具有抗炎功能的药物或化妆品中的应用，其特征在于，具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽选自以下生物活性肽中的一种或几种的组合：生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ。
5.具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽在制备具有免疫调节功能的食物或药物中的应用，其特征在于，具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽选自以下生物活性肽中的一种或几种的组合：生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ。
6.根据权利要求5所述具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽在制备具有免疫调节功能的食物或药物中的应用，其特征在于，所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ中的一种或几种的组合在制备促进巨噬细胞活化并释放细胞因子的食物或药物中的应用。
7.根据权利要求5所述具有氨基酸结构RDNKKTRIIPR的生物活性肽在制备具有免疫调节功能的食物或药物中的应用，其特征在于，所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ中的一种或几种的组合在制备促进淋巴细胞增殖的食物或药物中的应用。
8.一种抗炎产品，其特征在于，包括生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ中一种或几种的组合或所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的衍生物中的一种或几种的组合；所述的抗炎产品包括抗炎药物或抗炎化妆品。
9.一种具有免疫调节功能的产品，其特征在于，包括生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ中一种或几种的组合或所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的衍生物中的一种或几种的组合；所述具有免疫调节功能的产品包括具有免疫调节功能的食品或具有免疫调节功能的药物。
10.根据权利要求8所述一种抗炎产品或权利要求9所述一种具有免疫调节功能的产品，其特征在于，所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的衍生物，是指与所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ相同的活性或更优的活性；
所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的衍生物，是指在所述生物活性肽AGNAARDNKKTRIIPR、生物活性肽RDNKKTRIIPRHL或生物活性肽LEYLTAEILELAGNAARDNKKTRIIPRHLQ的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化修饰，得到的生物活性肽衍生物。
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