CN112745380B - 具有氨基酸结构raglqfpvgrvh的生物活性肽及其制备方法和应用 - Google Patents

具有氨基酸结构raglqfpvgrvh的生物活性肽及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112745380B
CN112745380B CN202110091268.0A CN202110091268A CN112745380B CN 112745380 B CN112745380 B CN 112745380B CN 202110091268 A CN202110091268 A CN 202110091268A CN 112745380 B CN112745380 B CN 112745380B
Authority
CN
China
Prior art keywords
raglqfpvgrvh
bioactive peptide
amino acid
srssraglqfpvgrvh
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110091268.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112745380A (zh
Inventor
张少辉
肖珊珊
占文静
张伯宇
陈承余
石毅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Huitai Life Health Technology Co ltd
Original Assignee
Zhejiang Huitai Life Health Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Huitai Life Health Technology Co ltd filed Critical Zhejiang Huitai Life Health Technology Co ltd
Priority to CN202110091268.0A priority Critical patent/CN112745380B/zh
Publication of CN112745380A publication Critical patent/CN112745380A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112745380B publication Critical patent/CN112745380B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及蛋白领域，具体涉及具有氨基酸结构RAGLQFPVGRVH的生物活性肽及其制备方法和应用，具有氨基酸结构RAGLQFPVGRVH的生物活性肽选自生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH或两者的组合，生物活性肽RAGLQFPVGRVH的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。经过体外免疫功能调节实验，验证了生物活性肽RAGLQFPVGRVH和SRSSRAGLQFPVGRVH具有较好的免疫调节功能。本发明的RAGLQFPVGRVH和SRSSRAGLQFPVGRVH可有效抑制机体因氧化而引起的炎症，促进巨噬细胞吞噬中性红能力，具有一定的免疫调节作用，提高机体免疫力，降低机体发病率，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。

Description

具有氨基酸结构RAGLQFPVGRVH的生物活性肽及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及蛋白领域，尤其是涉及具有氨基酸结构RAGLQFPVGRVH的生物活性肽及其制备方法和应用。
背景技术
生物活性肽因其具有很多潜在的生物功能，所以引起人们越来越多的关注，成为科学研究的热点之一。目前很多生物活性肽的有益效果也已经得到了很好的证明，如抗癌、降血压、抗菌、降胆固醇、抗糖尿病等等特性。当前最权威的生物活性肽数据库BIOPEP-UMW中已报告了3000多个不同的生物活性肽，但是由于生活肽的数量实在是太多，所以，还有非常多的多肽有待研究其相关性能。
目前对于生物活性肽的研究多集中于食物衍生多肽，对非食物衍生多肽研究和报道较少。且已经有研究结果证实，与食物衍生的生物活性肽相比，非食物衍生的生物活性肽具有更高的亲和力并能有效发挥其生物活性功能。
当多肽未从蛋白质中酶解分离时，这些蛋白质本身往往是不具备免疫调节活性的。如何从已知氨基酸序列的种类繁多的蛋白质中寻找具有特定功能的生物活性肽，并研究这些多肽的功能是蛋白领域研究的方向之一。
Histone H2A type 3蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。目前，现有技术中并没有关于Histone H2A type 3蛋白多肽片段相关功能的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供具有氨基酸结构RAGLQFPVGRVH的生物活性肽及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面，提供具有氨基酸结构RAGLQFPVGRVH的生物活性肽，选自生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH或两者的组合，
生物活性肽RAGLQFPVGRVH的氨基酸序列为Arg-Ala-Gly-Leu-Gln-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-Val-His，如SEQ ID NO：1所示。
生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH的氨基酸序列为Ser-Arg-Ser-Ser-Arg-Ala-Gly-Leu-Gln-Phe-Pro-Val-Gly-Arg-Val-His，如SEQ ID NO：2所示。
较优的，所述生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH为小鼠脾脏来源淋巴细胞肽。具体均来源于Histone H2A type 3蛋白，并且分别为Histone H2Atype 3蛋白第21～32位和第17～32位的氨基酸残基。Histone H2A type 3蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
Histone H2A type 3蛋白的氨基酸序列以及对应的核苷酸序列为既有技术，编码Histone H2A type 3蛋白第21～32位和第17～32位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性肽RAGLQFPVGRVH和SRSSRAGLQFPVGRVH。
较优的，所述生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH具有抗炎功能和免疫调节功能。
本发明还提供编码所述生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH的多核苷酸。
本发明第二方面，提供了所述生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从细胞中通过分离纯化的方法直接获得，可以直接通过化学合成制备。
通过基因工程的方法人工合成所述生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH是本领域技术人员能够实现的技术方案，例如可以是以DNA重组技术为基础，通过合适的DNA模板来控制多肽的序列合成。
关于从细胞中通过分离纯化的方法直接获得的方式可以为：基于给定的所述生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH的氨基酸序列，采用生物学技术上常规的酶解、纯化方法从小鼠脾脏来源淋巴细胞获得所述生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH。
本发明第三方面，提供了具有氨基酸结构RAGLQFPVGRVH的生物活性肽在制备具有抗炎功能的药物或化妆品中的应用，具有氨基酸结构RAGLQFPVGRVH的生物活性肽选自生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH或两者的组合。
具体而言，本发明的生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH可以用于制备具有抗炎的药物。
具体而言，本发明生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH或两者的组合在制备抑制机体因氧化而引起的炎症的药物中的应用。
本发明第四方面，提供了具有氨基酸结构RAGLQFPVGRVH的生物活性肽在制备具有免疫调节功能的食物或药物中的应用，所述具有氨基酸结构RAGLQFPVGRVH的生物活性肽选自生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH或两者的组合。
具体而言，本发明生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH或两者的组合在制备促巨噬细胞吞噬中性红能力的食物或药物中的应用。
本发明第五方面，提供了一种抗炎产品，包括生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH或两者的组合或所述生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH的衍生物中的一种或几种的组合；所述的抗炎产品包括抗炎药物或抗炎化妆品。
本发明第六方面，提供了一种具有免疫调节功能的产品，包括生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH或两者的组合或所述生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH的衍生物中的一种或几种的组合；所述具有免疫调节功能的产品包括具有免疫调节功能的食品或具有免疫调节功能的药物。
本发明中，所述生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH的衍生物，是指与所述生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH相同的活性或更优的活性。
本发明中，所述生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH的衍生物，是指在所述生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。
本发明生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH的有益效果为：本发明的生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH具有较好的抗炎活性；本发明的生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH可有效抑制机体因氧化而引起的炎症，促进巨噬细胞吞噬中性红能力，具有一定的免疫调节作用，提高机体免疫力，降低机体发病率，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。
附图说明
图1：质荷比为446.2591的片段的一级质谱图(m/z＝446.2591)；
图2：质荷比为446.2591的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
图3：质荷比为439.2444的片段的一级质谱图(m/z＝439.2444)；
图4：质荷比为439.2444的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1活性肽RAGLQFPVGRVH和SRSSRAGLQFPVGRVH的人工合成一、生物活性肽的合成
1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。
2. 2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。
3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。
4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
5.称取氨基酸Arg适量和1-羟基-苯并三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
6. 2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA:DCM＝1:1:2,v:v:v)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。
7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
9.称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
10. 1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。
11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
12.按照步骤9-11依次接上氨基酸Arg、Ala、Gly、Leu、Gln、Phe、Pro、Val、Gly、Arg、Val、His。
13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)将生物活性肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)离心沉降四次。
至此，人工合成了生物活性肽RAGLQFPVGRVH。
生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH的合成方法参考上面方法，只需在第12步连接特定生物活性肽对应的氨基酸。
二、生物活性肽的确认
1)UPLC分析
UPLC条件如下：
仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱仪
色谱柱规格：BEH C18色谱柱
流速：0.4mL/min
温度：50℃
紫外检测波长：210nm
进样量：2μL
梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈
Figure BDA0002912637960000071
2)质谱分析
质谱条件如下：
离子方式：ES+
质量范围(m/z)：100、1000
毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0
采样锥(V)：35.0
离子源温度(℃)：115
去溶剂温度(℃)：350
去溶剂气流(L/hr)：700.0
碰撞能量(eV)：4.0
扫描时间(sec)：0.25
内扫描时间(sec)：0.02
根据以上分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对生物活性肽RAGLQFPVGRVH和SRSSRAGLQFPVGRVH进行色谱分析和质谱分析。生物活性肽RAGLQFPVGRVH一级质谱图如图1所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为446.2591，保留时间是23.86min。生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH的质量色谱提取图如图3所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图4所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为439.2444，保留时间是18.42min。
3)结果
由图2可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比446.2591的片段序列为Arg、Ala、Gly、Leu、Gln、Phe、Pro、Val、Gly、Arg、Val、His(RAGLQFPVGRVH)，记为SEQ ID NO：1。该片段与Histone H2A type 3蛋白第21～32位的残基序列相对应，Histone H2A type 3蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAC38786.1，序列见SEQ ID NO：3。
由图4可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比439.2444的片段序列为Ser、Arg、Ser、Ser、Arg、Ala、Gly、Leu、Gln、Phe、Pro、Val、Gly、Arg、Val、His(SRSSRAGLQFPVGRVH)，记为SEQ ID NO：2。该片段与Histone H2A type 3蛋白第17～32位的残基序列相对应，Histone H2A type3蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAC38786.1，序列见SEQ ID NO：3。
实施例2生物活性肽的免疫调节活性实验
一、生物活性肽RAGLQFPVGRVH的对血清中免疫细胞因子作用的实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物ICR小鼠(雄性5周龄)，上海市实验动物中心；D-gal，国药集团化学试剂有限公司；多聚甲醛，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽RAGLQFPVGRVH；BCA蛋白试剂盒，南京凯基生物科技有限公司；ELISA细胞因子快速试剂盒(TNF-α和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：CM-230型摩尔超净水，上海摩勒科学仪器有限公司；密理博MilliporeMILLEX GP0.22μm滤膜，美国密理博公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
2.实验方法：
(1)动物衰老模型造模
将ICR小鼠适应性饲养一周后，分为4组，每组6只。组1为低剂量灌胃组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并以1mg/只·天的剂量灌胃生物活性肽；组2为高剂量灌胃组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并且3mg/只的·天剂量灌胃生物活性肽；组3为空白组，小鼠正常生长；组4为动物模型组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并且灌胃浓度为0.9％的生理盐水；D-gal的注射周期与生物活性肽的灌胃周期均为42天。每3天更换垫料，并保证饲料与蒸馏水的供给。每五天称量一次小鼠的体重，根据小鼠的体重配制D-gal注射液，且D-gal注射液经0.22μm针筒式滤膜过滤，以保证无菌。
(2)获取动物脏器与血清
实验周期完成后，以摘眼球取血法获取小鼠的血液，获得血液后断颈处死小鼠，而后将小鼠的躯体置于低温冰盒上，小鼠血液室温静置1小时后，以3000g离心15min，分离血清。血清保存在-80℃冰箱内待检。处置实验动物过程中的所有操作遵循2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。所摘取的小鼠脾脏直接浸泡于预先配制好的4％多聚甲醛溶液中，以固定其形态。多聚甲醛粉末较为难溶，可以加入微量的碳酸氢钠将pH值调节至碱性，以助溶。多聚甲醛溶液的配制需要在通风橱内完成。
(3)样品检测
根据试剂盒说明书指示，首先绘制标准曲线，将标准品粉末用标准品稀释液配制成1000pg/mL的溶液，再连续稀释为500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.3pg/mL、15.6pg/mL等不同浓度。每个浓度梯度溶液移取100μL于已包被抗体的酶标板中。吸取小鼠血清样品100μL，加入同一块酶标板中(若血清样品不够，可适当稀释后再检测计算时需按比例折算)。盖上酶标板，将其置于37℃环境下孵育90min。反应完毕后，小心甩去酶标板内的液体，并将酶标板置于吸水纸上，小心拍打，除去多余液体。将预热好的生物素抗抗体工作液按每孔100μL依次加入酶标板各孔内，37℃下，反应60min。反应完毕后，利用0.01M的PBS溶液洗涤3次，每次每孔内加入100μL的PBS，浸泡1min后倾去溶液，反复3次。将预热好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入，37℃反应30min。反应完毕后，用0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1min左右。按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30min的TMB显色液，37℃避光反应8-12min。按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色，用酶标仪在450nm测定OD值。通过细胞因子的标准蛋白做已知浓度系列稀释，测出OD值后绘制出标准曲线，根据标准曲线可推算出标本中细胞因子的含量。
3.实验结果及分析：
表1各组小鼠血清中细胞因子的变化情况
TNF-α(pg/mL) IL-6(pg/mL)
组1 2.41±0.27** 88.52±9.19**
组2 2.42±0.14** 101.42±17.32**
组3 2.35±0.31** 68.58±15.35**
组4 4.59±0.52 163.26±20.84
从表1中可以发现本实验中的模型组小鼠体内IL-6与TNF-α含量分别为163.26±20.84pg/mL，4.59±0.52 pg/mL，相较于正常组均呈现显著性的增加(P<0.01)，故可以认为由于持续不断地注射致衰老因子，导致动物模型组小鼠在细胞因子层面出现衰老性炎症的症状，而生物活性肽灌胃组的小鼠血清的IL-6与TNF-α含量均得到有效控制。根据细胞因子的实验结果，生物活性肽灌胃组小鼠的血清炎性细胞因子IL-6、TNF-α的分泌水平均低于动物模型组，从氧化损伤角度来看，小鼠因自由基攻击、过氧化产物堆积而造成的氧化损伤可能得到一定程度的抑制；从炎症的角度来看，小鼠因氧化而引起的炎症得到了有效的抑制；从衰老角度来看，小鼠由长期注射D-gal而引起的衰老所导致的一系列老年性疾病有可能得到控制。因此，可以认定生物活性肽RAGLQFPVGRVH可有效抑制小鼠因氧化而引起的炎症，具有一定的免疫调节作用，可用于保健品的研发制作。
二、生物活性肽RAGLQFPVGRVH的促巨噬细胞吞噬中性红能力实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽RAGLQFPVGRVH；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入生物活性肽(1mg/ml)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔为实验组，添加不含活性肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔进行培养的设为空白组；并且实验组和空白组在培养到24h时加入LPS至终浓度10μg/ml；继续培养至48h后，吸弃细胞培养液。PBS清洗孔底后加入37℃的中性红染液80μl/孔，10分钟后吸弃染液，用PBS清洗两次后，每孔加入150μl细胞裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1:1，v/v)。4℃隔夜溶解后，在波长540nm下测定吸光度值(OD540)。
3.实验结果及分析：
表2生物活性肽RAGLQFPVGRVH促巨噬细胞吞噬中性红能力的测定
实验分组 吸光度值(OD540)
空白组 0.0974±0.0224
实验组 0.1331±0.0209*
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)
**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表2，与细胞空白相比较，添加1mg/ml生物活性肽的炎症组巨噬细胞吞噬中性红能力明显增加，而且与细胞空白组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。说明生物活性肽RAGLQFPVGRVH在有炎症发生的情况下对体外巨噬细胞吞噬中性红能力具有显著的促进作用。
三、生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH的对血清中免疫细胞因子作用的实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物ICR小鼠(雄性5周龄)，上海市实验动物中心；D-gal，国药集团化学试剂有限公司；多聚甲醛，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH；BCA蛋白试剂盒，南京凯基生物科技有限公司；ELISA细胞因子快速试剂盒(TNF-α和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：CM-230型摩尔超净水，上海摩勒科学仪器有限公司；密理博MilliporeMILLEX GP0.22μm滤膜，美国密理博公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
2.实验方法：
(1)动物衰老模型造模
将ICR小鼠适应性饲养一周后，分为4组，每组6只。组1为低剂量灌胃组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并以1mg/只·天的剂量灌胃生物活性肽；组2为高剂量灌胃组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并且3mg/只的·天剂量灌胃生物活性肽；组3为空白组，小鼠正常生长；组4为动物模型组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并且灌胃浓度为0.9％的生理盐水；D-gal的注射周期与生物活性肽的灌胃周期均为42天。每3天更换垫料，并保证饲料与蒸馏水的供给。每五天称量一次小鼠的体重，根据小鼠的体重配制D-gal注射液，且D-gal注射液经0.22μm针筒式滤膜过滤，以保证无菌。
(2)获取动物脏器与血清
实验周期完成后，以摘眼球取血法获取小鼠的血液，获得血液后断颈处死小鼠，而后将小鼠的躯体置于低温冰盒上，小鼠血液室温静置1小时后，以3000g离心15min，分离血清。血清保存在-80℃冰箱内待检。处置实验动物过程中的所有操作遵循2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。所摘取的小鼠脾脏直接浸泡于预先配制好的4％多聚甲醛溶液中，以固定其形态。多聚甲醛粉末较为难溶，可以加入微量的碳酸氢钠将pH值调节至碱性，以助溶。多聚甲醛溶液的配制需要在通风橱内完成。
(3)样品检测
根据试剂盒说明书指示，首先绘制标准曲线，将标准品粉末用标准品稀释液配制成1000pg/mL的溶液，再连续稀释为500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.3pg/mL、15.6pg/mL等不同浓度。每个浓度梯度溶液移取100μL于已包被抗体的酶标板中。吸取小鼠血清样品100μL，加入同一块酶标板中(若血清样品不够，可适当稀释后再检测计算时需按比例折算)。盖上酶标板，将其置于37℃环境下孵育90min。反应完毕后，小心甩去酶标板内的液体，并将酶标板置于吸水纸上，小心拍打，除去多余液体。将预热好的生物素抗抗体工作液按每孔100μL依次加入酶标板各孔内，37℃下，反应60min。反应完毕后，利用0.01M的PBS溶液洗涤3次，每次每孔内加入100μL的PBS，浸泡1min后倾去溶液，反复3次。将预热好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入，37℃反应30min。反应完毕后，用0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1min左右。按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30min的TMB显色液，37℃避光反应8-12min。按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色，用酶标仪在450nm测定OD值。通过细胞因子的标准蛋白做已知浓度系列稀释，测出OD值后绘制出标准曲线，根据标准曲线可推算出标本中细胞因子的含量。
4.实验结果及分析：
表3各组小鼠血清中细胞因子的变化情况
TNF-α(pg/mL) IL-6(pg/mL)
组1 2.49±0.14** 73.23±11.23**
组2 2.59±0.11** 84.34±20.52**
组3 2.41±0.28** 65.76±12.11**
组4 5.38±0.16 153.58±17.39
从表3中可以发现本实验中的模型组小鼠体内IL-6与TNF-α含量分别为153.58±17.39pg/mL，5.38±0.16pg/mL，相较于正常组均呈现显著性的增加(P<0.01)，故可以认为由于持续不断地注射致衰老因子，导致动物模型组小鼠在细胞因子层面出现衰老性炎症的症状，而生物活性肽灌胃组的小鼠血清的IL-6与TNF-α含量均得到有效控制。根据细胞因子的实验结果，生物活性肽灌胃组小鼠的血清炎性细胞因子IL-6、TNF-α的分泌水平均低于动物模型组，从氧化损伤角度来看，小鼠因自由基攻击、过氧化产物堆积而造成的氧化损伤可能得到一定程度的抑制；从炎症的角度来看，小鼠因氧化而引起的炎症得到了有效的抑制；从衰老角度来看，小鼠由长期注射D-gal而引起的衰老所导致的一系列老年性疾病有可能得到控制。因此，可以认定生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH可有效抑制小鼠因氧化而引起的炎症，具有一定的免疫调节作用，可用于保健品的研发制作。
四、生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH的促巨噬细胞吞噬中性红能力实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入生物活性肽(1mg/ml)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔为实验组，添加不含活性肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔进行培养的设为空白组；并且实验组和空白组在培养到24h时加入LPS至终浓度10μg/ml；继续培养至48h后，吸弃细胞培养液。PBS清洗孔底后加入37℃的中性红染液80μl/孔，10分钟后吸弃染液，用PBS清洗两次后，每孔加入150μl细胞裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1:1，v/v)。4℃隔夜溶解后，在波长540nm下测定吸光度值(OD540)。
3.实验结果及分析：
表4生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH促巨噬细胞吞噬中性红能力的测定
实验分组 吸光度值(OD540)
空白组 0.0943±0.0224
实验组 0.1893±0.0276**
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)
**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表4，与细胞空白相比较，添加1mg/ml生物活性肽的炎症组巨噬细胞吞噬中性红能力明显增加，而且与细胞空白组比较，具有极显著性差异(P＜0.01)。说明生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH在有炎症发生的情况下对体外巨噬细胞吞噬中性红能力具有显著的促进作用。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江辉肽生命健康科技有限公司
<120> 具有氨基酸结构RAGLQFPVGRVH的生物活性肽及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
1 5 10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
1 5 10 15
<210> 3
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Ser Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
20 25 30
Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ser Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala
35 40 45
Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu
50 55 60
Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile
65 70 75 80
Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys
85 90 95
Leu Leu Gly Arg Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile
100 105 110
Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Ala Lys
115 120 125
Gly Lys
130

Claims (5)

1.具有氨基酸结构RAGLQFPVGRVH的生物活性肽，其特征在于，选自生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH或两者的组合，生物活性肽RAGLQFPVGRVH的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。
2.编码权利要求1所述具有氨基酸结构RAGLQFPVGRVH的生物活性肽的多核苷酸。
3.权利要求1所述具有氨基酸结构RAGLQFPVGRVH的生物活性肽的制备方法，其特征在于，直接通过化学合成制备。
4.权利要求1所述具有氨基酸结构RAGLQFPVGRVH的生物活性肽的应用，其特征在于，所述生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH或两者的组合在制备降低衰老状态下血清中免疫细胞因子IL-6与TNF-α的分泌水平的药物中的应用。
5.权利要求1所述具有氨基酸结构RAGLQFPVGRVH的生物活性肽的应用，其特征在于，所述生物活性肽RAGLQFPVGRVH或生物活性肽SRSSRAGLQFPVGRVH或两者的组合在制备促巨噬细胞吞噬中性红能力的药物中的应用。
CN202110091268.0A 2021-01-22 2021-01-22 具有氨基酸结构raglqfpvgrvh的生物活性肽及其制备方法和应用 Active CN112745380B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110091268.0A CN112745380B (zh) 2021-01-22 2021-01-22 具有氨基酸结构raglqfpvgrvh的生物活性肽及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110091268.0A CN112745380B (zh) 2021-01-22 2021-01-22 具有氨基酸结构raglqfpvgrvh的生物活性肽及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112745380A CN112745380A (zh) 2021-05-04
CN112745380B true CN112745380B (zh) 2022-04-08

Family

ID=75652986

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110091268.0A Active CN112745380B (zh) 2021-01-22 2021-01-22 具有氨基酸结构raglqfpvgrvh的生物活性肽及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112745380B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112646022B (zh) * 2020-12-16 2022-03-29 熊猫乳品集团股份有限公司 一种生物活性肽pkcpkcdkevyfaerv及其制备方法和应用
CN112592902B (zh) * 2020-12-16 2022-03-29 熊猫乳品集团股份有限公司 一种生物活性肽aseppvldvkrpflc及其制备方法和应用

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2208699A1 (en) * 1994-12-30 1996-07-11 Rockefeller University (The) Anti-inflammatory cd14 polypeptides
WO2011073918A2 (en) * 2009-12-16 2011-06-23 Actelion Pharmaceuticals Ltd Peptides as modulators of fprl1 and/or fprl2
CN104311630A (zh) * 2014-09-25 2015-01-28 广西中医药大学 文蛤生物活性肽及其提取方法和应用
CN107176995A (zh) * 2017-07-06 2017-09-19 浙江辉肽生命健康科技有限公司 一种生物活性多肽skvlpvpekavpypq及其制备方法和应用
CN107200782A (zh) * 2017-07-06 2017-09-26 浙江辉肽生命健康科技有限公司 一种生物活性多肽vavvkkgsnfq及其制备方法和应用
CN107200780A (zh) * 2017-07-06 2017-09-26 浙江辉肽生命健康科技有限公司 一种生物活性多肽lvypfpg及其制备方法和应用
CN107840882A (zh) * 2017-11-14 2018-03-27 上海交通大学 一种生物活性多肽dipnpigse及其制备方法和应用
CN108794602A (zh) * 2018-06-29 2018-11-13 浙江辉肽生命健康科技有限公司 一种生物活性多肽pnimviqh及其制备方法和应用
CN109053868A (zh) * 2018-08-30 2018-12-21 上海交通大学 一种生物活性多肽dienikitgei及其制备方法和应用
CN109160944A (zh) * 2018-08-30 2019-01-08 上海交通大学 一种生物活性多肽atavpiiff及其制备方法和应用
CN110938130A (zh) * 2019-11-08 2020-03-31 上海交通大学 一种生物活性多肽rvfqplphenkpltl及其制备方法和应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2208699A1 (en) * 1994-12-30 1996-07-11 Rockefeller University (The) Anti-inflammatory cd14 polypeptides
WO2011073918A2 (en) * 2009-12-16 2011-06-23 Actelion Pharmaceuticals Ltd Peptides as modulators of fprl1 and/or fprl2
CN104311630A (zh) * 2014-09-25 2015-01-28 广西中医药大学 文蛤生物活性肽及其提取方法和应用
CN107176995A (zh) * 2017-07-06 2017-09-19 浙江辉肽生命健康科技有限公司 一种生物活性多肽skvlpvpekavpypq及其制备方法和应用
CN107200782A (zh) * 2017-07-06 2017-09-26 浙江辉肽生命健康科技有限公司 一种生物活性多肽vavvkkgsnfq及其制备方法和应用
CN107200780A (zh) * 2017-07-06 2017-09-26 浙江辉肽生命健康科技有限公司 一种生物活性多肽lvypfpg及其制备方法和应用
CN107840882A (zh) * 2017-11-14 2018-03-27 上海交通大学 一种生物活性多肽dipnpigse及其制备方法和应用
CN108794602A (zh) * 2018-06-29 2018-11-13 浙江辉肽生命健康科技有限公司 一种生物活性多肽pnimviqh及其制备方法和应用
CN109053868A (zh) * 2018-08-30 2018-12-21 上海交通大学 一种生物活性多肽dienikitgei及其制备方法和应用
CN109160944A (zh) * 2018-08-30 2019-01-08 上海交通大学 一种生物活性多肽atavpiiff及其制备方法和应用
CN110938130A (zh) * 2019-11-08 2020-03-31 上海交通大学 一种生物活性多肽rvfqplphenkpltl及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112745380A (zh) 2021-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112759636B (zh) 具有氨基酸结构eslkgvdpkflr的生物活性肽及其制备方法和应用
CN112745380B (zh) 具有氨基酸结构raglqfpvgrvh的生物活性肽及其制备方法和应用
CN112646022B (zh) 一种生物活性肽pkcpkcdkevyfaerv及其制备方法和应用
CN112812168A (zh) 一种生物活性肽glnmcrqcf及其制备方法和应用
CN112625113A (zh) 一种生物活性肽agydveknnsriklglk及其制备方法和应用
CN112501140A (zh) 一种生物活性多肽yfgsgfaapffivrhqllkk及其制备方法和应用
CN112661830B (zh) 具有氨基酸结构airndeelnkllgr的生物活性肽及其制备方法和应用
CN112724237B (zh) 一种生物活性肽ggsdgygsgrgf及其制备方法和应用
CN112592396A (zh) 一种生物活性肽vdpfskkdw及其制备方法和应用
CN112500469A (zh) 一种生物活性多肽aapaapaaappae及其制备方法和应用
CN112500468A (zh) 一种生物活性肽rlafiahpklg及其制备方法和应用
CN112745379A (zh) 具有氨基酸结构rdnkktriipr的生物活性肽及其制备方法和应用
CN112625112A (zh) 一种生物活性多肽paapaqlpkki及其制备方法和应用
CN112480233A (zh) 一种生物活性肽iahpklgkrir及其制备方法和应用
CN112500467A (zh) 一种生物活性肽rrecpsdecgagvf及其制备方法和应用
CN112759635B (zh) 具有氨基酸结构vakvtggaaskl的生物活性肽及其制备方法和应用
CN112745381B (zh) 具有氨基酸结构nirnigktlvtr的生物活性肽及其制备方法和应用
CN112661829B (zh) 一种生物活性肽ggygsgggsggygsrrf及其制备方法和应用
CN112679597B (zh) 一种生物活性肽sepkpiff及其制备方法和应用
CN112759634B (zh) 具有氨基酸结构feyieenky的生物活性肽及其制备方法和应用
CN112812170B (zh) 具有氨基酸结构llpkkte的生物活性多肽及其制备方法和应用
CN112480236B (zh) 一种生物活性肽lecvepncrskr及其制备方法和应用
CN112592902B (zh) 一种生物活性肽aseppvldvkrpflc及其制备方法和应用
CN112724239B (zh) 具有氨基酸结构nkeldpvqklfvdkireyk的生物活性肽及其应用
CN112724238B (zh) 具有氨基酸结构fregttpkpk的生物活性肽及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant