CN112759635B - 具有氨基酸结构vakvtggaaskl的生物活性肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白领域，具体涉及具有氨基酸结构VAKVTGGAASKL的生物活性肽及其制备方法和应用，主要包括生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS、生物活性肽VAKVTGGAASKLS。经过体外免疫调节功能实验，发现生物活性肽RVAKVTGGAASKL、RVAKVTGGAASKLS和VAKVTGGAASKLS具有很好的免疫调节功能。本发明的RVAKVTGGAASKL、RVAKVTGGAASKLS和VAKVTGGAASKLS可有效抑制机体因氧化而引起的炎症，具有一定的免疫调节作用，可提高机体免疫力，降低机体发病率，促进淋巴细胞增殖，提高生命的质量，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白领域，尤其是涉及具有氨基酸结构VAKVTGGAASKL的生物活性肽及其制备方法和应用。
背景技术
生物活性肽因其具有很多潜在的生物功能，所以引起人们越来越多的关注，成为科学研究的热点之一。目前很多生物活性肽的有益效果也已经得到了很好的证明，如抗癌、降血压、抗菌、降胆固醇、抗糖尿病等等特性。当前最权威的生物活性肽数据库BIOPEP-UMW中已报告了3000多个不同的生物活性肽，但是由于生活肽的数量实在是太多，所以，还有非常多的多肽有待研究其相关性能。
目前对于生物活性肽的研究多集中于食物衍生多肽，对非食物衍生多肽研究和报道较少。且已经有研究结果证实，与食物衍生的生物活性肽相比，非食物衍生的生物活性肽具有更高的亲和力并能有效发挥其生物活性功能。淋巴细胞是免疫系统的中央调节细胞，其大部分功能是由一组被称为淋巴因子的小分子多肽介导的。这些小分子多肽的表达和分泌均是由于抗原刺激的细胞激活而诱导。所以淋巴细胞是动物机体内产生免疫调节肽的主要来源。
免疫调节肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生物活性肽。1981年Jolles等人首次发现，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一个氨基酸序列为Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr的六肽，体外实验证明该肽能够增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用。Migliore-Samour等人发现来自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能够刺激绵羊血红细胞对小鼠腹膜巨噬细胞的吞噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵抗，具有抗炎功能。李素萍等人用合成的小鼠骨髓巨噬细胞来与源肽(PGPIPN)饲喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用和红细胞相关的抗炎功能有显著的增强。Bowdis等人在研究来源于牛中性粒细胞的13氨基酸肽indolicidin的免疫功能时发现，多肽indolicidin在巨噬细胞样细胞系中抑制LPS诱导的TNF-α产量。
但是当这些小肽未从蛋白质中酶解分离时，这些蛋白质本身往往是不具备免疫调节活性的。如何从已知氨基酸序列的种类繁多的蛋白质中寻找具有特定功能的生物活性肽，并研究这些多肽的功能是蛋白领域研究的方向之一。
60S ribosomal protein L35蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。目前，现有技术中并没有关于60S ribosomal protein L35蛋白多肽片段相关功能的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供具有氨基酸结构VAKVTGGAASKL的生物活性肽及其制备方法和应用，具体而言，主要涉及生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS和生物活性肽VAKVTGGAASKLS及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面，提供具有氨基酸结构VAKVTGGAASKL的生物活性肽，选自生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS中的一种或几种；
生物活性肽RVAKVTGGAASKL的氨基酸序列为Arg-Val-Ala-Lys-Val-Thr-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Lys-Leu，如SEQ ID NO：1所示；
生物活性肽RVAKVTGGAASKLS的氨基酸序列为Arg-Val-Ala-Lys-Val-Thr-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Lys-Leu-Ser，如SEQ ID NO：2所示；
生物活性肽VAKVTGGAASKLS的氨基酸序列为：Val-Ala-Lys-Val-Thr-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Lys-Leu-Ser，如SEQ ID NO：3所示。
较优的，所述生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS为小鼠脾脏来源淋巴细胞肽。具体均来源于60S ribosomal protein L35蛋白，并且分别为60S ribosomal protein L35蛋白第32～44位、第32～45位和第33～45位的氨基酸残基。60S ribosomal protein L35蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
60S ribosomal protein L35蛋白的氨基酸序列以及对应的核苷酸序列为既有技术，编码60S ribosomal protein L35蛋白第32～44位、第32～45位和第33～45位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS和生物活性肽VAKVTGGAASKLS。
较优的，所述生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS具有抗炎功能和免疫调节功能。
本发明还提供编码所述生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS的多核苷酸。
本发明第二方面，提供了所述生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从细胞中通过分离纯化的方法直接获得，可以直接通过化学合成制备。
通过基因工程的方法人工合成所述生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS是本领域技术人员能够实现的技术方案，例如可以是以DNA重组技术为基础，通过合适的DNA模板来控制多肽的序列合成。
关于从细胞中通过分离纯化的方法直接获得的方式可以为：基于给定的生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS的氨基酸序列，采用生物学技术上常规的酶解、纯化方法从小鼠脾脏来源淋巴细胞获得所述生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS。
本发明第三方面，提供了具有氨基酸结构VAKVTGGAASKL的生物活性肽在制备具有抗炎功能的药物或化妆品中的应用，所述具有氨基酸结构VAKVTGGAASKL的生物活性肽选自生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS中的一种或几种。
具体而言，本发明生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS中的一种或几种可以用于制备具有抗炎的药物。
具体而言，本发明所述生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS中一种或多种的组合用于制备抑制机体因氧化而引起炎症的药物。
本发明第四方面，提供了具有氨基酸结构VAKVTGGAASKL的生物活性肽在制备具有免疫调节功能的食物或药物中的应用，所述具有氨基酸结构VAKVTGGAASKL的生物活性肽选自生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS中的一种或几种。
具体而言，本发明所述生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS中一种或多种的组合在制备促进淋巴细胞增殖的食物或药物中的应用。
本发明第五方面，提供了一种抗炎产品，包括所述生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS中一种或多种的组合或所述生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS的衍生物中的一种或几种的组合；所述的抗炎产品包括抗炎药物或抗炎化妆品。
本发明第六方面，提供了一种具有免疫调节功能的产品，包括所述生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS中一种或多种的组合或所述生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS的衍生物中的一种或几种的组合；所述具有免疫调节功能的产品包括具有免疫调节功能的食品或具有免疫调节功能的药物。
所述生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS的衍生物，是指与所述生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS相同的活性或更优的活性。
所述生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS的衍生物，是指在生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的生物活性肽衍生物。
本发明中生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS的有益效果为：本发明的生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS具有较好的抗炎活性；本发明的生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS可有效抑制因氧化而引起的炎症，具有一定的免疫调节作用，可提高机体免疫力，降低机体发病率，促进淋巴细胞增殖，提高生命的质量，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义
附图说明
图1：质荷比为419.9253的片段的一级质谱图(m/z＝419.9253)；
图2：质荷比为419.9253的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
图3：质荷比为672.9017的片段的一级质谱图(m/z＝672.9017)；
图4：质荷比为672.9017的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
图5：质荷比为396.9028的片段的一级质谱图(m/z＝396.9028)；
图6：质荷比为396.9028的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1活性肽RVAKVTGGAASKL、RVAKVTGGAASKLS和VAKVTGGAASKLS的人工合成
一、生物活性肽的合成
1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。
2. 2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。
3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。
4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
5.称取氨基酸Arg适量和1-羟基-苯并三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
6. 2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA:DCM＝1:1:2,v:v:v)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。
7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
9.称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
10. 1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。
11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
12.按照步骤9-11依次接上氨基酸Arg、Val、Ala、Lys、Val、Thr、Gly、Gly、Ala、Ala、Ser、Lys、Leu。
13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)将生物活性肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)离心沉降四次。
至此，人工合成了生物活性肽RVAKVTGGAASKL。
生物活性肽RVAKVTGGAASKLS和VAKVTGGAASKLS的合成方法参考上面方法，只需在第5步选用特定生物活性肽对应的首个氨基酸，以及在第12步连接特定生物活性肽对应的氨基酸。
二、生物活性肽的确认
1)UPLC分析
UPLC条件如下：
仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱仪
色谱柱规格：BEH C18色谱柱
流速：0.4mL/min
温度：50℃
紫外检测波长：210nm
进样量：2μL
梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈
2)质谱分析
质谱条件如下：
离子方式：ES+
质量范围(m/z)：100、1000
毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0
采样锥(V)：35.0
离子源温度(℃)：115
去溶剂温度(℃)：350
去溶剂气流(L/hr)：700.0
碰撞能量(eV)：4.0
扫描时间(sec)：0.25
内扫描时间(sec)：0.02
根据以上分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对生物活性肽RVAKVTGGAASKL、RVAKVTGGAASKLS和VAKVTGGAASKLS进行色谱分析和质谱分析。生物活性肽RVAKVTGGAASKL一级质谱图如图1所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为419.9253，保留时间是7.77min。生物活性肽RVAKVTGGAASKLS的质量色谱提取图如图3所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图4所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为672.9017，保留时间是7.36min。生物活性肽VAKVTGGAASKLS的质量色谱提取图如图5所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图6所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为396.9028，保留时间是8.57min。
3)结果
由图2可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比419.9253的片段序列为Arg、Val、Ala、Lys、Val、Thr、Gly、Gly、Ala、Ala、Ser、Lys、Leu(RVAKVTGGAASKL)，记为SEQ ID NO：1。该片段与60S ribosomal protein L35蛋白第32～44位的残基序列相对应，60S ribosomal protein L35蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAE41274.1，序列见SEQ ID NO：4。
由图4可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比672.9017的片段序列为Arg、Val、Ala、Lys、Val、Thr、Gly、Gly、Ala、Ala、Ser、Lys、Leu、Ser(RVAKVTGGAASKLS)，记为SEQ ID NO：2。该片段与60S ribosomal protein L35蛋白第32～45位的残基序列相对应，60S ribosomal protein L35蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAE41274.1，序列见SEQ ID NO：4。
由图6可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比396.9028的片段序列为Val、Ala、Lys、Val、Thr、Gly、Gly、Ala、Ala、Ser、Lys、Leu、Ser(VAKVTGGAASKLS)，记为SEQ ID NO：3。该片段与60S ribosomal protein L35蛋白第33～45位的残基序列相对应，60S ribosomal protein L35蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAE41274.1，序列见SEQ ID NO：4。
实施例2生物活性肽的免疫调节活性实验
一、生物活性肽RVAKVTGGAASKL的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)
1.实验材料与仪器：
试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽RVAKVTGGAASKL；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(Corolase PP，购自AB公司)。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱，Heraeus公司；DragonWellscan MK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。
2.实验方法：
无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行原代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×106个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入：100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL生物活性肽样品。另外，设置空白对照组(pH7.2～7.4，3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA)，研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5％CO2 37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。
体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：
式中：A1为空白对照在570nm处下的吸光值；A2为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A3为实验组在570nm处下的吸光值。
3.实验结果及分析：
表1生物活性肽RVAKVTGGAASKL对体外淋巴细胞增殖的影响
| 实验分组 | 刺激指数SI |
| BSA | 1 |
| 生物活性肽 | 1.2423±0.0482** |
注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)
**号标记为与阴性对照比较，有极显著性差异(P＜0.01)。
实验结果见表1。由表1可知，在生物活性肽的质量浓度为500μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明RVAKVTGGAASKL一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.2423，和阴性对照组具有极显著差异(P<0.01)。因此，可以认定活性生物活性肽RVAKVTGGAASKL具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。
二、生物活性肽RVAKVTGGAASKL的对血清中免疫细胞因子作用的实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物ICR小鼠(雄性5周龄)，上海市实验动物中心；D-gal，国药集团化学试剂有限公司；多聚甲醛，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽RVAKVTGGAASKL；BCA蛋白试剂盒，南京凯基生物科技有限公司；ELISA细胞因子快速试剂盒(TNF-α和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：CM-230型摩尔超净水，上海摩勒科学仪器有限公司；密理博MilliporeMILLEX GP0.22μm滤膜，美国密理博公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
2.实验方法：
(1)动物衰老模型造模
将ICR小鼠适应性饲养一周后，分为4组，每组6只。组1为低剂量灌胃组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并以1mg/只·天的剂量灌胃生物活性肽；组2为高剂量灌胃组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并且2mg/只的·天剂量灌胃生物活性肽；组3为空白组，小鼠正常生长；组4为动物模型组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并且灌胃浓度为0.9％的生理盐水；D-gal的注射周期与生物活性肽的灌胃周期均为42天。每3天更换垫料，并保证饲料与蒸馏水的供给。每五天称量一次小鼠的体重，根据小鼠的体重配制D-gal注射液，且D-gal注射液经0.22μm针筒式滤膜过滤，以保证无菌。
(2)获取动物脏器与血清
实验周期完成后，以摘眼球取血法获取小鼠的血液，获得血液后断颈处死小鼠，而后将小鼠的躯体置于低温冰盒上，小鼠血液室温静置1小时后，以3000g离心15min，分离血清。血清保存在-80℃冰箱内待检。处置实验动物过程中的所有操作遵循2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。所摘取的小鼠脾脏直接浸泡于预先配制好的4％多聚甲醛溶液中，以固定其形态。多聚甲醛粉末较为难溶，可以加入微量的碳酸氢钠将pH值调节至碱性，以助溶。多聚甲醛溶液的配制需要在通风橱内完成。
(3)样品检测
根据试剂盒说明书指示，首先绘制标准曲线，将标准品粉末用标准品稀释液配制成1000pg/mL的溶液，再连续稀释为500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.3pg/mL、15.6pg/mL等不同浓度。每个浓度梯度溶液移取100μL于已包被抗体的酶标板中。吸取小鼠血清样品100μL，加入同一块酶标板中(若血清样品不够，可适当稀释后再检测计算时需按比例折算)。盖上酶标板，将其置于37℃环境下孵育90min。反应完毕后，小心甩去酶标板内的液体，并将酶标板置于吸水纸上，小心拍打，除去多余液体。将预热好的生物素抗抗体工作液按每孔100μL依次加入酶标板各孔内，37℃下，反应60min。反应完毕后，利用0.01M的PBS溶液洗涤3次，每次每孔内加入100μL的PBS，浸泡1min后倾去溶液，反复3次。将预热好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入，37℃反应30min。反应完毕后，用0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1min左右。按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30min的TMB显色液，37℃避光反应8-12min。按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色，用酶标仪在450nm测定OD值。通过细胞因子的标准蛋白做已知浓度系列稀释，测出OD值后绘制出标准曲线，根据标准曲线可推算出标本中细胞因子的含量。
3.实验结果及分析：
表2各组小鼠血清中细胞因子的变化情况
| TNF-α(pg/mL) | IL-6(pg/mL) | |
| 组1 | 2.23±0.53** | 61.42±11.24** |
| 组2 | 2.44±0.36** | 73.89±14.82** |
| 组3 | 2.13±0.42** | 57.34±15.32** |
| 组4 | 4.68±0.83 | 152.43±24.29 |
从表2中可以发现本实验中的模型组小鼠体内IL-6与TNF-α含量分别为152.43±24.29pg/mL，4.68±0.83pg/mL，相较于正常组均呈现显著性的增加(P<0.01)，故可以认为由于持续不断地注射致衰老因子，导致动物模型组小鼠在细胞因子层面出现衰老性炎症的症状，而生物活性肽灌胃组的小鼠血清的IL-6与TNF-α含量均得到有效控制。根据细胞因子的实验结果，生物活性肽灌胃组小鼠的血清炎性细胞因子IL-6、TNF-α的分泌水平均低于动物模型组，从氧化损伤角度来看，小鼠因自由基攻击、过氧化产物堆积而造成的氧化损伤可能得到一定程度的抑制；从炎症的角度来看，小鼠因氧化而引起的炎症得到了有效的抑制；从衰老角度来看，小鼠由长期注射D-gal而引起的衰老所导致的一系列老年性疾病有可能得到控制。因此，可以认定RVAKVTGGAASKL可有效抑制小鼠因氧化而引起的炎症，具有一定的免疫调节作用，可用于保健品的研发制作。
三、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)
1.实验材料与仪器：
试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽RVAKVTGGAASKLS；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(CorolasePP，购自AB公司)。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱，Heraeus公司；DragonWellscan MK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。
2.实验方法：
无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行原代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×106个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入：100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL生物活性肽样品。另外，设置空白对照组(pH7.2～7.4，3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA)，研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5％CO2 37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。
体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：
式中：A1为空白对照在570nm处下的吸光值；A2为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A3为实验组在570nm处下的吸光值。
3.实验结果及分析：
表3生物活性肽RVAKVTGGAASKLS对体外淋巴细胞增殖的影响
| 实验分组 | 刺激指数SI |
| BSA | 1 |
| 生物活性肽 | 1.2274±0.0284** |
注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)
**号标记为与阴性对照比较，有极显著性差异(P＜0.01)。
实验结果见表3。由表3可知，在生物活性肽的质量浓度为500μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明RVAKVTGGAASKLS一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.2274，和阴性对照组具有极显著差异(P<0.01)。因此，可以认定活性生物活性肽RVAKVTGGAASKLS具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。
四、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS的对血清中免疫细胞因子作用的实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物ICR小鼠(雄性5周龄)，上海市实验动物中心；D-gal，国药集团化学试剂有限公司；多聚甲醛，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽RVAKVTGGAASKLS；BCA蛋白试剂盒，南京凯基生物科技有限公司；ELISA细胞因子快速试剂盒(TNF-α和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：CM-230型摩尔超净水，上海摩勒科学仪器有限公司；密理博MilliporeMILLEX GP0.22μm滤膜，美国密理博公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
2.实验方法：
(1)动物衰老模型造模
将ICR小鼠适应性饲养一周后，分为4组，每组6只。组1为低剂量灌胃组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并以1mg/只·天的剂量灌胃生物活性肽；组2为高剂量灌胃组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并且2mg/只的·天剂量灌胃生物活性肽；组3为空白组，小鼠正常生长；组4为动物模型组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并且灌胃浓度为0.9％的生理盐水；D-gal的注射周期与生物活性肽的灌胃周期均为42天。每3天更换垫料，并保证饲料与蒸馏水的供给。每五天称量一次小鼠的体重，根据小鼠的体重配制D-gal注射液，且D-gal注射液经0.22μm针筒式滤膜过滤，以保证无菌。
(2)获取动物脏器与血清
实验周期完成后，以摘眼球取血法获取小鼠的血液，获得血液后断颈处死小鼠，而后将小鼠的躯体置于低温冰盒上，小鼠血液室温静置1小时后，以3000g离心15min，分离血清。血清保存在-80℃冰箱内待检。处置实验动物过程中的所有操作遵循2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。所摘取的小鼠脾脏直接浸泡于预先配制好的4％多聚甲醛溶液中，以固定其形态。多聚甲醛粉末较为难溶，可以加入微量的碳酸氢钠将pH值调节至碱性，以助溶。多聚甲醛溶液的配制需要在通风橱内完成。
(3)样品检测
根据试剂盒说明书指示，首先绘制标准曲线，将标准品粉末用标准品稀释液配制成1000pg/mL的溶液，再连续稀释为500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.3pg/mL、15.6pg/mL等不同浓度。每个浓度梯度溶液移取100μL于已包被抗体的酶标板中。吸取小鼠血清样品100μL，加入同一块酶标板中(若血清样品不够，可适当稀释后再检测计算时需按比例折算)。盖上酶标板，将其置于37℃环境下孵育90min。反应完毕后，小心甩去酶标板内的液体，并将酶标板置于吸水纸上，小心拍打，除去多余液体。将预热好的生物素抗抗体工作液按每孔100μL依次加入酶标板各孔内，37℃下，反应60min。反应完毕后，利用0.01M的PBS溶液洗涤3次，每次每孔内加入100μL的PBS，浸泡1min后倾去溶液，反复3次。将预热好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入，37℃反应30min。反应完毕后，用0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1min左右。按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30min的TMB显色液，37℃避光反应8-12min。按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色，用酶标仪在450nm测定OD值。通过细胞因子的标准蛋白做已知浓度系列稀释，测出OD值后绘制出标准曲线，根据标准曲线可推算出标本中细胞因子的含量。
4.实验结果及分析：
表4各组小鼠血清中细胞因子的变化情况
| TNF-α(pg/mL) | IL-6(pg/mL) | |
| 组1 | 2.26±0.42** | 59.45±13.75** |
| 组2 | 2.32±0.21** | 78.64±15.28** |
| 组3 | 2.21±0.36** | 52.85±13.27** |
| 组4 | 4.76±0.73 | 166.48±27.23 |
从表4中可以发现本实验中的模型组小鼠体内IL-6与TNF-α含量分别为166.48±27.23pg/mL，4.76±0.73pg/mL，相较于正常组均呈现显著性的增加(P<0.01)，故可以认为由于持续不断地注射致衰老因子，导致动物模型组小鼠在细胞因子层面出现衰老性炎症的症状，而生物活性肽灌胃组的小鼠血清的IL-6与TNF-α含量均得到有效控制。根据细胞因子的实验结果，生物活性肽灌胃组小鼠的血清炎性细胞因子IL-6、TNF-α的分泌水平均低于动物模型组，从氧化损伤角度来看，小鼠因自由基攻击、过氧化产物堆积而造成的氧化损伤可能得到一定程度的抑制；从炎症的角度来看，小鼠因氧化而引起的炎症得到了有效的抑制；从衰老角度来看，小鼠由长期注射D-gal而引起的衰老所导致的一系列老年性疾病有可能得到控制。因此，可以认定RVAKVTGGAASKLS可有效抑制小鼠因氧化而引起的炎症，具有一定的免疫调节作用，可用于保健品的研发制作。
五、生物活性肽VAKVTGGAASKLS的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)
1.实验材料与仪器：
试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽VAKVTGGAASKLS；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(Corolase PP，购自AB公司)。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱，Heraeus公司；DragonWellscan MK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。
2.实验方法：
无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行原代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×106个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入：100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL生物活性肽样品。另外，设置空白对照组(pH7.2～7.4，3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA)，研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5％CO2 37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。
体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：
式中：A1为空白对照在570nm处下的吸光值；A2为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A3为实验组在570nm处下的吸光值。
3.实验结果及分析：
表5生物活性肽VAKVTGGAASKLS对体外淋巴细胞增殖的影响
| 实验分组 | 刺激指数SI |
| BSA | 1 |
| 生物活性肽 | 1.0457±0.0246* |
注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)
**号标记为与阴性对照比较，有极显著性差异(P＜0.01)。
实验结果见表5。由表5可知，在生物活性肽的质量浓度为500μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明VAKVTGGAASKLS一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.0457，和阴性对照组具有显著差异(P<0.05)。因此，可以认定活性生物活性肽VAKVTGGAASKLS具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。
六、生物活性肽VAKVTGGAASKLS的对血清中免疫细胞因子作用的实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物ICR小鼠(雄性5周龄)，上海市实验动物中心；D-gal，国药集团化学试剂有限公司；多聚甲醛，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽VAKVTGGAASKLS；BCA蛋白试剂盒，南京凯基生物科技有限公司；ELISA细胞因子快速试剂盒(TNF-α和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：CM-230型摩尔超净水，上海摩勒科学仪器有限公司；密理博MilliporeMILLEX GP0.22μm滤膜，美国密理博公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
2.实验方法：
(1)动物衰老模型造模
将ICR小鼠适应性饲养一周后，分为4组，每组6只。组1为低剂量灌胃组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并以1mg/只·天的剂量灌胃生物活性肽；组2为高剂量灌胃组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并且2mg/只的·天剂量灌胃生物活性肽；组3为空白组，小鼠正常生长；组4为动物模型组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并且灌胃浓度为0.9％的生理盐水；D-gal的注射周期与生物活性肽的灌胃周期均为42天。每3天更换垫料，并保证饲料与蒸馏水的供给。每五天称量一次小鼠的体重，根据小鼠的体重配制D-gal注射液，且D-gal注射液经0.22μm针筒式滤膜过滤，以保证无菌。
(2)获取动物脏器与血清
实验周期完成后，以摘眼球取血法获取小鼠的血液，获得血液后断颈处死小鼠，而后将小鼠的躯体置于低温冰盒上，小鼠血液室温静置1小时后，以3000g离心15min，分离血清。血清保存在-80℃冰箱内待检。处置实验动物过程中的所有操作遵循2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。所摘取的小鼠脾脏直接浸泡于预先配制好的4％多聚甲醛溶液中，以固定其形态。多聚甲醛粉末较为难溶，可以加入微量的碳酸氢钠将pH值调节至碱性，以助溶。多聚甲醛溶液的配制需要在通风橱内完成。
(3)样品检测
根据试剂盒说明书指示，首先绘制标准曲线，将标准品粉末用标准品稀释液配制成1000pg/mL的溶液，再连续稀释为500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.3pg/mL、15.6pg/mL等不同浓度。每个浓度梯度溶液移取100μL于已包被抗体的酶标板中。吸取小鼠血清样品100μL，加入同一块酶标板中(若血清样品不够，可适当稀释后再检测计算时需按比例折算)。盖上酶标板，将其置于37℃环境下孵育90min。反应完毕后，小心甩去酶标板内的液体，并将酶标板置于吸水纸上，小心拍打，除去多余液体。将预热好的生物素抗抗体工作液按每孔100μL依次加入酶标板各孔内，37℃下，反应60min。反应完毕后，利用0.01M的PBS溶液洗涤3次，每次每孔内加入100μL的PBS，浸泡1min后倾去溶液，反复3次。将预热好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入，37℃反应30min。反应完毕后，用0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1min左右。按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30min的TMB显色液，37℃避光反应8-12min。按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色，用酶标仪在450nm测定OD值。通过细胞因子的标准蛋白做已知浓度系列稀释，测出OD值后绘制出标准曲线，根据标准曲线可推算出标本中细胞因子的含量。
3.实验结果及分析：
表6各组小鼠血清中细胞因子的变化情况
| . | TNF-α(pg/mL) | IL-6(pg/mL) |
| 组1 | 2.44±0.32** | 58.88±14.84** |
| 组2 | 2.54±0.39** | 62.74±12.69** |
| 组3 | 2.36±0.48** | 54.38±13.58** |
| 组4 | 4.89±0.43 | 121.42±21.55 |
从表6中可以发现本实验中的模型组小鼠体内IL-6与TNF-α含量分别为121.42±21.55pg/mL，4.89±0.43pg/mL，相较于正常组均呈现显著性的增加(P<0.01)，故可以认为由于持续不断地注射致衰老因子，导致动物模型组小鼠在细胞因子层面出现衰老性炎症的症状，而生物活性肽灌胃组的小鼠血清的IL-6与TNF-α含量均得到有效控制。根据细胞因子的实验结果，生物活性肽灌胃组小鼠的血清炎性细胞因子IL-6、TNF-α的分泌水平均低于动物模型组，从氧化损伤角度来看，小鼠因自由基攻击、过氧化产物堆积而造成的氧化损伤可能得到一定程度的抑制；从炎症的角度来看，小鼠因氧化而引起的炎症得到了有效的抑制；从衰老角度来看，小鼠由长期注射D-gal而引起的衰老所导致的一系列老年性疾病有可能得到控制。因此，可以认定VAKVTGGAASKLS可有效抑制小鼠因氧化而引起的炎症，具有一定的免疫调节作用，可用于保健品的研发制作。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江辉肽生命健康科技有限公司
<120> 具有氨基酸结构VAKVTGGAASKL的生物活性肽及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Val Ala Lys Val Thr Gly Gly Ala Ala Ser Lys Leu
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Val Ala Lys Val Thr Gly Gly Ala Ala Ser Lys Leu Ser
1 5 10
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Val Ala Lys Val Thr Gly Gly Ala Ala Ser Lys Leu Ser
1 5 10
<210> 4
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Lys Ile Lys Ala Arg Asp Leu Arg Gly Lys Lys Lys Glu Glu
1 5 10 15
Leu Leu Lys Gln Leu Asp Asp Leu Lys Val Glu Leu Ser Gln Leu Arg
20 25 30
Val Ala Lys Val Thr Gly Gly Ala Ala Ser Lys Leu Ser Lys Ile Arg
35 40 45
Val Val Arg Lys Ser Ile Ala Arg Val Leu Thr Val Ile Asn Gln Thr
50 55 60
Gln Lys Glu Asn Leu Arg Lys Phe Tyr Lys Gly Lys Lys Tyr Lys Pro
65 70 75 80
Leu Asp Leu Arg Pro Lys Lys Thr Arg Ala Met Arg Arg Arg Leu Thr
85 90 95
Lys His Glu Glu Lys Leu Lys Thr Lys Lys Gln Gln Arg Lys Glu Arg
100 105 110
Leu Tyr Pro Leu Arg Lys Tyr Ala Val Lys Ala
115 120
Claims (4)
1.具有氨基酸结构VAKVTGGAASKL的生物活性肽，其特征在于，选自生物活性肽RVAKVTGGAASKL、生物活性肽RVAKVTGGAASKLS或生物活性肽VAKVTGGAASKLS中的一种或几种；
生物活性肽RVAKVTGGAASKL的氨基酸序列为Arg-Val-Ala-Lys-Val-Thr-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Lys-Leu；
生物活性肽RVAKVTGGAASKLS的氨基酸序列为Arg-Val-Ala-Lys-Val-Thr-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Lys-Leu-Ser；
生物活性肽VAKVTGGAASKLS的氨基酸序列为：Val-Ala-Lys-Val-Thr-Gly-Gly-Ala-Ala-Ser-Lys-Leu-Ser。
2.编码权利要求1所述具有氨基酸结构VAKVTGGAASKL的生物活性肽的多核苷酸。
3.权利要求1所述具有氨基酸结构VAKVTGGAASKL的生物活性肽的制备方法，其特征在于，直接通过化学合成制备。
4.权利要求1所述具有氨基酸结构VAKVTGGAASKL的生物活性肽在制备降低衰老状态下血清中免疫细胞因子IL-6与TNF-α的分泌水平的药物中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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