CN112480236B - 一种生物活性肽lecvepncrskr及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种生物活性肽LECVEPNCRSKR及其制备方法和应用，生物活性肽LECVEPNCRSKR的氨基酸序列为Leu‑Glu‑Cys‑Val‑Glu‑Pro‑Asn‑Cys‑Arg‑Ser‑Lys‑Arg。经过体外免疫功能调节实验，验证了生物活性肽LECVEPNCRSKR具有较好的免疫调节功能。本发明的生物活性肽LECVEPNCRSKR在一定浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力，可有效抑制机体因氧化而引起的炎症，抑制炎症因子的过表达，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，提高生命的质量，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白领域，尤其是涉及一种生物活性肽LECVEPNCRSKR及其制备方法和应用。
背景技术
目前对于生物活性肽的研究多集中于食物衍生多肽，对非食物衍生多肽研究和报道较少。且已经有研究结果证实，与食物衍生的生物活性肽相比，非食物衍生的生物活性肽具有更高的亲和力并能有效发挥其生物活性功能。淋巴细胞是免疫系统的中央调节细胞，其大部分功能是由一组被称为淋巴因子的小分子多肽介导的。这些小分子多肽的表达和分泌均是由于抗原刺激的细胞激活而诱导。所以淋巴细胞是动物机体内产生免疫调节肽的主要来源。
免疫调节肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生物活性多肽。1981年Jolles等人首次发现，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一个氨基酸序列为Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr的六肽，体外实验证明该肽能够增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用。Migliore-Samour等人发现来自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能够刺激绵羊血红细胞对小鼠腹膜巨噬细胞的吞噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵抗，具有抗炎功能。李素萍等人用合成的小鼠骨髓巨噬细胞来与源肽（PGPIPN）饲喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用和红细胞相关的抗炎功能有显著的增强。Bowdis等人在研究来源于牛中性粒细胞的13氨基酸肽indolicidin的免疫功能时发现，多肽indolicidin在巨噬细胞样细胞系中抑制LPS诱导的TNF-α产量。
免疫调节肽一般是指具有免疫调节活性的分子量相对较小的小肽。现在公开的免疫调节肽一般是从蛋白质中酶解分离得到或化学方法合成得到的具有特定免疫调节活性的小肽。但是当这些小肽未从蛋白质中酶解分离时，这些蛋白质本身往往是不具备免疫调节活性的。如何从已知氨基酸序列的种类繁多的蛋白质中寻找具有特定功能的生物活性肽，并研究这些多肽的功能是蛋白领域研究的方向之一。
60S ribosomal protein L36a蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。目前，现有技术中并没有关于60S ribosomal protein L36a蛋白多肽片段相关功能的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物活性肽LECVEPNCRSKR及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面，提供一种生物活性肽LECVEPNCRSKR，其氨基酸序列为Leu-Glu-Cys-Val-Glu-Pro-Asn-Cys-Arg-Ser-Lys-Arg，如SEQ ID NO：1所示。
较优的，所述生物活性肽为小鼠脾脏来源淋巴细胞肽。具体来源于60S ribosomalprotein L36a蛋白，并且为60S ribosomal protein L36a蛋白第70～81位的氨基酸残基。60S ribosomal protein L36a蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
60S ribosomal protein L36a蛋白的氨基酸序列以及对应的核苷酸序列为既有技术，编码60S ribosomal protein L36a蛋白第70～81位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性肽LECVEPNCRSKR。
较优的，所述生物活性肽具有抗炎功能和免疫调节功能。
本发明还提供编码所述生物活性肽LECVEPNCRSKR的多核苷酸。
本发明第二方面，提供了所述生物活性肽LECVEPNCRSKR的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从细胞中通过分离纯化的方法直接获得，可以直接通过化学合成制备。
通过基因工程的方法人工合成所述生物活性肽LECVEPNCRSKR是本领域技术人员能够实现的技术方案，例如可以是以DNA重组技术为基础，通过合适的DNA模板来控制多肽的序列合成。
关于从细胞中通过分离纯化的方法直接获得的方式可以为：基于给定的生物活性肽LECVEPNCRSKR的氨基酸序列，采用生物学技术上常规的酶解、纯化方法从小鼠脾脏来源淋巴细胞获得所述生物活性肽LECVEPNCRSKR。
本发明第三方面，提供了所述生物活性肽LECVEPNCRSKR在制备具有抗炎功能的药物或化妆品中的应用。
进一步地，所述生物活性肽LECVEPNCRSKR在制备抑制因氧化而引起的炎症的药物中的应用。
本发明第四方面，提供了所述生物活性肽LECVEPNCRSKR在制备具有免疫调节功能的食物或药物中的应用。
进一步地，所述生物活性肽LECVEPNCRSKR在制备促巨噬细胞一氧化氮诱生量的食物或药物中的应用。
本发明第五方面，提供了一种抗炎产品，包括所述生物活性肽LECVEPNCRSKR或所述生物活性肽LECVEPNCRSKR的衍生物；所述的抗炎产品包括抗炎食品、抗炎保健品、抗炎药物或抗炎化妆品；
本发明第六方面，提供了一种具有免疫调节功能的产品，包括所述生物活性肽LECVEPNCRSKR或所述生物活性肽LECVEPNCRSKR的衍生物；所述具有免疫调节功能的产品包括具有免疫调节功能的食品或具有免疫调节功能的药物。
所述生物活性肽LECVEPNCRSKR的衍生物是指具有与所述生物活性肽LECVEPNCRSKR相同的活性或更优的活性。
所述生物活性肽LECVEPNCRSKR的衍生物，是指在生物活性肽LECVEPNCRSKR的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的生物活性肽衍生物。
本发明生物活性肽LECVEPNCRSKR的有益效果为：本发明的生物活性肽LECVEPNCRSKR具有较好的抗炎活性；本发明的生物活性肽LECVEPNCRSKR在一定浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力，可有效抑制机体因氧化而引起的炎症，抑制炎症因子的过表达，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，提高生命的质量，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。
附图说明
图1：质荷比为387.6915的片段的一级质谱图（m/z= 387.6915）；
图2：质荷比为387.6915的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING ：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989 and Third edition，2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，1987 and periodic updates ；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego ；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998 ；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin (P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999 ； 和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1 活性肽LECVEPNCRSKR的人工合成
一、生物活性肽的合成
人工合成生物活性肽LECVEPNCRSKR。
二、生物活性肽的确认
1）UPLC分析
UPLC条件如下：
仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱仪
色谱柱规格：BEH C18 色谱柱
流速：0.4mL/min
温度：50℃
紫外检测波长：210nm
进样量：2μL
梯度条件：A液：含有0.1%甲酸（v/v）的水，B液：含有0.1%甲酸（v/v）的乙腈
Time(min) %A %B
0 95.0 5.0
1.50 80.0 20.0
3.50 60.0 40.0
5.00 40.0 60.0
7.00 15.0 85.0
8.00 0.0 100.0
11.00 0.0 100.0
11.50 95.0 5.0
13.00 95.0 5.0
2）质谱分析
质谱条件如下：
离子方式：ES+
质量范围（m/z）：100、1000
毛细管电压（Capillary）（kV）：3.0
采样锥（V）：35.0
离子源温度（℃）：115
去溶剂温度（℃）：350
去溶剂气流（L/hr）：700.0
碰撞能量（eV）：4.0
扫描时间（sec）：0.25
内扫描时间（sec）：0.02
根据以上分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对生物活性肽LECVEPNCRSKR进行色谱分析和质谱分析。生物活性肽LECVEPNCRSKR一级质谱图如图1所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为387.6915，保留时间是7.15 min。
3）结果
由图2可知，根据az、by断裂的情况，经过 Mascot 软件分析计算，得到质荷比387.6915的片段序列为Leu、Glu、Cys、Val、Glu、Pro、Asn、Cys、Arg、Ser、Lys、Arg（LECVEPNCRSKR），记为SEQ ID NO：1。该片段与60S ribosomal protein L36a蛋白第70～81位的残基序列相对应，60S ribosomal protein L36a蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAB27075.1，序列见SEQ ID NO：2。
实施例2 生物活性肽的免疫活性实验
一、生物活性肽LECVEPNCRSKR的促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定（Griess法）
1. 实验试剂及仪器：
试剂：实验动物 balb/c小鼠（雄性6-8周龄）脾脏淋巴细胞来源生物活性肽LECVEPNCRSKR；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱 上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司； Hera cell 150 CO2 培养箱 Heraeus公司；DragonWellscan MK3酶标仪 Labsystems公司。
2. 试验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液（10% FBS）200μl/孔，炎症组在24h时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48h后，收集培养液上清50μl/孔，在培养液上清中依次添加Griess试剂1和Griess试剂2各50μl/孔，室温反应10分钟后，在540nm波长下测定吸光度值（OD540）。
3. 实验结果及分析：
表1 生物活性肽LECVEPNCRSKR促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定
| 实验分组 | 正常组 | 炎症组 |
| 细胞空白 | 0.0574±0.0483 | 0.3241±0.0173 |
| 生物活性肽(1mg/ml) | 0.1473±0.0174** | 0.583±0.0149** |
| 生物活性肽(0.5mg/ml) | 0.1384±0.0201** | 0.540±0.0259** |
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P ＜0.05)；
**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P ＜0.01)
实验结果见表1，由表1可知，在实验组中添加生物活性肽LECVEPNCRSKR，浓度分别为1 mg/mL和0.5mg/mL，对于正常情况下和LPS造炎症情况下的巨噬细胞的一氧化氮诱生量均有促进作用，与细胞空白组相比，具有极显著性差异（P<0.01）。说明生物活性肽LECVEPNCRSKR在一定浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力。
二、生物活性肽LECVEPNCRSKR的对血清中免疫细胞因子作用的实验
1. 实验试剂及仪器：
试剂：实验动物 ICR小鼠（雄性5周龄），上海市实验动物中心；D-gal，国药集团化学试剂有限公司；多聚甲醛，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽LECVEPNCRSKR；BCA蛋白试剂盒，南京凯基生物科技有限公司；ELISA细胞因子快速试剂盒（TNF-α和IL-6），武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：CM-230型摩尔超净水，上海摩勒科学仪器有限公司；密理博MilliporeMILLEX GP0.22μm滤膜，美国密理博公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
2. 实验方法：
（1）动物衰老模型造模
将ICR小鼠适应性饲养一周后，分为4组，每组6只。组1为低剂量灌胃组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并以1mg/只•天的剂量灌胃生物活性肽LECVEPNCRSKR；组2为高剂量灌胃组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并且3mg/只的•天剂量灌胃生物活性肽LECVEPNCRSKR；组3为空白组，小鼠正常生长；组4为动物模型组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并且灌胃浓度为0.9%的生理盐水；D-gal的注射周期与生物活性肽的灌胃周期均为42天。每3天更换垫料，并保证饲料与蒸馏水的供给。每五天称量一次小鼠的体重，根据小鼠的体重配制D-gal注射液，且D-gal注射液经0.22μm针筒式滤膜过滤，以保证无菌。
（2）获取动物脏器与血清
实验周期完成后，以摘眼球取血法获取小鼠的血液，获得血液后断颈处死小鼠，而后将小鼠的躯体置于低温冰盒上，小鼠血液室温静置1小时后，以3000g离心15min，分离血清。血清保存在-80℃冰箱内待检。处置实验动物过程中的所有操作遵循2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。所摘取的小鼠脾脏直接浸泡于预先配制好的4%多聚甲醛溶液中，以固定其形态。多聚甲醛粉末较为难溶，可以加入微量的碳酸氢钠将pH值调节至碱性，以助溶。多聚甲醛溶液的配制需要在通风橱内完成。
（3）样品检测
根据试剂盒说明书指示，首先绘制标准曲线，将标准品粉末用标准品稀释液配制成1000pg/mL的溶液，再连续稀释为500 pg/mL、 250 pg/mL、 125 pg/mL、 62.5 pg/mL、31.3pg/mL、 15.6 pg/mL等不同浓度。每个浓度梯度溶液移取100μL于已包被抗体的酶标板中。吸取小鼠血清样品100 μL，加入同一块酶标板中（若血清样品不够，可适当稀释后再检测计算时需按比例折算）。盖上酶标板，将其置于37℃环境下孵育90min。反应完毕后，小心甩去酶标板内的液体，并将酶标板置于吸水纸上，小心拍打，除去多余液体。将预热好的生物素抗抗体工作液按每孔100μL依次加入酶标板各孔内，37℃下，反应60min。反应完毕后，利用 0.01M的PBS 溶液洗涤 3 次，每次每孔内加入100μL 的PBS，浸泡1min后倾去溶液，反复3次。将预热好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入，37℃反应30min。反应完毕后，用0.01MPBS洗涤5次，每次浸泡1min左右。按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30min的TMB显色液，37℃避光反应8-12min。按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色，用酶标仪在450nm测定OD值。通过细胞因子的标准蛋白做已知浓度系列稀释，测出OD值后绘制出标准曲线，根据标准曲线可推算出标本中细胞因子的含量。
3. 实验结果及分析：
表6各组小鼠血清中细胞因子的变化情况
| TNF-a (pg/mL) | IL-6 (pg/mL) | |
| 组1 | 2.71±0.24** | 95.28±10.27** |
| 组2 | 2.38±0.42** | 83.29±19.48** |
| 组3 | 2.30±0.21** | 67.34±9.73** |
| 组4 | 5.32±0.44 | 179.23±21.41 |
从表6中可以发现本实验中的模型组小鼠体内IL-6与TNF-α含量分别为179.23±21.41pg/mL，5.32±0.44 pg/mL，相较于正常组均呈现极显著性的增加(P<0.01)，故可以认为由于持续不断地注射致衰老因子，导致动物模型组小鼠在细胞因子层面出现衰老性炎症的症状，而生物活性肽灌胃组的小鼠血清的IL-6与TNF-α含量均得到有效控制。根据细胞因子的实验结果，生物活性肽灌胃组小鼠的血清炎性细胞因子IL-6、TNF-α的分泌水平均低于动物模型组，从氧化损伤角度来看，小鼠因自由基攻击、过氧化产物堆积而造成的氧化损伤可能得到一定程度的抑制；从炎症的角度来看，小鼠因氧化而引起的炎症得到了有效的抑制；从衰老角度来看，小鼠由长期注射D-gal而引起的衰老所导致的一系列老年性疾病有可能得到控制。因此，可以认定LECVEPNCRSKR可有效抑制小鼠因氧化而引起的炎症，具有一定的免疫调节作用，可用于保健品的研发制作。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 熊猫乳品集团股份有限公司,浙江辉肽生命健康科技有限公司
<120> 一种生物活性肽LECVEPNCRSKR及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Glu Cys Val Glu Pro Asn Cys Arg Ser Lys Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Val Asn Val Pro Lys Thr Arg Arg Thr Phe Cys Lys Lys Cys Gly
1 5 10 15
Lys His Gln Pro His Lys Val Thr Gln Tyr Lys Lys Gly Lys Asp Ser
20 25 30
Leu Tyr Ala Gln Gly Lys Arg Arg Tyr Asp Arg Lys Gln Ser Gly Tyr
35 40 45
Gly Gly Gln Thr Lys Pro Ile Phe Arg Lys Lys Ala Lys Thr Thr Lys
50 55 60
Lys Ile Val Leu Arg Leu Glu Cys Val Glu Pro Asn Cys Arg Ser Lys
65 70 75 80
Arg Met Leu Ala Ile Lys Arg Cys Lys His Phe Glu Leu Gly Gly Asp
85 90 95
Lys Lys Arg Lys Gly Gln Val Ile Gln Phe
100 105
Claims (3)
1.一种生物活性肽LECVEPNCRSKR，其特征在于，其氨基酸序列为Leu-Glu-Cys-Val-Glu-Pro-Asn-Cys-Arg-Ser-Lys-Arg。
2.编码权利要求1所述生物活性肽LECVEPNCRSKR的多核苷酸。
3.如权利要求1所述生物活性肽LECVEPNCRSKR的制备方法，其特征在于，直接通过化学合成制备。
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