CN112661830B

CN112661830B - 具有氨基酸结构airndeelnkllgr的生物活性肽及其制备方法和应用

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Publication number: CN112661830B
Application number: CN202110083631.4A
Authority: CN
Inventors: 张少辉; 张伯宇; 占文静
Original assignee: Zhejiang Huitai Life Health Technology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Huitai Life Health Technology Co ltd
Priority date: 2021-01-21
Filing date: 2021-01-21
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2041-01-21
Also published as: CN112661830A

Abstract

本发明涉及蛋白领域，具体涉及具有氨基酸结构AIRNDEELNKLLGR的生物活性肽及其制备方法和应用。生物活性肽选自以下8种生物活性肽中的一种或几种：AIRNDEELNKLLGRVTI、AIRNDEELNKLLGRVTIAQ、LQLAIRNDEELNKLLGRVTI、LAIRNDEELNKLLGRVTIA、AIRNDEELNKLLGR、AIRNDEELNKLLGRV、AIRNDEELNKLLGRVTIA和LAIRNDEELNKLLGRVTI。经过体外免疫调节功能实验，发现这八种生物活性肽具有很好的免疫调节功能。本发明的八种生物活性肽具有显著促进淋巴细胞增殖的能力，发挥机体免疫功能，提高机体免疫力，促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加，降低机体发病率，提高生命的质量，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。

Description

具有氨基酸结构AIRNDEELNKLLGR的生物活性肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及蛋白领域，尤其是具有氨基酸结构AIRNDEELNKLLGR的生物活性肽及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，生物活性肽已经成为人们耳熟能详的一个词语。因其具有很多潜在的生物功能，所以引起人们越来越多的关注，成为科学研究的热点之一。目前很多生物活性肽的有益效果也已经得到了很好的证明，如抗癌、降血压、抗菌、降胆固醇、抗糖尿病等等特性。当前最权威的生物活性肽数据库BIOPEP-UMW中已报告了3000多个不同的生物活性肽。

免疫调节肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生物活性肽。免疫调节肽一般是指具有免疫调节活性的分子量相对较小的小肽。1981年Jolles等人首次发现，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一个氨基酸序列为Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr的六肽，体外实验证明该肽能够增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用。Migliore-Samour等人发现来自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能够刺激绵羊血红细胞对小鼠腹膜巨噬细胞的吞噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵抗，具有抗炎功能。李素萍等人用合成的小鼠骨髓巨噬细胞来与源肽(PGPIPN)饲喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用和红细胞相关的抗炎功能有显著的增强。Bowdis等人在研究来源于牛中性粒细胞的13氨基酸肽indolicidin的免疫功能时发现，多肽indolicidin在巨噬细胞样细胞系中抑制LPS诱导的TNF-α产量。

现在公开的免疫调节肽一般是从蛋白质中酶解分离得到或化学方法合成得到的具有特定免疫调节活性的小肽。但是当这些小肽未从蛋白质中酶解分离时，这些蛋白质本身往往是不具备免疫调节活性的。如何从已知氨基酸序列的种类繁多的蛋白质中寻找具有特定功能的生物活性肽，并研究这些多肽的功能是蛋白领域研究的方向之一。

Histone H2A type 3和Histone H2A type 1-E蛋白氨基酸序列分别如SEQ IDNO：9和SEQ ID NO：10所示。目前，现有技术中并没有关于Histone H2A type 3和HistoneH2A type 1-E蛋白多肽片段相关功能的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供具有氨基酸结构AIRNDEELNKLLGR的生物活性肽及其制备方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面，提供具有氨基酸结构AIRNDEELNKLLGR的生物活性肽，所述生物活性肽选自以下8种生物活性肽中的一种或几种：

AIRNDEELNKLLGRVTI、AIRNDEELNKLLGRVTIAQ、

LQLAIRNDEELNKLLGRVTI、LAIRNDEELNKLLGRVTIA、

AIRNDEELNKLLGR、AIRNDEELNKLLGRV、AIRNDEELNKLLGRVTIA和LAIRNDEELNKLLGRVTI，其氨基酸序列分别为

Ala-Ile-Arg-Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys-Leu-Leu-Gly-Arg-Val-Thr-Ile，

Ala-Ile-Arg-Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys-Leu-Leu-Gly-Arg-Val-Thr-Ile-Ala-Gln，

His-Leu-Gln-Leu-Ala-Ile-Arg-Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys-Leu-Leu-Gly-Arg-Val-Thr-Ile，

Leu-Ala-Ile-Arg-Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys-Leu-Leu-Gly-Arg-Val-Thr-Ile-Ala，

Ala-Ile-Arg-Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys-Leu-Leu-Gly-Arg，

Ala-Ile-Arg-Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys-Leu-Leu-Gly-Arg-Val，

Ala-Ile-Arg-Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys-Leu-Leu-Gly-Arg-Val-Thr-Ile-Ala，

Leu-Ala-Ile-Arg-Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys-Leu-Leu-Gly-Arg-Val-Thr-Ile。

分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：8所示。

较优的，所述八种生物活性肽为小鼠脾脏来源淋巴细胞肽。

具体生物活性肽AIRNDEELNKLLGR、AIRNDEELNKLLGRVTIA和LAIRNDEELNKLLGRVTI分别来源于Histone H2A type 1-E蛋白第87～100位、第87～104位和第86～103位，

生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTI、AIRNDEELNKLLGRVTIAQ、HLQLAIRNDEELNKLLGRVTI、LAIRNDEELNKLLGRVTIA和AIRNDEELNKLLGRV分别来源于HistoneH2A type 3蛋白第87～103位、第87～105位、第83～103位、第86～104位和第87～101位。

其中，Histone H2A type 3和Histone H2A type 1-E蛋白氨基酸序列分别如SEQID NO：9和SEQ ID NO：10所示。

Histone H2A type 3和Histone H2A type 1-E蛋白的氨基酸序列以及对应的核苷酸序列为既有技术，编码Histone H2A type 1-E蛋白第87～100位、第87～104位和第86～103位、Histone H2A type 3蛋白第87～103位、第87～105位、第83～103位、第86～104位和第87～101位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的八种生物活性肽。

较优的，所述八种生物活性肽具有抗炎功能和免疫调节功能。

本发明还提供编码所述具有氨基酸结构AIRNDEELNKLLGR的生物活性肽的多核苷酸。

本发明第二方面，提供了所述八种生物活性肽的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从细胞中通过分离纯化的方法直接获得，可以直接通过化学合成制备。

以生物活性肽AIRNDEELNKLLGR为例来说明其制备方法：

通过基因工程的方法人工合成所述生物活性肽AIRNDEELNKLLGR是本领域技术人员能够实现的技术方案，例如可以是以DNA重组技术为基础，通过合适的DNA模板来控制多肽的序列合成。

关于从细胞中通过分离纯化的方法直接获得的方式可以为：基于给定的生物活性肽AIRNDEELNKLLGR的氨基酸序列，采用生物学技术上常规的酶解、纯化方法从小鼠脾脏来源淋巴细胞获得所述生物活性肽AIRNDEELNKLLGR。

同理，对于其他七种生物活性肽的制备方法均可以通过基因工程的方法人工合成，可以从细胞中通过分离纯化的方法直接获得，可以直接通过化学合成制备。

本发明第三方面，提供了八种所述生物活性肽中的一种或几种的组合在制备具有抗炎功能的药物或化妆品中的应用。

具体而言，本发明的八种生物活性肽中的一种或几种的组合可以用于制备具有抗炎的药物。

本发明第四方面，提供了所述生物活性肽中的一种或几种的组合在制备具有免疫调节功能的食物或药物中的应用。

进一步地，所述生物活性肽中的一种或几种的组合在制备促巨噬细胞一氧化氮诱生量的食物或药物中的应用。

进一步地，所述生物活性肽中的一种或几种的组合在制备促体外淋巴细胞增殖能力的食物或药物中的应用。

本发明第五方面，提供了一种抗炎产品，包括上述八种所述生物活性肽中的一种或几种的组合或所述生物活性肽的衍生物中的一种或几种的组合；所述的抗炎产品包括抗炎药物或抗炎化妆品。

本发明第六方面，提供了一种具有免疫调节功能的产品，包括所述生物活性肽中的一种或几种的组合或所述生物活性肽的衍生物中的一种或几种的组合；所述具有免疫调节功能的产品包括具有免疫调节功能的食品或具有免疫调节功能的药物。

所述生物活性肽的衍生物是指具有与具体所述生物活性肽相同的活性或更优的活性。

所述生物活性肽的衍生物，是指在八种生物活性肽的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的生物活性肽衍生物。

本发明具有氨基酸结构AIRNDEELNKLLGR的生物活性肽的有益效果为：本发明具有氨基酸结构AIRNDEELNKLLGR的生物活性肽具有较好的抗炎活性；本发明的具有氨基酸结构AIRNDEELNKLLGR的生物活性肽具有显著促进淋巴细胞增殖的能力，发挥机体免疫功能，提高机体免疫力，促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加，降低机体发病率，提高生命的质量，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。

附图说明

图1：质荷比为652.0402的片段的一级质谱图(m/z＝652.0402)；

图2：质荷比为652.0402的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；

图3：质荷比为718.4091的片段的一级质谱图(m/z＝718.4091)；

图4：质荷比为718.4091的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；

图5：质荷比为612.1072的片段的一级质谱图(m/z＝612.1072)；

图6：质荷比为612.1072的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；

图7：质荷比为535.3123的片段的一级质谱图(m/z＝535.3123)；

图8：质荷比为535.3123的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；

图9：质荷比为547.6418的片段的一级质谱图(m/z＝547.6418)；

图10：质荷比为547.6418的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；

图11：质荷比为435.7483的片段的一级质谱图(m/z＝435.7483)；

图12：质荷比为435.7483的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；

图13：质荷比为675.7224的片段的一级质谱图(m/z＝675.7224)；

图14：质荷比为675.7224的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；

图15：质荷比为689.7374的片段的一级质谱图(m/z＝689.7374)；

图16：质荷比为689.7374的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况。

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1八种生物活性肽的人工合成

一、生物活性肽的合成

1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。

2. 2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。

3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。

4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。

5.称取氨基酸Ala适量和1-羟基-苯并三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。

6. 2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA:DCM＝1:1:2,v:v:v)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。

7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。

8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。

9.称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。

10. 1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。

11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。

12.按照步骤9-11依次接上氨基酸Ala、Ile、Arg、Asn、Asp、Glu、Glu、Leu、Asn、Lys、Leu、Leu、Gly和Arg。

13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)将生物活性肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)离心沉降四次。

至此，人工合成了生物活性肽AIRNDEELNKLLGR。

其它七种生物活性肽的合成方法参考上面方法，只需在第5步选用特定生物活性肽对应的首个氨基酸，以及在第12步连接特定生物活性肽对应的氨基酸。。

二、生物活性肽的确认

1)UPLC分析

UPLC条件如下：

仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱仪

色谱柱规格：BEH C18色谱柱

流速：0.4mL/min

温度：50℃

紫外检测波长：210nm

进样量：2μL

梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈

2)质谱分析

质谱条件如下：

离子方式：ES+

质量范围(m/z)：100、1000

毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0

采样锥(V)：35.0

离子源温度(℃)：115

去溶剂温度(℃)：350

去溶剂气流(L/hr)：700.0

碰撞能量(eV)：4.0

扫描时间(sec)：0.25

内扫描时间(sec)：0.02

根据以上分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对八种生物活性肽进行色谱分析和质谱分析。

生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTI的质量色谱提取图如图1所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为652.0402，保留时间是48.17min。

生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIAQ的质量色谱提取图如图3所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图4所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为718.4091，保留时间是46.69min。

生物活性肽HLQLAIRNDEELNKLLGRVTI的质量色谱提取图如图5所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图6所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为612.1072，保留时间是50.87min。

生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTIA的质量色谱提取图如图7所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图8所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为535.3123，保留时间是49.79min。

生物活性肽AIRNDEELNKLLGR的质量色谱提取图如图9所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图10所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为547.6418，保留时间是32.88min。

生物活性肽AIRNDEELNKLLGRV的质量色谱提取图如图11所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图12所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为435.7483，保留时间是41.51min。

生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIA的质量色谱提取图如图13所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图14所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为675.7224，保留时间是47.81min。

生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTI的质量色谱提取图如图15所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图16所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为689.7374，保留时间是50.58min。

3)结果

由图2可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比652.0402的片段序列为Ala、Ile、Arg、Asn、Asp、Glu、Glu、Leu、Asn、Lys、Leu、Leu、Gly、Arg、Val、Thr、Ile(AIRNDEELNKLLGRVTI)，记为SEQ ID NO：1。该片段与Histone H2A type 3蛋白第87～103位残基序列相对应，Histone H2A type 3蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAC38786.1，序列见SEQ ID NO：9。

由图4可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比718.4091的片段序列为Ala、Ile、Arg、Asn、Asp、Glu、Glu、Leu、Asn、Lys、Leu、Leu、Gly、Arg、Val、Thr、Ile、Ala、Gln(AIRNDEELNKLLGRVTIAQ)，记为SEQ ID NO：2。该片段与Histone H2Atype 3蛋白第87～105位的残基序列相对应，Histone H2A type 3蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAC38786.1，序列见SEQ ID NO：9。

由图6可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比612.1072的片段序列为His、Leu、Gln、Leu、Ala、Ile、Arg、Asn、Asp、Glu、Glu、Leu、Asn、Lys、Leu、Leu、Gly、Arg、Val、Thr、Ile(HLQLAIRNDEELNKLLGRVTI)，记为SEQ ID NO：3。该片段与Histone H2A type 3蛋白第83～103位的残基序列相对应，Histone H2A type 3蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAC38786.1，序列见SEQ ID NO：9。

由图8可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比535.3123的片段序列为Leu、Ala、Ile、Arg、Asn、Asp、Glu、Glu、Leu、Asn、Lys、Leu、Leu、Gly、Arg、Val、Thr、Ile、Ala(LAIRNDEELNKLLGRVTIA)，记为SEQ ID NO：4。该片段与Histone H2Atype 3蛋白第86～104位的残基序列相对应，Histone H2A type 3蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAC38786.1，序列见SEQ ID NO：9。

由图10可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比547.6418的片段序列为Ala、Ile、Arg、Asn、Asp、Glu、Glu、Leu、Asn、Lys、Leu、Leu、Gly、Arg(AIRNDEELNKLLGR)，记为SEQ ID NO：5。该片段与Histone H2A type 1-E蛋白第87～100位的残基序列相对应，Histone H2A type 1-E蛋白氨基酸序列的GenBank编号为AAH58544.1，序列见SEQ ID NO：10。

由图12可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比435.7483的片段序列为Ala、Ile、Arg、Asn、Asp、Glu、Glu、Leu、Asn、Lys、Leu、Leu、Gly、Arg、Val(AIRNDEELNKLLGRV)，记为SEQ ID NO：6。该片段与Histone H2A type 3蛋白第87～101位的残基序列相对应，Histone H2A type 3蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAC38786.1，序列见SEQ ID NO：9。

由图14可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比675.7224的片段序列为Ala、Ile、Arg、Asn、Asp、Glu、Glu、Leu、Asn、Lys、Leu、Leu、Gly、Arg、Val、Thr、Ile、Ala(AIRNDEELNKLLGRVTIA)，记为SEQ ID NO：7。该片段与Histone H2A type1-E蛋白第87～104位的残基序列相对应，Histone H2A type 1-E蛋白氨基酸序列的GenBank编号为AAH58544.1，序列见SEQ ID NO：10。

由图16可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比689.7374的片段序列为Leu、Ala、Ile、Arg、Asn、Asp、Glu、Glu、Leu、Asn、Lys、Leu、Leu、Gly、Arg、Val、Thr、Ile(LAIRNDEELNKLLGRVTI)，记为SEQ ID NO：8。该片段与Histone H2A type1-E蛋白第86～103位的残基序列相对应，Histone H2A type 1-E蛋白氨基酸序列的GenBank编号为AAH58544.1，序列见SEQ ID NO：10。

实施例2生物活性肽的免疫调节活性实验

一、生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTI的促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定(Griess法)

1.实验试剂及仪器：

试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)脾脏淋巴细胞来源生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTI；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。

仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO₂培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。

2.试验方法：

加入细胞个数为2×10⁶/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含生物活性肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24h时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48h后，收集培养液上清50μl/孔，在培养液上清中依次添加Griess试剂1和Griess试剂2各50μl/孔，室温反应10分钟后，在540nm波长下测定吸光度值(OD540)。

3.实验结果及分析：

表1生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTI促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定

实验分组	正常组	炎症组
			细胞空白	0.0248±0.0219	0.2852±0.0428
生物活性肽(1mg/ml)	0.1352±0.0482**	0.6385±0.0389**
			生物活性肽(0.2mg/ml)	0.0301±0.0241	0.3019±0.0245*

注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)

实验结果见表1，由表1可知，在实验组中添加生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTI，浓度为1mg/mL，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下生长的促进巨噬细胞的一氧化氮诱生量均有促进作用，与细胞空白组相比，具有极显著性差异(P<0.01)。当生物活性肽的添加浓度为0.2mg/mL，在LPS造炎症情况下，也能促进巨噬细胞一氧化氮诱生量的增加，并具有显著性差异(P<0.05)。但是与正常情况下生长的细胞空白组相比，没有显著性差异。说明生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTI在一定浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力。

二、生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTI的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)

1.实验材料与仪器：

试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTI；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(CorolasePP，购自AB公司)。

仪器设备：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO₂培养箱，Heraeus公司；DragonWellscan MK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。

2.实验方法：

无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行原代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×10⁶个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入：100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL生物活性肽样品。另外，设置空白对照组(pH7.2～7.4，3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA)，研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5％CO₂ 37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。

体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：

式中：A₁为空白对照在570nm处下的吸光值；A ₂为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A ₃为实验组在570nm处下的吸光值。

3.实验结果及分析：

表2生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTI对体外淋巴细胞增殖的影响

实验分组	刺激指数SI
		BSA	1
生物活性肽	1.219±0.038**

注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**号标记为与阴性对照比较，有极显著性差异(P＜0.01)。

实验结果见表2。由表2可知，在生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTI的质量浓度为100μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTI一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.219，和阴性对照组具有极显著差异(P<0.01)。因此，可以认定该生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTI具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。

三、生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIAQ的促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定(Griess法)

1.实验试剂及仪器：

试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)脾脏淋巴细胞来源生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIAQ；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。

2.试验方法：

4.实验结果及分析：

表3生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIAQ促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定

实验分组	正常组	炎症组
			细胞空白	0.0253±0.0212	0.2903±0.0419
生物活性肽(1mg/ml)	0.1482±0.0399**	0.4729±0.0389**
			生物活性肽(0.2mg/ml)	0.0728±0.0188*	0.3648±0.0210*

注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)

实验结果见表3，由表3可知，在实验组中添加生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIAQ，浓度为1mg/mL，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下生长的促进巨噬细胞的一氧化氮诱生量均有促进作用，与细胞空白组相比，具有极显著性差异(P<0.01)。当生物活性肽的添加浓度为0.2mg/mL，在正常情况下和LPS造炎症情况下，也能促进巨噬细胞一氧化氮诱生量的增加，并具有显著性差异(P<0.05)。说明生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIAQ在一定浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力。

四、生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIAQ的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)

1.实验材料与仪器：

试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIAQ；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(Corolase PP，购自AB公司)。

2.实验方法：

体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：

式中：A₁为空白对照在570nm处下的吸光值；A ₂为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A₃为实验组在570nm处下的吸光值。

3.实验结果及分析：

表4生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIAQ对体外淋巴细胞增殖的影响

实验分组	刺激指数SI
		BSA	1
生物活性肽	1.257±0.023**

注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**号标记为与阴性对照比较，有极显著性差异(P＜0.01)。

实验结果见表4。由表4可知，在生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIAQ的质量浓度为100μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIAQ一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.257，和阴性对照组具有极显著差异(P<0.01)。因此，可以认定该生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIAQ具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。

五、生物活性肽HLQLAIRNDEELNKLLGRVTI的促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定(Griess法)

1.实验试剂及仪器：

试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)脾脏淋巴细胞来源生物活性肽HLQLAIRNDEELNKLLGRVTI；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。

2.试验方法：

5.实验结果及分析：

表5生物活性肽HLQLAIRNDEELNKLLGRVTI促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定

实验分组	正常组	炎症组
			细胞空白	0.0242±0.0135	0.2843±0.0433
生物活性肽(1mg/ml)	0.0967±0.0128*	0.5829±0.0258**
			生物活性肽(0.2mg/ml)	0.0357±0.0112	0.319±0.0223

注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)

实验结果见表5，由表5可知，在实验组中添加生物活性肽HLQLAIRNDEELNKLLGRVTI，浓度为1mg/mL，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下生长的促进巨噬细胞的一氧化氮诱生量均有促进作用，与细胞空白组相比，正常情况下生长具有显著性差异(P<0.05)，LPS造炎症情况下生长具有极显著性差异(P<0.01)。当生物活性肽的添加浓度为0.2mg/mL，并无显著性差异。说明生物活性肽HLQLAIRNDEELNKLLGRVTI在1mg/mL浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力。

六、生物活性肽HLQLAIRNDEELNKLLGRVTI的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)

1.实验材料与仪器：

试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽HLQLAIRNDEELNKLLGRVTI；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(Corolase PP，购自AB公司)。

2.实验方法：

体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：

3.实验结果及分析：

表6生物活性肽HLQLAIRNDEELNKLLGRVTI对体外淋巴细胞增殖的影响

实验分组	刺激指数SI
		BSA	1
生物活性肽	1.042±0.028*

注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**号标记为与阴性对照比较，有极显著性差异(P＜0.01)。

实验结果见表6。由表6可知，在生物活性肽HLQLAIRNDEELNKLLGRVTI的质量浓度为100μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽HLQLAIRNDEELNKLLGRVTI一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.042，和阴性对照组具有显著差异(P<0.05)。因此，可以认定该生物活性肽HLQLAIRNDEELNKLLGRVTI具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。

七、生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTIA的促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定(Griess法)

1.实验试剂及仪器：

试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)脾脏淋巴细胞来源生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTIA；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。

2.试验方法：

6.实验结果及分析：

表7生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTIA促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定

实验分组	正常组	炎症组
			细胞空白	0.0239±0.0124	0.2753±0.0488
生物活性肽(1mg/ml)	0.1642±0.0128**	0.4863±0.0174**
			生物活性肽(0.2mg/ml)	0.0837±0.0262*	0.3463±0.0164*

注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)

实验结果见表7，由表7可知，在实验组中添加生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTIA，浓度为1mg/mL，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下生长的促进巨噬细胞的一氧化氮诱生量均有促进作用，与细胞空白组相比，具有极显著性差异(P<0.01)。当生物活性肽的添加浓度为0.2mg/mL，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下生长的促进巨噬细胞的一氧化氮诱生量均有促进作用，具有显著性差异(P<0.05)。说明生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTIA在一定浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力。

八、生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTIA的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)

1.实验材料与仪器：

试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTIA；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(Corolase PP，购自AB公司)。

2.实验方法：

体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：

式中：A₁为空白对照在570nm处下的吸光值；A₂为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A₃为实验组在570nm处下的吸光值。

3.实验结果及分析：

表8生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTIA对体外淋巴细胞增殖的影响

实验分组	刺激指数SI
		BSA	1
生物活性肽	1.265±0.014**

注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**号标记为与阴性对照比较，有极显著性差异(P＜0.01)。

实验结果见表8。由表8可知，在生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTIA的质量浓度为100μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTIA一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.265，和阴性对照组具有极显著差异(P<0.01)。因此，可以认定该生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTIA具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。

九、生物活性肽AIRNDEELNKLLGR的促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定(Griess法)

1.实验试剂及仪器：

试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)脾脏淋巴细胞来源生物活性肽AIRNDEELNKLLGR；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。

2.试验方法：

7.实验结果及分析：

表9生物活性肽AIRNDEELNKLLGR促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定

实验分组	正常组	炎症组
			细胞空白	0.0257±0.0154	0.2787±0.0393
生物活性肽(1mg/ml)	0.1286±0.0153**	0.592±0.0266**
			生物活性肽(0.2mg/ml)	0.0739±0.0102*	0.3686±0.0133*

注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)

实验结果见表9，由表9可知，在实验组中添加生物活性肽AIRNDEELNKLLGR，浓度为1mg/mL，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下生长的促进巨噬细胞的一氧化氮诱生量均有促进作用，与细胞空白组相比，具有极显著性差异(P<0.01)。当生物活性肽的添加浓度为0.2mg/mL，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下均具有显著性差异(P<0.05)。说明生物活性肽AIRNDEELNKLLGR在一定浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力。

十、生物活性肽AIRNDEELNKLLGR的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)

1.实验材料与仪器：

试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽AIRNDEELNKLLGR；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(CorolasePP，购自AB公司)。

2.实验方法：

体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：

3.实验结果及分析：

表10生物活性肽AIRNDEELNKLLGR对体外淋巴细胞增殖的影响

实验分组	刺激指数SI
		BSA	1
生物活性肽	1.248±0.021**

注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**号标记为与阴性对照比较，有极显著性差异(P＜0.01)。

实验结果见表10。由表10可知，在生物活性肽AIRNDEELNKLLGR的质量浓度为100μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽AIRNDEELNKLLGR一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.248，和阴性对照组具有极显著差异(P<0.01)。因此，可以认定该生物活性肽AIRNDEELNKLLGR具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。

十一、生物活性肽AIRNDEELNKLLGRV的促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定(Griess法)

1.实验试剂及仪器：

试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)脾脏淋巴细胞来源生物活性肽AIRNDEELNKLLGRV；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。

2.试验方法：

3.实验结果及分析：

表11生物活性肽AIRNDEELNKLLGRV促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定

实验分组	正常组	炎症组
			细胞空白	0.0245±0.0178	0.2743±0.0376
生物活性肽(1mg/ml)	0.1569±0.0243**	0.6281±0.0321**
			生物活性肽(0.2mg/ml)	0.0286±0.0144	0.259±0.0093

注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)

实验结果见表11，由表11可知，在实验组中添加生物活性肽AIRNDEELNKLLGRV，浓度为1mg/mL，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下生长的促进巨噬细胞的一氧化氮诱生量均有促进作用，与细胞空白组相比，具有极显著性差异(P<0.01)。当生物活性肽的添加浓度为0.2mg/mL，与细胞空白组相比，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下均无显著性差异。说明生物活性肽AIRNDEELNKLLGRV在1mg/mL浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力。

十二、生物活性肽AIRNDEELNKLLGRV的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)

1.实验材料与仪器：

试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽AIRNDEELNKLLGRV；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(CorolasePP，购自AB公司)。

2.实验方法：

体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：

3.实验结果及分析：

表12生物活性肽AIRNDEELNKLLGRV对体外淋巴细胞增殖的影响

实验分组	刺激指数SI
		BSA	1
生物活性肽	1.206±0.031**

注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**号标记为与阴性对照比较，有极显著性差异(P＜0.01)。

实验结果见表12。由表12可知，在生物活性肽AIRNDEELNKLLGRV的质量浓度为100μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽AIRNDEELNKLLGRV一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.206，和阴性对照组具有极显著差异(P<0.01)。因此，可以认定该生物活性肽AIRNDEELNKLLGRV具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。

十三、生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIA的促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定(Griess法)

1.实验试剂及仪器：

试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)脾脏淋巴细胞来源生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIA；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。

2.试验方法：

3.实验结果及分析：

表13生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIA促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定

实验分组	正常组	炎症组
			细胞空白	0.0226±0.0186	0.2589±0.0412
生物活性肽(1mg/ml)	0.0834±0.0148*	0.3512±0.0261*
			生物活性肽(0.2mg/ml)	0.0231±0.0155	0.2611±0.0173

注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)

实验结果见表13，由表13可知，在实验组中添加生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIA，浓度为1mg/mL，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下生长的促进巨噬细胞的一氧化氮诱生量均有促进作用，与细胞空白组相比，具有显著性差异(P<0.05)。当生物活性肽的添加浓度为0.2mg/mL，与细胞空白组相比，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下均无显著性差异。说明生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIA在1mg/mL浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力。

十四、生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIA的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)

1.实验材料与仪器：

试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIA；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(Corolase PP，购自AB公司)。

2.实验方法：

体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：

3.实验结果及分析：

表14生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIA对体外淋巴细胞增殖的影响

实验分组	刺激指数SI
		BSA	1
生物活性肽	1.137±0.024*

注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**号标记为与阴性对照比较，有极显著性差异(P＜0.01)。

实验结果见表14。由表14可知，在生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIA的质量浓度为100μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIA一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.137，和阴性对照组具有显著差异(P<0.05)。因此，可以认定该生物活性肽AIRNDEELNKLLGRVTIA具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。

十五、生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTI的促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定(Griess法)

1.实验试剂及仪器：

试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)脾脏淋巴细胞来源生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTI；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。

2.试验方法：

3.实验结果及分析：

表15生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTI促巨噬细胞一氧化氮诱生量的测定

实验分组	正常组	炎症组
			细胞空白	0.0233±0.0201	0.2649±0.0382
生物活性肽(1mg/ml)	0.1274±0.0277**	0.5893±0.0249**
			生物活性肽(0.2mg/ml)	0.0989±0.0137*	0.3248±0.0198*

注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**，与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.01)

实验结果见表15，由表15可知，在实验组中添加生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTI，浓度为1mg/mL，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下生长的促进巨噬细胞的一氧化氮诱生量均有促进作用，与细胞空白组相比，具有极显著性差异(P<0.01)。当生物活性肽的添加浓度为0.2mg/mL，与细胞空白组相比，对于正常情况下生长和LPS造炎症情况下均有显著性差异(P<0.05)。说明生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTI在一定浓度条件下具有促进巨噬细胞一氧化氮诱生量增加的能力。

十六、生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTI的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)

1.实验材料与仪器：

试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTI；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(Corolase PP，购自AB公司)。

2.实验方法：

体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：

3.实验结果及分析：

表16生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTI对体外淋巴细胞增殖的影响

实验分组	刺激指数SI
		BSA	1
生物活性肽	1.231±0.042**

注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；

**号标记为与阴性对照比较，有极显著性差异(P＜0.01)。

实验结果见表16。由表16可知，在生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTI的质量浓度为100μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTI一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.231，和阴性对照组具有极显著差异(P<0.01)。因此，可以认定该生物活性肽LAIRNDEELNKLLGRVTI具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江辉肽生命健康科技有限公司

<120> 具有氨基酸结构AIRNDEELNKLLGR的生物活性肽及其制备方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys Leu Leu Gly Arg Val Thr

1 5 10 15

Ile

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys Leu Leu Gly Arg Val Thr

1 5 10 15

Ile Ala Gln

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys Leu Leu

1 5 10 15

Gly Arg Val Thr Ile

20

<210> 4

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys Leu Leu Gly Arg Val

1 5 10 15

Thr Ile Ala

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys Leu Leu Gly Arg

1 5 10

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys Leu Leu Gly Arg Val

1 5 10 15

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys Leu Leu Gly Arg Val Thr

1 5 10 15

Ile Ala

<210> 8

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys Leu Leu Gly Arg Val

1 5 10 15

Thr Ile

<210> 9

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys

1 5 10 15

Ser Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His

20 25 30

Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ser Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala

35 40 45

Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu

50 55 60

Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile

65 70 75 80

Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys

85 90 95

Leu Leu Gly Arg Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile

100 105 110

Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Ala Lys

115 120 125

Gly Lys

130

<210> 10

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys

1 5 10 15

Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His

20 25 30

Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ser Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala

35 40 45

Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu

50 55 60

Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile

65 70 75 80

Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys

85 90 95

Leu Leu Gly Arg Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile

100 105 110

Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Ala Lys

115 120 125

Gly Lys

130

Claims

1.具有氨基酸结构AIRNDEELNKLLGR的生物活性肽，其特征在于，所述生物活性肽选自以下8种生物活性肽中的一种或几种：

AIRNDEELNKLLGRVTI、AIRNDEELNKLLGRVTIAQ、

LQLAIRNDEELNKLLGRVTI、LAIRNDEELNKLLGRVTIA、

AIRNDEELNKLLGR、AIRNDEELNKLLGRV 、AIRNDEELNKLLGRVTIA和LAIRNDEELNKLLGRVTI，其氨基酸序列分别为

Ala-Ile-Arg-Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys-Leu-Leu-Gly-Arg-Val-Thr-Ile，

Ala-Ile-Arg-Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys-Leu-Leu-Gly-Arg-Val-Thr-Ile-Ala-Gln，

Leu-Ala-Ile-Arg-Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys-Leu-Leu-Gly-Arg-Val-Thr-Ile-Ala，

Ala-Ile-Arg-Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys-Leu-Leu-Gly-Arg，

Ala-Ile-Arg-Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys-Leu-Leu-Gly-Arg-Val，

Ala-Ile-Arg-Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys-Leu-Leu-Gly-Arg-Val-Thr-Ile-Ala，

Leu-Ala-Ile-Arg-Asn-Asp-Glu-Glu-Leu-Asn-Lys-Leu-Leu-Gly-Arg-Val-Thr-Ile。

2.编码权利要求1所述具有氨基酸结构AIRNDEELNKLLGR的生物活性肽的多核苷酸。

3.权利要求1所述具有氨基酸结构AIRNDEELNKLLGR的生物活性肽在制备促巨噬细胞一氧化氮诱生量的药物中的应用。