CN112812169B - 具有氨基酸结构apkiqrlvtpr的生物活性肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白领域，具体涉及具有氨基酸结构APKIQRLVTPR的生物活性肽及其制备方法和应用，具有氨基酸结构APKIQRLVTPR的生物活性肽，选自生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR中的一种或几种的组合。经过体外免疫功能调节验证实验，证明生物活性肽APKIQRLVTPR、KAPKIQRLVTPR和TKAPKIQRLVTPR具有很好的免疫调节功能。本发明的APKIQRLVTPR、KAPKIQRLVTPR和TKAPKIQRLVTPR能够促进巨噬细胞活化并释放细胞因子，降低机体发病率，并对体外巨噬细胞增殖有显著促进作用，提高机体免疫力，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。

Description

具有氨基酸结构APKIQRLVTPR的生物活性肽及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及蛋白领域，尤其是涉及具有氨基酸结构APKIQRLVTPR的生物活性肽及其制备方法和应用。
背景技术
生物活性肽因其具有很多潜在的生物功能，所以引起人们越来越多的关注，成为科学研究的热点之一。目前很多生物活性肽的有益效果也已经得到了很好的证明，如抗癌、降血压、抗菌、降胆固醇、抗糖尿病等等特性。当前最权威的生物活性肽数据库BIOPEP-UMW中已报告了3000多个不同的生物活性肽。
免疫调节肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生物活性肽。1981年Jolles等人首次发现，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一个氨基酸序列为Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr的六肽，体外实验证明该肽能够增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用。Migliore-Samour等人发现来自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能够刺激绵羊血红细胞对小鼠腹膜巨噬细胞的吞噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵抗，具有抗炎功能。李素萍等人用合成的小鼠骨髓巨噬细胞来与源肽(PGPIPN)饲喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用和红细胞相关的抗炎功能有显著的增强。Bowdis等人在研究来源于牛中性粒细胞的13氨基酸肽indolicidin的免疫功能时发现，多肽indolicidin在巨噬细胞样细胞系中抑制LPS诱导的TNF-α产量。
但是当这些小肽未从蛋白质中酶解分离时，这些蛋白质本身往往是不具备免疫调节活性的。由于生活肽的数量实在是太多，所以，还有非常多的多肽有待研究其相关性能。如何从已知氨基酸序列的种类繁多的蛋白质中寻找具有特定功能的生物活性肽，并研究这些多肽的功能是蛋白领域研究的方向之一。
40S ribosomal protein S6蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。目前，现有技术中并没有关于40S ribosomal protein S6蛋白多肽片段相关功能的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供具有氨基酸结构APKIQRLVTPR的生物活性肽及其制备方法和应用。尤其是关于生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR和生物活性肽TKAPKIQRLVTPR及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面，提供具有氨基酸结构APKIQRLVTPR的生物活性肽，选自生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR中的一种或几种的组合，
生物活性肽APKIQRLVTPR的氨基酸序列为Ala-Pro-Lys-Ile-Gln-Arg-Leu-Val-Thr-Pro-Arg，如SEQ ID NO：1所示。
生物活性肽KAPKIQRLVTPR的氨基酸序列为Lys-Ala-Pro-Lys-Ile-Gln-Arg-Leu-Val-Thr-Pro-Arg，如SEQ ID NO：2所示。
生物活性肽TKAPKIQRLVTPR的氨基酸序列为Thr-Lys-Ala-Pro-Lys-Ile-Gln-Arg-Leu-Val-Thr-Pro-Arg，如SEQ ID NO：3所示。
较优的，所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR和生物活性肽TKAPKIQRLVTPR为小鼠脾脏来源淋巴细胞肽。具体均来源于40S ribosomal protein S6蛋白，并且分别为40S ribosomal protein S6蛋白第173～183位、第172～183位和第171～183位的氨基酸残基。40S ribosomal protein S6蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
40S ribosomal protein S6蛋白的氨基酸序列以及对应的核苷酸序列为既有技术，编码40S ribosomal protein S6蛋白第173～183位、第172～183位和第171～183位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性肽APKIQRLVTPR、KAPKIQRLVTPR和TKAPKIQRLVTPR。
较优的，所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR和生物活性肽TKAPKIQRLVTPR具有抗炎功能和免疫调节功能。
本发明还提供编码所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR和生物活性肽TKAPKIQRLVTPR的多核苷酸。
本发明第二方面，提供了所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR和生物活性肽TKAPKIQRLVTPR的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从细胞中通过分离纯化的方法直接获得，可以直接通过化学合成制备。
通过基因工程的方法人工合成所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR和生物活性肽TKAPKIQRLVTPR是本领域技术人员能够实现的技术方案，例如可以是以DNA重组技术为基础，通过合适的DNA模板来控制多肽的序列合成。
关于从细胞中通过分离纯化的方法直接获得的方式可以为：基于给定的生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR和生物活性肽TKAPKIQRLVTPR的氨基酸序列，采用生物学技术上常规的酶解、纯化方法从小鼠脾脏来源淋巴细胞获得所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR和生物活性肽TKAPKIQRLVTPR。
本发明第三方面，提供具有氨基酸结构APKIQRLVTPR的生物活性肽在制备具有抗炎功能的药物或化妆品中的应用，所述具有氨基酸结构APKIQRLVTPR的生物活性肽选自生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR中的一种或几种的组合。
具体而言，本发明的生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR可以用于制备具有抗炎的药物。
本发明第四方面，提供了具有氨基酸结构APKIQRLVTPR的生物活性肽在制备具有免疫调节功能的食物或药物中的应用，所述具有氨基酸结构APKIQRLVTPR的生物活性肽选自生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR中的一种或几种的组合。
具体而言，本发明所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR中一种或多种的组合在制备促进巨噬细胞释放细胞因子的食物或药物中的应用。
具体而言，本发明所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR中一种或多种的组合在制备促进体外巨噬细胞增殖能力的食物或药物中的应用。
本发明第五方面，提供了一种抗炎产品，包括所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR中一种或多种的组合或所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR的衍生物中的一种或几种的组合；所述的抗炎产品包括抗炎药物或抗炎化妆品。
本发明第六方面，提供了一种具有免疫调节功能的产品，包括所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR中一种或多种的组合或所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR的衍生物中的一种或几种的组合；所述具有免疫调节功能的产品包括具有免疫调节功能的食品或具有免疫调节功能的药物。
所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR的衍生物，是指具有与所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR相同的活性或更优的活性。
所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR的衍生物，是指在所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的生物活性肽衍生物。
本发明具有氨基酸结构APKIQRLVTPR的生物活性肽的有益效果为：本发明所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR具有较好的抗炎活性；本发明所述生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR能够促进巨噬细胞活化并释放细胞因子，降低机体发病率，并对体外巨噬细胞增殖有显著促进作用，提高机体免疫力，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。
附图说明
图1：质荷比为426.9389的片段的一级质谱图(m/z＝426.9389)；
图2：质荷比为426.9389的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
图3：质荷比为352.4798的片段的一级质谱图(m/z＝352.4798)；
图4：质荷比为352.4798的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
图5：质荷比为377.7418的片段的一级质谱图(m/z＝377.7418)；
图6：质荷比为377.7418的片段的二级质谱图和生物活性肽az、by断裂情况；
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1活性肽APKIQRLVTPR、KAPKIQRLVTPR和TKAPKIQRLVTPR的人工合成
一、生物活性肽的合成
1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。
2. 2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。
3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。
4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
5.称取氨基酸Ala适量和1-羟基-苯并三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
6. 2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA:DCM＝1:1:2,v:v:v)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。
7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
9.称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
10. 1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。
11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
12.按照步骤9-11依次接上氨基酸Ala、Pro、Lys、Ile、Gln、Arg、Leu、Val、Thr、Pro、Arg。
13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)将生物活性肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)离心沉降四次。
至此，人工合成了生物活性肽APKIQRLVTPR。
生物活性肽KAPKIQRLVTPR和TKAPKIQRLVTPR的合成方法参考上面方法，只需在第5步选用特定生物活性肽对应的首个氨基酸，以及在第12步连接特定生物活性肽对应的氨基酸。
二、生物活性肽的确认
1)UPLC分析
UPLC条件如下：
仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱仪
色谱柱规格：BEH C18色谱柱
流速：0.4mL/min
温度：50℃
紫外检测波长：210nm
进样量：2μL
梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈
Figure BDA0002910022550000071
Figure BDA0002910022550000081
2)质谱分析
质谱条件如下：
离子方式：ES+
质量范围(m/z)：100、1000
毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0
采样锥(V)：35.0
离子源温度(℃)：115
去溶剂温度(℃)：350
去溶剂气流(L/hr)：700.0
碰撞能量(eV)：4.0
扫描时间(sec)：0.25
内扫描时间(sec)：0.02
根据以上分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对生物活性肽APKIQRLVTPR、KAPKIQRLVTPR和TKAPKIQRLVTPR进行色谱分析和质谱分析。生物活性肽APKIQRLVTPR一级质谱图如图1所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为426.9389，保留时间是13.47min。生物活性肽KAPKIQRLVTPR的质量色谱提取图如图3所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图4所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为352.4798，保留时间是10.24min。生物活性肽TKAPKIQRLVTPR的质量色谱提取图如图5所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图6所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为377.7418，保留时间是11.91min。
3)结果
由图2可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比426.9389的片段序列为Ala、Pro、Lys、Ile、Gln、Arg、Leu、Val、Thr、Pro、Arg(APKIQRLVTPR)，记为SEQ ID NO：1。该片段与40S ribosomal protein S6蛋白第173～183位的残基序列相对应，40S ribosomal protein S6蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAB28498.1，序列见SEQ ID NO：4。
由图4可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比352.4798的片段序列为Lys、Ala、Pro、Lys、Ile、Gln、Arg、Leu、Val、Thr、Pro、Arg(KAPKIQRLVTPR)，记为SEQ ID NO：2。该片段与40S ribosomal protein S6蛋白第172～183位的残基序列相对应，40S ribosomal protein S6蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAB28498.1，序列见SEQ ID NO：4。
由图6可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比377.7418的片段序列为Thr、Lys、Ala、Pro、Lys、Ile、Gln、Arg、Leu、Val、Thr、Pro、Arg(TKAPKIQRLVTPR)，记为SEQ ID NO：3。该片段与40S ribosomal protein S6蛋白第171～183位的残基序列相对应，40S ribosomal protein S6蛋白氨基酸序列的GenBank编号为BAB28498.1，序列见SEQ ID NO：4。
实施例2生物活性肽的免疫调节活性实验
一、生物活性肽APKIQRLVTPR的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6、8周龄)，上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源性生物活性肽APKIQRLVTPR；ELISA细胞因子快速试剂盒(IL-1β和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：LRH、250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL、22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24小时时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48小时，炎症组在培养终止前24小时加入LPS至终浓度100ng/ml。培养终止后，离心收集细胞培养液上清液。在已包被细胞因子抗体的酶标板中加入100μl上清液，37℃反应90分钟后，加入生物素标记抗体，37℃反应60分钟，PBS洗涤后，加入亲和素、过氧化物酶复合物，反应30分钟。PBS洗涤后加入显色液，反应20分钟。加入显色终止液后，使用酶标仪在波长450nm下测定吸光度值(OD450)。
3.实验结果及分析：
表1生物活性肽APKIQRLVTPR对巨噬细胞细胞因子水平影响的测定
实验分组 IL-1β IL-6
细胞空白 0.395±0.041 1.202±0.030
生物活性肽(0.5mg/ml) 0.749±0.020** 1.832±0.628**
生物活性肽(1mg/ml) 0.401±0.021 1.208±0.072
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)
从表1中可知，在IL-1β和IL-6这两种细胞因子的实验结果中，IL-1β和IL-6在0.5mg/ml时表现出了极显著性差异(P＜0.01)，证明生物活性肽APKIQRLVTPR可促进巨噬细胞释放细胞因子，而在肽浓度达到1mg/ml时，其与空白组相比并未有明显差异，证明了一定浓度下的生物活性肽APKIQRLVTPR可促进小鼠腹腔巨噬细胞活化并释放IL-1β和IL-6，提高这些细胞因子在正常巨噬细胞静息状态下的作用，从而调节机体的免疫力。
二、MTT法测定生物活性肽APKIQRLVTPR的体外巨噬细胞增殖能力实验
1.实验试剂及仪器
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽APKIQRLVTPR；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)Amresco公司；LPS(脂多糖)Sigma公司；牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)Genebase公司；三联溶解液，含10％SDS、5％异丁醇以及0.012mol/L HCl的水溶液。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.试验方法：
balb/c小鼠腹腔注射2ml的2％(w/w)灭菌淀粉溶液，连续注射三天，最后一次注射24小时后断颈处死。剥去腹部皮肤，用注射器吸取4℃磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗腹腔，离心管收集冲洗液后，离心(1000rpm，4℃)10分钟后弃上清，用4℃RPMI1640完全培养液(含10％FBS)洗涤两次，0.2％台盼蓝溶液染色做细胞活力检测，确认采集到的有活力巨噬细胞占95％以上。细胞计数板读数后，调整细胞浓度至合适浓度。
将已吹打至完全悬浮的细胞悬液以合适体积加入96孔细胞培养板，37℃、5％CO2环境下培养4小时后，吸弃孔中液体，用37℃RPMI1640完全培养液小心清洗细胞培养板孔底，洗去未贴壁的细胞和细胞碎片，得到纯化后的贴壁腹腔巨噬细胞。每孔加入0.2mlRPMI1640完全培养基，实验用小肽样品及LPS事先溶解于培养基后加入，开始细胞培养。
得到纯化后的贴壁腹腔巨噬细胞后，实验组每孔加溶解有生物活性肽(1mg/ml)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，连续培养48h；阴性对照组每孔加溶解有BSA(500μg/mL)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔；空白组添加RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，连续培养48h。并且，实验组、阴性对照组和空白组又分别设正常组和炎症组；炎症组在培养到24h时加入LPS至终浓度为100ng/ml；正常组不加LPS；并且正常组和炎症组在44h时加入5％MTT20μl/孔；细胞培养达到48h后加入100μl/孔的三联溶解液以终止培养，隔夜溶解后，在波长570nm下用酶标仪测各孔的吸光度值(OD570)，生长指数(GrowthIndices)的计算公式如下：
生长指数GI＝(小肽组OD值-空白培养液OD值)/(空白组OD值-空白培养液OD值)
其中，空白培养液为含10％FBS的RPMI1640完全培养液。
3.实验结果及分析
表2生物活性肽APKIQRLVTPR对体外巨噬细胞增殖的影响
实验分组 正常组GI 炎症组GI
阴性对照组 1 1
生物活性肽(1mg/ml) 1.0392±0.0193* 1.0958±0.0384**
注：*表示与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；**表示与阴性对照组比较，有高度显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表2，由表2可知，在添加1mg/ml生物活性肽的条件下，正常组和炎症组的巨噬细胞均有增殖，正常组与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)，对于炎症组的影响具有极显著差异(P＜0.01)。说明生物活性肽APKIQRLVTPR对体外巨噬细胞具有显著的增殖作用，在炎症情况下影响更加明显。
三、生物活性肽KAPKIQRLVTPR的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6、8周龄)，上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源性生物活性肽KAPKIQRLVTPR；ELISA细胞因子快速试剂盒(IL-1β和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：LRH、250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL、22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24小时时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48小时，炎症组在培养终止前24小时加入LPS至终浓度100ng/ml。培养终止后，离心收集细胞培养液上清液。在已包被细胞因子抗体的酶标板中加入100μl上清液，37℃反应90分钟后，加入生物素标记抗体，37℃反应60分钟，PBS洗涤后，加入亲和素、过氧化物酶复合物，反应30分钟。PBS洗涤后加入显色液，反应20分钟。加入显色终止液后，使用酶标仪在波长450nm下测定吸光度值(OD450)。
3.实验结果及分析：
表3生物活性肽KAPKIQRLVTPR对巨噬细胞细胞因子水平影响的测定
Figure BDA0002910022550000121
Figure BDA0002910022550000131
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)
从表3中可知，在IL-1β和IL-6这两种细胞因子的实验结果中，IL-1β和IL-6在0.5mg/ml时表现出了极显著性差异(P＜0.01)，证明生物活性肽可促进巨噬细胞释放细胞因子，在肽浓度达到1mg/ml时表现出了显著性差异(P＜0.05)，证明了一定浓度下的生物活性肽KAPKIQRLVTPR可促进小鼠腹腔巨噬细胞活化并释放IL-1β和IL-6，提高这些细胞因子在正常巨噬细胞静息状态下的作用，从而调节机体的免疫力。
二、MTT法测定生物活性肽KAPKIQRLVTPR的体外巨噬细胞增殖能力实验
1.实验试剂及仪器
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽KAPKIQRLVTPR；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)Amresco公司；LPS(脂多糖)Sigma公司；牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)Genebase公司；三联溶解液，含10％SDS、5％异丁醇以及0.012mol/L HCl的水溶液。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.试验方法：
balb/c小鼠腹腔注射2ml的2％(w/w)灭菌淀粉溶液，连续注射三天，最后一次注射24小时后断颈处死。剥去腹部皮肤，用注射器吸取4℃磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗腹腔，离心管收集冲洗液后，离心(1000rpm，4℃)10分钟后弃上清，用4℃RPMI1640完全培养液(含10％FBS)洗涤两次，0.2％台盼蓝溶液染色做细胞活力检测，确认采集到的有活力巨噬细胞占95％以上。细胞计数板读数后，调整细胞浓度至合适浓度。
将已吹打至完全悬浮的细胞悬液以合适体积加入96孔细胞培养板，37℃、5％CO2环境下培养4小时后，吸弃孔中液体，用37℃RPMI1640完全培养液小心清洗细胞培养板孔底，洗去未贴壁的细胞和细胞碎片，得到纯化后的贴壁腹腔巨噬细胞。每孔加入0.2mlRPMI1640完全培养基，实验用小肽样品及LPS事先溶解于培养基后加入，开始细胞培养。
得到纯化后的贴壁腹腔巨噬细胞后，实验组每孔加溶解有生物活性肽(1mg/ml)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，连续培养48h；阴性对照组每孔加溶解有BSA(500μg/mL)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔；空白组添加RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，连续培养48h。并且，实验组、阴性对照组和空白组又分别设正常组和炎症组；炎症组在培养到24h时加入LPS至终浓度为100ng/ml；正常组不加LPS；并且正常组和炎症组在44h时加入5％MTT20μl/孔；细胞培养达到48h后加入100μl/孔的三联溶解液以终止培养，隔夜溶解后，在波长570nm下用酶标仪测各孔的吸光度值(OD570)，生长指数(GrowthIndices)的计算公式如下：
生长指数GI＝(小肽组OD值-空白培养液OD值)/(空白组OD值-空白培养液OD值)
其中，空白培养液为含10％FBS的RPMI1640完全培养液。
3.实验结果及分析
表4生物活性肽KAPKIQRLVTPR对体外巨噬细胞增殖的影响
实验分组 正常组GI 炎症组GI
阴性对照组 1 1
生物活性肽(1mg/ml) 1.0278±0.0123* 1.1201±0.0489**
注：*表示与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；**表示与阴性对照组比较，有高度显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表4，由表4可知，在添加1mg/ml生物活性肽的条件下，正常组和炎症组的巨噬细胞均有增殖，正常组与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)，对于炎症组的影响具有极显著差异(P＜0.01)。说明生物活性肽KAPKIQRLVTPR对体外巨噬细胞具有显著的增殖作用，在炎症情况下影响更加明显。
五、生物活性肽TKAPKIQRLVTPR的促巨噬细胞分泌细胞因子的实验(ELISA法)
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6、8周龄)，上海斯莱克实验动物有限公司；小鼠淋巴细胞提取液，上海索莱宝生物科技有限公司；RPMI1640培养基，GIBCO公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Genebase公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源性生物活性肽TKAPKIQRLVTPR；ELISA细胞因子快速试剂盒(IL-1β和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。
仪器设备：LRH、250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL、22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，炎症组在24小时时加入LPS至终浓度10μg/ml，连续培养48小时，炎症组在培养终止前24小时加入LPS至终浓度100ng/ml。培养终止后，离心收集细胞培养液上清液。在已包被细胞因子抗体的酶标板中加入100μl上清液，37℃反应90分钟后，加入生物素标记抗体，37℃反应60分钟，PBS洗涤后，加入亲和素、过氧化物酶复合物，反应30分钟。PBS洗涤后加入显色液，反应20分钟。加入显色终止液后，使用酶标仪在波长450nm下测定吸光度值(OD450)。
3.实验结果及分析：
表5生物活性肽TKAPKIQRLVTPR对巨噬细胞细胞因子水平影响的测定
实验分组 IL-1β IL-6
细胞空白 0.408±0.042 1.237±0.023
生物活性肽(0.5mg/ml) 0.787±0.034** 1.853±0.535**
生物活性肽(1mg/ml) 0.423±0.019 1.246±0.042
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；**，与阴性对照组比较，有极显著性差异(P＜0.01)
从表5中可知，在IL-1β和IL-6这两种细胞因子的实验结果中，IL-1β和IL-6在0.5mg/ml时表现出了极显著性差异(P＜0.01)，证明生物活性肽TKAPKIQRLVTPR可促进巨噬细胞释放细胞因子，而在肽浓度达到1mg/ml时，其与空白组相比并未有明显差异，证明了一定浓度下的生物活性肽TKAPKIQRLVTPR可促进小鼠腹腔巨噬细胞活化并释放IL-1β和IL-6，提高这些细胞因子在正常巨噬细胞静息状态下的作用，从而调节机体的免疫力。
六、MTT法测定生物活性肽TKAPKIQRLVTPR的体外巨噬细胞增殖能力实验
1.实验试剂及仪器
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽TKAPKIQRLVTPR；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)Amresco公司；LPS(脂多糖)Sigma公司；牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)Genebase公司；三联溶解液，含10％SDS、5％异丁醇以及0.012mol/L HCl的水溶液。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.试验方法：
balb/c小鼠腹腔注射2ml的2％(w/w)灭菌淀粉溶液，连续注射三天，最后一次注射24小时后断颈处死。剥去腹部皮肤，用注射器吸取4℃磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗腹腔，离心管收集冲洗液后，离心(1000rpm，4℃)10分钟后弃上清，用4℃RPMI1640完全培养液(含10％FBS)洗涤两次，0.2％台盼蓝溶液染色做细胞活力检测，确认采集到的有活力巨噬细胞占95％以上。细胞计数板读数后，调整细胞浓度至合适浓度。
将已吹打至完全悬浮的细胞悬液以合适体积加入96孔细胞培养板，37℃、5％CO2环境下培养4小时后，吸弃孔中液体，用37℃RPMI1640完全培养液小心清洗细胞培养板孔底，洗去未贴壁的细胞和细胞碎片，得到纯化后的贴壁腹腔巨噬细胞。每孔加入0.2mlRPMI1640完全培养基，实验用小肽样品及LPS事先溶解于培养基后加入，开始细胞培养。
得到纯化后的贴壁腹腔巨噬细胞后，实验组每孔加溶解有生物活性肽(1mg/ml)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，连续培养48h；阴性对照组每孔加溶解有BSA(500μg/mL)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔；空白组添加RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔，连续培养48h。并且，实验组、阴性对照组和空白组又分别设正常组和炎症组；炎症组在培养到24h时加入LPS至终浓度为100ng/ml；正常组不加LPS；并且正常组和炎症组在44h时加入5％MTT20μl/孔；细胞培养达到48h后加入100μl/孔的三联溶解液以终止培养，隔夜溶解后，在波长570nm下用酶标仪测各孔的吸光度值(OD570)，生长指数(GrowthIndices)的计算公式如下：
生长指数GI＝(小肽组OD值-空白培养液OD值)/(空白组OD值-空白培养液OD值)
其中，空白培养液为含10％FBS的RPMI1640完全培养液。
3.实验结果及分析
表6生物活性肽TKAPKIQRLVTPR对体外巨噬细胞增殖的影响
实验分组 正常组GI 炎症组GI
阴性对照组 1 1
生物活性肽(1mg/ml) 1.0473±0.0138* 1.0865±0.0217**
注：*表示与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；**表示与阴性对照组比较，有高度显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表6，由表6可知，在添加1mg/ml生物活性肽的条件下，正常组和炎症组的巨噬细胞均有增殖，正常组与阴性对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)，对于炎症组的影响具有极显著差异(P＜0.01)。说明生物活性肽TKAPKIQRLVTPR对体外巨噬细胞具有显著的增殖作用，在炎症情况下影响更加明显。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江辉肽生命健康科技有限公司
<120> 具有氨基酸结构APKIQRLVTPR的生物活性肽及其制备方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Pro Lys Ile Gln Arg Leu Val Thr Pro Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Lys Ala Pro Lys Ile Gln Arg Leu Val Thr Pro Arg
1 5 10
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Lys Ala Pro Lys Ile Gln Arg Leu Val Thr Pro Arg
1 5 10
<210> 4
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Lys Leu Asn Ile Ser Phe Pro Ala Thr Gly Cys Gln Lys Leu Ile
1 5 10 15
Glu Val Asp Asp Glu Arg Lys Leu Arg Thr Phe Tyr Glu Lys Arg Met
20 25 30
Ala Thr Glu Val Ala Ala Asp Ala Leu Gly Glu Glu Trp Lys Gly Tyr
35 40 45
Val Val Arg Ile Ser Gly Gly Asn Asp Lys Gln Gly Phe Pro Met Lys
50 55 60
Gln Gly Val Leu Thr His Gly Arg Val Arg Leu Leu Leu Ser Lys Gly
65 70 75 80
His Ser Cys Tyr Arg Pro Arg Arg Thr Gly Glu Arg Lys Arg Lys Ser
85 90 95
Val Arg Gly Cys Ile Val Asp Ala Asn Leu Ser Val Leu Asn Leu Val
100 105 110
Ile Val Lys Lys Gly Glu Lys Asp Ile Pro Gly Leu Thr Asp Thr Thr
115 120 125
Val Pro Arg Arg Leu Gly Pro Lys Arg Ala Ser Arg Ile Arg Lys Leu
130 135 140
Phe Asn Leu Ser Lys Glu Asp Asp Val Arg Gln Tyr Val Val Arg Lys
145 150 155 160
Pro Leu Asn Lys Glu Gly Lys Lys Pro Arg Thr Lys Ala Pro Lys Ile
165 170 175
Gln Arg Leu Val Thr Pro Arg Val Leu Gln His Lys Arg Arg Arg Ile
180 185 190
Ala Leu Lys Lys Gln Arg Thr Lys Lys Asn Lys Glu Glu Ala Ala Glu
195 200 205
Tyr Ala Lys Leu Leu Ala Lys Arg Met Lys Glu Ala Lys Glu Lys Arg
210 215 220
Gln Glu Gln Ile Ala Lys Arg Arg Arg Leu Ser Ser Leu Arg Ala Ser
225 230 235 240
Thr Ser Lys Ser Glu Ser Ser Gln Lys
245

Claims (4)

1.具有氨基酸结构APKIQRLVTPR的生物活性肽，其特征在于，选自生物活性肽APKIQRLVTPR、生物活性肽KAPKIQRLVTPR或生物活性肽TKAPKIQRLVTPR中的一种或几种的组合，
生物活性肽APKIQRLVTPR的氨基酸序列为Ala-Pro-Lys-Ile-Gln-Arg-Leu-Val-Thr-Pro-Arg；
生物活性肽KAPKIQRLVTPR的氨基酸序列为Lys-Ala-Pro-Lys-Ile-Gln-Arg-Leu-Val-Thr-Pro-Arg；
生物活性肽TKAPKIQRLVTPR的氨基酸序列为Thr-Lys-Ala-Pro-Lys-Ile-Gln-Arg-Leu-Val-Thr-Pro-Arg。
2.编码权利要求1所述具有氨基酸结构APKIQRLVTPR的生物活性肽的多核苷酸。
3.权利要求1所述具有氨基酸结构APKIQRLVTPR的生物活性肽的制备方法，其特征在于直接通过化学合成制备。
4.权利要求1所述具有氨基酸结构APKIQRLVTPR的生物活性肽在制备促进巨噬细胞增殖能力的药物中的应用。
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