CN112679597B

CN112679597B - 一种生物活性肽sepkpiff及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112679597B
Application number: CN202110070482.8A
Authority: CN
Inventors: 张少辉; 占文静; 张伯宇
Original assignee: Zhejiang Huitai Life Health Technology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Huitai Life Health Technology Co ltd
Priority date: 2021-01-19
Filing date: 2021-01-19
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2041-01-19
Also published as: CN112679597A

Abstract

本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种生物活性肽SEPKPIFF及其制备方法和应用，生物活性肽SEPKPIFF的氨基酸序列为Ser‑Glu‑Pro‑Lys‑Pro‑Ile‑Phe‑Phe。经过体外免疫调节功能验证实验，证明生物活性肽SEPKPIFF具有很好的免疫调节功能。本发明的生物活性肽SEPKPIFF能够增强淋巴细胞的体外增殖能力，可有效抑制机体因氧化而引起的炎症，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，对治疗炎症引起的慢性疾病具有很大帮助，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。

Description

一种生物活性肽SEPKPIFF及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及蛋白领域，尤其是涉及一种生物活性肽SEPKPIFF及其制备方法和应用。

背景技术

免疫调节肽一般是指具有免疫调节活性的分子量相对较小的小肽。免疫调节肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生物活性肽。1981年Jolles等人首次发现，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一个氨基酸序列为Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr的六肽，体外实验证明该肽能够增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用。Migliore-Samour等人发现来自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能够刺激绵羊血红细胞对小鼠腹膜巨噬细胞的吞噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵抗，具有抗炎功能。李素萍等人用合成的小鼠骨髓巨噬细胞来与源肽(PGPIPN)饲喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用和红细胞相关的抗炎功能有显著的增强。Bowdis等人在研究来源于牛中性粒细胞的13氨基酸肽indolicidin的免疫功能时发现，多肽indolicidin在巨噬细胞样细胞系中抑制LPS诱导的TNF-α产量。

现在公开的免疫调节肽一般是从蛋白质中酶解分离得到或化学方法合成得到的具有特定免疫调节活性的小肽。但是当这些小肽未从蛋白质中酶解分离时，这些蛋白质本身往往是不具备免疫调节活性的。如何从已知氨基酸序列的种类繁多的蛋白质中寻找具有特定功能的生物活性肽，并研究这些多肽的功能是蛋白领域研究的方向之一。

Protein SON蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。目前，现有技术中并没有关于Protein SON蛋白多肽片段相关功能的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物活性肽SEPKPIFF及其制备方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面，提供一种生物活性肽SEPKPIFF，其氨基酸序列为Ser-Glu-Pro-Lys-Pro-Ile-Phe-Phe，如SEQ ID NO：1所示。

较优的，所述生物活性肽为小鼠脾脏来源淋巴细胞肽。具体来源于Protein SON蛋白，并且为Protein SON蛋白第2164～2171位的氨基酸残基。Protein SON蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

Protein SON蛋白的氨基酸序列以及对应的核苷酸序列为既有技术，编码ProteinSON蛋白第2164～2171位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的生物活性肽SEPKPIFF。

较优的，所述生物活性肽具有抗炎功能和免疫调节功能。

本发明还提供编码所述生物活性肽SEPKPIFF的多核苷酸。

本发明第二方面，提供了所述生物活性肽SEPKPIFF的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从细胞中通过分离纯化的方法直接获得，可以直接通过化学合成制备。

通过基因工程的方法人工合成所述生物活性肽SEPKPIFF是本领域技术人员能够实现的技术方案，例如可以是以DNA重组技术为基础，通过合适的DNA模板来控制多肽的序列合成。

关于从细胞中通过分离纯化的方法直接获得的方式可以为：基于给定的生物活性肽SEPKPIFF的氨基酸序列，采用生物学技术上常规的酶解、纯化方法从小鼠脾脏来源淋巴细胞获得所述生物活性肽SEPKPIFF。

本发明第三方面，提供了所述生物活性肽SEPKPIFF在制备具有抗炎功能的药物或化妆品中的应用。

具体而言，本发明的生物活性肽SEPKPIFF可以用于制备具有抗炎和/或抗氧化的药物。

进一步地，所述生物活性肽SEPKPIFF在制备抑制因氧化而引起的炎症的药物中的应用。

本发明第四方面，提供了所述生物活性肽SEPKPIFF在制备具有免疫调节功能的食物或药物中的应用。

进一步地，所述生物活性肽SEPKPIFF在制备促巨淋巴细胞增殖的食物或药物中的应用。

本发明第五方面，提供了一种抗炎产品，包括所述生物活性肽SEPKPIFF或所述生物活性肽SEPKPIFF的衍生物；所述的抗炎产品包括抗炎药物或抗炎化妆品。

本发明第六方面，提供了一种具有免疫调节功能的产品，包括所述生物活性肽SEPKPIFF或所述生物活性肽SEPKPIFF的衍生物；所述具有免疫调节功能的产品包括具有免疫调节功能的食品或具有免疫调节功能的药物。

所述生物活性肽SEPKPIFF的衍生物是指具有与所述生物活性肽SEPKPIFF相同的活性或更优的活性。

所述生物活性肽SEPKPIFF的衍生物，是指在生物活性肽SEPKPIFF的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的生物活性肽衍生物。

本发明生物活性肽SEPKPIFF的有益效果为：本发明的生物活性肽SEPKPIFF具有较好的抗炎活性；本发明的生物活性肽SEPKPIFF能够增强淋巴细胞的体外增殖能力，有效抑制机体因氧化而引起的炎症，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，对治疗炎症引起的慢性疾病具有很大帮助，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。

附图说明

图1：质荷比为482.761的片段的一级质谱图(m/z＝482.761)；

图2：质荷比为482.761的片段的二级质谱图和多肽az、by断裂情况；

具体实施方式

在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1活性肽SEPKPIFF的人工合成

一、生物活性肽的合成

1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。

2.2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。

3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。

4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。

5.称取氨基酸Ser适量和1-羟基-苯并三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。

6.2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA:DCM＝1:1:2,v:v:v)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。

7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。

8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。

9.称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。

10.1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。

11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。

12.按照步骤9-11依次接上氨基酸Ser、Glu、Pro、Lys、Pro、Ile、Phe、Phe。

13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)将生物活性肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)离心沉降四次。

至此，人工合成了生物活性肽SEPKPIFF。

二、生物活性肽的确认

1)UPLC分析

UPLC条件如下：

仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱仪

色谱柱规格：BEH C18色谱柱

流速：0.4mL/min

温度：50℃

紫外检测波长：210nm

进样量：2μL

梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈

2)质谱分析

质谱条件如下：

离子方式：ES+

质量范围(m/z)：100、1000

毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0

采样锥(V)：35.0

离子源温度(℃)：115

去溶剂温度(℃)：350

去溶剂气流(L/hr)：700.0

碰撞能量(eV)：4.0

扫描时间(sec)：0.25

内扫描时间(sec)：0.02

根据以上分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对生物活性肽SEPKPIFF进行色谱分析和质谱分析。生物活性肽SEPKPIFF一级质谱图如图1所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2所示，可得此峰的生物活性肽质荷比为482.761，保留时间是44.63min。

3)结果

由图2可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比482.761的片段序列为Ser、Glu、Pro、Lys、Pro、Ile、Phe、Phe(SEPKPIFF)，记为SEQ ID NO：1。该片段与Protein SON蛋白第2164～2171位的残基序列相对应，Protein SON蛋白氨基酸序列的GenBank编号为AC131691，序列见SEQ ID NO：2。

实施例2生物活性肽的免疫活性实验

一、生物活性肽SEPKPIFF的对血清中免疫细胞因子作用的实验

1.实验试剂及仪器：

试剂：实验动物ICR小鼠(雄性5周龄)，上海市实验动物中心；D-gal，国药集团化学试剂有限公司；多聚甲醛，国药集团化学试剂有限公司；氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽SEPKPIFF；BCA蛋白试剂盒，南京凯基生物科技有限公司；ELISA细胞因子快速试剂盒(TNF-α和IL-6)，武汉博士德生物工程有限公司。

仪器设备：CM-230型摩尔超净水，上海摩勒科学仪器有限公司；密理博MilliporeMILLEX GP0.22μm滤膜，美国密理博公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

2.实验方法：

(1)动物衰老模型造模

将ICR小鼠适应性饲养一周后，分为4组，每组6只。组1为低剂量灌胃组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并以1mg/只·天的剂量灌胃生物活性肽SEPKPIFF；组2为高剂量灌胃组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并且3mg/只的·天剂量灌胃生物活性肽SEPKPIFF；组3为空白组，小鼠正常生长；组4为动物模型组，小鼠每天以500mg/kg的剂量颈背部皮下注射D-gal，并且灌胃浓度为0.9％的生理盐水；D-gal的注射周期与生物活性肽的灌胃周期均为42天。每3天更换垫料，并保证饲料与蒸馏水的供给。每五天称量一次小鼠的体重，根据小鼠的体重配制D-gal注射液，且D-gal注射液经0.22μm针筒式滤膜过滤，以保证无菌。

(2)获取动物脏器与血清

实验周期完成后，以摘眼球取血法获取小鼠的血液，获得血液后断颈处死小鼠，而后将小鼠的躯体置于低温冰盒上，小鼠血液室温静置1小时后，以3000g离心15min，分离血清。血清保存在-80℃冰箱内待检。处置实验动物过程中的所有操作遵循2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。所摘取的小鼠脾脏直接浸泡于预先配制好的4％多聚甲醛溶液中，以固定其形态。多聚甲醛粉末较为难溶，可以加入微量的碳酸氢钠将pH值调节至碱性，以助溶。多聚甲醛溶液的配制需要在通风橱内完成。

(3)样品检测

根据试剂盒说明书指示，首先绘制标准曲线，将标准品粉末用标准品稀释液配制成1000pg/mL的溶液，再连续稀释为500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL、31.3pg/mL、15.6pg/mL等不同浓度。每个浓度梯度溶液移取100μL于已包被抗体的酶标板中。吸取小鼠血清样品100μL，加入同一块酶标板中(若血清样品不够，可适当稀释后再检测计算时需按比例折算)。盖上酶标板，将其置于37℃环境下孵育90min。反应完毕后，小心甩去酶标板内的液体，并将酶标板置于吸水纸上，小心拍打，除去多余液体。将预热好的生物素抗抗体工作液按每孔100μL依次加入酶标板各孔内，37℃下，反应60min。反应完毕后，利用0.01M的PBS溶液洗涤3次，每次每孔内加入100μL的PBS，浸泡1min后倾去溶液，反复3次。将预热好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入，37℃反应30min。反应完毕后，用0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1min左右。按每孔90μL依次加入已在37℃平衡30min的TMB显色液，37℃避光反应8-12min。按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色，用酶标仪在450nm测定OD值。通过细胞因子的标准蛋白做已知浓度系列稀释，测出OD值后绘制出标准曲线，根据标准曲线可推算出标本中细胞因子的含量。

3.实验结果及分析：

表1各组小鼠血清中细胞因子的变化情况

从表1中可以发现本实验中的模型组小鼠体内IL-6与TNF-α含量分别为184.833±20.48pg/mL，3.894±0.38pg/mL，相较于正常组均呈现显著性的增加(P<0.01)，故可以认为由于持续不断地注射致衰老因子，导致动物模型组小鼠在细胞因子层面出现衰老性炎症的症状，而生物活性肽灌胃组的小鼠血清的IL-6与TNF-α含量均得到有效控制。根据细胞因子的实验结果，生物活性肽灌胃组小鼠的血清炎性细胞因子IL-6、TNF-α的分泌水平均低于动物模型组，从氧化损伤角度来看，小鼠因自由基攻击、过氧化产物堆积而造成的氧化损伤可能得到一定程度的抑制；从炎症的角度来看，小鼠因氧化而引起的炎症得到了有效的抑制；从衰老角度来看，小鼠由长期注射D-gal而引起的衰老所导致的一系列老年性疾病有可能得到控制。因此，可以认定SEPKPIFF可有效抑制小鼠因氧化而引起的炎症，具有一定的免疫调节作用，可用于保健品的研发制作。

二、生物活性肽SEPKPIFF的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)

1.实验材料与仪器：

试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽SEPKPIFF；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(Corolase PP，购自AB公司)。

仪器设备：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150 CO₂培养箱，Heraeus公司；DragonWellscan MK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。

2.实验方法：

无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行元代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×10⁶个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入：100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL生物活性肽样品。另外，设置空白对照组(pH7.2～7.4，3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA)，研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5％CO₂ 37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。

体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：

式中：A₁为空白对照在570nm处下的吸光值；A ₂为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A ₃为实验组在570nm处下的吸光值。

3.实验结果及分析：

表2生物活性肽SEPKPIFF对体外淋巴细胞增殖的影响

实验分组	刺激指数SI
		BSA	1
SEPKPIFF	1.2031±0.0734*

注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)。

实验结果见表2。由表2可知，在生物活性肽SEPKPIFF的质量浓度为150μg/mL的条件下，生物活性肽SEPKPIFF的刺激指数大于BSA，说明SEPKPIFF一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且SEPKPIFF的刺激指数达到了1.2031，和阴性对照组具有显著差异(P<0.05)。因此，可以认定该生物活性肽SEPKPIFF具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江辉肽生命健康科技有限公司

<120> 一种生物活性肽SEPKPIFF及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Glu Pro Lys Pro Ile Phe Phe

1 5

<210> 2

<211> 2444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ala Asp Ile Glu Gln Val Phe Arg Ser Phe Val Val Ser Lys

1 5 10 15

Phe Arg Glu Ile Gln Gln Glu Leu Ser Ser Gly Arg Ser Glu Gly Gln

20 25 30

Leu Asn Gly Glu Thr Asn Pro Pro Ile Glu Gly Asn Gln Ala Gly Asp

35 40 45

Thr Ala Ala Ser Ala Arg Ser Leu Pro Asn Glu Glu Ile Val Gln Lys

50 55 60

Ile Glu Glu Val Leu Ser Gly Val Leu Asp Thr Glu Leu Arg Tyr Lys

65 70 75 80

Pro Asp Leu Lys Glu Ala Ser Arg Lys Ser Arg Cys Val Ser Val Gln

85 90 95

Thr Asp Pro Thr Asp Glu Val Pro Thr Lys Lys Ser Lys Lys His Lys

100 105 110

Lys His Lys Asn Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Lys

115 120 125

Tyr Lys Arg Gln Pro Glu Glu Ser Glu Ser Lys Leu Lys Ser His His

130 135 140

Asp Gly Asn Leu Glu Ser Asp Ser Phe Leu Lys Phe Asp Ser Glu Pro

145 150 155 160

Ser Ala Ala Ala Leu Glu His Pro Val Arg Ala Phe Gly Leu Ser Glu

165 170 175

Ala Ser Glu Thr Ala Leu Val Leu Glu Pro Pro Val Val Ser Met Glu

180 185 190

Val Gln Glu Ser His Val Leu Glu Thr Leu Lys Pro Ala Thr Lys Ala

195 200 205

Ala Glu Leu Ser Val Val Ser Thr Ser Val Ile Ser Glu Gln Ser Glu

210 215 220

Gln Pro Met Pro Gly Met Leu Glu Pro Ser Met Thr Lys Ile Leu Asp

225 230 235 240

Ser Phe Thr Ala Ala Pro Val Pro Met Ser Thr Ala Ala Leu Lys Ser

245 250 255

Pro Glu Pro Val Val Thr Met Ser Val Glu Tyr Gln Lys Ser Val Leu

260 265 270

Lys Ser Leu Glu Thr Met Pro Pro Glu Thr Ser Lys Thr Thr Leu Val

275 280 285

Glu Leu Pro Ile Ala Lys Val Val Glu Pro Ser Glu Thr Leu Thr Ile

290 295 300

Val Ser Glu Thr Pro Thr Glu Val His Pro Glu Pro Ser Pro Ser Thr

305 310 315 320

Met Asp Phe Pro Glu Ser Ser Thr Thr Asp Val Gln Arg Leu Pro Glu

325 330 335

Gln Pro Val Glu Ala Pro Ser Glu Ile Ala Asp Ser Ser Met Thr Arg

340 345 350

Pro Gln Glu Ser Leu Glu Leu Pro Lys Thr Thr Ala Val Glu Leu Gln

355 360 365

Glu Ser Thr Val Ala Ser Ala Leu Glu Leu Pro Gly Pro Pro Ala Thr

370 375 380

Ser Ile Leu Glu Leu Gln Gly Pro Pro Val Thr Pro Val Pro Glu Leu

385 390 395 400

Pro Gly Pro Ser Ala Thr Pro Val Pro Glu Leu Ser Gly Pro Leu Ser

405 410 415

Thr Pro Val Pro Glu Leu Pro Gly Pro Pro Ala Thr Val Val Pro Glu

420 425 430

Leu Pro Gly Pro Ser Val Thr Pro Val Pro Gln Leu Ser Gln Glu Leu

435 440 445

Pro Gly Pro Pro Ala Pro Ser Met Gly Leu Glu Pro Pro Gln Glu Val

450 455 460

Pro Glu Pro Pro Val Met Ala Gln Glu Leu Ser Gly Val Pro Ala Val

465 470 475 480

Ser Ala Ala Ile Glu Leu Thr Gly Gln Pro Ala Val Thr Val Ala Met

485 490 495

Glu Leu Thr Glu Gln Pro Val Thr Thr Thr Glu Phe Glu Gln Pro Val

500 505 510

Ala Met Thr Thr Val Glu His Pro Gly His Pro Glu Val Thr Thr Ala

515 520 525

Thr Gly Leu Leu Gly Gln Pro Glu Ala Ala Met Val Leu Glu Leu Pro

530 535 540

Gly Gln Pro Val Ala Thr Thr Ala Leu Glu Leu Ser Gly Gln Pro Ser

545 550 555 560

Val Thr Gly Val Pro Glu Leu Ser Gly Leu Pro Ser Ala Thr Arg Ala

565 570 575

Leu Glu Leu Ser Gly Gln Ser Val Ala Thr Gly Ala Leu Glu Leu Pro

580 585 590

Gly Gln Leu Met Ala Thr Gly Ala Leu Glu Phe Ser Gly Gln Ser Gly

595 600 605

Ala Ala Gly Ala Leu Glu Leu Leu Gly Gln Pro Leu Ala Thr Gly Val

610 615 620

Leu Glu Leu Pro Gly Gln Pro Gly Ala Pro Glu Leu Pro Gly Gln Pro

625 630 635 640

Val Ala Thr Val Ala Leu Glu Ile Ser Val Gln Ser Val Val Thr Thr

645 650 655

Ser Glu Leu Ser Thr Met Thr Val Ser Gln Ser Leu Glu Val Pro Ser

660 665 670

Thr Thr Ala Leu Glu Ser Tyr Asn Thr Val Ala Gln Glu Leu Pro Thr

675 680 685

Thr Leu Val Gly Glu Thr Ser Val Thr Val Gly Val Asp Pro Leu Met

690 695 700

Ala Gln Glu Ser His Met Leu Ala Ser Asn Thr Met Glu Thr His Met

705 710 715 720

Leu Ala Ser Asn Thr Met Asp Ser Gln Met Leu Ala Ser Asn Thr Met

725 730 735

Asp Ser Gln Met Leu Ala Ser Asn Thr Met Asp Ser Gln Met Leu Ala

740 745 750

Ser Ser Thr Met Asp Ser Gln Met Leu Ala Ser Ser Thr Met Asp Ser

755 760 765

Gln Met Leu Ala Thr Ser Thr Met Asp Ser Gln Met Leu Ala Thr Ser

770 775 780

Ser Met Asp Ser Gln Met Leu Ala Thr Ser Ser Met Asp Ser Gln Met

785 790 795 800

Leu Ala Thr Ser Ser Met Asp Ser Gln Met Leu Ala Thr Ser Ser Met

805 810 815

Asp Ser Gln Met Leu Ala Thr Ser Ser Met Asp Ser Gln Met Leu Ala

820 825 830

Thr Ser Ser Met Asp Ser Gln Met Leu Ala Thr Ser Ser Met Asp Ser

835 840 845

Gln Met Leu Ala Thr Ser Ser Met Asp Ser Gln Met Leu Ala Ser Gly

850 855 860

Ala Met Asp Ser Gln Met Leu Ala Ser Gly Thr Met Asp Ala Gln Met

865 870 875 880

Leu Ala Ser Gly Thr Met Asp Ala Gln Met Leu Ala Ser Ser Thr Gln

885 890 895

Asp Ser Ala Met Met Gly Ser Lys Ser Pro Asp Pro Tyr Arg Leu Ala

900 905 910

Gln Asp Pro Tyr Arg Leu Ala Gln Asp Pro Tyr Arg Leu Gly His Asp

915 920 925

Pro Tyr Arg Leu Gly His Asp Ala Tyr Arg Leu Gly Gln Asp Pro Tyr

930 935 940

Arg Leu Gly His Asp Pro Tyr Arg Leu Thr Pro Asp Pro Tyr Arg Val

945 950 955 960

Ser Pro Arg Pro Tyr Arg Ile Ala Pro Arg Ser Tyr Arg Ile Ala Pro

965 970 975

Arg Pro Tyr Arg Leu Ala Pro Arg Pro Leu Met Leu Ala Ser Arg Arg

980 985 990

Ser Met Met Met Ser Tyr Ala Ala Glu Arg Ser Met Met Ser Ser Tyr

995 1000 1005

Glu Arg Ser Met Met Ser Tyr Glu Arg Ser Met Met Ser Pro Met Ala

1010 1015 1020

Glu Arg Ser Met Met Ser Ala Tyr Glu Arg Ser Met Met Ser Ala Tyr

1025 1030 1035 1040

Glu Arg Ser Met Met Ser Pro Met Ala Glu Arg Ser Met Met Ser Ala

1045 1050 1055

Tyr Glu Arg Ser Met Met Ser Ala Tyr Glu Arg Ser Met Met Ser Pro

1060 1065 1070

Met Ala Asp Arg Ser Met Met Ser Met Gly Ala Asp Arg Ser Met Met

1075 1080 1085

Ser Ser Tyr Ser Ala Ala Asp Arg Ser Met Met Ser Ser Tyr Ser Ala

1090 1095 1100

Ala Asp Arg Ser Met Met Ser Ser Tyr Thr Asp Arg Ser Met Met Ser

1105 1110 1115 1120

Met Ala Ala Asp Ser Tyr Thr Asp Ser Tyr Thr Asp Ser Tyr Thr Glu

1125 1130 1135

Ala Tyr Met Val Pro Pro Leu Pro Pro Glu Glu Pro Pro Thr Met Pro

1140 1145 1150

Pro Leu Pro Pro Glu Glu Pro Pro Met Thr Pro Pro Leu Pro Pro Glu

1155 1160 1165

Glu Pro Pro Glu Gly Pro Ala Leu Ser Thr Glu Gln Ser Ala Leu Thr

1170 1175 1180

Ala Asp Asn Thr Trp Ser Thr Glu Val Thr Leu Ser Thr Gly Glu Ser

1185 1190 1195 1200

Leu Ser Gln Pro Glu Pro Pro Val Ser Gln Ser Glu Ile Ser Glu Pro

1205 1210 1215

Met Ala Val Pro Ala Asn Tyr Ser Met Ser Glu Ser Glu Thr Ser Met

1220 1225 1230

Leu Ala Ser Glu Ala Val Met Thr Val Pro Glu Pro Ala Arg Glu Pro

1235 1240 1245

Glu Ser Ser Val Thr Ser Ala Pro Val Glu Ser Ala Val Val Ala Glu

1250 1255 1260

His Glu Met Val Pro Glu Arg Pro Met Thr Tyr Met Val Ser Glu Thr

1265 1270 1275 1280

Thr Met Ser Val Glu Pro Ala Val Leu Thr Ser Glu Ala Ser Val Ile

1285 1290 1295

Ser Glu Thr Ser Glu Thr Tyr Asp Ser Met Arg Pro Ser Gly His Ala

1300 1305 1310

Ile Ser Glu Val Thr Met Ser Leu Leu Glu Pro Ala Val Thr Ile Ser

1315 1320 1325

Gln Pro Ala Glu Asn Ser Leu Glu Leu Pro Ser Met Thr Val Pro Ala

1330 1335 1340

Pro Ser Thr Met Thr Thr Thr Glu Ser Pro Val Val Ala Val Thr Glu

1345 1350 1355 1360

Ile Pro Pro Val Ala Val Pro Glu Pro Pro Ile Met Ala Val Pro Glu

1365 1370 1375

Leu Pro Thr Met Ala Val Val Lys Thr Pro Ala Val Ala Val Pro Glu

1380 1385 1390

Pro Leu Val Ala Ala Pro Glu Pro Pro Thr Met Ala Thr Pro Glu Leu

1395 1400 1405

Cys Ser Leu Ser Val Ser Glu Pro Pro Val Ala Val Ser Glu Leu Pro

1410 1415 1420

Ala Leu Ala Asp Pro Glu His Ala Ile Thr Ala Val Ser Gly Val Ser

1425 1430 1435 1440

Ser Leu Glu Pro Ser Val Pro Ile Leu Glu Pro Ala Val Ser Val Leu

1445 1450 1455

Gln Pro Val Met Ile Val Ser Glu Pro Ser Val Pro Val Gln Glu Pro

1460 1465 1470

Thr Val Ala Val Ser Glu Pro Ala Val Ile Val Ser Glu His Thr Gln

1475 1480 1485

Ile Thr Ser Pro Glu Met Ala Val Glu Ser Ser Pro Val Ile Val Asp

1490 1495 1500

Ser Ser Val Met Ser Ser Gln Ile Met Lys Gly Met Asn Leu Leu Gly

1505 1510 1515 1520

Gly Asp Glu Asn Leu Gly Pro Glu Val Gly Met Gln Glu Thr Leu Leu

1525 1530 1535

His Pro Gly Glu Glu Pro Arg Asp Gly Gly His Leu Lys Ser Asp Leu

1540 1545 1550

Tyr Glu Asn Glu Tyr Asp Arg Asn Ala Asp Leu Thr Val Asn Ser His

1555 1560 1565

Leu Ile Val Lys Asp Ala Glu His Asn Thr Val Cys Ala Thr Thr Val

1570 1575 1580

Gly Pro Val Gly Glu Ala Ser Glu Glu Lys Ile Leu Pro Ile Ser Glu

1585 1590 1595 1600

Thr Lys Glu Ile Thr Glu Leu Ala Thr Cys Ala Ala Val Ser Glu Ala

1605 1610 1615

Asp Ile Gly Arg Ser Leu Ser Ser Gln Leu Ala Leu Glu Leu Asp Thr

1620 1625 1630

Val Gly Thr Ser Lys Gly Phe Glu Phe Val Thr Ala Ser Ala Leu Ile

1635 1640 1645

Ser Glu Ser Lys Tyr Asp Val Glu Val Ser Val Thr Thr Gln Asp Thr

1650 1655 1660

Glu His Asp Met Val Ile Ser Thr Ser Pro Ser Gly Gly Ser Glu Ala

1665 1670 1675 1680

Asp Ile Glu Gly Pro Leu Pro Ala Lys Asp Ile His Leu Asp Leu Pro

1685 1690 1695

Ser Thr Asn Phe Val Cys Lys Asp Val Glu Asp Ser Leu Pro Ile Lys

1700 1705 1710

Glu Ser Ala Gln Ala Val Ala Val Ala Leu Ser Pro Lys Glu Ser Ser

1715 1720 1725

Glu Asp Thr Glu Val Pro Leu Pro Asn Lys Glu Ile Val Pro Glu Ser

1730 1735 1740

Gly Tyr Ser Ala Ser Ile Asp Glu Ile Asn Glu Ala Asp Leu Val Arg

1745 1750 1755 1760

Pro Leu Leu Pro Lys Asp Met Glu Arg Leu Thr Ser Leu Arg Ala Gly

1765 1770 1775

Ile Glu Gly Pro Leu Leu Ala Ser Glu Val Glu Arg Asp Lys Ser Ala

1780 1785 1790

Ala Ser Pro Val Val Ile Ser Ile Pro Glu Arg Ala Ser Glu Ser Ser

1795 1800 1805

Ser Glu Glu Lys Asp Asp Tyr Glu Ile Phe Val Lys Val Lys Asp Thr

1810 1815 1820

His Glu Lys Ser Lys Lys Asn Lys Asn Arg Asp Lys Gly Glu Lys Glu

1825 1830 1835 1840

Lys Lys Arg Asp Ser Ser Leu Arg Ser Arg Ser Lys Arg Ser Lys Ser

1845 1850 1855

Ser Glu His Lys Ser Arg Lys Arg Thr Ser Glu Ser Arg Ser Arg Ala

1860 1865 1870

Arg Lys Arg Ser Ser Lys Ser Lys Ser His Arg Ser Gln Thr Arg Ser

1875 1880 1885

Arg Ser Arg Ser Arg Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Ser Arg Ser Lys

1890 1895 1900

Ser Arg Gly Arg Arg Ser Val Ser Lys Glu Lys Arg Lys Arg Ser Pro

1905 1910 1915 1920

Lys His Arg Ser Lys Ser Arg Glu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Ser Ser

1925 1930 1935

Arg Asp Asn Arg Lys Ala Ala Arg Ala Arg Ser Arg Thr Pro Ser Arg

1940 1945 1950

Arg Ser Arg Ser His Thr Pro Ser Arg Arg Arg Arg Ser Arg Ser Val

1955 1960 1965

Gly Arg Arg Arg Ser Phe Ser Ile Ser Pro Ser Arg Arg Ser Arg Thr

1970 1975 1980

Pro Ser Arg Arg Ser Arg Thr Pro Ser Arg Arg Ser Arg Thr Pro Ser

1985 1990 1995 2000

Arg Arg Ser Arg Thr Pro Ser Arg Arg Ser Arg Thr Pro Ser Arg Arg

2005 2010 2015

Arg Arg Ser Arg Ser Ala Val Arg Arg Arg Ser Phe Ser Ile Ser Pro

2020 2025 2030

Val Arg Leu Arg Arg Ser Arg Thr Pro Leu Arg Arg Arg Phe Ser Arg

2035 2040 2045

Ser Pro Ile Arg Arg Lys Arg Ser Arg Ser Ser Glu Arg Gly Arg Ser

2050 2055 2060

Pro Lys Arg Leu Thr Asp Leu Asp Lys Ala Gln Leu Leu Glu Ile Ala

2065 2070 2075 2080

Lys Ala Asn Ala Ala Ala Met Cys Ala Lys Ala Gly Val Pro Leu Pro

2085 2090 2095

Pro Asn Leu Lys Pro Ala Pro Pro Pro Thr Ile Glu Glu Lys Val Ala

2100 2105 2110

Lys Lys Ser Gly Gly Ala Thr Ile Glu Glu Leu Thr Glu Lys Cys Lys

2115 2120 2125

Gln Ile Ala Gln Ser Lys Glu Asp Asp Asp Val Ile Val Asn Lys Pro

2130 2135 2140

His Val Ser Asp Glu Glu Glu Glu Glu Pro Pro Phe Tyr His His Pro

2145 2150 2155 2160

Phe Lys Leu Ser Glu Pro Lys Pro Ile Phe Phe Asn Leu Asn Ile Ala

2165 2170 2175

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2180 2185 2190

Phe Pro Val Ser Ser Gly Ser Gln His Arg Lys Lys Glu Ala Asp Ser

2195 2200 2205

Val Tyr Gly Glu Trp Val Pro Val Glu Lys Asn Gly Glu Glu Ser Lys

2210 2215 2220

Asp Asp Asp Asn Val Phe Ser Ser Ser Leu Pro Ser Glu Pro Val Asp

2225 2230 2235 2240

Ile Ser Thr Ala Met Ser Glu Arg Ala Leu Ala Gln Lys Arg Leu Ser

2245 2250 2255

Glu Asn Ala Phe Asp Leu Glu Ala Met Ser Met Leu Asn Arg Ala Gln

2260 2265 2270

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2275 2280 2285

Thr Gly Ser Thr Gly Val Gln Val Leu Thr Gln Glu Gln Leu Ala Asn

2290 2295 2300

Thr Gly Ala Gln Ala Trp Ile Lys Lys Asp Gln Phe Leu Arg Ala Ala

2305 2310 2315 2320

Pro Val Thr Gly Gly Met Gly Ala Val Leu Met Arg Lys Met Gly Trp

2325 2330 2335

Arg Glu Gly Glu Gly Leu Gly Lys Asn Lys Glu Gly Asn Lys Glu Pro

2340 2345 2350

Ile Leu Val Asp Phe Lys Thr Asp Arg Lys Gly Leu Val Ala Val Gly

2355 2360 2365

Glu Arg Ala Gln Lys Arg Ser Gly Asn Phe Ser Ala Ala Met Lys Asp

2370 2375 2380

Leu Ser Gly Lys His Pro Val Ser Ala Leu Met Glu Ile Cys Asn Lys

2385 2390 2395 2400

Arg Arg Trp Gln Pro Pro Glu Phe Leu Leu Val His Asp Ser Gly Pro

2405 2410 2415

Asp His Arg Lys His Phe Leu Phe Arg Val Leu Arg Asn Gly Ser Pro

2420 2425 2430

Tyr Gln Pro Asn Cys Met Phe Phe Leu Asn Arg Tyr

2435 2440

Claims

1.一种生物活性肽SEPKPIFF，其特征在于，其氨基酸序列为Ser-Glu-Pro-Lys-Pro-Ile-Phe-Phe。

2.编码权利要求1所述生物活性肽SEPKPIFF的多核苷酸。

3.如权利要求1所述生物活性肽SEPKPIFF的制备方法，其特征在于，直接通过化学合成制备。