CN112812170A - 具有氨基酸结构llpkkte的生物活性多肽及其制备方法和应用 - Google Patents

具有氨基酸结构llpkkte的生物活性多肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及蛋白领域，具体涉及具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽及其制备方法和应用。具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽选自以下多肽中的一种或几种：生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK。经过体外免疫功能调节实验，验证了该七种多肽具有较好的免疫调节功能。本发明的七种多肽具有促进体外巨噬细胞吞噬中性红能力，能够提高人体的免疫力，降低机体发病率，促进淋巴细胞增殖，提高生命的质量，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。

Description

具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及蛋白领域，尤其是涉及具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽及其制备方法和应用。
背景技术
生物活性肽因其具有很多潜在的生物功能，所以引起人们越来越多的关注，成为科学研究的热点之一。目前很多生物活性肽的有益效果也已经得到了很好的证明，如抗癌、降血压、抗菌、降胆固醇、抗糖尿病等等特性。当前最权威的生物活性肽数据库BIOPEP-UMW中已报告了3000多个不同的生物活性肽，但是由于生活肽的数量实在是太多，所以，还有非常多的多肽有待研究其相关性能。
目前对于生物活性肽的研究多集中于食物衍生多肽，对非食物衍生多肽研究和报道较少。且已经有研究结果证实，与食物衍生的生物活性肽相比，非食物衍生的生物活性肽具有更高的亲和力并能有效发挥其生物活性功能。
免疫调节肽是继阿片肽发现后首次从乳中获得并证明其生理活性的一类生物活性多肽。1981年Jolles等人首次发现，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，可以得到一个氨基酸序列为Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr的六肽，体外实验证明该肽能够增强小鼠腹腔巨噬细胞对绵羊红细胞的吞噬作用。Migliore-Samour等人发现来自酪蛋白的六肽Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp能够刺激绵羊血红细胞对小鼠腹膜巨噬细胞的吞噬作用以及增强对于肺炎克雷伯菌的抵抗，具有抗炎功能。李素萍等人用合成的小鼠骨髓巨噬细胞来与源肽(PGPIPN)饲喂大鼠发现大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬作用和红细胞相关的抗炎功能有显著的增强。Bowdis等人在研究来源于牛中性粒细胞的13氨基酸肽indolicidin的免疫功能时发现，多肽indolicidin在巨噬细胞样细胞系中抑制LPS诱导的TNF-α产量。
但是当小肽或多肽未从蛋白质中酶解分离时，这些蛋白质本身往往是不具备免疫调节活性的。如何从已知氨基酸序列的种类繁多的蛋白质中寻找具有特定功能的生物活性肽，并研究这些多肽的功能是蛋白领域研究的方向之一。
Histone H2A type 1-F、Histone H2A type 2-C、Histone H2A.J和Histone H2Atype 1-K蛋白氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8～SEQ ID NO：11所示。目前，现有技术中并没有关于Histone H2A type 1-F、Histone H2A type 2-C、Histone H2A.J和Histone H2Atype 1-K蛋白多肽片段相关功能的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽及其制备方法和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面，提供具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽，选自以下多肽中的一种或几种：
生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK，
其氨基酸序列分别为：
Leu-Leu-Pro-Lys-Lys-Thr-Glu-Ser-His-His-Lys-Pro-Lys-Gly，
Leu-Leu-Pro-Lys-Lys-Thr-Glu-Ser-His-His-Lys-Pro-Lys-Gly-Lys，
Val-Leu-Leu-Pro-Lys-Lys-Thr-Glu-Ser-His-His-Lys-Pro-Lys-Gly-Lys，
Leu-Leu-Pro-Lys-Lys-Thr-Glu-Ser-His-Lys-Ala-Lys-Ser，
Leu-Leu-Pro-Lys-Lys-Thr-Glu-Ser-Gln-Lys-Val-Lys-Ser，
Leu-Leu-Pro-Lys-Lys-Thr-Glu-Ser-Gln-Lys-Val-Lys-Ser-Lys，
Leu-Leu-Pro-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-His-His-Lys-Ala-Lys-Gly-Lys
序列分别如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：7所示。
较优的，所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK为小鼠脾脏来源淋巴细胞肽。
具体LLPKKTESHHKPKG、LLPKKTESHHKPKGK和VLLPKKTESHHKPKGK来源于Histone H2Atype 1-F蛋白第116～129位、第116～130位和第115～130位，LLPKKTESHKAKS来源于Histone H2A type 2-C蛋白第116～128位，LLPKKTESQKVKS、LLPKKTESQKVKSK分别来源于Histone H2A.J蛋白第116～128位、第116～129位，LLPKKTETHHKAKGK来源于Histone H2Atype 1-K蛋白第116～130位，Histone H2A type 1-F、Histone H2A type 2-C、HistoneH2A.J和Histone H2A type 1-K蛋白氨基酸序列分别如SEQ ID NO：8～SEQ ID NO：11所示。
Histone H2A type 1-F、Histone H2A type 2-C、Histone H2A.J和Histone H2Atype 1-K蛋白的氨基酸序列以及对应的核苷酸序列为既有技术，编码Histone H2A type1-F蛋白第116～129位、第116～130位和第115～130位，Histone H2A type 2-C蛋白第116～128位，Histone H2A.J蛋白第116～128位、第116～129位，Histone H2A type 1-K蛋白第116～130位氨基酸残基的核苷酸片段能编码成熟的七种生物活性多肽。
较优的，所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK具有抗炎功能和免疫调节功能。
本发明还提供编码所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK的多核苷酸。
本发明第二方面，提供了具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽的制备方法，可以通过基因工程的方法人工合成，可以从细胞中通过分离纯化的方法直接获得，可以直接通过化学合成制备。
通过基因工程的方法人工合成具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽是本领域技术人员能够实现的技术方案，例如可以是以DNA重组技术为基础，通过合适的DNA模板来控制多肽的序列合成。
关于从细胞中通过分离纯化的方法直接获得的方式可以为：基于给定的具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽的氨基酸序列，采用生物学技术上常规的酶解、纯化方法从小鼠脾脏来源淋巴细胞获得所述具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽。
本发明第三方面，提供了具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽在制备具有抗炎功能的药物或化妆品中的应用，具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽，选自以下多肽中的一种或几种：生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK。
具体而言，本发明的七种生物活性多肽可以用于制备具有抗炎的药物。
本发明第四方面，提供了具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽在制备具有免疫调节功能的食物或药物中的应用，具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽，选自以下多肽中的一种或几种：生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK。
具体而言，本发明生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK中一种或多种的组合在制备促进淋巴细胞增殖的食物或药物中的应用。
具体而言，本发明生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK中一种或多种的组合在制备促进体外巨噬细胞吞噬中性红能力的食物或药物中的应用。
本发明第五方面，提供了一种抗炎产品，包括所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK中一种或多种的组合或所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK的衍生物中的一种或几种的组合；所述的抗炎产品包括抗炎药物或抗炎化妆品。
本发明第六方面，提供了一种具有免疫调节功能的产品，包括所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK中一种或多种的组合或所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK的衍生物中的一种或几种的组合；所述具有免疫调节功能的产品包括具有免疫调节功能的食品或具有免疫调节功能的药物。
所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK的衍生物，是指具有与所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK相同的活性或更优的活性。
所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK的衍生物，是指在所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。
本发明具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽的有益效果为：本发明的小鼠脾脏来源淋巴细胞的生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK具有较好的抗炎活性；本发明的七种生物活性多肽具有促进体外巨噬细胞吞噬中性红能力，能够提高人体的免疫力，降低机体发病率，促进淋巴细胞增殖，提高生命的质量，对开发具有免疫调节功能的食品、保健品和药物具有十分重要的意义。
附图说明
图1：质荷比为400.7383的片段的一级质谱图(m/z＝400.7383)；
图2：质荷比为400.7383的片段的二级质谱图和多肽az、by断裂情况；
图3：质荷比为432.7627的片段的一级质谱图(m/z＝432.7627)；
图4：质荷比为432.7627的片段的二级质谱图和多肽az、by断裂情况；
图5：质荷比为367.4724的片段的一级质谱图(m/z＝367.4724)；
图6：质荷比为367.4724的片段的二级质谱图和多肽az、by断裂情况；
图7：质荷比为372.231的片段的一级质谱图(m/z＝372.231)；
图8：质荷比为372.231的片段的二级质谱图和多肽az、by断裂情况；
图9：质荷比为538.6704的片段的一级质谱图(m/z＝538.6704)；
图10：质荷比为538.6704的片段的二级质谱图和多肽az、by断裂情况；
图11：质荷比为429.7625的片段的一级质谱图(m/z＝429.7625)；
图12：质荷比为429.7625的片段的二级质谱图和多肽az、by断裂情况；
图13：质荷比为457.53的片段的一级质谱图(m/z＝457.53)；
图14：质荷比为457.53的片段的二级质谱图和多肽az、by断裂情况；
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方案之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1七种生物活性肽的人工合成
一、生物活性肽的合成
1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。
2. 2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。
3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。
4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
5.称取氨基酸Leu适量和1-羟基-苯并三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
6. 2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐:DIEA:DCM＝1:1:2,v:v:v)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。
7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4，v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
9.称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
10. 1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。
11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4,v:v)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
12.按照步骤9-11依次接上氨基酸Leu、Leu、Pro、Lys、Lys、Thr、Glu、Ser、His、His、Lys、Pro、Lys、Gly。
13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1，v:v:v)将多肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9,v:v)离心沉降四次。
至此，人工合成了生物活性肽LLPKKTESHHKPKG。
其它六种生物活性肽的合成方法参考上面方法，只需在第5步选用特定生物活性肽对应的首个氨基酸，以及在第12步连接特定生物活性肽对应的氨基酸。
二、生物活性肽的确认
1)UPLC分析
UPLC条件如下：
仪器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱仪
色谱柱规格：BEH C18色谱柱
流速：0.4mL/min
温度：50℃
紫外检测波长：210nm
进样量：2μL
梯度条件：A液：含有0.1％甲酸(v/v)的水，B液：含有0.1％甲酸(v/v)的乙腈
Figure BDA0002910021290000071
2)质谱分析
质谱条件如下：
离子方式：ES+
质量范围(m/z)：100、1000
毛细管电压(Capillary)(kV)：3.0
采样锥(V)：35.0
离子源温度(℃)：115
去溶剂温度(℃)：350
去溶剂气流(L/hr)：700.0
碰撞能量(eV)：4.0
扫描时间(sec)：0.25
内扫描时间(sec)：0.02
根据以上分析方法，利用超高效液相、电喷雾、四级杆、飞行时间质谱，对七种生物活性肽进行色谱分析和质谱分析。
生物活性肽LLPKKTESHHKPKG一级质谱图如图1所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图2所示，可得此峰的多肽质荷比为400.7383，保留时间是4.49min。
生物活性肽LLPKKTESHHKPKGK的质量色谱提取图如图3所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图4所示，可得此峰的多肽质荷比为432.7627，保留时间是4.45min。
生物活性肽LLPKKTESHKAKS的质量色谱提取图如图5所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图6所示，可得此峰的多肽质荷比为367.4724，保留时间是4.48min。
生物活性肽LLPKKTESQKVKS的质量色谱提取图如图7所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图8所示，可得此峰的多肽质荷比为372.231，保留时间是6.57min。
生物活性肽LLPKKTESQKVKSK的质量色谱提取图如图9所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图10所示，可得此峰的多肽质荷比为538.6704，保留时间是6.34min。
生物活性肽LLPKKTETHHKAKGK的质量色谱提取图如图11所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图12所示，可得此峰的多肽质荷比为429.7625，保留时间是3.1min。
生物活性肽VLLPKKTESHHKPKGK的质量色谱提取图如图13所示，提取峰的二级质谱图和az、by断裂情况如图14所示，可得此峰的多肽质荷比为457.53，保留时间是6.26min。
3)结果
由图2可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比400.7383的片段序列为Leu、Leu、Pro、Lys、Lys、Thr、Glu、Ser、His、His、Lys、Pro、Lys、Gly(LLPKKTESHHKPKG)，记为SEQ ID NO：1。该片段与Histone H2A type 1-F蛋白第116～129位的残基序列相对应，Histone H2A type 1-F蛋白氨基酸序列见SEQ ID NO：8。
由图4可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比432.7627的片段序列为Leu、Leu、Pro、Lys、Lys、Thr、Glu、Ser、His、His、Lys、Pro、Lys、Gly、Lys(LLPKKTESHHKPKGK)，记为SEQ ID NO：2。该片段与Histone H2A type 1-F蛋白第116～130位残基序列相对应，Histone H2A type 1-F蛋白氨基酸序列见SEQ ID NO：8。
由图6可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比367.4724的片段序列为Leu、Leu、Pro、Lys、Lys、Thr、Glu、Ser、His、Lys、Ala、Lys、Ser(LLPKKTESHKAKS)，记为SEQ ID NO：3。该片段与Histone H2A type 2-C蛋白第116～128位的残基序列相对应，Histone H2A type 2-C蛋白氨基酸序列见SEQ ID NO：9。
由图8可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比372.231的片段序列为Leu、Leu、Pro、Lys、Lys、Thr、Glu、Ser、Gln、Lys、Val、Lys、Ser(LLPKKTESQKVKS)，记为SEQ ID NO：4。该片段与Histone H2A.J蛋白第116～128位的残基序列相对应，Histone H2A.J蛋白氨基酸序列见SEQ ID NO：10。
由图10可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比538.6704的片段序列为Leu、Leu、Pro、Lys、Lys、Thr、Glu、Ser、Gln、Lys、Val、Lys、Ser、Lys(LLPKKTESQKVKSK)，记为SEQ ID NO：5。该片段与Histone H2A.J蛋白第116～129位的残基序列相对应，Histone H2A.J蛋白氨基酸序列见SEQ ID NO：10。
由图12可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比429.7625的片段序列为Leu、Leu、Pro、Lys、Lys、Thr、Glu、Thr、His、His、Lys、Ala、Lys、Gly、Lys(LLPKKTETHHKAKGK)，记为SEQ ID NO：6。该片段与Histone H2A type 1-K蛋白第116～130位的残基序列相对应，Histone H2A type 1-K蛋白氨基酸序列见SEQ ID NO：11。
由图14可知，根据az、by断裂的情况，经过Mascot软件分析计算，得到质荷比457.53的片段序列为Val、Leu、Leu、Pro、Lys、Lys、Thr、Glu、Ser、His、His、Lys、Pro、Lys、Gly、Lys(VLLPKKTESHHKPKGK)，记为SEQ ID NO：7。该片段与Histone H2A type 1-F蛋白第115～130位的残基序列相对应，Histone H2A type 1-F蛋白氨基酸序列见SEQ ID NO：8。
实施例2生物活性肽的免疫调节活性实验
一、生物活性肽LLPKKTESHHKPKG的促巨噬细胞吞噬中性红能力实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含生物活性肽(0.1mg/ml)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔为实验组，添加不含活性肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔进行培养的设为空白组；并且实验组和空白组在培养到24h时加入LPS至终浓度10μg/ml；继续培养至48h后，吸弃细胞培养液。PBS清洗孔底后加入37℃的中性红染液80μl/孔，10分钟后吸弃染液，用PBS清洗两次后，每孔加入150μl细胞裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1:1，v/v)。4℃隔夜溶解后，在波长540nm下测定吸光度值(OD540)。
3.实验结果及分析：
表1生物活性肽LLPKKTESHHKPKG促巨噬细胞吞噬中性红能力的测定
实验分组 吸光度值(OD540)
空白组 0.1079±0.0314
实验组 0.1238±0.0294*
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)
实验结果见表1，与细胞空白相比较，添加0.1mg/ml生物活性肽的炎症组巨噬细胞吞噬中性红能力明显增加，而且与细胞空白组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。说明生物活性肽LLPKKTESHHKPKG在有炎症发生的情况下对体外巨噬细胞吞噬中性红能力具有显著的促进作用。
二、生物活性肽LLPKKTESHHKPKG的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)
1.实验材料与仪器：
试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽LLPKKTESHHKPKG；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(CorolasePP，购自AB公司)。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱，Heraeus公司；DragonWellscan MK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。
2.实验方法：
无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行原代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×106个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入：100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL生物活性肽样品。另外，设置空白对照组(pH7.2～7.4，3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA)，研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5％CO2 37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。
体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：
Figure BDA0002910021290000111
式中：A1为空白对照在570nm处下的吸光值；A2为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A3为实验组在570nm处下的吸光值。
3.实验结果及分析：
表2生物活性肽LLPKKTESHHKPKG对体外淋巴细胞增殖的影响
实验分组 刺激指数SI
BSA 1
生物活性肽 1.184±0.014**
注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；
**号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表2。由表2可知，在生物活性肽的质量浓度为500μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.184，和阴性对照组具有显著差异(P<0.01)。因此，可以认定该生物活性肽LLPKKTESHHKPKG具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。
三、生物活性肽LLPKKTESHHKPKGK的促巨噬细胞吞噬中性红能力实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含生物活性肽(0.1mg/ml)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔为实验组，添加不含活性肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔进行培养的设为空白组；并且实验组和空白组在培养到24h时加入LPS至终浓度10μg/ml；继续培养至48h后，吸弃细胞培养液。PBS清洗孔底后加入37℃的中性红染液80μl/孔，10分钟后吸弃染液，用PBS清洗两次后，每孔加入150μl细胞裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1:1，v/v)。4℃隔夜溶解后，在波长540nm下测定吸光度值(OD540)。
3.实验结果及分析：
表3生物活性肽LLPKKTESHHKPKGK促巨噬细胞吞噬中性红能力的测定
Figure BDA0002910021290000112
Figure BDA0002910021290000121
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)
实验结果见表3，与细胞空白相比较，添加0.1mg/ml生物活性肽的炎症组巨噬细胞吞噬中性红能力明显增加，而且与细胞空白组比较，具有极显著性差异(P＜0.01)。说明生物活性肽LLPKKTESHHKPKGK在有炎症发生的情况下对体外巨噬细胞吞噬中性红能力具有显著的促进作用。
四、生物活性肽LLPKKTESHHKPKGK的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)
1.实验材料与仪器：
试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽LLPKKTESHHKPKGK；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(CorolasePP，购自AB公司)。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱，Heraeus公司；DragonWellscan MK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。
2.实验方法：
无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行原代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×106个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入：100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL生物活性肽样品。另外，设置空白对照组(pH7.2～7.4，3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA)，研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5％CO2 37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。
体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：
Figure BDA0002910021290000122
式中：A1为空白对照在570nm处下的吸光值；A2为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A3为实验组在570nm处下的吸光值。
3.实验结果及分析：
表4生物活性肽LLPKKTESHHKPKGK对体外淋巴细胞增殖的影响
实验分组 刺激指数SI
BSA 1
生物活性肽 1.195±0.015**
注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；
**号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表4。由表4可知，在生物活性肽的质量浓度为500μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.195，和阴性对照组具有显著差异(P<0.01)。因此，可以认定该生物活性肽LLPKKTESHHKPKGK具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。
五、生物活性肽LLPKKTESHKAKS的促巨噬细胞吞噬中性红能力实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性多肽LLPKKTESHKAKS；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含生物活性肽(0.1mg/ml)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔为实验组，添加不含活性肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔进行培养的设为空白组；并且实验组和空白组在培养到24h时加入LPS至终浓度10μg/ml；继续培养至48h后，吸弃细胞培养液。PBS清洗孔底后加入37℃的中性红染液80μl/孔，10分钟后吸弃染液，用PBS清洗两次后，每孔加入150μl细胞裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1:1，v/v)。4℃隔夜溶解后，在波长540nm下测定吸光度值(OD540)。
3.实验结果及分析：
表5生物活性肽LLPKKTESHKAKS促巨噬细胞吞噬中性红能力的测定
实验分组 吸光度值(OD540)
空白组 0.1123±0.0342
实验组 0.1483±0.0119*
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)
实验结果见表5，与细胞空白相比较，添加0.1mg/ml生物活性肽的炎症组巨噬细胞吞噬中性红能力明显增加，而且与细胞空白组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。说明生物活性肽LLPKKTESHKAKS在有炎症发生的情况下对体外巨噬细胞吞噬中性红能力具有显著的促进作用。
六、生物活性肽LLPKKTESHKAKS的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)
1.实验材料与仪器：
试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽LLPKKTESHKAKS；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(Corolase PP，购自AB公司)。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱，Heraeus公司；DragonWellscan MK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。
2.实验方法：
无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行原代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×106个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入：100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL生物活性肽样品。另外，设置空白对照组(pH7.2～7.4，3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA)，研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5％CO2 37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。
体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：
Figure BDA0002910021290000141
式中：A1为空白对照在570nm处下的吸光值；A2为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A3为实验组在570nm处下的吸光值。
3.实验结果及分析：
表6生物活性肽LLPKKTESHKAKS对体外淋巴细胞增殖的影响
实验分组 刺激指数SI
BSA 1
生物活性肽 1.173±0.022**
注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；
**号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表6。由表6可知，在生物活性肽的质量浓度为500μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.173，和阴性对照组具有显著差异(P<0.01)。因此，可以认定该生物活性肽LLPKKTESHKAKS具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。
七、生物活性肽LLPKKTESQKVKS的促巨噬细胞吞噬中性红能力实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性多肽LLPKKTESQKVKS；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含生物活性肽(0.1mg/ml)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔为实验组，添加不含活性肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔进行培养的设为空白组；并且实验组和空白组在培养到24h时加入LPS至终浓度10μg/ml；继续培养至48h后，吸弃细胞培养液。PBS清洗孔底后加入37℃的中性红染液80μl/孔，10分钟后吸弃染液，用PBS清洗两次后，每孔加入150μl细胞裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1:1，v/v)。4℃隔夜溶解后，在波长540nm下测定吸光度值(OD540)。
3.实验结果及分析：
表7生物活性肽LLPKKTESQKVKS促巨噬细胞吞噬中性红能力的测定
实验分组 吸光度值(OD540)
空白组 0.1085±0.0274
实验组 0.1748±0.0210**
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)
实验结果见表7，与细胞空白相比较，添加0.1mg/ml生物活性肽的炎症组巨噬细胞吞噬中性红能力明显增加，而且与细胞空白组比较，具有极显著性差异(P＜0.01)。说明生物活性肽LLPKKTESQKVKS在有炎症发生的情况下对体外巨噬细胞吞噬中性红能力具有显著的促进作用。
八、生物活性肽LLPKKTESQKVKS的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)
1.实验材料与仪器：
试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽LLPKKTESQKVKS；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(Corolase PP，购自AB公司)。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱，Heraeus公司；DragonWellscan MK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。
2.实验方法：
无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行原代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×106个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入：100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL生物活性肽样品。另外，设置空白对照组(pH7.2～7.4，3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA)，研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5％CO2 37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。
体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：
Figure BDA0002910021290000161
式中：A1为空白对照在570nm处下的吸光值；A2为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A3为实验组在570nm处下的吸光值。
3.实验结果及分析：
表8生物活性肽LLPKKTESQKVKS对体外淋巴细胞增殖的影响
实验分组 刺激指数SI
BSA 1
生物活性肽 1.1381±0.103*
注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；
**号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表8。由表8可知，在生物活性肽LLPKKTESQKVKS的质量浓度为500μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.1381，和阴性对照组具有显著差异(P<0.05)。因此，可以认定该生物活性肽LLPKKTESQKVKS具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。
九、生物活性肽LLPKKTESQKVKSK的促巨噬细胞吞噬中性红能力实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含生物活性肽(0.1mg/ml)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔为实验组，添加不含活性肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔进行培养的设为空白组；并且实验组和空白组在培养到24h时加入LPS至终浓度10μg/ml；继续培养至48h后，吸弃细胞培养液。PBS清洗孔底后加入37℃的中性红染液80μl/孔，10分钟后吸弃染液，用PBS清洗两次后，每孔加入150μl细胞裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1:1，v/v)。4℃隔夜溶解后，在波长540nm下测定吸光度值(OD540)。
3.实验结果及分析：
表9生物活性肽LLPKKTESQKVKSK促巨噬细胞吞噬中性红能力的测定
实验分组 吸光度值(OD540)
空白组 0.1083±0.0322
实验组 0.2018±0.0382**
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)
实验结果见表9，与细胞空白相比较，添加0.1mg/ml生物活性肽的炎症组巨噬细胞吞噬中性红能力明显增加，而且与细胞空白组比较，具有极显著性差异(P＜0.01)。说明生物活性肽LLPKKTESQKVKSK在有炎症发生的情况下对体外巨噬细胞吞噬中性红能力具有显著的促进作用。
十、生物活性肽LLPKKTESQKVKSK的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)
1.实验材料与仪器：
试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽LLPKKTESQKVKSK；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(CorolasePP，购自AB公司)。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱，Heraeus公司；DragonWellscan MK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。
2.实验方法：
无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行原代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×106个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入：100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL生物活性肽样品。另外，设置空白对照组(pH7.2～7.4，3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA)，研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5％CO2 37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。
体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：
Figure BDA0002910021290000181
式中：A1为空白对照在570nm处下的吸光值；A2为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A3为实验组在570nm处下的吸光值。
3.实验结果及分析：
表10生物活性肽LLPKKTESQKVKSK对体外淋巴细胞增殖的影响
实验分组 刺激指数SI
BSA 1
生物活性肽 1.124±0.043*
注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；
**号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表10。由表10可知，在生物活性肽的质量浓度为500μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.124，和阴性对照组具有显著差异(P<0.05)。因此，可以认定该生物活性肽LLPKKTESQKVKSK具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。
十一、生物活性肽LLPKKTETHHKAKGK的促巨噬细胞吞噬中性红能力实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱Heraeus公司；Dragon WellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含生物活性肽(0.1mg/ml)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔为实验组，添加不含活性肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔进行培养的设为空白组；并且实验组和空白组在培养到24h时加入LPS至终浓度10μg/ml；继续培养至48h后，吸弃细胞培养液。PBS清洗孔底后加入37℃的中性红染液80μl/孔，10分钟后吸弃染液，用PBS清洗两次后，每孔加入150μl细胞裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1:1，v/v)。4℃隔夜溶解后，在波长540nm下测定吸光度值(OD540)。
3.实验结果及分析：
表11生物活性肽LLPKKTETHHKAKGK促巨噬细胞吞噬中性红能力的测定
实验分组 吸光度值(OD540)
空白组 0.1095±0.0331
实验组 0.1683±0.0185**
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)
实验结果见表11，与细胞空白相比较，添加0.1mg/ml生物活性肽的炎症组巨噬细胞吞噬中性红能力明显增加，而且与细胞空白组比较，具有极显著性差异(P＜0.01)。说明生物活性肽LLPKKTETHHKAKGK在有炎症发生的情况下对体外巨噬细胞吞噬中性红能力具有显著的促进作用。
十二、生物活性肽LLPKKTETHHKAKGK的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)
1.实验材料与仪器：
试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽LLPKKTETHHKAKGK；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(CorolasePP，购自AB公司)。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱，Heraeus公司；DragonWellscan MK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。
2.实验方法：
无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行原代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×106个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入：100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL生物活性肽样品。另外，设置空白对照组(pH7.2～7.4，3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA)，研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5％CO2 37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。
体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：
Figure BDA0002910021290000201
式中：A1为空白对照在570nm处下的吸光值；A2为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A3为实验组在570nm处下的吸光值。
3.实验结果及分析：
表12生物活性肽LLPKKTETHHKAKGK对体外淋巴细胞增殖的影响
实验分组 刺激指数SI
BSA 1
生物活性肽 1.201±0.037**
注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；
**号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表12。由表12可知，在生物活性肽LLPKKTETHHKAKGK的质量浓度为500μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.201，和阴性对照组具有显著差异(P<0.01)。因此，可以认定该生物活性肽LLPKKTETHHKAKGK具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。
十三、生物活性肽VLLPKKTESHHKPKGK的促巨噬细胞吞噬中性红能力实验
1.实验试剂及仪器：
试剂：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄)上海交通大学农业与生物学院动物实验中心；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK；LPS，购自Sigma公司；中性红染色液，碧云天生物技术研究所生产。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Heracell150CO2培养箱Heraeus公司；DragonWellscanMK3酶标仪Labsystems公司。
2.实验方法：
加入细胞个数为2×106/ml的细胞悬液100μl/孔，贴壁纯化后加入含生物活性肽(0.1mg/ml)的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔为实验组，添加不含活性肽的RPMI1640完全培养液(10％FBS)200μl/孔进行培养的设为空白组；并且实验组和空白组在培养到24h时加入LPS至终浓度10μg/ml；继续培养至48h后，吸弃细胞培养液。PBS清洗孔底后加入37℃的中性红染液80μl/孔，10分钟后吸弃染液，用PBS清洗两次后，每孔加入150μl细胞裂解液(冰醋酸：无水乙醇＝1:1，v/v)。4℃隔夜溶解后，在波长540nm下测定吸光度值(OD540)。
3.实验结果及分析：
表13生物活性肽VLLPKKTESHHKPKGK促巨噬细胞吞噬中性红能力的测定
实验分组 吸光度值(OD540)
空白组 0.1063±0.0288
实验组 0.2029±0.0319**
注：*，与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)
实验结果见表13，与细胞空白相比较，添加0.1mg/ml生物活性肽的炎症组巨噬细胞吞噬中性红能力明显增加，而且与细胞空白组比较，具有极显著性差异(P＜0.01)。说明生物活性肽VLLPKKTESHHKPKGK在有炎症发生的情况下对体外巨噬细胞吞噬中性红能力具有显著的促进作用。
十四、生物活性肽VLLPKKTESHHKPKGK的体外淋巴细胞增殖能力实验(MTT法)
1.实验材料与仪器：
试剂与材料：实验动物balb/c小鼠(雄性6-8周龄，上海交通大学农业与生物学院动物实验中心)；实施例1获得的小鼠脾脏淋巴细胞来源生物活性肽VLLPKKTESHHKPKGK；小鼠淋巴细胞提取液(购自索来宝公司)；RPMI1640培养基(购自GIBCO公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，购自Amresco公司)；伴刀豆蛋白(ConA，购自Sigma公司)；牛血清白蛋白(BSA，购自Genebase公司)；胃蛋白酶(购自Sigma公司)；胰酶(CorolasePP，购自AB公司)。
仪器设备：LRH-250F生化培养箱，上海恒科技有限公司；GL-22M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；Hera cell 150CO2培养箱，Heraeus公司；DragonWellscan MK3酶标仪，Labsystems公司；ALPHA 1-2-LD真空冷冻干燥机，Christ公司；超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，waters公司。
2.实验方法：
无菌条件下取小鼠脾脏，用淋巴细胞提取液提取小鼠淋巴细胞，进行原代培养。用完全RPMI1640培养液将细胞密度调整为2.5×106个/mL。在96孔细胞培养板中依次加入：100μL小鼠淋巴细胞悬液，100μL RPMI1640完全培养液，20μL伴刀豆蛋白，100μL生物活性肽样品。另外，设置空白对照组(pH7.2～7.4，3mol/L的PBS)和阴性对照组(500μg/mL BSA)，研究表明其对于体外淋巴细胞增殖没有影响。每组3个平行实验样。在5％CO2 37℃培养箱中培养68h后，无菌条件下每孔加入20μL MTT，继续培养4h，小心弃去上清液，每孔加入100μL二甲基亚砜，37℃生化培养箱孵化10min，摇匀，用酶标仪在570nm处测定吸光值。
体外淋巴细胞增殖能力用刺激指数来表示，计算方法如下：
Figure BDA0002910021290000211
式中：A1为空白对照在570nm处下的吸光值；A2为阴性对照组在570nm处下的吸光值，A3为实验组在570nm处下的吸光值。
3.实验结果及分析：
表14生物活性肽VLLPKKTESHHKPKGK对体外淋巴细胞增殖的影响
实验分组 刺激指数SI
BSA 1
生物活性肽 1.166±0.011**
注：*号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.05)；
**号标记为与阴性对照比较，有显著性差异(P＜0.01)
实验结果见表14。由表14可知，在生物活性肽的质量浓度为500μg/mL的条件下，生物活性肽的刺激指数大于BSA，说明生物活性肽一定程度上能刺激体外小鼠淋巴细胞的增殖。并且生物活性肽的刺激指数达到了1.166，和阴性对照组具有显著差异(P<0.01)。因此，可以认定该生物活性肽VLLPKKTESHHKPKGK具有显著促进小鼠淋巴细胞增殖的能力，可以作为一种具有免疫调节活性的物质添加到保健品中，能够提高人体的免疫力。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 浙江辉肽生命健康科技有限公司
<120> 具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽及其制备方法和应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Pro Lys Gly
1 5 10
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Pro Lys Gly Lys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Pro Lys Gly Lys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His Lys Ala Lys Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser Gln Lys Val Lys Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser Gln Lys Val Lys Ser Lys
1 5 10
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Thr His His Lys Ala Lys Gly Lys
1 5 10 15
<210> 8
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
20 25 30
Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ser Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala
35 40 45
Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu
50 55 60
Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile
65 70 75 80
Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys
85 90 95
Leu Leu Gly Arg Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile
100 105 110
Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His Lys Pro Lys
115 120 125
Gly Lys
130
<210> 9
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Ser Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
20 25 30
Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ala Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala
35 40 45
Pro Val Tyr Met Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu
50 55 60
Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile
65 70 75 80
Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys
85 90 95
Leu Leu Gly Lys Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile
100 105 110
Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His Lys Ala Lys Ser
115 120 125
Lys
<210> 10
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Ser Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
20 25 30
Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ala Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala
35 40 45
Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu
50 55 60
Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile
65 70 75 80
Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys
85 90 95
Leu Leu Gly Arg Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile
100 105 110
Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser Gln Lys Val Lys Ser
115 120 125
Lys
<210> 11
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
20 25 30
Arg Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ser Glu Arg Val Gly Ala Gly Ala
35 40 45
Pro Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu
50 55 60
Glu Leu Ala Gly Asn Ala Ala Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile
65 70 75 80
Pro Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys
85 90 95
Leu Leu Gly Arg Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile
100 105 110
Gln Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Thr His His Lys Ala Lys
115 120 125
Gly Lys
130

Claims (10)

1.具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽，其特征在于，选自以下多肽中的一种或几种：
生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK，
其氨基酸序列分别为：
Leu-Leu-Pro-Lys-Lys-Thr-Glu-Ser-His-His-Lys-Pro-Lys-Gly，
Leu-Leu-Pro-Lys-Lys-Thr-Glu-Ser-His-His-Lys-Pro-Lys-Gly-Lys，
Val-Leu-Leu-Pro-Lys-Lys-Thr-Glu-Ser-His-His-Lys-Pro-Lys-Gly-Lys，
Leu-Leu-Pro-Lys-Lys-Thr-Glu-Ser-His-Lys-Ala-Lys-Ser，
Leu-Leu-Pro-Lys-Lys-Thr-Glu-Ser-Gln-Lys-Val-Lys-Ser，
Leu-Leu-Pro-Lys-Lys-Thr-Glu-Ser-Gln-Lys-Val-Lys-Ser-Lys，
Leu-Leu-Pro-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-His-His-Lys-Ala-Lys-Gly-Lys。
2.编码生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK的多核苷酸。
3.如权利要求1所述具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽的制备方法，其特征在于，通过基因工程的方法人工合成，从细胞中通过分离纯化的方法直接获得，或直接通过化学合成制备。
4.具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽在制备具有抗炎功能的药物或化妆品中的应用，其特征在于，具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽选自以下多肽中的一种或几种：生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK。
5.具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽在制备具有免疫调节功能的食物或药物中的应用，其特征在于，具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽选自以下多肽中的一种或几种：生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK。
6.根据权利要求5所述具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽在制备具有免疫调节功能的食物或药物中的应用，其特征在于，所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK中一种或多种的组合在制备促进淋巴细胞增殖的食物或药物中的应用。
7.根据权利要求5所述具有氨基酸结构LLPKKTE的生物活性多肽在制备具有免疫调节功能的食物或药物中的应用，其特征在于，所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK中一种或多种的组合在制备促进体外巨噬细胞吞噬中性红能力的食物或药物中的应用。
8.一种抗炎产品，其特征在于，包括所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK中一种或多种的组合或所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK的衍生物中的一种或几种的组合；所述的抗炎产品包括抗炎药物或抗炎化妆品。
9.一种具有免疫调节功能的产品，其特征在于，包括所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK中一种或多种的组合或所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK的衍生物中的一种或几种的组合；所述具有免疫调节功能的产品包括具有免疫调节功能的食品或具有免疫调节功能的药物。
10.根据权利要求8所述一种抗炎产品或权利要求9所述一种具有免疫调节功能的产品，其特征在于，所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK的衍生物，是指具有与所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK相同的活性或更优的活性；
所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK的衍生物，是指在所述生物活性多肽LLPKKTESHHKPKG、生物活性多肽LLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽VLLPKKTESHHKPKGK、生物活性多肽LLPKKTESHKAKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKS、生物活性多肽LLPKKTESQKVKSK或生物活性多肽LLPKKTETHHKAKGK的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰，得到的多肽衍生物。
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