CN102408477A - 鹿角脱盘蛋白多肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鹿角脱盘蛋白多肽，它是鹿角脱盘经胶体匀浆，乙醇沉淀，真空旋转蒸发及冷冻干燥得到鹿角脱盘总肽粗提物，再经Sephadex G-25凝胶过滤层析除盐，最终得到的蛋白质含量为91.8％的总肽，对小鼠乳腺癌细胞的增殖具有明显抑制作用，其中浓度为30μg/mL时，作用72h后抑制率最高为69.2％；利用层析技术分离纯化得到的鹿角脱盘11kDa蛋白多肽，纯度达98.8％，精确分子量为11329Da；MTT结果对MA782细胞增殖具有明显抑制作用，其中浓度为10μg/mL时，72h后的最高抑制率为53.3％。

Description

鹿角脱盘蛋白多肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说鹿角脱盘蛋白多肽、鹿角脱盘11kDa蛋白多肽及其制备方法和应用。

背景技术

鹿角脱盘是鹿科动物雄性鹿(Cervus nippon Temminck)在每年的78月份，鹿茸被割下后自然生长出来的十分坚硬、形状不一、界于鹿茸骨化与未骨化之间的盘状物质，角冠和残留的角根于翌年新茸萌发时自然脱落的部分，也称“鹿角帽”或“鹿花盘”，《中药大辞典》中把鹿角脱盘收录为中药材鹿角来源的一种，民间常用于治疗乳腺炎、恶疮、痈肿等。现代研究表明鹿角脱盘含有多种药理作用各异的活性成分，具有治疗乳腺增生、抑制乳腺癌、抗疲劳、镇痛、抑菌等多种功能，其显著的生理功能显示了很好的开发利用前景，因此开展鹿角脱盘这一珍贵动物性中药材资源的药效物质基础研究有一定的实际意义，同时促使相关资源为人类健康服务亦具有一定的参考价值。

我国民间应用鹿角脱盘治疗乳房肿块已有悠久历史。张维滋以鹿角脱盘为原料，用水反复煎煮提取胶体物质，再经过透析和超滤制成水溶液，进而稀释制备成鹿角脱盘注射液，临床用于治疗乳腺增生。经146例临床观察证实，鹿角脱盘注射液用于治疗乳腺增生治愈率32.88％，显效28.77％，好转21.9％，平均总有效率为83.55％，显示了其对乳腺增生的良好疗效。王丽虹等采用分子筛方法制备出鹿角脱盘多肽及水溶性成分，药理活性实验表明，鹿角脱盘制剂和鹿角脱盘多肽皆能抑制戊酸雌二醇所致的小鼠乳腺增生，两者抗乳腺增生作用远较丙酸睾丸素强。陈玉山等^[22]的鹿角脱盘注射液药理实验表明，给小鼠注射鹿角脱盘注射液可明显对抗戊酸雌二醇所致小鼠乳腺增生，大剂量使用能明显抑制MA-737小鼠乳腺癌生长。赵文静等用鹿角脱盘与其他中药配伍，制成复方鹿角脱盘胶囊，观察其对乳腺增生小鼠乳腺微观组织及血清LH含量的影响，结果表明复方鹿角脱盘胶囊可使乳腺组织形态学各项指标得到明显改善，以高剂量组效果较显著，同时高剂量组有降低LH含量的作用，总体好于西药他莫昔芬。张宝香等报道，鹿角脱盘制剂与鹿角脱盘多肽抑制乳腺增生作用机制可能是通过升高脑多巴胺含量，进而抑制血中催乳素分泌。

鹿角脱盘中的化学成分比较复杂，含有多种氨基酸(包括人体不能合成的必需氨基酸)、蛋白质、矿物质元素、糖类及脂类。近年来已有研究者从鹿角脱盘中分离得到具有生物活性的蛋白质或多肽成分，通过药理实验验证了其各自不同的功效，有报道称鹿角脱盘制剂与鹿角脱盘多肽对巨噬细胞吞噬功能和T淋巴细胞的有增殖、改善不良因素引起的应激反应能力抗疲劳作用、镇痛作用、补血、抗炎及抑菌，也有治疗个例胃癌的报道。

近年来多肽在生物体内的生理功能受到越来越多的重视。大量研究表明，蛋白质分子量大、结构复杂，摄入人体后不易被消化吸收，因而影响其生理功能和营养价值的有效发挥^[36]。据报道人体摄入的蛋白质经酶水解后，主要以肽的形式被消化吸收。多肽与蛋白质相比，结构简单，分子量小，是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质。科学研究发现，几乎所有细胞都受多肽调节，如细胞分化、神经激素递质调节、免疫调节等，它具有调节机体生理功能和为机体提供营养的双重功效。同时由于多肽具有活化细胞免疫机能、改善心血管功能和抗衰老等生理活性，这为开发多肽药物、多肽类保健食品提供了理论依据。可见，进行多肽的研究和开发有十分重要的研究意义和应用前景。目前，许多学者通过从天然动植物中提取、化学合成肽库及从噬菌体展示肽库中筛选的方法，得到了一些具有抗肿瘤活性的小分子多肽。这些多肽具有相对分子质量小、活性高、毒性低的特点，对多药抗性的肿瘤细胞系具有良好的抑制活性。同时分子量较小的多肽可以多种方式给药，且不易引起免疫反应，相对于重组蛋白质类大分子药物具有易于改造、人工合成成本低的优点，因而在肿瘤的临床治疗上具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供鹿角脱盘蛋白多肽。

鹿角脱盘蛋白多肽，它由下述方法制备：

1)取鹿角脱盘粉末，在温度4℃条件下，加入pH 3.5的醋酸-醋酸钠缓冲液，胶体磨匀浆；匀浆液离心，取上清，加入95％乙醇使其终浓度达到55％，放置并每隔1h搅拌一次，4h后离心，取上清；上清液40℃真空旋转蒸发，回收乙醇；过滤；

2)采用凝胶过滤层析法除盐，核酸蛋白检测仪检测280nm处检测吸光度值，将峰前部分收集。

本发明又一个目的是提供鹿角脱盘11kDa蛋白多肽。

鹿角脱盘11kDa蛋白多肽，它是从鹿角脱盘中提取，分子量为11329Da的多肽；

所述的鹿角脱盘为梅花鹿鹿角脱盘；

鹿角脱盘11kDa蛋白多肽，是由下述方法制备的：

1)鹿角脱盘蛋白多肽，用Sephadex G-50层析，用去离子水洗脱，流速为0.5mL/min，洗脱过程采用紫外检测仪检测，检测波长为280nm；分离回收第2个峰；

2)反相高效液相层析

用15％乙腈溶解，微孔滤膜过滤；流动相A：取TFA 1mL，加于经微孔滤膜滤过、脱气的1000mL超纯水中。流动相B：取TFA 0.85mlL，加于脱气的乙腈1000mL溶剂中；洗脱方法：乙腈浓度0-70％，0-30min；70-100％，30-45min。进样量：0.1mL(浓度100mg/mL)；检测波长：280nm；柱温：40℃；流速：0.8mL/min；每次梯度结束后，以初始流动相20％乙腈充分平衡色谱柱；分离回收第3个峰。

本发明的再一个目的是：鹿角脱盘蛋白多肽或鹿角脱盘11kDa蛋白多肽在制备乳腺癌药物的应用。

本发明提供的鹿角脱盘蛋白多肽是鹿角脱盘经胶体匀浆，乙醇沉淀，真空旋转蒸发及冷冻干燥得到鹿角脱盘总肽粗提物，再经Sephadex G-25凝胶过滤层析除盐，最终得到的蛋白质含量为91.8％的总肽，对小鼠乳腺癌细胞的增殖具有明显抑制作用，其中浓度为30μg/mL时，作用72h后抑制率最高为69.2％；作用MA782细胞72h后，细胞周期各期细胞数变化最明显，其中G0/G1期细胞百分比为81.621％，S期细胞百分比为8.983％；能抑制端粒酶活性，降低TERT基因的表达水平，其中作用72h后其TERT基因表达水平降低最明显；利用层析技术分离纯化得到的鹿角脱盘11kDa蛋白多肽，纯度达98.8％，精确分子量为11329Da；MTT结果显示单体多肽对MA782细胞增殖具有明显抑制作用，其中浓度为10μg/mL时，72h后的最高抑制率为53.3％；细胞周期各期细胞数变化最明显，其中G0/G1期细胞百分比为81.460％，S期细胞百分比为11.882％；单体多肽能抑制细胞端粒酶活性，降低TERT基因的表达水平，其中作用72h后TERT基因表达水平降低最明显。

附图说明

图1为鹿角脱盘总肽蛋白质标准曲线；

图2为鹿角脱盘总肽SDS-PAGE电泳图；

图3为鹿角脱盘总肽作用MA782细胞72小时后的结果，其中，A为对照组，B实验组；

图4为MTT法检测鹿角脱盘总肽对MA782细胞增殖的影响图；

图5流式细胞仪检测鹿角脱盘总肽作用MA782细胞周期的结果；

图6为TRAP-银染法检测鹿角脱盘总肽作用MA782细胞后端粒酶活性结果；其中，1：对照组，2-6：分别为作用后24h，48h，72h，96h，120h的结果；

图7目的基因TERT和内参β-actin基因相对荧光定量PCR的扩增曲线；

图8为相对荧光定量PCR的检测结果，1：对照组，2-4：总肽分别作用24h，48h，72h后TERT基因的表达水平；

图9为鹿角脱盘总肽G50凝胶过滤层析图谱；

图10为反相高效液相层析图谱；

图11为鹿角脱盘11kDa蛋白多肽的HPLC纯度鉴定；

图12为鹿角脱盘11kDa蛋白多肽的质谱检测；

图13为流式细胞仪检测鹿角脱盘11kDa蛋白多肽对MA782细胞周期的影响；

图14为TRAP-银染法检测鹿角脱盘11kDa蛋白多肽作用MA782细胞后端粒酶的活性；其中，1：对照组，2-6：分别为作用后24h 48h，72h，96h，120h的结果；

图15目的基因TERT和内参β-actin基因相对荧光定量PCR的扩增曲线；

图16为相对荧光定量PCR的检测结果，1：对照组，2-4：单体蛋白多肽分别作用24h，48h，72h后TERT基因的表达水平。

具体实施方式

实施例1鹿角脱盘蛋白多肽(总肽)的制备

1)鹿角脱盘总肽粗提物

取500g鹿角脱盘粉末，加入2500mL预冷(4℃)的pH 3.5的醋酸-醋酸钠缓冲液溶液，用胶体磨反复匀浆；匀浆液离心(4℃，5000rpm，20min)，取上清，加入95％乙醇使其终浓度达到55％，4℃放置并每隔1h搅拌一次，4h后离心(4℃，5000rpm，20min)，取上清。上清液40℃真空旋转蒸发，回收乙醇至浓缩液体积为300mL左右，过滤冻干，得鹿角脱盘总肽粗提物；-20℃保存待用。以上操作除回收乙醇外均应在4℃条件下进行。粗提物的冻干品呈乳白色，细丝状，易溶于水。

2)总肽粗品除盐(凝胶过滤层析法)

(1)层析柱的准备：取50g Sephadex G-25凝胶干粉，加1000mL去离子水，浸泡过夜，溶胀。待充分溶胀后，将凝胶匀浆轻轻搅拌，并观察是否有杂质或不均一的细小颗粒，如有则反复倾倒去除，直至上清不再混浊为止，真空减压除气泡后装柱；柱子(柱规格：ф20mm×100cm)先用0.2M氢氧化钠洗涤，再用水冲洗干净，最后用蒸馏水和去离子水清洗一遍。将柱子垂直固定后，出水口封住，先在柱底部灌入1/3体积的去离子水，然后将凝胶匀浆缓缓灌入柱中，待匀浆在柱底部沉降1-2cm左右后，打开出水口，控制流速为0.5mL/min。当凝胶沉降至立柱顶端5cm处左右停止，以去离子水为流动相，使柱子过夜平衡；

(2)上样层析：取鹿角脱盘总肽冻干品0.5g，用5mL去离子水溶解并过滤，为上样液。将样品用胶头滴管沿柱壁缓慢加入柱内，用去离子水洗脱，流速为0.5mL/mi n，至出峰时起用自动馏分收集器收集，每管5mL。核酸蛋白检测仪检测280nm处检测吸光度值，将峰前部分收集，冻干。冻干品-20℃保存待用，以上操作在4℃层析冷柜中进行。粗提物经SephadexG-25凝胶过滤层析除盐后，鹿角脱盘总肽纯化冻干品呈白色絮状，极易溶于水。

实施例2鹿角脱盘总肽测定

1)总肽蛋白质含量测定(BCA法)

取牛血清白蛋白标准品10μL，用蒸馏水稀释至100μL，使终浓度为0.5mg/mL。将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20μL加到96孔板的标准品孔中，用蒸馏水补充至20μL。按A∶B＝50∶1的比例配置适量BCA工作液。称取除盐后的总肽10mg，用蒸馏水稀释至浓度为0.1mg/mL。将待测样品加入96孔板的样品孔中，用蒸馏水补充至20μL。向各孔加入200μLBCA工作液，60℃放置30min。在酶标仪490nm处测定吸光度值，以吸光度值为纵坐标，以蛋白质含量为横坐标，绘制标准曲线，计算出蛋白质含量。

蛋白质标准曲线(见图1)的相关系数为0.9987，由酶标仪测出蛋白质492nm处的吸光度值如表1，在标准曲线上查出相应的蛋白质含量，计算出制备的鹿角脱盘总肽蛋白质含量为91.8％，说明粗提物中主要成分为蛋白质。

表1样品及标准溶液吸光度值

Table 3-7 The OD of sample and standard solution

2)鹿角脱盘总肽电泳

鹿角脱盘总肽SDS-PAGE电泳，结果见图2，梅花鹿角脱盘总肽主要含有5种蛋白质，分别为分子量为11kDa、18kDa，40kDa、64kDa和80kDa。

实施例3鹿角脱盘总肽对小鼠乳腺癌细胞作用

1)鹿角脱盘总肽对小鼠乳腺癌MA782细胞增殖的影响(MTT法检测)

取处于对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后，弃去消化液，用RPMI-1640完全培养液配成单个细胞悬液，细胞计数后，按照3×10³/孔的密度接种于96孔培养板中，每孔体积200μL。将培养板移入CO₂培养箱中，在37℃、5％CO₂及饱和湿度的条件下培养24小时。细胞贴壁后，将培养液吸弃，以无总肽处理的细胞为对照组，以总肽处理的细胞为实验组。总肽的浓度分别为10、20、30、40和50μg/mL，培养时间为24h、48h、72h，各浓度分别设置3个复孔，检测总肽对MA782细胞增殖的影响。当培养结束前4小时，每孔加入20μL MTT溶液。培养箱中继续孵育4小时，终止培养。小心吸弃孔内上清液后，每孔加入200μLDMSO，轻微振荡，培养箱中放置30min，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果，按抑制率(％)＝(对照组OD值-实验组OD值)×100/对照组OD值，计算抑制率，用统计学分析结果，结果用平均值±标准差表示(见表2)。鹿角脱盘总肽作用后细胞染色质收缩，边缘不光滑；72小时后的照片见图3、4。鹿角脱盘总肽浓度为10、20、30、40、50μg/mL时均能抑制MA782增殖，其中浓度为30μg/mL时，对MA782细胞的抑制率最明显。

表2总肽MA782增殖的影响

Table 3-7 Effect of total polvpeptide on the proliferation of MA782(x±s，n＝3)

注：与相同时间对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

2)鹿角脱盘总肽对小鼠乳腺癌细胞周期的影响(流式细胞仪检测)

以无总肽作用的MA782细胞为对照组，以总肽(30μg/mL)作用的细胞为实验组，分别作用24h、48h、72h。用0.25％胰蛋白酶分别消化对照组与实验组细胞，1000r/min离心5min，弃上清，再用3mLPBS洗涤一次。加入-20℃预冷的75％乙醇，吹打细胞使其成单细胞悬液，密封置于4℃冰箱内固定24小时后，1000rpm离心5min，弃上清。PBS洗涤去除残留的乙醇溶液。向沉淀中加入3mLPBS，过350目纱网，1000rpm离心5min，弃上清后再加入800μLPBS液、200μL碘化丙锭染液和10μLRNase，混匀后4℃冰箱避光染色30min后，流式细胞仪检测细胞周期变化，结果用MCYCLE软件分析，细胞周期各个阶段分别以百分比表示。

总肽(30μg/mL)分别作用MA782细胞24h，48h和72h，实验结果表明，与对照组比，实验组MA782细胞G0/G1期细胞百分比升高，S期细胞百分比降低，且影响程度与作用时间相关。其中72h后，G0/G1期细胞比例升高和S期细胞比例降低最明显，说明总肽将大部分MA782细胞阻滞在G1期，从而抑制细胞的快速增殖。流式细胞仪检测MA782细胞周期结果如图5和表3。

表3细胞周期不同时象细胞百分比

Table 3-9 The percentage of mitotic cycle in differents period

3)鹿角脱盘总肽对小鼠乳腺癌细胞端粒酶活性的影响

采用TRAP-银染法检测总肽(30μg/mL)作用前后小鼠乳腺癌细胞端粒酶活性的变化。结果显示与对照组比较，总肽作用后MA782细胞端粒酶活性降低，端粒酶重复序列条带数目减少。其中处理96h和120h后端粒酶活性降低较为明显，如图6，说明总肽能抑制小鼠乳腺癌细胞的端粒酶活性。

4)相对荧光定量PCR方法检测MA782细胞端粒酶TERT基因的表达变化，结果显示：以对照组细胞TERT基因表达水平为1，则总肽作用24h后，TERT基因表达水平是0.075，48h后是0.073，72h后是0.031，说明鹿角脱盘总肽能明显抑制MA782细胞端粒酶TERT基因的表达水平，结果见表4和图7、8。

表4目的基因TERT和内参基因β-actin的PCR扩增

实施例4鹿角脱盘11kDa蛋白多肽的制备

1)Sephadex G-50层析

取除盐后的总肽冻干品100mg，用去离子水溶解，以Sephadex G-50为介质装填层析柱(柱规格：ф20mm×100cm)。取30g Sephadex G-50凝胶干粉，加500mL去离子水浸泡过夜，待充分溶胀后将凝胶匀浆搅拌悬浮；看上清中是否有杂质或破碎小颗粒，如有则应反复倾倒，直到上清不再浑浊为止；真空泵减压去除气泡后装柱，层析柱用去离子水过夜平衡。次日将样品加入柱内(样品浓度为50mg/mL，上样量2mL)，用去离子水洗脱，流速为0.5mL/min，洗脱过程采用紫外检测仪检测，检测波长为280nm；分离回收第2个峰；冷冻干燥，冻干品-20℃保存待用。G50凝胶过滤层析图谱见图9。

2)反相高效液相层析

仪器为岛津LC-2010A高效液相色谱仪，安捷伦半制备型反相HPLC色谱柱，二元梯度泵和紫外可见分光光度检测器；色谱柱规格：Zorbax 300SB C18 9.4×250mm半制备柱；样品处理：取经Sephadex G-50层析后经MTT检测活性最强组分S2冻干品100mg，用15％乙腈溶解，微孔滤膜过滤。流动相A：取TFA1mL，加于经微孔滤膜滤过、脱气的1000mL超纯水中。流动相B：取TFA 0.85mlL，加于脱气的乙腈1000mL溶剂中。洗脱方法：乙腈浓度0-70％，0-30min；70-100％，30-45min。进样量：0.1mL(浓度100mg/mL)；检测波长：280nm；柱温：40℃；流速：0.8mL/min。每次梯度结束后，以初始流动相20％乙腈充分平衡色谱柱；分离回收第3个峰；冷冻干燥，冻干品-20℃保存待用。见图10。

实施例5鹿角脱盘11kDa蛋白多肽测定

1)鹿角脱盘11kDa蛋白多肽HPLC检测

取5mg冻干品，用15％乙腈溶液溶解，微孔滤膜过滤。高效液相色谱仪：Waters；色谱柱：反相柱DiamonsilC185μm(250×4.5mm)；检测器：waters 2487紫外检测器；流动相：70％乙腈，含0.1％的三氟乙酸；柱温：室温；进样量：1μL；检测波长：280nm；流速：1mL/min进行检测。鹿角脱盘11kDa蛋白多肽纯度为98.8％。见图11。

2)鹿角脱盘11kDa蛋白多肽分子量测定

采用德国autoflex TOF/TOF串联质谱系统测得S2H3分子量为11329道尔顿，说明经该分离纯化工艺所得到的是一分子量为11329Da的单体多肽。由中国科学院长春应用化学研究所质谱室协助完成。见图12。

实施例6鹿角脱盘11kDa蛋白多肽鹿角脱盘总肽对小鼠乳腺癌细胞作用

1)单体多肽S2H3对小鼠乳腺癌细胞周期的影响

反相高效液相层析后，获得的鹿角脱盘11kDa蛋白多肽(10μg/mL)，选择处于对数生长期的小鼠乳腺癌细胞MA782，以不加鹿角脱盘11kDa蛋白多肽的MA782细胞为对照组，以鹿角脱盘11kDa蛋白多肽(10μg/mL)作用的细胞为实验组，分别作用24h、48h、72h，流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果见图13和表5。与对照组相比，MA782细胞G0/G1期细胞数目增多，S期细胞数目则降低，且影响程度与作用时间有关。72h后，G0/G1期细胞百分比升高最明显，与总肽对细胞周期的影响差异不显著，说明鹿角脱盘11kDa蛋白多肽能将大部分肿瘤细胞停滞在G1期，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

表5细胞周期不同时象细胞百分比

2)鹿角脱盘11kDa蛋白多肽对小鼠乳腺癌细胞端粒酶的影响

选择处于对数生长期的小鼠乳腺癌细胞，以无鹿角脱盘11kDa蛋白多肽作用的MA782细胞为对照组，以鹿角脱盘11kDa蛋白多肽(10μg/mL)作用后的细胞为实验组，作用时间24h、48h、72h、96h和120h。分别提取对照组和实验组细胞的端粒酶，并用BCA法测定其蛋白质含量。随后进行PCR、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染。经BCA法测定细胞抽提物的蛋白质浓度为5.7μg/μL。用CHAPS裂解液将其终浓度调至1μg/μL。采用改进的TRAP-银染方法检测鹿角脱盘11kDa蛋白多肽(10μg/mL)作用前后小鼠乳腺癌细胞端粒酶活性的变化，结果显示与对照组比较，实验组端粒酶活性降低，其中处理72h之后，端粒酶活性明显下降，如图14。

3)11kDa蛋白多肽对小鼠乳腺癌细胞TERT基因表达的影响

选择处于对数生长期的小鼠乳腺癌细胞，以未经鹿角脱盘11kDa蛋白多肽作用的MA782细胞为对照组，以鹿角脱盘11kDa蛋白多肽(10μg/mL)作用后的细胞为实验组，作用时间为24h、48h、72h。分别提取对照组和实验组细胞的总RNA，反转录合成cDNA。以小鼠β-actin为内参基因，利用相对荧光定量PCR检测单体多肽分别作用24h、48h、72h后MA782细胞TERT基因的表达水平。结果显示：以对照组细胞TERT基因表达水平为1，则鹿角脱盘11kDa蛋白多肽(10μg/mL)作用MA782细胞24h后，TERT基因表达水平是0.201，作用48h后是0.114，作用72h后是0.088，说明鹿角脱盘单体多肽能明显抑制小鼠乳腺癌细胞端粒酶TERT基因表达水平，结果见图15、16和表6。

表6目的基因和内参基因的扩增结果

Claims (5)

1.鹿角脱盘蛋白多肽，它由下述方法制备：

1)取鹿角脱盘粉末，在温度4℃条件下，加入pH 3.5的醋酸-醋酸钠缓冲液，胶体磨匀浆；匀浆液离心，取上清，加入95％乙醇使其终浓度达到55％，放置并每隔1h搅拌一次，4h后离心，取上清；上清液40℃真空旋转蒸发，回收乙醇；过滤；

2)采用凝胶过滤层析法除盐，核酸蛋白检测仪检测280nm处检测吸光度值，将峰前部分收集。

2.鹿角脱盘11kDa蛋白多肽，它是从鹿角脱盘中提取，分子量为11329Da的多肽。

3.根据权利要求1所述的所述的鹿角脱盘蛋白多肽，其特征在于：鹿角脱盘为梅花鹿鹿角脱盘。

4.鹿角脱盘11kDa蛋白多肽，是由下述方法制备的：

1)将鹿角脱盘蛋白多肽，采用Sephadex G-50层析，用去离子水洗脱，流速为0.5mL/min，洗脱过程采用紫外检测仪检测，检测波长为280nm；分离回收第2个峰；

2)采用反相高效液相层析，用15％乙腈溶解，微孔滤膜过滤；流动相A：取TFA1mL，加于经微孔滤膜滤过、脱气的1000mL超纯水中。流动相B：取TFA 0.85mlL，加于脱气的乙腈1000mL溶剂中；洗脱方法：乙腈浓度0-70％，0-30min；70-100％，30-45min。进样量：0.1mL(浓度100mg/mL)；检测波长：280nm；柱温：40℃；流速：0.8mL/min；每次梯度结束后，以初始流动相20％乙腈充分平衡色谱柱；分离回收第3个峰。

5.鹿角脱盘蛋白多肽或鹿角脱盘11kDa蛋白多肽在制备乳腺癌药物的应用。

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