CN102304178B - 光滑爪蟾抗肿瘤多肽制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

一种光滑爪蟾抗肿瘤多肽制备方法及用途，属于生物化学药物技术领域，其特征是：以光滑爪蟾皮肤分泌物为原材料提取，由Phe-Leu-Gly-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Gly-Leu-Lys-Ile-Gly-Ala-Asn-Met-Leu-Gly-Gly-Ala-Pro-Gln-Gln，经质谱测定其分子量为2283.395Da。该多肽具有抗肿瘤作用，对大肠癌细胞SW480的增殖与生长具有抑制作用，可作为在制备抗肿瘤药中的应用。有益效果是：抗肿瘤多肽在相同剂量下，只能杀死肿瘤细胞，对正常细胞无毒副作用。具有疏水的氨基酸残基和带正电的氨基酸残基；两亲特性，在疏水环境中，可以使疏水的氨基酸残基和带正电的氨基酸残基分别处于分子的两侧；即可诱导的或预先形成的α-螺旋或β折叠结构；有一定的疏水性。

Description

光滑爪蟾抗肿瘤多肽制备方法及用途

技术领域

本发明属于生物化学药物技术领域。

背景技术

癌症是威胁人类健康的主要疾病之一，现有癌症治疗药物最大的局限是在于缺乏选择性，在清除癌细胞的同时也会杀伤正常细胞。晚期肿瘤传统的治疗方法是放疗或化疗，然而无论是放疗还是化疗都不可避免地会造成血系统和消化系统的损害，对免疫系统造成进一步的打击，并且不能完全消除残存的肿瘤细胞。一般认为，抗癌肽仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞，而对正常体细胞无不良影响。抗肿瘤多肽的这一特性可能是由于真核细胞膜上有大量的膜蛋白和胆固醇，使细胞膜结构趋于稳定。

随着抗肿瘤药物的不断出现，临床治疗水平的提高，抗肿瘤药物的应用越来越广泛。临床应用时既要注意抗肿瘤药物的治疗作用，也不可忽视它的副作用的发生率、严重度及可逆性。抗肿瘤药物的毒副作用就象一把“双刃剑”，治疗剂量等毒性剂量十分接近，即安全系数低等特点。

(一)消化系统

1.恶性呕吐：这是肿瘤化疗最常见的副作用之一。发生率65-85％，这不但影响病人的情绪和进食，甚至造成营养、代谢障碍和其他并发症。

2.口腔炎

局部或全因素均可引起口腔粘膜的炎症反应，在颊、唇粘膜、颚、舌、口底及齿龈出现红斑、溃疡、出血和疼痛。

(二)、骨髓抑制

多数抗肿瘤药可引起不同程度的骨髓抑制。对骨髓造血细胞的抑制，依次为白细胞、血小板，最后影响血红蛋白，出现全血性减少。

(三)、其它器官毒性

1.皮肤毒性：最常见的是脱发，也可能引起血管外渗所致的局部皮肤坏死，色素沉着及皮疹等。

2.肝脏毒性：表现为血清转氨酶和胆红质暂时升高，也可伴有临床和病理改变。引起肝脏损害的药物多为直接的毒性作用，少数药物如DTIC可能是过敏反应。常见的肝损害组织学改变有脂肪浸润、肝细胞坏死、肝内胆汁淤积，甚至肝硬变。

3.胰腺毒性：较少见。皮质类固醇、雌激素、6-MP、L-ASP等有时可导致胰腺炎。

4.心脏毒性：蒽环类化合物：如ADR和DRN，表现为暂时性心电图改变，或迟发性心肌病，伴有心力衰竭，与应用剂量密切相关。有些药物致心肌坏死，心绞痛等。

5.肺毒性：BLM可引起肺纤维化，严重时可导致坏死。其发生率与累积剂量密切相关。有慢性呼吸功能减退、年龄较大的患者易发生。

6.肾毒性：某些抗肿瘤药物对肾脏的损害是肾小管坏死和沉淀。防止的方法主要是适当水化与利尿和尿液碱化。常规检查肾功能，足量补充水份，采用联合化疗水减少单一药物剂量。

7.神经毒性：神经毒性有时可导致功能丧失，还要区别由于药物的作用，还是肿瘤的作用。VCR对周围神经有明显的毒性，可引起无力，指(趾)感觉异常、腱反射减退或消崐失、肠麻痹、体位性低血压等。5-Fu可引起急性小脑共济失调。鞘内注射MIX可发生慢性脑病。Pcz和L-ASP可引起中枢神经症状，如嗜睡。幻觉和抑郁等。DDP可导致第8对脑神经损害。

8.对生殖器官的影响：抗肿瘤药可影响睾丸、卵巢功能，引起不育。男性生殖腺功能不全，表现有阳萎、精子减少、活力减退。女性生殖腺过早衰退，表现为月经不规律或闭经。若在妊娠崐前三个月，可引起染色体退行性变，有致畸胎作用。

发明内容

本发明的目的是：提供一种光滑爪蟾抗肿瘤多肽制备方法及用途，以光滑爪蟾为实验材料，通过电刺激的方法获得皮肤分泌物，利用凝胶过滤层析和反相高压液相层析，分离纯化出一种抗肿瘤多肽，该多肽特别对大肠癌细胞SW480有抑制作用。

本发明的抗肿瘤多肽是：

经测序得知序列为

Phe-Leu-Gly-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Gly-Leu-Lys-Ile-Gly-Ala-Asn-Met-Leu-Gly-Gly-Ala-Pro-Gln-Gln，经质谱测定其分子量为2283.395Da，命名为P-1。

本发明的抗肿瘤多肽有抗肿瘤活性：

当样品浓度达到256μg/ml时，P-1对人大肠癌细胞SW480的抑制率达到84.2％。且呈现量效关系。

本发明的制备方法是：

以光滑爪蟾材料源，用电刺激法取得光滑爪蟾皮肤分泌物，通过两步分离纯化，凝胶过滤层析和反相高效液相色谱层析，分离并获得抗癌活性峰。

本发明的有益效果是：

抗肿瘤多肽在相同剂量下，只能杀死肿瘤细胞，对正常细胞无毒副作用。目前，人们已经发现一些对于抗肿瘤多肽的抗肿瘤活性具有重要作用的影响因素：

(1)具有疏水的氨基酸残基和带正电的氨基酸残基；

(2)两亲特性，在疏水环境中，可以使疏水的氨基酸残基和带正电的氨基酸残基分别处于分子的两侧；

(3)一定的二级结构，即可诱导的或预先形成的α-螺旋或β折叠结构；

(4)一定的疏水性。

抗肿瘤多肽的抗肿瘤机制也处于研究中，当前许多研究表明，抗肿瘤多肽抑杀肿瘤细胞机制可以归纳为如下两个方面：一方面，抗肿瘤多肽可以通过调动机体免疫机能，从体液免疫方面来抵抗癌细胞的入侵；另一方面，它直接接触性抑杀肿瘤细胞，主要从细胞膜、线粒体、核膜等方面来达到抑杀肿瘤细胞的效果。在胞膜攻击作用方面，目前趋向认为抗肿瘤多肽的抗肿瘤作用机制与抗菌作用机制是类似的，即抗肿瘤多肽分子通过静电及疏水特性与细胞膜相互作用并破坏胞膜的完整性。与正常真核细胞膜相比，肿瘤细胞的细胞膜含有更高成分的磷脂酰丝氨酸和糖基化成分，因此，具有更高的负电性，流动性和表面积，这有利于提高两亲α-螺旋阳离子抗肿瘤多肽对肿瘤细胞的选择性和趋向性。本发明的抗肿瘤多肽P-1与Cecropin类抗菌肽结构相似，都是通过其两亲α-双螺旋上的正电荷与胞膜磷脂分子上负电荷之间的静电吸引而结合，随后抗菌肽的疏水端(酰胺基)插入到疏水的胞膜中央，双亲的α-双螺旋留在质膜表面，打乱质膜上蛋白质和脂质的原有秩序，使膜外正电荷增多，导致膜去极化。由于其α-螺旋结构的亲水、疏水两亲性的特点，抗肿瘤多肽分子可相互聚集形成离子通道，导致内容物外泄，最后导致细胞渗透压丧失而死亡。此外，国内外科学家也多次观察到抗肿瘤多肽对肿瘤细胞细胞器的破坏：线粒体肿胀、空泡化和排列不规则，提示抗肿瘤多肽的作用机制可能与抑制肿瘤细胞呼吸相关。线粒体是细胞赖以生存的“动力工厂”，抗肿瘤多肽破坏线粒体的结构，使细胞无法获得能量，最终导致细胞死亡。也有学者认为，细胞骨架和核染色质DNA损伤是抗菌肽导致肿瘤细胞死亡的重要原因。各种不同结构的抗肿瘤多肽可能存在有不同的作用机制，同一种抗肿瘤多肽也可能通过多种途径发挥作用，了解不同抗菌肿瘤多肽的作用机制，有助于对抗肿瘤多肽的临床应用前景及可能产生的问题有的认识，使研究开发更具有针对性。由于本发明的抗肿瘤多肽属于小分子蛋白，与抗菌肽相似，与其他抗肿瘤药物相比，抗肿瘤多肽P-1的毒副作用更小，具有更高的安全性，由于其抗肿瘤机制的特殊性，临床上不会出现耐药性，将来有望开发成为无毒副作用的抗肿瘤药物。

附图说明

图1利用SephadexG-25分子筛分离光滑爪蟾皮肤分泌物示意图。

图2利用反相高效液相色谱分离SephadexG-25分子筛的活性峰的示意图。

图3抗肿瘤多肽P-1对大肠癌细胞SW480抑制率的示意图，其中纵坐标为大肠癌细胞SW480抑制率，横坐标为P-1浓度。

具体实施方式

实施例1：

光滑爪蟾抗肿瘤活性多肽P-1的制备

1取光滑爪蟾100只，利用电刺激(30V恒压)的方法获得光滑爪蟾皮肤分泌物，12000r/min离心20min，收集上清，再过0.45μm滤膜，10K超滤管5000g/min离心1h，真空离心浓缩样品。

2利用GE公司AKTA纯化系统和Sephadex G-25(2.6×100cm)分子筛分离光滑爪蟾电刺激皮肤分泌液浓缩样品，调整泵的流速恒流：以PBS(PH8.0)为缓冲液，恒流3ml/min，以215nm吸光度检测峰值，得到三个峰(图1)，以人大肠癌细胞为抗癌肽活性检测细胞株，将三个峰的物质浓缩后进行抗癌活性实验检测，其中第三个峰为活性峰，并将其冻干浓缩。

3将上述经G-25层析柱分离得到的活性峰冻干样品用超纯水溶解，并用0.22μm滤器过滤。利用制备型反相高效液相色谱(Preparative High PerformanceLiquid Chromatography)，ACE公司的C_18-300半制备反相柱分离纯化，柱高250mm，直径10mm。超纯水(含0.05％TFA)平衡后，1ml滤过液上样，进行0-80％梯度洗脱，流速2ml/min，利用自动收集的方法收集分离后的样品，从第6分钟开始收集样品，每一分钟收集一次样品(图2)，共收集50管。浓缩后进行抗癌活性检测，其中第14管具有抗肿瘤活性。

光滑爪蟾抗肿瘤多肽的测序

本发明所提供的光滑爪蟾抗肿瘤多肽用Edman降解法进行测序。Edman降解法是一种对蛋白质进行测序的化学方法，是从肽链游离的N末端测定氨基酸残基序列的过程。N末端氨基酸残基被苯异硫氰酸酯修饰，然后从多肽链上切下修饰的残基，再经层鉴定，余下的多肽链(少一个残基)被收回再惊醒下一轮降解循环。Edman降解测序的主要涉及偶联、水解、萃取和转换等4个过程。首先使用苯异硫氰酸酯(PITC)在PH9.0的碱性条件下对多肽进行处理，PITC与肽链的N-端的氨基酸反应，形成苯氨基甲酰(PTC)衍生物，即PTC-肽。然后PTC-肽用TFA处理，N-端氨基酸残基被有选择地切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下来将衍生物用氯丁烷从反应液中萃取出来，而切掉了一个N-端氨基酸残基的肽仍留在溶液中。萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸作用，再一步环化，形成一个稳定的苯乙内酰硫脲(PTH)的衍生物，即PTH-氨基酸。留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程。整个过程现在都是通过测序仪自动进行。每个循环获得一个PTH-氨基酸，经HPLC可鉴定出是哪一种氨基酸。本发明所提供的多肽经Edman降解法测序，序列为Phe-Leu-Gly-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Gly-Leu-Lys-Ile-Gly-Ala-Asn-Met-Leu-Gly-Gly-Ala-Pro-Gln-Gln。

抗肿瘤多肽的固相合成

1抗肿瘤多肽的合成

合成反应从C端到N端逐个进行，由合成固相合成仪自动控制。首先称量0.1mmol的结合了第一个氨基酸的树脂，装柱，再用20％哌啶二甲基甲酰胺溶液脱保护，二甲基甲酰胺清洗，9-笏甲氧羰基(Fmoc)保护的游离氨基酸溶解于并啶并三氮唑四甲基六氟磷酸盐(HATU)P二异丙基乙基胺(DIPEA)，溶解后的溶液在柱上循环偶合反应30min，二甲基甲酰胺清洗重复以上脱保护到偶合反应步骤直到制备结束。

2合成后的多肽的制备和分析：取下反应后的树脂，加入剪切液5mL(88％三氟乙酸，5％苯酚，5％水，2％三异丙基硅烷)，室温反应2h，过滤，滤出液中加入10倍体积的预冷无水乙醚(-20℃)50mL，4000r/min离心10min，收集沉淀。用预冷无水乙醚洗涤沉淀3次后室温干燥。称量一定量干燥后的多肽，溶于0.05％TFA的水溶液中，样品经过孔径为0.22μm的滤膜过滤后，经C18反向柱(10mm×250mm)分离(洗脱液为：A液：含0.05％TFA的水溶液；B液：含0.05％TFA的乙氰溶液；洗脱条件为0～60％B液30min)，收集洗脱峰，冷冻干燥。利用质谱MALDI-TOF将定其分子量和纯度备用。

光滑爪蟾抗肿瘤多肽对肿瘤细胞的抑制作用

1.细胞培养

将大肠癌细胞SW480的单细胞悬液接种于96孔培养板；培养24h，利用细胞计数板计数并用培养基调节细胞浓度，使细胞浓度达到10³-10⁴细胞/孔，培养24h后，待细胞贴壁后，用0.22μm的滤器过滤不同浓度的抗肿瘤肽样品P-1，然后将其加入到稀释好的细胞悬液中，继续培养48h。加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续培养4h。然后将孔内培养液吸出，再加入DMSO溶液100μl。用酶标仪检测各孔OD值(检测波长为490nm)。

2.MTT比色法测定光滑爪蟾抗肿瘤多肽对大肠癌细胞SW480增殖的影响。

抗肿瘤多肽P-1以不同浓度0、2、4.、8、16、32、64、128、256μg/ml处理大肠癌细胞SW480，作用24小时后加入MTT，4小时后将孔内培养液吸出，再加入DMSO溶液100μl，用酶标仪检测细胞抑制率。如图3所示，结果显示：经48小时作用，除对照组外，P-1浓度在达到16μg/ml的时候开始对肿瘤细胞有抑制作用，对大肠癌细胞SW480的抑制率达到7.7％，其他浓度组对肿瘤细胞的抑制率依次是：16.4％、44.3％、79.6％、84.2％.

从以上结果可以看出，光滑爪蟾抗肿瘤多肽对于人大肠癌细胞SW480有抑制作用，且有量效关系。

抗肿瘤多肽P-1的体内抗肿瘤活性测定

50只健康的BALB/c小白鼠，体重20±2克，平均分五组，每组10只，全部为雌鼠。将已接种SW480肉瘤的荷瘤小鼠处死，无菌操作抽取其腹水，按1∶3比例稀释，配置成细胞悬液，于每只实验用小鼠的右前肢腋窝皮下注射0.2ml瘤细胞悬液，肿瘤细胞大约在10⁶，植瘤24小时后，给药组分别以不同剂量进行静脉注射，以生理盐水作为阴性对照组，CTX为阳性对照组，连续注射7天后，于停药3天时处死小鼠，剖取皮下瘤块，称瘤重，计算抑瘤率。

Claims (1)

1.一种光滑爪蟾抗肿瘤多肽，其特征是：以光滑爪蟾皮肤分泌物为原材料提取，

由Phe-Leu-Gly-Lys-Ala-Leu-Lys-Ala-Gly-Leu-Lys-Ile-Gly-Ala-Asn-Met-Leu-Gly-Gly-Ala-Pro-Gln-Gln组成的二十三肽，其分子量为2283.395 Da。

Images