CN101948439A - 鹿茸活性生物碱类化合物的提取方法及在医药上的应用 - Google Patents

Abstract

鹿茸活性生物碱类化合物的提取方法及在医药上的应用。本发明公开了一种利用膜分离技术提取鹿茸中生物碱类化合物的提取方法。取鹿茸粉加蒸馏水室温搅拌，置冰箱冷藏过夜，浸出液经离心，弃沉渣；上清液过滤膜过滤，滤液过超滤膜超滤；超滤外液经纳滤膜浓缩，得纳滤浓缩液；浓缩液经旋转蒸发再浓缩。将其过阳离子柱，蒸馏水洗脱，取活性峰；再过阴离子柱层析，流动相为蒸馏水，取活性峰；蒸发浓缩后冷冻干燥，得含有PAA1、PAA2和PAA3的冻干粉。实验证明该类物质有治疗贫血、创伤及疲劳的恢复、心绞痛及冠心病发作后修复期、免疫功能低下、化疗后的“升高白细胞”等潜在用途。

Description

鹿茸活性生物碱类化合物的提取方法及在医药上的应用

技术领域

本发明属于来源于动物体活性生物碱类化合物的提取技术领域，涉及与尿嘧啶、尿苷和肌苷为立体异构的生物活性物质的提取技术。同时，也涉及来源于动物体的有效成分为主的医药配制品。

背景技术

鹿茸作为一种保健药具有很高的疗效，历史上它也被用于许多疾病的治疗，包括贫血症、关节炎、健忘症、创伤和疼痛。一般来说，鹿茸有增强机体代谢，保护和更新受损的器官和组织，调节免疫和吞噬细胞功能，减缓衰老进程，降低血压和改善促性腺和甲状腺功能等作用。

鹿茸产品众多，制备方法各不相同。如果不清楚鹿茸的有效成分，不知道这些有效成分的化学性质，在提取过程中将带有极大的盲目性，有可能造成有效成分的损失及资源的浪费。另外，以鹿茸为原料的药品及食品的质量标准，应该以鹿茸的活性成分的化学性质相关，以保障用鹿茸为原料的药品及食品的质量及安全。目前，鹿茸药材的质量标准仍以蛋白含量为主，而氨基酸及多肽类也许并非鹿茸的主要活性成分。因此，鹿茸药理作用的物质基础研究尤为重要。

鹿茸药理作用的物质基础研究由来已久，国内1994年由杨秀伟等首次报道了从鹿茸中提取尿嘧啶、尿苷，次黄嘌呤等核苷类化合物，但比较研究的结果却是与标准品波谱一致^[1]。此后又对鹿茸中的尿嘧啶、尿苷，次黄嘌呤抑制单胺氧化酶的活性进行比较，并认为次黄嘌呤抑制单胺氧化酶的活性最强^[2]。1992年张志强等应用凝胶过滤和离子交换层析等技术，从鹿茸中提取纯化出一种多肽，经高压液相色谱和N-末端氨基酸分析鉴定为单一多肽。是由68个氨基酸组成，分子量为7200^[3]。药理研究证明，这个成分对大鼠角叉采胶性足肿胀有明显的抑制作用^[4]。1995年霍玉书等应用柱层析技术，从新鲜梅花鹿中分离出一种多肽，这种多肽可以促进鸡胚神经节的分化，据分析可能是神经生长因子类物质^[5]。1999年王本祥、周秋丽等应用凝胶过滤、高压液相制备以及激光解析电离飞行质谱分析等技术，从新鲜梅花鹿鹿茸中提取出一种多肽，分子量5788^[6]。药理研究表明，这种多肽可以促进骨、软骨细胞的分裂，有促进骨折愈合的作用。随后，该课题组在2001年应用同样的工艺方法从新鲜马鹿茸有提取出一种多肽，分子量3200^[7-9]，并有氨基酸序列分析数据。药理研究表明，这种多肽可以促进成纤维细胞和表皮细胞的增殖，有促进皮肤创伤愈合的作用。2003年他们又从马鹿茸提取出一种分子量为3095的多肽，并对其氨基酸组成进行了分析^[10]。目前，鹿茸多肽的化学和药理研究尽管较多，但仍未见有关合成的多肽与天然的鹿茸多肽比较研究的报道，也未见相关化合物专利。其他一些有关在鹿茸中提取的化合物，如多胺、神经节甙脂、胆固醇等，因不是鹿茸中特有的化合物，而较少深入研究。

在以往的鹿茸制剂的提取工艺中多采用醇浸、煮沸、超临界CO₂萃取、超滤浓缩等技术^[11-20]。由于不清楚鹿茸的活性成分的化学结构、分子量、理化性质等，各种提取工艺均存在不同程度的缺陷。同时，由于不知道鹿茸有效成分药理作用的有效剂量范围，各种制剂的剂量无法定量，给临床应用带来一定的盲目性。本发明在鹿茸活性成分清楚的前提下，对其在药材中的含量进行了定量，对有效剂量范围进行实验验证。

参考文献：

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[11].鹿茸生长因子制剂和工艺公开号CN1104095A.

[12].一种鹿茸多肽的制备方法，以其作为主要活性成分的药物公开号CN1631900A.

[13].水溶性冻干鹿茸提取物提取方法公开号CN1481816A.

[14].醇溶性冻干鹿茸提取物提取方法，公开号CN1481814A.

[15].超临界二氧化碳鹿茸精制备方法公开号CN1481815A.

[16].鹿茸有效成分低温超声裂解浸提法，公开号CN1430971A.

[17].一种鹿茸精注射液的制备方法，公开号CN1207296A.

[18].鹿茸精注射剂新的给药途径及其制备工艺、新适应症，公开号CN1768762A.

[19].一种鹿茸药用成分的水解提取方法及产品，公开号CN1425387A.

[20].综合提取鲜鹿茸中活性成分的方法公开号CN1771993A.

发明内容

与以往鹿茸中核酸类物质的概念截然不同，本发明提出鹿茸活性成分是生物碱类物质的新概念。本发明的主要目的是：一、提供一种有效的分离方法分离出鹿茸的几种活性成分的化合物，公开它们的化学结构、理化性质以及活性特征。二、提供这些活性成分在药物领域的应用。

本发明的技术方案是：一、采用膜分离技术提取和浓缩提取物，以保证化合物不受剧烈外界条件影响。二、使用纯水作溶剂，不存在其他离子掺入的问题。三、使用离子交换层析技术脱色素，并纯化活性成分，以最大限度的保留活性成分，减少有机溶剂的使用和残留。

具体分离的操作步骤：取鹿茸粉加5-10％(g/v)的蒸馏水，室温至40℃搅拌4h，置冰箱冷藏过夜。浸出液经8000rpm离心40nim，弃沉渣。浸出液上清过0.8μ滤膜过滤。滤液过超滤膜超滤(3KD)，超滤外液(内液弃去)再过纳滤膜纳滤，得纳滤内液。纳滤内液56℃旋转蒸发浓缩，得纳滤浓缩液。将其过CM-cellulose阳离子柱，洗脱液为蒸馏水，取活性峰，活性峰溶液经旋转蒸发浓缩。再过DEAE-sephadexA25阴离子柱层析，流动相为蒸馏水，取活性峰。旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，得冻干粉(即为鹿茸总提取物，简称LR，下同)。其中含三种活性成分：PAA1、PAA2和PAA3。

同时，上述操作中，在将其过CM-cellulose阳离子柱，蒸馏水洗脱，取活性峰，活性峰溶液经旋转蒸发浓缩。用Tris盐酸缓冲液pH9.0平衡DEAE-sephadexA25阴离子柱，将以上浓缩液层析，缓冲液洗脱，弃穿透峰。再用2％甲酸洗脱，取解吸附部分。56℃旋转蒸发浓缩至干，加蒸馏水再溶解。冷冻干燥，也能得冻干粉(鹿茸总提取物，LR)。其中含三种活性成分：PAA1、PAA2和PAA3。

如果在上述提取步骤中，用Tris盐酸缓冲液pH9.0平衡DEAE-sephadex A25阴离子柱，缓冲液洗脱，弃穿透峰。继续用蒸馏水洗脱，取穿透峰，其主要活性成分为PAA1和PAA2，活性成分占42％。再用2％甲酸洗脱，取解吸附部分，56℃旋转蒸发浓缩至干，加蒸馏水再溶解，主要活性成分为PAA3。

将冻干粉用液相色谱制备得到三种活性成分：PAA1、PAA2和PAA3{分别为已知化合物尿嘧啶(uracil)、尿苷(uridine)和肌苷(inosine)的立体异构物的简称}。

经过对PAA1、PAA2和PAA3样品的波谱解析，其化学结构式分别为：

PAA1分子式为C₄H₄N₂O₂；分子量＝112.3；白色粉末，m.p302～304℃。结构式为：

其中“*”代表未定义立体键。

PAA2分子式为C₉H₁₂N₂O₆；分子量＝244.06；白色粉末，m.p93～95℃。结构式为：

其中“*”代表未定义立体键。

PAA3分子式为C₁₀H₁₂N₄O₅；分子量＝268.07；白色粉末，m.p139～140℃。结构式为：

其中“*”代表未定义立体键。

以上化合物与已知化合物尿嘧啶(uracil)、尿苷(uridine)和肌苷(inosine)十分相似：

通过对化合物经紫外、红外、质谱、圆二色谱及一维和二维核磁共振谱解析，分别是尿嘧啶、尿苷和肌苷的立体异构体。与标准品(尿嘧啶、尿苷和肌苷)比较，样品在摩尔吸收系数、熔点、旋光性、核磁谱、活性等指标与标准品均有差别，其表现在立体结构上N-H、C-H与环上的角度有变化，从而造成仪器分析测试上数据与现有产品的差别。

不仅如此，PAA1、PAA2和PAA3与相应的化合物尿嘧啶、尿苷和肌苷的生物活性存在着显著的差别。PAA1，PAA2，PAA3可以表达鹿茸药理活性，其有效剂量范围与相应的细胞刺激因子和生长因子相同。PAA1、PAA2和PAA3对由5-氟尿嘧啶(5-FU)处理的小鼠骨髓间充质干细胞的增殖均有刺激作用，与巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)相似，而尿嘧啶、尿苷和肌苷没有活性。PAA1、PAA2和PAA3可以刺激低氧/再给氧损伤的心肌细胞代谢活性。PAA1、PAA2和PAA3可以活化小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。而尿嘧啶、尿苷和肌苷没有活性。PAA1、PAA2和PAA3可以促进家兔角膜缘干细胞的增殖，与成纤维细胞生长因子(FGF)作用相似。因此，PAA1、PAA2和PAA3均有治疗贫血、创伤及疲劳的恢复、心绞痛及冠心病发作后修复期、免疫功能低下、化疗后的“升高白细胞”等的潜在用途。

本发明的突出特点是：(1)发现了在鹿茸中前人从未发现的、与已知化合物尿嘧啶、尿苷和肌苷为立体异构化合物PAA1、PAA2和PAA3，并有效的提取和分离出来。(2)检定了PAA1、PAA2和PAA3与立体异构化合物尿嘧啶、尿苷和肌苷在结构上的差异。(3)验证了由于这种结构上的差异，导致其之间生物活性的显著差异，使得PAA1、PAA2和PAA3在医药学上有着极为可观的潜在用途。(4)在提取工艺上：(I).采用膜分离技术提取和浓缩提取物，以保证化合物不受剧烈外界条件影响。(II).使用纯水作溶剂，不存在其他离子掺入的问题。(III).使用离子交换层析技术脱色素，并纯化活性成分，得到总提取物；本工艺可以最大限度的保留活性成分，减少有机溶剂的使用和残留。

以下用实施例对本发明作进一步的说明。

具体实施方式

一.提取方法实施例

实施例1

取鹿茸粉30克加蒸馏水600毫升，室温至40℃搅拌4h，置冰箱冷藏过夜。浸出液经8000rpm离心40nim，弃沉渣。浸出液上清过0.8μ滤膜过滤。滤液过超滤膜超滤(3KD)，得超滤外液。过纳滤膜纳滤，得纳滤内液。56℃旋转蒸发浓缩，得纳滤浓缩液。过CM-cellulose阳离子柱洗脱液为蒸馏水，取活性峰。活性峰溶液经旋转蒸发浓缩，过DEAE-sephadexA25阴离子柱层析，流动相为蒸馏水，取活性峰。旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，得冻干粉53.67mg(鹿茸总提取物，LR)，得率0.178％。总提取物经液相色谱制备得活性成分，占总重量11.99％。其中，PAA1(2.08mg)，PAA2(2.96mg)，PAA3(1.4mg)。

实施例2

取鹿茸粉30克加蒸馏水600毫升，室温至40℃搅拌4h，置冰箱冷藏过夜。浸出液经8000rpm离心40nim，弃沉渣。浸出液上清过0.8μ滤膜过滤。滤液过超滤膜超滤(3KD)，得超滤外液。过纳滤膜纳滤，得超滤内液。56℃旋转蒸发浓缩，得纳滤浓缩液。过CM-cellulose阳离子柱洗脱液为蒸馏水取活性峰，活性峰溶液经旋转蒸发浓缩。DEAE-sephadex A25阴离子柱层析，Tris盐酸缓冲液pH9.0平衡柱，缓冲液洗脱，弃穿透峰。2％甲酸洗脱，取解吸附部分。56℃旋转蒸发浓缩至干，加蒸馏水再溶解。冷冻干燥，得冻干粉22.8mg(鹿茸总提取物，LR)，得率0.076％。活性成分占28.25％，比例同上。

实施例3

取鹿茸粉30克加蒸馏水600毫升，室温至40℃搅拌4h，置冰箱冷藏过夜。浸出液经8000rpm离心40nim，弃沉渣。浸出液上清过0.8μ滤膜过滤。滤液过超滤膜超滤(3KD)，得超滤外液。过纳滤膜纳滤浓缩，得超滤内液。56℃旋转蒸发浓缩，得纳滤浓缩液。过CM-cellulose阳离子柱洗脱液为蒸馏水，取活性峰。活性峰溶液经旋转蒸发浓缩。DEAE-sephadex A25阴离子柱层析，Tris盐酸缓冲液pH9.0平衡柱，缓冲液洗脱，弃穿透峰。蒸馏水洗脱，取穿透峰，主要活性成分为PAA1和PAA2，得冻干粉10.27毫克，活性成分占42％。继续用2％甲酸洗脱，取解吸附部分，56℃旋转蒸发浓缩至干，加蒸馏水再溶解，主要活性成分为和PAA3。冷冻干燥，得冻干粉12.81mg，活性成分占10.92％。

二.药理活性测试

实施例1：鹿茸提取物对5-氟尿嘧啶处理的模型小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖的影响

1、实验方法：取10只小鼠，尾静脉注射5-氟尿嘧啶(5-FU)150mg/kg体重，48h后取股骨骨髓细胞，培养方法参考文献。

细胞接种在96孔培养板中，细胞接种密度为1.0×10⁴个细胞/孔100μl，细胞接种24h后换成无血清培养液。对照组加等体积培养液，阳性药物加入巨噬细胞-粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)，加药组分别加入样品PAA1、PAA2、PAA3及相应的化合物标准品尿嘧啶(Uracil)、尿苷(Uridine)、肌苷(Inosine)，所有样品的终浓度均为100、10.0、1.0、0.1ng/ml四个剂量组。5％CO₂、37℃孵育24h。在细胞培养结束前4h，每孔加入20μLMTT继续培养，4h后中止反应，加入100μL100％二甲基砜。经微量振荡器振荡后，用自动酶标光度计测定570nm处各孔的A值。

2、结果

实验结果表明，样品PAA1、PAA2、PAA3刺激模型小鼠MSCs细胞增殖的作用较强，与GM-CSF的作用相似。有效剂量范围在100.0-0.1ng/ml之间。化合物相应的标准品无活性。(见表1)

表1、鹿茸各组分对模型小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖的影响(

n＝3)

对照组0.0256±0.0051，与对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

3、结论：

样品PAA1、PAA2、PAA3刺激模型小鼠MSCs细胞增殖的作用较强，与GM-CSF的作用相似。有效剂量范围在100.0-1.0ng/ml之间。化合物相应的标准品无活性。

实施例2：鹿茸提取物对角膜缘干细胞增殖的影响

1、实验方法：角膜缘干细胞的分离培养：日本大耳白兔，无菌条件下取全眼球，沿角膜缘外1mm处环形剪下角膜，摘除晶状体、虹膜、除去多余巩膜组织，完整角膜片放入Hank’s液培养皿中液洗涤两次，从角膜缘内侧1mm处环形剪下角膜缘，除去内皮层和多余固有层，将角膜缘上皮组织尽量剪碎，再用0.25％胰蛋白酶和0.2％EDTA(1∶1)消化，37℃消化30min，加入Hank’s液碎打，1000转/nim，离心5min，冲洗2次，用含15％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM/F12培养液制备成细胞悬液，接种至培养瓶中，3天换液一次，等细胞铺满瓶底备实验用。

细胞接种在96孔培养板中，细胞接种密度为1.0×10⁴个细胞/孔100μl，细胞接种24h后换成无血清培养液。对照组加等体积培养液，加药组分别加入终浓度为100、10、1、0.1ng/ml的PAA1、PAA2、PAA3，阳性对照组加入成纤维细胞生长因子(FGF)每个剂量组4个平行孔。5％CO₂、37℃孵育24h。在细胞培养结束前4h，每孔加入10μLMTT继续培养，4h后中止反应，加入100μL 100％二甲基亚砜。经微量振荡器振荡后，用自动酶标光度计测定570nm处各孔的A值。

2、结果：

实验结果表明，PAA1、PAA2、PAA3样品组100.0-1.0ng/ml范围内对角膜缘干细胞增殖均有刺激作用，与FGF作用相似。见表2

表2、鹿茸各组分对角膜缘干细胞增殖的刺激作用(

n＝4)。

对照组0.0428±0.0047，与对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

3、结论：

PAA1、PAA2、PAA3样品组100.0-1.0ng/ml范围内与FGF一样，对角膜缘干细胞增殖均有刺激作用。

实施例3：鹿茸提取物对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

1、试验方法

乳鼠心肌细胞培养：无菌操作取出生3d的乳鼠心脏，去除心包膜，取心尖部心肌组织剪成1mm³小块，用D-Hank’s液冲洗2遍，加入0.125％胰蛋白酶，37℃消化20min。将组织块吹打制备成细胞悬液，离心10min(1000rpm/min^-1)弃上清，加入D-Hank’s液，离心10min(500rpm/min^-1)弃上清洗涤两遍。细胞悬液加入含15％胎牛血清的DMEM培养液，置25ml培养瓶。37℃培养60nim。取培养液中细胞，弃贴壁细胞。经差速贴壁纯化后的心肌细胞再次制备成细胞悬液，接种至96孔培养板，置5％CO₂培养箱37℃培养。

对照组加入等体积培养液，实验组分别加入样品PAA1、PAA2、PAA3，及相应的化合物标准品Uracil、Uridine、Inosine，所有样品的终浓度均为100、10.0、1.0、0.1ng/ml四个剂量组。

缺氧/复氧模型建立：原代培养的心肌细胞经胰酶消化，加入低糖培养液制成细胞悬液，接种在96孔培养板中，细胞数密度为3×10⁵个细胞/孔，同时加入不同浓度的受试样品，对照组加等体积的培养液。低氧条件为5％CO₂、3％O₂、92％N₂，37℃培养，饱和湿度下，细胞与受试样品共同孵育2h后。换常规培养液，恢复常氧条件及5％CO₂，37℃继续孵育2h。终止培养，按下述方法测定各项指标。

观察指标及检测方法：细胞内线粒体脱氢酶活性：弃培养液上清，加入含5％MTT的培养液100μl，继续孵育4h，终止培养，弃培养液。加入100μL 100％二甲基砜，经微量震荡器震荡后，用自动酶标光度计测定570nm处各孔的A值。以A值表示心肌细胞代谢活性的强弱。结果见表3.

2、结果

表3、PAA1、PAA2、PAA3，对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤后线粒体脱氢酶活性的影响(n＝3)

对照组0.116±0.004，与对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

3、结论

结果表明，与对照组比较，PAA1、PAA2、PAA3对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤后线粒体脱氢酶活性均有显著提高作用。而标准品对该指标无明显影响。

实施例4：鹿茸提取物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

1、实验方法：小鼠腹腔巨噬细胞的制备  取数只小鼠，腹腔内注射无血清培养液1.5mL，10min后颈椎脱臼处死小鼠，75％酒精浸泡消毒，无菌收集腹腔液。1000r/min离心10min收集细胞，用含10％FBS的培养液调整细胞浓度至3×10⁶/mL。以每孔100μL细胞悬液接种于96孔培养板，置培养箱中，经5％CO₂、37℃培养2h。弃上清液，用培养液洗去未贴壁细胞，培养孔内为腹腔巨噬细胞。每孔加培养液100μL，继续培养。

对照组和实验组均含有LPS 10μg/mL。对照组加入等体积培养液，实验组分别加入样品PAA1、PAA2、PAA3，及相应的化合物标准品Uracil、Uridine、Inosine，所有样品的终浓度均为100、10.0、1.0、0.1ng/ml四个剂量组。

巨噬细胞吞噬中性红试验：分组加药的巨噬细胞经37℃孵育24h后，每孔加入中性红生理盐水液，终浓度为1g/L，继续培养20min。细胞经PBS洗涤3遍，每孔加入细胞溶解液(乙酸∶无水乙醇＝50∶50)100μL，室温放置2h。待细胞溶解后，用自动酶标光度计测各孔吸光度A值，测量波长540nm。以A值表示巨噬细胞吞噬功能的强弱。结果见表4。

2、结果

表4、PAA1、PAA2、PAA3，对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(

n＝3)。

对照组0.066±0.003，与对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。

3、结论

表4结果表明，与对照组比较，PAA1、PAA2、PAA3对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能活性均有显著提高作用。而标准品对该指标无明显影响。

三.药物剂型实施例

以下含有鹿茸提取物(LR)(含PAA1、PAA2、PAA3成分)的制剂，可与相应药用载体结合制备成各种剂型，用于皮肤、粘膜、角膜的炎症溃疡，心脏病发作的恢复期，贫血及白细胞降低，运动后的体力恢复。见表5.

表5药物剂型品种、使用途径：

Claims (6)

1.鹿茸活性生物碱类化合物提取方法，其特性在于含有以下结构的化合物：

其中“*”所处的N-H或C-H键代表未定义的立体键；

提取方法按以下步骤进行：

(1)取鹿茸粉，按5-10％(g/v)加蒸馏水，室温至40℃搅拌4h，置冰箱冷藏过夜，浸出液经8000rpm离心40nim，弃沉渣；

(2)浸出液上清过0.8μ滤膜过滤，滤液过3KD超滤膜超滤，超滤外液再过纳滤膜纳滤浓缩，得纳滤浓缩液；

(3)纳滤浓缩液经56℃旋转蒸发浓缩，得浓缩液；

(4)将其过CM-cellulose阳离子柱，洗脱液为蒸馏水，取活性峰，活性峰溶液经旋转蒸发浓缩；再过DEAE-sephadexA25阴离子柱层析，流动相为蒸馏水，取活性峰；旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，得含有PAA1、PAA2和PAA3的冻干粉。

2.根据权利要求1所述鹿茸活性生物碱类化合物的提取方法，其特征在于所述含有PAA1、PAA2和PAA3的冻干粉经液相制备色谱分离分别得到PAA1、PAA2和PAA3。

3.根据权利要求1所述鹿茸活性生物碱类化合物的提取方法，其特征在于在步骤(4)将其过CM-cellulose阳离子柱，洗脱液为蒸馏水，取活性峰，活性峰溶液经旋转蒸发浓缩；再过用Tris盐酸缓冲液pH9.0平衡的DEAE-sephadex A25阴离子柱层析，缓冲液洗脱，弃穿透峰后，用2％(v/v)甲酸洗脱，取解吸附部分，56℃旋转蒸发浓缩至干，加蒸馏水再溶解，冷冻干燥，得含有PAA1、PAA2和PAA3的冻干粉。

4.根据权利要求1所述鹿茸活性生物碱类化合物的提取方法，其特征在于在步骤(4)将其过CM-cellulose阳离子柱，洗脱液为蒸馏水，取活性峰，活性峰溶液经旋转蒸发浓缩；再过用Tris盐酸缓冲液pH9.0平衡的DEAE-sephadex A25阴离子柱层析，缓冲液洗脱，弃穿透峰后，蒸馏水洗脱，取穿透峰，经浓缩、冷冻干燥得到主要活性成分为PAA1和PAA2的冻干粉；继续用2％甲酸洗脱，取解吸附部分，56℃旋转蒸发浓缩至干，加蒸馏水再溶解，冷冻干燥，得主要活性成分为PAA3的冻干粉。

5.鹿茸活性生物碱类化合物在医药上的应用，其特征在于治疗贫血、创伤及疲劳的恢复、心绞痛及冠心病发作后修复期、免疫功能低下和化疗后的“升高白细胞”疾病的潜在用途。

6.根据权利要求5所述鹿茸活性生物碱类化合物在医药上的应用，其特征在于用于治疗贫血、创伤及疲劳的恢复、心绞痛及冠心病发作后修复期、免疫功能低下、化疗后的“升高白细胞”等，所用的含有PAA1、PAA2和PAA3冻干粉有如下医药剂型：

(1)注射剂，0.075mg/只，敷料为注射用水，用于肌肉或静脉注射；

(2)片剂，0.075mg/片，敷料为药用淀粉，用于内服；

(3)胶囊剂，0.075mg/粒，用药用胶囊装入，用于内服；

(4)栓剂，0.050mg/枚，辅料为水溶性基质，用于肛门及阴道；

(5)气雾剂，0.010mg/ml，辅料为抛射剂，用于呼吸道；

(6)滴眼剂，0.010mg/ml，辅料为缓冲液，用于眼部疾患的水剂和软膏；

(7)微球，0.075mg/粒，辅料为包衣材料，用于消化道疾患；

(8)贴剂，0.020mg/片，辅料为沾合剂，用于口腔粘膜疾患。