CN106755245A - 一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法、制备得到的土鳖虫糖蛋白及其应用 - Google Patents

一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法、制备得到的土鳖虫糖蛋白及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及糖蛋白提取技术领域，尤其涉及一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法，该方法包括下列步骤：(1)预处理：土鳖虫清洗、烘干和粉碎；(2)脱脂处理：加入脱脂溶剂进行超声处理；(3)糖蛋白的提取：微波辅助浸提及水浴浸提；(4)糖蛋白的纯化：乙醇分级沉淀及复合酶酶解法来除去游离的蛋白质，进行超滤，冷冻干燥得到糖蛋白。本发明中的提取纯化方法，操作简单，条件温和，能有效去除游离蛋白质，同时还不破坏糖蛋白的活性，大大提高了糖蛋白的提取效率。

Description

一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法、制备得到的土鳖虫糖蛋 白及其应用
技术领域
本发明涉及糖蛋白提取技术领域，具体涉及一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法。
背景技术
土鳖虫为鳖蠊科昆虫地鳖或冀地鳖的雌虫干燥体，主产福建、河北、陕西、甘肃、青海、山东、河南、江苏、浙江、湖南等地，具有破血逐瘀，续筋接骨之功效，是一种重要的传统中药。其生物体内含有多种活性蛋白、氨基酸、不饱和脂肪酸、微量元素、生物碱和脂溶性维生素等物质，现在药理研究表明土鳖虫具有溶栓、抗凝血、抗肿瘤、调节血脂等作用。
活性肽广泛存在于自然界中，生物体很多活性物质都以肽的形式存在，没有肽，就没有活性，没有生命。科学家们研究发现了具有免疫调节、激素调节、酶调节、抗病毒、降血压和降血脂等功能性肽。由于功能性肽的特殊功能，使得人们对它需求增加，现在已提取出多种功能性肽多用于医用和保健，如功能性大豆蛋白肽已经用于降血脂。
目前，对土鳖虫化学成分的研究主要集中在氨基酸、脂肪酸、微量元素、生物碱等方面，对土鳖虫糖蛋白的研究较少；现有技术公开了采用水提法对新鲜的土鳖虫进行糖蛋白的提取，然后再通过Sevag法、离子交换层析法进行糖蛋白的纯化；虽然采用Sevag法可有效除去游离蛋白，但是所得的糖蛋白的提取率低而且生物活性较差、纯度低。因此，有必要提供一种更合理的糖蛋白的提取纯化方法，以提高土鳖虫糖蛋白的提取率同时还保持糖蛋白的生物活性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法，该方法可提高糖蛋白提取率、同时保持糖蛋白生物活性。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法，所述提取纯化方法包括下列步骤：
(1)预处理：取新鲜的雌性土鳖虫清洗干净，然后加入pH3～6的PBS溶液浸泡10～30min，然后用蒸馏水清洗，将所述雌性土鳖虫烘干、粉碎，得到土鳖虫粉；
(2)脱脂处理：取步骤(1)得到的土鳖虫粉，然后加入所述土鳖虫粉重量5～10倍的脱脂溶剂进行超声处理，抽滤，得到脱脂土鳖虫粉；
(3)糖蛋白的提取：取步骤(2)中的脱脂土鳖虫粉，然后再加入脱脂土鳖虫粉重量3～8倍的0.2～0.35mol/L盐溶液进行微波辅助浸提，然后再进行水浴浸提，离心分离，经过减压浓缩得到土鳖虫糖蛋白粗提液；
(4)糖蛋白的纯化：取步骤(3)中的土鳖虫糖蛋白粗提液，加入所述土鳖虫糖蛋白粗提液体积3～10倍的体积浓度为45％～65％的乙醇进行分级沉淀，弃去上清液，收集沉淀物，然后用蒸馏水将沉淀物进行复溶，调pH为3.5～5.8，温度控制在40℃～60℃，再加入所述沉淀物重量0.2～0.5倍复合酶进行酶解，酶解结束后在95℃条件灭酶，得到酶解液，然后将酶解液进行超滤膜处理后得到的截留液过DEAE-52阴离子交换柱进行分离纯化，用0.2～0.35mol/L的氯化钠洗脱，检测糖蛋白的出峰位置，分管收集，合并洗脱峰，将洗脱液透析处理，冷冻干燥得到土鳖虫糖蛋白纯品。
作为一种改进的技术方案，步骤(2)中的脱脂溶剂为质量浓度为8％～10％的十二烷基苯磺酸钠。
作为一种改进的技术方案，步骤(2)中超声处理时的超声功率为220～400V，超声时间为0.5～2min，温度控制在25℃～35℃。
作为一种改进的技术方案，步骤(3)中微波辅助浸提条件：微波功率为200W～300W,微波辅助提取时间为1～5min。
作为一种改进的技术方案，步骤(3)中水浴浸提的温度为40～60℃，浸提时间为0.5～2h。
作为一种改进的技术方案，步骤(3)中的土鳖虫糖蛋白粗提液在纯化之前，先于截留分子量为500Da的透析袋中，蒸馏水透析48h。
作为一种改进的技术方案，步骤(4)中复合酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶和链酶蛋白酶，且所述胃蛋白酶、胰蛋白酶和链酶蛋白酶的质量比为0.3～0.6:0.2～0.35:0.1～0.3。
作为一种改进的技术方案，步骤(4)中超滤膜的截留分子量为8000Da。
本发明还研究了上述方法制备的土鳖虫糖蛋白在胃癌离体细胞生长抑制方面的应用。
本发明建立的土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法，通过该方法获得的土鳖虫糖蛋白对胃癌离体细胞生长起到抑制作用；为了更好的说明土鳖虫糖蛋白在胃癌离体细胞生长抑制中的作用，本发明通过药理实验及结果进行如下描述：
(1)肿瘤细胞的培养
将人胃癌细胞SGC-7901于37℃、5％CO2、含10％新生小牛血清和1.25μg/ml庆大霉素的RPMI1640培养基条件下培养，每隔2-3d换新鲜培养基1次。
(2)苔盼蓝活细胞计数法检测土鳖虫糖蛋白对细胞的作用
选取对数生长期的胃癌细胞，制成单细胞悬浮液，调整细胞浓度至2×105个/ml,接种1ml上述细胞悬液至25ml的细胞培养瓶中，加入3ml生长培养液，培养18h，灭菌的PBS洗涤3次后加入3ml不同浓度的土鳖虫糖蛋白溶液(以维持培养液配置，过滤除菌)，置培养箱中继续培养24h、36h、48h。取出培养瓶，用0.2mL胰酶液在1min内将细胞消化使脱落，随即加入3ml生长培养液终止消化并吹打成单个细胞悬液，吸取0.5ml细胞悬液于干净的试管中，加入0.1ml苔盼染色液(0.4％，以生理盐水配)，摇匀静置2min，用血球计数板对未染色的细胞计数，并在1min完成。
(3)MTT法检测细胞对土鳖虫糖蛋白的敏感性
用生长液调整细胞浓度至5×104个/ml，随即接孔到96孔板，每孔200μl，96孔板边缘一圈的36个孔弃用，各孔加200μl灭菌的PBS；37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱中放置18h使细胞贴壁，吸去培养液，各孔用灭菌的PBS洗3次，除去孔中的残留血清，加入不同浓度的糖蛋白溶液(以维持液配成)各200μl，培养24h、36h、48h，设空白对照。样品液作用后，各孔各加入配置好的5mg/ml,25μl的MTT溶液，继续培养4h，倾倒各孔液体，每孔加入150μl,37℃预温的二甲基亚砜(DMSO),震荡10min后放入酶标仪作双波长吸光度检测，检测波长570nm，参考波长630nm。
(4)实验结果
苔盼蓝活细胞计数法检测分析结果显示：胃癌细胞在土鳖虫糖蛋白作用24h、36h和48h后，均呈现明显的抑制作用，多数细胞出现坏死症状，与阴性对照组相比有显著性差异，p＜0.05。其实验结果见表1。
表1糖蛋白对胃癌细胞的抑制作用
土鳖虫糖蛋白浓度(mg/L) 24h抑制率(％) 36h抑制率(％) 48h抑制率(％)
0 0 0 0
0.086 1.46 1.85 2.97
0.860 6.23 11.42 20.35
8.600 12.46 23.62 32.46
86.00 48.79 54.82 58.54
MTT法检测结果显示：胃癌细胞对糖蛋白比较敏感，作用36h即呈现较明显的抑制作用，作用48h后抑制作用反而降低，与阴性对照组相比有显著性差异，p＜0.05。其实验结果见表2。
表2糖蛋白对胃癌细胞作用24h、36h和48h的MTT检测
土鳖虫糖蛋白浓度(mg/L) 24h抑制率(％) 36h抑制率(％) 48h抑制率(％)
0 0 0 0
0.086 2.68 8.90 6.32
0.860 6.14 12.26 10.17
4.238 28.46 36.46 32.37
8.724 42.20 53.68 48.62
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
(1)本发明通过PBS溶液对土鳖虫进行浸泡预处理，可有效除去臭味，然后再加入脱脂剂十二烷基苯磺酸钠进行超声处理可有效除去土鳖虫生物体内的脂溶性色素及脂肪酸，同时还可以除去部分水溶性色素，进一步降低了脂溶性物质对糖蛋白提取的干扰；
(2)本发明采用微波辅助浸提及水浴浸提，由于微波能可使溶剂分子运动速度加快，渗透、扩散及溶解速度加快，加速糖蛋白从细胞转移到溶剂中，随着微波功率的提高，进一步提高了糖蛋白的提取效率，大大缩短了提取时间；
(3)本发明采用酶解法来去除游离的蛋白质，与Sevag法相比，酶解法除蛋白的反应条件温和，而且通过加入特定的复合酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和链酶蛋白酶)可有效去除游离蛋白质，同时还不会破坏糖蛋白的活性，经过酶解处理，离子交换柱处理后得到的土鳖虫糖蛋白纯度提高。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法，包括下列步骤：
(1)预处理：取新鲜的雌性土鳖虫清洗干净，然后加入pH3.5的PBS溶液浸泡15min，然后用蒸馏水清洗，将雌性土鳖虫烘干、粉碎，得到土鳖虫粉；
(2)脱脂处理：取步骤(1)得到的土鳖虫粉100g，然后加入土鳖虫粉重量5倍的质量浓度为8％的十二烷基苯磺酸钠进行超声处理(超声功率为260V，超声时间为0.5min，温度控制在25℃)，抽滤，得到脱脂土鳖虫粉；
(3)糖蛋白的提取：取步骤(2)中的脱脂土鳖虫粉，然后再加入脱脂土鳖虫粉重量3倍的0.2mol/L盐溶液进行微波辅助浸提(微波功率为230W,提取时间为1.5min)，然后再进行水浴浸提(温度为45℃，浸提时间为0.5h)，离心分离，经过减压浓缩得到土鳖虫糖蛋白粗提液；
(4)糖蛋白的纯化：取步骤(3)中的土鳖虫糖蛋白粗提液，加入土鳖虫糖蛋白粗提液体积3倍的体积浓度为45％的乙醇进行分级沉淀，弃去上清液，收集沉淀物，然后用蒸馏水将沉淀物进行复溶，调pH为3.5，温度控制在45℃，再加入沉淀物重量0.2倍复合酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和链酶蛋白酶的质量比为0.35:0.2:0.1)进行酶解，酶解结束后在95℃条件灭酶，得到酶解液，最后将酶解液经过超滤膜(截留分子量为8000Da)处理后，再过DEAE-52阴离子交换柱进行分离纯化，用0.2mol/L的氯化钠洗脱，检测糖蛋白的出峰位置，分管收集，合并洗脱峰，将洗脱液透析处理，冷冻干燥得到土鳖虫糖蛋白纯品。
此条件下土鳖虫糖蛋白的提取率为10.89％。
实施例2
一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法，包括下列步骤：
(1)预处理：取新鲜的雌性土鳖虫清洗干净，然后加入pH4.2的PBS溶液浸泡20min，然后用蒸馏水清洗，将雌性土鳖虫烘干、粉碎，得到土鳖虫粉；
(2)脱脂处理：取步骤(1)得到的土鳖虫粉100g，然后加入土鳖虫粉重量7倍的质量浓度为9％的十二烷基苯磺酸钠进行超声处理(超声功率为300V，超声时间为1min，温度控制在28℃)，抽滤，得到脱脂土鳖虫粉；
(3)糖蛋白的提取：取步骤(2)中的脱脂土鳖虫粉，然后再加入脱脂土鳖虫粉重量5倍的0.25mol/L盐溶液进行微波辅助浸提(微波功率为260W,提取时间为2.5min)，然后再进行水浴浸提(温度为50℃，浸提时间为1h)，离心分离，经过减压浓缩得到土鳖虫糖蛋白粗提液；
(4)透析处理：取步骤(3)中的土鳖虫糖蛋白粗提液，于截留分子量为500Da的透析袋中，蒸馏水透析48h，得到土鳖虫糖蛋白保留液。
(5)糖蛋白的纯化：取步骤(4)中的土鳖虫糖蛋白保留液，加入土鳖虫糖蛋白粗提液体积5倍的体积浓度为55％的乙醇进行分级沉淀，弃去上清液，收集沉淀物，然后用蒸馏水将沉淀物进行复溶，调pH为4.2，温度控制在48℃，再加入沉淀物重量0.3倍复合酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和链酶蛋白酶的质量比为0.4:0.25:0.17)进行酶解，酶解结束后在95℃条件灭酶，得到酶解液，最后将酶解液经过超滤膜(截留分子量为8000Da)处理后，再过DEAE-52阴离子交换柱进行分离纯化，用0.25mol/L的氯化钠洗脱，检测糖蛋白的出峰位置，分管收集，合并洗脱峰，将洗脱液透析处理，冷冻干燥得到土鳖虫糖蛋白纯品。
此条件下土鳖虫糖蛋白的提取率为11.45％。
实施例3
一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法，包括下列步骤：
(1)预处理：取新鲜的雌性土鳖虫清洗干净，然后加入pH5的PBS溶液浸泡28min，然后用蒸馏水清洗，将雌性土鳖虫烘干、粉碎，得到土鳖虫粉；
(2)脱脂处理：取步骤(1)得到的土鳖虫粉100g，然后加入土鳖虫粉重量8倍的质量浓度为9.5％的十二烷基苯磺酸钠进行超声处理(超声功率为350V，超声时间为1.5min，温度控制在32℃)，抽滤，得到脱脂土鳖虫粉；
(3)糖蛋白的提取：取步骤(2)中的脱脂土鳖虫粉，然后再加入脱脂土鳖虫粉重量7倍的0.3mol/L盐溶液进行微波辅助浸提(微波功率为280W,提取时间为3.5min)，然后再进行水浴浸提(温度为55℃，浸提时间为1.5h)，离心分离，经过减压浓缩得到土鳖虫糖蛋白粗提液；
(4)透析处理：取步骤(3)中的土鳖虫糖蛋白粗提液，于截留分子量为500Da的透析袋中，蒸馏水透析48h，得到土鳖虫糖蛋白保留液。
(5)糖蛋白的纯化：取步骤(4)中的土鳖虫糖蛋白保留液，加入土鳖虫糖蛋白粗提液体积8倍的体积浓度为60％的乙醇进行分级沉淀，弃去上清液，收集沉淀物，然后用蒸馏水将沉淀物进行复溶，调pH为5.3，温度控制在56℃，再加入沉淀物重量0.45倍复合酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和链酶蛋白酶的质量比为0.5:0.3:0.23)进行酶解，酶解结束后在95℃条件灭酶，得到酶解液，最后将酶解液经过超滤膜(截留分子量为8000Da)处理后，再过DEAE-52阴离子交换柱进行分离纯化，用0.3mol/L的氯化钠洗脱，检测糖蛋白的出峰位置，分管收集，合并洗脱峰，将洗脱液透析处理，冷冻干燥得到土鳖虫糖蛋白纯品。
此条件下土鳖虫糖蛋白的提取率为12.36％。
实施例4
一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法，包括下列步骤：
(1)预处理：取新鲜的雌性土鳖虫清洗干净，然后加入pH5.8的PBS溶液浸泡35min，然后用蒸馏水清洗，将雌性土鳖虫烘干、粉碎，得到土鳖虫粉；
(2)脱脂处理：取步骤(1)得到的土鳖虫粉100g，然后加入土鳖虫粉重量8倍的质量浓度为10％的十二烷基苯磺酸钠进行超声处理(超声功率为400V，超声时间为1.8min，温度控制在35℃)，抽滤，得到脱脂土鳖虫粉；
(3)糖蛋白的提取：取步骤(2)中的脱脂土鳖虫粉，然后再加入脱脂土鳖虫粉重量8倍的0.34mol/L盐溶液进行微波辅助浸提(微波功率为300W,提取时间为2min)，然后再进行水浴浸提(温度为60℃，浸提时间为2h)，离心分离，经过减压浓缩得到土鳖虫糖蛋白粗提液；
(4)透析处理：取步骤(3)中的土鳖虫糖蛋白粗提液，于截留分子量为500Da的透析袋中，蒸馏水透析48h，得到土鳖虫糖蛋白保留液。
(5)糖蛋白的纯化：取步骤(4)中的土鳖虫糖蛋白保留液，加入土鳖虫糖蛋白粗提液体积10倍的体积浓度为65％的乙醇进行分级沉淀，弃去上清液，收集沉淀物，然后用蒸馏水将沉淀物进行复溶，调pH为5.8，温度控制在60℃，再加入沉淀物重量0.5倍复合酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶和链酶蛋白酶的质量比为0.58:0.32:0.27)进行酶解，酶解结束后在95℃条件灭酶，得到酶解液，最后将酶解液经过超滤膜(截留分子量为8000Da)处理后，再过DEAE-52阴离子交换柱进行分离纯化，用0.32mol/L的氯化钠洗脱，检测糖蛋白的出峰位置，分管收集，合并洗脱峰，将洗脱液透析处理，冷冻干燥得到土鳖虫糖蛋白纯品。
此条件下土鳖虫糖蛋白的提取率为12.08％。
对比实施例
采用传统方法提取：称取步骤(1)中的土鳖虫粉100g，加入蒸馏水水浴浸提，过滤后将所得滤液中加入Sevag试剂(氯仿与正丁醇的体积比为3:1)，除去沉淀蛋白，将上清液过DEAE-50纤维素离子交换柱纯化，用洗脱液洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥得到土鳖虫糖蛋白纯品。
此条件下土鳖虫糖蛋白的提取率为8.15％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法，其特征在于所述提取纯化方法包括下列步骤：
(1)预处理：取新鲜的雌性土鳖虫清洗干净，然后加入pH3～6的PBS溶液浸泡10～40min，然后用蒸馏水清洗，将所述雌性土鳖虫烘干、粉碎，得到土鳖虫粉；
(2)脱脂处理：取步骤(1)得到的土鳖虫粉，然后加入所述土鳖虫粉重量5～10倍的脱脂溶剂进行超声处理，抽滤，得到脱脂土鳖虫粉；
(3)糖蛋白的提取：取步骤(2)中的脱脂土鳖虫粉，然后再加入脱脂土鳖虫粉重量3～8倍的0.2～0.35mol/L盐溶液进行微波辅助浸提，然后再进行水浴浸提，离心分离，经过减压浓缩得到土鳖虫糖蛋白粗提液；
(4)糖蛋白的纯化：取步骤(3)中的土鳖虫糖蛋白粗提液，加入所述土鳖虫糖蛋白粗提液体积3～10倍的体积浓度为45％～65％的乙醇进行分级沉淀，弃去上清液，收集沉淀物，然后用蒸馏水将沉淀物进行复溶，调pH为3.5-5.8，温度控制在40℃～60℃，再加入所述沉淀物重量0.2～0.5倍复合酶进行酶解，酶解结束后在95℃条件灭酶，得到酶解液，然后将酶解液进行超滤膜处理后得到的截留液过DEAE-52阴离子交换柱进行分离纯化，用0.2～0.35mol/L的氯化钠洗脱，检测糖蛋白的出峰位置，分管收集，合并洗脱峰，将洗脱液透析处理，冷冻干燥得到土鳖虫糖蛋白纯品。
2.根据权利要求1所述的一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法，其特征在于：步骤(2)中的脱脂溶剂为质量浓度为8％～10％的十二烷基苯磺酸钠。
3.根据权利要求1所述的一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法，其特征在于：步骤(2)中超声处理时的超声功率为220～400V，超声时间为0.5-2min，温度控制在25℃～35℃。
4.根据权利要求1所述的一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法，其特征在于：步骤(3)中微波辅助浸提条件：微波功率为200W～300W,微波辅助提取时间为1～5min。
5.根据权利要求1所述的一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法，其特征在于：步骤(3)中水浴浸提的温度为40～60℃，浸提时间为0.5～2h。
6.根据权利要求1所述的一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法，其特征在于：步骤(3)中的土鳖虫糖蛋白粗提液在纯化之前，先于截留分子量为500Da的透析袋中，蒸馏水透析48h。
7.根据权利要求1所述的一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法，其特征在于：步骤(4)中复合酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶和链酶蛋白酶，且所述胃蛋白酶、胰蛋白酶和链酶蛋白酶的质量比为0.3～0.6:0.2～0.35:0.1～0.3。
8.根据权利要求1所述的一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法，其特征在于：步骤(4)中超滤膜的截留分子量为8000Da。
9.权利要求1的一种土鳖虫糖蛋白的提取纯化方法制备得到的土鳖虫糖蛋白。
10.权利要求9的土鳖虫糖蛋白在胃癌离体细胞生长抑制方面的应用。
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