CN103923201A - 一种海马活性糖蛋白的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种海马活性糖蛋白的制备方法，特点是包括以下步骤：a.将冷冻干燥后的海马粉粹，采用CO2超临界流体萃取技术脱除脂肪酸；配置0～0.25mol/L的NaCl浸提液，与脱脂海马按照1:10～1:35（mL/g）的比例混合于锥形瓶中，摇匀后首先进行超声波辅助提取20min，再置于水浴锅中于30℃～80℃下热水浸提1～6h，最后滤纸过滤，上清液即为糖蛋白混合溶液；b.海马糖蛋白的纯化：采取Sevage法和乙醇分级沉淀法。将粗纯品用蒸馏水复溶，3500Da透析袋透析72h脱盐，冷冻干燥，得到海马糖蛋白粗纯品，优点是省时、高效，全程无有毒有害试剂的残留和污染，并确保了制取糖蛋白的活性。

Description

一种海马活性糖蛋白的制备方法
技术领域
本发明涉及一种糖蛋白的制备方法，尤其是涉及一种海马活性糖蛋白的制备方法。 
背景技术
海马为海龙科动物，性温、味甘、归肝、肾经，属于药食同源类生物，是名贵的海洋滋补药物，在我国素有“北方人参，南方海马”之称，具有极高的经济价值。2005《中国药典》收载原动物主要有五种：线纹海马Hippocampus kelloggi Jordan et Snyder、刺海马H. histrix Kaup、大海马H. kuda Bleeker 、三斑海马H. trimaculatus Leach或小海马（海蛆）H. japonicus Kaup的干燥体。夏、秋二季捕捞，洗净，晒干；或除去皮膜及内脏，晒干。 
海马药用历史悠久，历代古医籍及我国药典历次版本一部（中药部分）均有收载。公元739年，《本草拾遗》古医籍中陈藏器首次使用海马之名；《神农本草》古医籍中记载：海马性温、味甘、无毒，具有强身补肾、舒筋活络、止痛止血、退热生肌、强心明目、祛疾止喘、夫人催生等功能；明代《本草纲目》记载：海马雌雄成对，其性温暖，有交感之意，故难产及阳虚房中方术多用之，具有暖水脏、壮阳道之功能。现代医学已经证明海马具有较高的营养价值和化学活性成分，含有大量的镁、钙，其次为锌、铁、锶、锰，少量的钴、镍、铜和铬，还含有大量的硬脂酸、胆甾醇、胆甾二醇，其不饱和脂肪酸占总脂肪酸比例较高，其中多烯不饱和脂肪酸EPA（二十碳五烯酸）和DHA（二十二碳六烯酸）较为丰富。海马具有补肾壮阳、调气活血等功效，临床上主要用于治疗阳痿、遗尿、虚喘、症积等。目前对海马化学成分的研究主要集中在氨基酸、微量元素、磷脂、脂肪酸和甾体类等，对水溶性组分的研究较少，所以海马水溶性组分的研究有利于人们对海马的认识更加完整。 
海洋拥有特殊的生态环境，赋予了海洋生物异于陆生生物所特有的化学成分和结构，具有特异的高活性、高药效。近年来对海洋药物的研究越发深入，越来越多的研究发现糖蛋白具有很好的医疗保健功效，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血脂、提高免疫力等活性。糖蛋白涉及细胞的定向归巢、糖蛋白毒素及激素作用机制，可使药物选择性地集中到病灶，提高药效，而不影响正常组织的生长和免疫系统的功能，降低不良反应。海马蛋白质含量丰富，高达70%左右。现代科学已证明80%以上的蛋白质都是糖蛋白，包括许多酶、激素、毒素、载体蛋白、免疫球蛋白、结构蛋白、凝集素、受体、粘液组分等，甚至过去人们一直认为是“纯”的多糖，如糖原和纤维素，亦含有少量共价结合的蛋白质。目前，国内外对海马糖蛋白的制备的研究还未见相关报道。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有高效、快速并能保持糖蛋白活性的海马糖蛋白制备方法。 
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种海马活性糖蛋白的制备方法，包括以下步骤： 
（1）海马前处理：将海马洗净冻好后，于-40℃下冷冻干燥48-72h，再用粉碎机粉碎，然后采用CO2超临界流体萃取技术脱除脂肪酸，得到脱脂海马粉；
（2）海马糖蛋白提取：将步骤（1）得到的脱脂海马粉与NaCl浓度为0～0.25mol/L的浸提液按（10～35）g：1mL的比例混合于锥形瓶中摇匀后，首先进行超声波辅助提取20min，再置于水浴锅中于30℃～80℃下浸提1～6h后，用滤纸过滤，得到的上清液即为海马糖蛋白混合溶液；
（3）海马糖蛋白粗纯化：将步骤（2）得到的海马糖蛋白溶液减压浓缩至原体积的四分之一，得到糖蛋白样品液，将糖蛋白样品液采用Sevage法除游离蛋白，脱蛋白一次，4℃静置过夜，弃下层游离蛋白层；收集上层糖蛋白溶液，进行乙醇分级沉淀，然后将沉淀收集，将沉淀用丙酮、乙醚各洗涤2次，然后用蒸馏水复溶至8-12mL，再用3500Da透析袋透析72h脱盐，冷冻干燥，得到海马糖蛋白粗纯品。
 步骤（1）中所述的CO2超临界流体萃取技术进行脱脂的条件为：载气为高纯度CO2，萃取压强35MPa、萃取时间135min、萃取温度58℃、分离釜温度80℃、CO2流量15L/h，其中萃取时间依次由动态萃取10min和静态萃取125min组成。 
步骤（2）中所述的超声波辅助提取的条件为：超声功率500W，超声时间20min。 
步骤（2）中所述的浸提液中NaCl浓度为0.08mol/L，所述的浸提温度为72.77℃，所述的浸提时间为4.27h，所述的脱脂海马粉与所述的NaCl浸提液的料液比21.41 g：1mL。此条件为海马糖蛋白提取的最佳工艺参数。 
步骤（3）中所述的Sevage法除游离蛋白的条件为：糖蛋白样品液与Sevage试剂比例为4:1，所述的Sevage试剂由氯仿与正丁醇按5:1的比例混合而成。 
步骤（3）中所述的乙醇分级沉淀条件为：将收集的糖蛋白溶液层依次加入无水乙醇，分别在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%时于4℃沉淀12h，最后收集各乙醇浓度下得到的沉淀。 
步骤（3）得到的海马糖蛋白粗纯品进行精纯化的过程为：取海马糖蛋白粗纯品按质量体积比0.2g：5mL的比例溶解在去离子水中，过0.45μm滤膜后取样品液，将样品液上DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化，上样后分别用0.05、0.1、0.5mol/L NaHCO3进行阶段性洗脱，每个浓度洗脱120min，517nm处采用苯酚硫酸法检测糖出峰位置，280nm处采用紫外吸收法检测蛋白质出峰位置，分别收集含有糖蛋白组分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰，冷冻干燥，得到不同分子量的海马糖蛋白精纯品。 
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了一种海马活性糖蛋白的制备方法，采用NaCl浓度为0～0.25mol/L的浸提液浸提并超声波辅助提取，省时、高效，且工艺简单、操作方便，并避免了酸碱及酶解对原始糖蛋白结构的破坏，全程无有毒有害试剂的残留和污染，确保了制取海马糖蛋白的活性；Sevage法脱蛋白一次并静置过夜能够有效的脱除游离蛋白质，且避免了脱蛋白次数过多导致的糖蛋白损失；乙醇分级沉淀法能够有效的将不同分子量阶段的糖蛋白纯化出来，保证了制取糖蛋白种类的完整性；透析法能够有效的脱除盐分，并且去除了小分子杂质；糖蛋白的检测技术采取分别测定糖和蛋白质含量，通过响应面法进行糖和蛋白质得率的共同优化工艺，以达到糖蛋白的最优提取条件。在此最优提取工艺条件下，进行了三次提取验证，海马糖蛋白粗纯品的理论得率为7.037%，实际得率平均为6.977%，具有较好的重复性。 
附图说明
图1为浸提时间对海马糖蛋白提取实验中糖和蛋白质得率的影响； 
图2为浸提液中NaCl浓度对海马糖蛋白提取实验中糖和蛋白质得率的影响；
图3为浸提温度对海马糖蛋白提取实验中糖和蛋白质得率的影响；
图4为液料比对海马糖蛋白提取实验中糖和蛋白质得率的影响；
图5为纤维素DEAE-52阴离子交换柱对海马糖蛋白粗品的纯化效果。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 
一、实验测定方法 
（1）糖蛋白中糖含量的测定
海马糖蛋白中的糖含量测定采用苯酚-硫酸法。配置0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液，分别取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL葡萄糖标准溶液，加蒸馏水补足至2mL，然后加入1mL质量分数为5%的苯酚溶液，充分振荡混匀后沿比色管壁迅速加入5mL浓硫酸，让硫酸能均匀地沿壁流下，室温下充分反应30min；取适量反应液在200~600nm下进行扫描，蒸馏水做空白样，确定其最大吸收波长为488nm；在488nm处测样品吸光度，绘制葡萄糖标准曲线，得回归方程y = 0.7434ｘ-0.0012，R2 = 0.9995，其中ｘ为吸光度值，y为糖的质量浓度μg/mL。样品液稀释到适当倍数，以同样的方法进行测定，根据标准曲线求得样品液中糖含量。
（2）糖蛋白中蛋白质含量的测定 
海马糖蛋白中的蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法。将0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50mL的95%乙醇中，再加入100mL 85%磷酸，最后用蒸馏水定容至1000mL，抽滤，棕色瓶保存备用。用牛血清配置0.1mg/mL的蛋白标准溶液，分别取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL蛋白质标准溶液，加蒸馏水补足至1mL，再加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂，充分混匀，室温下静置10min后于595nm处测各样品的吸光度，绘制蛋白质标准曲线，得回归方程y = 0.5932ｘ+0.0017，R2 = 0.9997，其中ｘ为吸光度值，y为蛋白质的质量浓度μg/mL。样品液稀释到适当倍数，以同样的方法进行测定，根据标准曲线求得样品液中蛋白质含量。
 二、具体实施例 
实施例1
一种海马活性糖蛋白的制备方法，包括以下步骤：
（1）海马前处理：将海马洗净冻好后，于-40℃下冷冻干燥48-72h，再用粉碎机粉碎，然后采用CO2超临界流体萃取技术脱除脂肪酸，得到脱脂海马粉；其中CO2超临界流体萃取技术进行脱脂的条件为：载气为高纯度CO2，萃取压强35MPa、萃取时间135min、萃取温度58℃、分离釜温度80℃、CO2流量15L/h，其中萃取时间依次由动态萃取10min和静态萃取125min组成；
（2）海马糖蛋白提取：将步骤（1）得到的脱脂海马粉与NaCl浓度为0.08mol/L的浸提液按21.41：1（g / mL）的比例混合于锥形瓶中摇匀后，首先于超声功率500W的条件下进行超声波辅助提取20min，再置于水浴锅中于72.77℃下浸提4.27h后，用滤纸过滤，得到的上清液即为海马糖蛋白混合溶液；此条件为海马糖蛋白提取的最佳工艺参数；
（3）海马糖蛋白粗纯化：将步骤（2）得到的海马糖蛋白溶液减压浓缩至原体积的四分之一，得到糖蛋白样品液，将糖蛋白样品液采用Sevage法除游离蛋白，脱蛋白一次，4℃静置过夜，弃下层游离蛋白层；收集上层糖蛋白溶液进行乙醇分级沉淀，然后将沉淀收集，分别用丙酮、乙醚各洗涤2次，然后用蒸馏水复溶至8-12mL，再用3500Da透析袋透析72h脱盐，冷冻干燥，得到海马糖蛋白粗纯品，其中Sevage法除游离蛋白的条件为：糖蛋白样品液与Sevage试剂比例为4:1， Sevage试剂由氯仿与正丁醇按5:1的比例混合而成；乙醇分级沉淀条件为：将收集的糖蛋白溶液层依次加入无水乙醇，分别在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%时于4℃沉淀12h，最后收集各乙醇浓度下得到的沉淀。
 实施例2 
基本同上述实施例1，其区别在于：步骤（2）中浸提液为蒸馏水（即NaCl浓度为0），且浸提液与脱脂海马粉按照1:10（mL/g）的比例混合于锥形瓶中，超声20min后于30℃水浴锅中热水浸提6h，最后过滤得海马糖蛋白混合溶液。
 实施例3 
基本同实施例1，其区别在于：步骤（2）中的浸提液的NaCl浓度为0.25mol/L，且浸提液与脱脂海马按照1:35（mL/g）的比例混合于锥形瓶中，超声20min后于80℃水浴锅中热水浸提1h，最后过滤得海马糖蛋白混合溶液。
 实施例4 
基本同实施例1，其区别在于：步骤（2）中的浸提液的NaCl浓度为0.01mol/L，且浸提液与脱脂海马按照1:10（mL/g）的比例混合于锥形瓶中，超声20min后于40℃水浴锅中热水浸提2h，最后过滤得海马糖蛋白混合溶液。
 实施例4 
基本同实施例1，其区别在于：将步骤（3）得到的海马糖蛋白粗纯品进行精纯化，其过程具体为：取海马糖蛋白粗纯品按质量体积比0.2g：5mL的比例溶解在去离子水中，过0.45μm滤膜后取样品液，将样品液上DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化，上样后分别用0.05、0.1、0.5mol/L NaHCO3进行阶段性洗脱，每个浓度洗脱120min，517nm处采用苯酚硫酸法检测糖出峰位置，280nm处采用紫外吸收法检测蛋白质出峰位置，分别收集含有糖蛋白组分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰，冷冻干燥，得到不同分子量的海马糖蛋白精纯品。
 三、对比试验 
最佳提取条件的确定：海马前处理和提取操作如实施例1，分别对影响海马糖蛋白提取得率的浸提时间、浸提液盐浓度、浸提温度和液料比进行单因素实验。
对浸提时间进行单因素设计：设置浸提时间分别为1、2、3、4、5、6h，其他条件分别控制为浸提液盐浓度0.1mol/L、浸提温度50℃、液料比1:25（mL/g）。结果如图1所示，由图可知制备海马糖蛋白的最佳浸提时间为4h。 
对浸提液盐浓度进行单因素设计：配置不同NaCl浓度的浸提液，分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mol/L，其他条件分别控制为浸提时间4h、浸提温度50℃、液料比1:25（mL/g）。结果如图2所示，由图可知制备海马糖蛋白的最佳浸提液盐浓度为0.05 mol/L。 
对浸提温度进行单因素设计：调节浸提温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，其他条件控制：浸提时间4h、盐浓度0.05 mol/L、液料比1:25（mL/g）。结果如图3所示，由图可知制备海马糖蛋白的最佳浸提温度为70℃。 
对液料比进行单因素设计：浸提液与海马的液料比（单位mL/g）分别为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35，其他条件控制：浸提时间4h、盐浓度0.05mol/L、温度70℃。结果如图4所示，由图可知制备海马糖蛋白的最佳液料比为1:20（mL/g）。 
运用Design-Expert 7.0.0软件进行响应面法设计试验，在单因素实验的基础上，选择浸提时间、盐浓度、温度、液料比四个因素的较优水平进行响应面设计，设计方案及结果分析如表1、表2、表3所示。 
表1  海马糖蛋白提取工艺因素响应面设计表 
表2  响应面实验表及结果
表3  响应面方差分析
注：(a) P-value Prob>F值的大小表示模型及各因素的显著水平；(b) P-value Prob>F值大于0.05表示模型及各因素无显著影响，P-value Prob>F小于0.05表示模型及各因素有显著影响，P-value Prob>F小于0.01表示模型及因素有极显著影响。
由Design-Expert 7.0.0软件对海马糖蛋白提取试验的结果见表2，方差分析见表3，得到两组回归方程： 
Sugar = 0.64＋0.039A＋0.064B－0.050C＋0.031D＋0.034AB－0.012AC＋0.010AD＋8.750E-003BC＋0.051BD－0.019CD－0.079A2－0.040B2－0.026C2－0.11D2     Protein = 0.68－8.583E-003A＋0.036B＋0.17C＋0.013D－1.250E-003AB－5.750E-003AC＋0.011AD＋2.500E-003BC－0.017BD－7.250E-003CD－0.030A2－0.081B2－0.12C2－3.983E-003D2
其中A、B、C、D分别代表浸提时间、盐浓度、温度、液料比。糖蛋白中糖和蛋白质的响应面模型P-value Prob>F值分别为0.039和0.0002，分别小于0.05和0.01，表明模型是显著的。模型失拟项（Lack of Fit）表示模型预测值与实际值不拟合的概率，表3中糖和蛋白质的模型失拟项P-value Prob>F值分别为0.9728和0.0671，均大于0.05，模型失拟项不显著，模型选择合适，可以用此模型对海马进行糖蛋白提取工艺优化。
根据回归方程Sugar、Protein及表3可见，糖蛋白中糖得率回归方程中B、C、A2对糖得率影响显著，二次项D2影响极其显著，而交互项影响不显著；糖蛋白中蛋白质得率回归方程中C、B2 、C2 对蛋白质得率有极显著影响，交互项影响不显著。回归方程优化后得： 
Sugar = －3.90787＋0.67855A－5.16600B＋0.042357C＋0.092172D＋0.68000AB－1.17500E-003AC＋1.02500E-003AD＋0.017500BC＋0.10300BD－1.85000E-004CD－0.079058 A2－16.17333B2－2.58083E-004C2－1.06683E-003D2     Protein = －7.44546＋0.23078A＋5.05933B＋0.19346C＋6.96167E-003D－0.025000AB－5.75000E-004AC＋1.07500E-003AD＋5.00000E-003BC－0.034000BD－7.25000E-005CD－0.030108 A2－32.34333B2－1.22483E-003C2－3.98333E-005D2
由上述可知，海马糖蛋白提取的最佳工艺参数为：超声波辅助提取20min，浸提时间4.27h、浸提液盐浓度0.08mol/L、温度72.77℃、液料比1:21.41，在此最优提取工艺条件下，海马糖蛋白的理论得率为7.037%。
 四、验证试验 
海马糖蛋白的纯化：将上述提取的海马糖蛋白混合溶液减压浓缩至原体积的四分之一，得到糖蛋白样品液，将糖蛋白样品液采用Sevage法除游离蛋白，糖蛋白样品液与Sevage试剂比例为4:1，Sevage试剂由氯仿与正丁醇按5:1的比例混合而成，脱蛋白一次，4℃静置过夜，弃下层游离蛋白层；收集上层糖蛋白溶液，采用乙醇分级沉淀去除单糖等小分子物质，依次加入无水乙醇，分别在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%时于4℃沉淀12h进行乙醇分级沉淀，最后收集各乙醇浓度下得到的沉淀，用丙酮、乙醚各洗涤2次，然后用蒸馏水复溶至约10mL，再用3500Da透析袋透析72h脱盐。海马糖蛋白溶液进过上述脱除游离蛋白、小分子糖、盐分等之后，冷冻干燥，得到海马糖蛋白粗纯品。
海马糖蛋白纯度验证：海马糖蛋白的精纯化采取柱层析法，选取DEAE-52纤维素阴离子交换柱纯化。取0.2g海马糖蛋白粗纯品，溶解在5mL去离子水中，过0.45μm滤膜；上样后分别用0.05、0.1、0.5mol/L NaHCO3进行阶段性洗脱，每个浓度洗脱120min，517nm处采用苯酚硫酸法检测糖出峰位置，280nm处采用紫外吸收法检测蛋白质出峰位置。根据图5海马糖蛋白DEAE-52 NaHCO3溶液梯度洗脱曲线可见，经过DEAE-52纤维素阴离子交换柱纯化后，共出现5个峰，其中峰1、2、4既含蛋白又含糖峰，且峰型规整，为糖蛋白主要峰，是结合糖蛋白；峰3既含蛋白又含糖峰，且峰型较规整，但峰相对较小，忽略不计；峰5只有蛋白峰，无糖峰，且峰型不整，不是结合糖蛋白，故忽略不计。由检测结果表明，海马糖蛋白粗纯品基本都是结合糖蛋白，故证明此法可有效的制取海马活性糖蛋白。 
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。 

Claims (7)

1.一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）海马前处理：将海马洗净冻好后，于-40℃下冷冻干燥48-72h，再用粉碎机粉碎，然后采用CO2超临界流体萃取技术脱除脂肪酸，得到脱脂海马粉；
（2）海马糖蛋白提取：将步骤（1）得到的脱脂海马粉与NaCl浓度为0～0.25mol/L的浸提液按（10～35）g：1mL的比例混合于锥形瓶中摇匀后，首先进行超声波辅助提取20min，再置于水浴锅中于30℃～80℃下浸提1～6h后，用滤纸过滤，得到的上清液即为海马糖蛋白混合溶液；
（3）海马糖蛋白粗纯化：将步骤（2）得到的海马糖蛋白溶液减压浓缩至原体积的四分之一，得到糖蛋白样品液，将糖蛋白样品液采用Sevage法除游离蛋白，脱蛋白一次，4℃静置过夜，弃下层游离蛋白层；收集上层糖蛋白溶液，进行乙醇分级沉淀，然后将沉淀收集，将沉淀用丙酮、乙醚各洗涤2次，然后用蒸馏水复溶至8-12mL，再用3500Da透析袋透析72h脱盐，冷冻干燥，得到海马糖蛋白粗纯品。
2.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的CO2超临界流体萃取技术进行脱脂的条件为：载气为高纯度CO2，萃取压强35MPa、萃取时间135min、萃取温度58℃、分离釜温度80℃、CO2流量15L/h，其中萃取时间依次由动态萃取10min和静态萃取125min组成。
3.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的超声波辅助提取的条件为：超声功率500W，超声时间20min。
4.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的浸提液中NaCl浓度为0.08mol/L，所述的浸提温度为72.77℃，所述的浸提时间为4.27h，所述的脱脂海马粉与所述的NaCl浸提液的料液比21.41 g：1mL。
5.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于步骤（3）中所述的Sevage法除游离蛋白的条件为：糖蛋白样品液与Sevage试剂比例为4:1，所述的Sevage试剂由氯仿与正丁醇按5:1的比例混合而成。
6.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于步骤（3）中所述的乙醇分级沉淀条件为：将收集的糖蛋白溶液层依次加入无水乙醇，分别在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%时于4℃沉淀12h，最后收集各乙醇浓度下得到的沉淀。
7.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法，其特征在于步骤（3）得到的海马糖蛋白粗纯品进行精纯化的过程为：取海马糖蛋白粗纯品按质量体积比0.2g：5mL的比例溶解在去离子水中，过0.45μm滤膜后取样品液，将样品液上DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化，上样后分别用0.05、0.1、0.5mol/L NaHCO3进行阶段性洗脱，每个浓度洗脱120min，在280nm处采用紫外吸收法检测糖蛋白的出峰位置，分别收集含有糖蛋白组分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰，冷冻干燥，得到不同分子量的海马糖蛋白精纯品。
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