CN103923201A - 一种海马活性糖蛋白的制备方法 - Google Patents
一种海马活性糖蛋白的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103923201A CN103923201A CN201410129587.6A CN201410129587A CN103923201A CN 103923201 A CN103923201 A CN 103923201A CN 201410129587 A CN201410129587 A CN 201410129587A CN 103923201 A CN103923201 A CN 103923201A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hippocampus
- glycoprotein
- extraction
- preparation
- ratio
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/461—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from fish
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/54—Improvements relating to the production of bulk chemicals using solvents, e.g. supercritical solvents or ionic liquids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种海马活性糖蛋白的制备方法,特点是包括以下步骤:a.将冷冻干燥后的海马粉粹,采用CO2超临界流体萃取技术脱除脂肪酸;配置0~0.25mol/L的NaCl浸提液,与脱脂海马按照1:10~1:35(mL/g)的比例混合于锥形瓶中,摇匀后首先进行超声波辅助提取20min,再置于水浴锅中于30℃~80℃下热水浸提1~6h,最后滤纸过滤,上清液即为糖蛋白混合溶液;b.海马糖蛋白的纯化:采取Sevage法和乙醇分级沉淀法。将粗纯品用蒸馏水复溶,3500Da透析袋透析72h脱盐,冷冻干燥,得到海马糖蛋白粗纯品,优点是省时、高效,全程无有毒有害试剂的残留和污染,并确保了制取糖蛋白的活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种糖蛋白的制备方法,尤其是涉及一种海马活性糖蛋白的制备方法。
背景技术
海马为海龙科动物,性温、味甘、归肝、肾经,属于药食同源类生物,是名贵的海洋滋补药物,在我国素有“北方人参,南方海马”之称,具有极高的经济价值。2005《中国药典》收载原动物主要有五种:线纹海马Hippocampus kelloggi Jordan et Snyder、刺海马H. histrix Kaup、大海马H. kuda Bleeker 、三斑海马H. trimaculatus Leach或小海马(海蛆)H. japonicus Kaup的干燥体。夏、秋二季捕捞,洗净,晒干;或除去皮膜及内脏,晒干。
海马药用历史悠久,历代古医籍及我国药典历次版本一部(中药部分)均有收载。公元739年,《本草拾遗》古医籍中陈藏器首次使用海马之名;《神农本草》古医籍中记载:海马性温、味甘、无毒,具有强身补肾、舒筋活络、止痛止血、退热生肌、强心明目、祛疾止喘、夫人催生等功能;明代《本草纲目》记载:海马雌雄成对,其性温暖,有交感之意,故难产及阳虚房中方术多用之,具有暖水脏、壮阳道之功能。现代医学已经证明海马具有较高的营养价值和化学活性成分,含有大量的镁、钙,其次为锌、铁、锶、锰,少量的钴、镍、铜和铬,还含有大量的硬脂酸、胆甾醇、胆甾二醇,其不饱和脂肪酸占总脂肪酸比例较高,其中多烯不饱和脂肪酸EPA(二十碳五烯酸)和DHA(二十二碳六烯酸)较为丰富。海马具有补肾壮阳、调气活血等功效,临床上主要用于治疗阳痿、遗尿、虚喘、症积等。目前对海马化学成分的研究主要集中在氨基酸、微量元素、磷脂、脂肪酸和甾体类等,对水溶性组分的研究较少,所以海马水溶性组分的研究有利于人们对海马的认识更加完整。
海洋拥有特殊的生态环境,赋予了海洋生物异于陆生生物所特有的化学成分和结构,具有特异的高活性、高药效。近年来对海洋药物的研究越发深入,越来越多的研究发现糖蛋白具有很好的医疗保健功效,具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血脂、提高免疫力等活性。糖蛋白涉及细胞的定向归巢、糖蛋白毒素及激素作用机制,可使药物选择性地集中到病灶,提高药效,而不影响正常组织的生长和免疫系统的功能,降低不良反应。海马蛋白质含量丰富,高达70%左右。现代科学已证明80%以上的蛋白质都是糖蛋白,包括许多酶、激素、毒素、载体蛋白、免疫球蛋白、结构蛋白、凝集素、受体、粘液组分等,甚至过去人们一直认为是“纯”的多糖,如糖原和纤维素,亦含有少量共价结合的蛋白质。目前,国内外对海马糖蛋白的制备的研究还未见相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有高效、快速并能保持糖蛋白活性的海马糖蛋白制备方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种海马活性糖蛋白的制备方法,包括以下步骤:
(1)海马前处理:将海马洗净冻好后,于-40℃下冷冻干燥48-72h,再用粉碎机粉碎,然后采用CO2超临界流体萃取技术脱除脂肪酸,得到脱脂海马粉;
(2)海马糖蛋白提取:将步骤(1)得到的脱脂海马粉与NaCl浓度为0~0.25mol/L的浸提液按(10~35)g:1mL的比例混合于锥形瓶中摇匀后,首先进行超声波辅助提取20min,再置于水浴锅中于30℃~80℃下浸提1~6h后,用滤纸过滤,得到的上清液即为海马糖蛋白混合溶液;
(3)海马糖蛋白粗纯化:将步骤(2)得到的海马糖蛋白溶液减压浓缩至原体积的四分之一,得到糖蛋白样品液,将糖蛋白样品液采用Sevage法除游离蛋白,脱蛋白一次,4℃静置过夜,弃下层游离蛋白层;收集上层糖蛋白溶液,进行乙醇分级沉淀,然后将沉淀收集,将沉淀用丙酮、乙醚各洗涤2次,然后用蒸馏水复溶至8-12mL,再用3500Da透析袋透析72h脱盐,冷冻干燥,得到海马糖蛋白粗纯品。
步骤(1)中所述的CO2超临界流体萃取技术进行脱脂的条件为:载气为高纯度CO2,萃取压强35MPa、萃取时间135min、萃取温度58℃、分离釜温度80℃、CO2流量15L/h,其中萃取时间依次由动态萃取10min和静态萃取125min组成。
步骤(2)中所述的超声波辅助提取的条件为:超声功率500W,超声时间20min。
步骤(2)中所述的浸提液中NaCl浓度为0.08mol/L,所述的浸提温度为72.77℃,所述的浸提时间为4.27h,所述的脱脂海马粉与所述的NaCl浸提液的料液比21.41 g:1mL。此条件为海马糖蛋白提取的最佳工艺参数。
步骤(3)中所述的Sevage法除游离蛋白的条件为:糖蛋白样品液与Sevage试剂比例为4:1,所述的Sevage试剂由氯仿与正丁醇按5:1的比例混合而成。
步骤(3)中所述的乙醇分级沉淀条件为:将收集的糖蛋白溶液层依次加入无水乙醇,分别在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%时于4℃沉淀12h,最后收集各乙醇浓度下得到的沉淀。
步骤(3)得到的海马糖蛋白粗纯品进行精纯化的过程为:取海马糖蛋白粗纯品按质量体积比0.2g:5mL的比例溶解在去离子水中,过0.45μm滤膜后取样品液,将样品液上DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化,上样后分别用0.05、0.1、0.5mol/L NaHCO3进行阶段性洗脱,每个浓度洗脱120min,517nm处采用苯酚硫酸法检测糖出峰位置,280nm处采用紫外吸收法检测蛋白质出峰位置,分别收集含有糖蛋白组分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰,冷冻干燥,得到不同分子量的海马糖蛋白精纯品。
与现有技术相比,本发明的优点在于:本发明首次公开了一种海马活性糖蛋白的制备方法,采用NaCl浓度为0~0.25mol/L的浸提液浸提并超声波辅助提取,省时、高效,且工艺简单、操作方便,并避免了酸碱及酶解对原始糖蛋白结构的破坏,全程无有毒有害试剂的残留和污染,确保了制取海马糖蛋白的活性;Sevage法脱蛋白一次并静置过夜能够有效的脱除游离蛋白质,且避免了脱蛋白次数过多导致的糖蛋白损失;乙醇分级沉淀法能够有效的将不同分子量阶段的糖蛋白纯化出来,保证了制取糖蛋白种类的完整性;透析法能够有效的脱除盐分,并且去除了小分子杂质;糖蛋白的检测技术采取分别测定糖和蛋白质含量,通过响应面法进行糖和蛋白质得率的共同优化工艺,以达到糖蛋白的最优提取条件。在此最优提取工艺条件下,进行了三次提取验证,海马糖蛋白粗纯品的理论得率为7.037%,实际得率平均为6.977%,具有较好的重复性。
附图说明
图1为浸提时间对海马糖蛋白提取实验中糖和蛋白质得率的影响;
图2为浸提液中NaCl浓度对海马糖蛋白提取实验中糖和蛋白质得率的影响;
图3为浸提温度对海马糖蛋白提取实验中糖和蛋白质得率的影响;
图4为液料比对海马糖蛋白提取实验中糖和蛋白质得率的影响;
图5为纤维素DEAE-52阴离子交换柱对海马糖蛋白粗品的纯化效果。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一、实验测定方法
(1)糖蛋白中糖含量的测定
海马糖蛋白中的糖含量测定采用苯酚-硫酸法。配置0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液,分别取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL葡萄糖标准溶液,加蒸馏水补足至2mL,然后加入1mL质量分数为5%的苯酚溶液,充分振荡混匀后沿比色管壁迅速加入5mL浓硫酸,让硫酸能均匀地沿壁流下,室温下充分反应30min;取适量反应液在200~600nm下进行扫描,蒸馏水做空白样,确定其最大吸收波长为488nm;在488nm处测样品吸光度,绘制葡萄糖标准曲线,得回归方程y = 0.7434x-0.0012,R2 = 0.9995,其中x为吸光度值,y为糖的质量浓度μg/mL。样品液稀释到适当倍数,以同样的方法进行测定,根据标准曲线求得样品液中糖含量。
(2)糖蛋白中蛋白质含量的测定
海马糖蛋白中的蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法。将0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50mL的95%乙醇中,再加入100mL 85%磷酸,最后用蒸馏水定容至1000mL,抽滤,棕色瓶保存备用。用牛血清配置0.1mg/mL的蛋白标准溶液,分别取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL蛋白质标准溶液,加蒸馏水补足至1mL,再加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂,充分混匀,室温下静置10min后于595nm处测各样品的吸光度,绘制蛋白质标准曲线,得回归方程y = 0.5932x+0.0017,R2 = 0.9997,其中x为吸光度值,y为蛋白质的质量浓度μg/mL。样品液稀释到适当倍数,以同样的方法进行测定,根据标准曲线求得样品液中蛋白质含量。
二、具体实施例
实施例1
一种海马活性糖蛋白的制备方法,包括以下步骤:
(1)海马前处理:将海马洗净冻好后,于-40℃下冷冻干燥48-72h,再用粉碎机粉碎,然后采用CO2超临界流体萃取技术脱除脂肪酸,得到脱脂海马粉;其中CO2超临界流体萃取技术进行脱脂的条件为:载气为高纯度CO2,萃取压强35MPa、萃取时间135min、萃取温度58℃、分离釜温度80℃、CO2流量15L/h,其中萃取时间依次由动态萃取10min和静态萃取125min组成;
(2)海马糖蛋白提取:将步骤(1)得到的脱脂海马粉与NaCl浓度为0.08mol/L的浸提液按21.41:1(g / mL)的比例混合于锥形瓶中摇匀后,首先于超声功率500W的条件下进行超声波辅助提取20min,再置于水浴锅中于72.77℃下浸提4.27h后,用滤纸过滤,得到的上清液即为海马糖蛋白混合溶液;此条件为海马糖蛋白提取的最佳工艺参数;
(3)海马糖蛋白粗纯化:将步骤(2)得到的海马糖蛋白溶液减压浓缩至原体积的四分之一,得到糖蛋白样品液,将糖蛋白样品液采用Sevage法除游离蛋白,脱蛋白一次,4℃静置过夜,弃下层游离蛋白层;收集上层糖蛋白溶液进行乙醇分级沉淀,然后将沉淀收集,分别用丙酮、乙醚各洗涤2次,然后用蒸馏水复溶至8-12mL,再用3500Da透析袋透析72h脱盐,冷冻干燥,得到海马糖蛋白粗纯品,其中Sevage法除游离蛋白的条件为:糖蛋白样品液与Sevage试剂比例为4:1, Sevage试剂由氯仿与正丁醇按5:1的比例混合而成;乙醇分级沉淀条件为:将收集的糖蛋白溶液层依次加入无水乙醇,分别在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%时于4℃沉淀12h,最后收集各乙醇浓度下得到的沉淀。
实施例2
基本同上述实施例1,其区别在于:步骤(2)中浸提液为蒸馏水(即NaCl浓度为0),且浸提液与脱脂海马粉按照1:10(mL/g)的比例混合于锥形瓶中,超声20min后于30℃水浴锅中热水浸提6h,最后过滤得海马糖蛋白混合溶液。
实施例3
基本同实施例1,其区别在于:步骤(2)中的浸提液的NaCl浓度为0.25mol/L,且浸提液与脱脂海马按照1:35(mL/g)的比例混合于锥形瓶中,超声20min后于80℃水浴锅中热水浸提1h,最后过滤得海马糖蛋白混合溶液。
实施例4
基本同实施例1,其区别在于:步骤(2)中的浸提液的NaCl浓度为0.01mol/L,且浸提液与脱脂海马按照1:10(mL/g)的比例混合于锥形瓶中,超声20min后于40℃水浴锅中热水浸提2h,最后过滤得海马糖蛋白混合溶液。
实施例4
基本同实施例1,其区别在于:将步骤(3)得到的海马糖蛋白粗纯品进行精纯化,其过程具体为:取海马糖蛋白粗纯品按质量体积比0.2g:5mL的比例溶解在去离子水中,过0.45μm滤膜后取样品液,将样品液上DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化,上样后分别用0.05、0.1、0.5mol/L NaHCO3进行阶段性洗脱,每个浓度洗脱120min,517nm处采用苯酚硫酸法检测糖出峰位置,280nm处采用紫外吸收法检测蛋白质出峰位置,分别收集含有糖蛋白组分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰,冷冻干燥,得到不同分子量的海马糖蛋白精纯品。
三、对比试验
最佳提取条件的确定:海马前处理和提取操作如实施例1,分别对影响海马糖蛋白提取得率的浸提时间、浸提液盐浓度、浸提温度和液料比进行单因素实验。
对浸提时间进行单因素设计:设置浸提时间分别为1、2、3、4、5、6h,其他条件分别控制为浸提液盐浓度0.1mol/L、浸提温度50℃、液料比1:25(mL/g)。结果如图1所示,由图可知制备海马糖蛋白的最佳浸提时间为4h。
对浸提液盐浓度进行单因素设计:配置不同NaCl浓度的浸提液,分别为0、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mol/L,其他条件分别控制为浸提时间4h、浸提温度50℃、液料比1:25(mL/g)。结果如图2所示,由图可知制备海马糖蛋白的最佳浸提液盐浓度为0.05 mol/L。
对浸提温度进行单因素设计:调节浸提温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃,其他条件控制:浸提时间4h、盐浓度0.05 mol/L、液料比1:25(mL/g)。结果如图3所示,由图可知制备海马糖蛋白的最佳浸提温度为70℃。
对液料比进行单因素设计:浸提液与海马的液料比(单位mL/g)分别为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35,其他条件控制:浸提时间4h、盐浓度0.05mol/L、温度70℃。结果如图4所示,由图可知制备海马糖蛋白的最佳液料比为1:20(mL/g)。
运用Design-Expert 7.0.0软件进行响应面法设计试验,在单因素实验的基础上,选择浸提时间、盐浓度、温度、液料比四个因素的较优水平进行响应面设计,设计方案及结果分析如表1、表2、表3所示。
表1 海马糖蛋白提取工艺因素响应面设计表
表2 响应面实验表及结果
表3 响应面方差分析
注:(a) P-value Prob>F值的大小表示模型及各因素的显著水平;(b) P-value Prob>F值大于0.05表示模型及各因素无显著影响,P-value Prob>F小于0.05表示模型及各因素有显著影响,P-value Prob>F小于0.01表示模型及因素有极显著影响。
由Design-Expert 7.0.0软件对海马糖蛋白提取试验的结果见表2,方差分析见表3,得到两组回归方程:
Sugar = 0.64+0.039A+0.064B-0.050C+0.031D+0.034AB-0.012AC+0.010AD+8.750E-003BC+0.051BD-0.019CD-0.079A2-0.040B2-0.026C2-0.11D2 Protein = 0.68-8.583E-003A+0.036B+0.17C+0.013D-1.250E-003AB-5.750E-003AC+0.011AD+2.500E-003BC-0.017BD-7.250E-003CD-0.030A2-0.081B2-0.12C2-3.983E-003D2
其中A、B、C、D分别代表浸提时间、盐浓度、温度、液料比。糖蛋白中糖和蛋白质的响应面模型P-value Prob>F值分别为0.039和0.0002,分别小于0.05和0.01,表明模型是显著的。模型失拟项(Lack of Fit)表示模型预测值与实际值不拟合的概率,表3中糖和蛋白质的模型失拟项P-value Prob>F值分别为0.9728和0.0671,均大于0.05,模型失拟项不显著,模型选择合适,可以用此模型对海马进行糖蛋白提取工艺优化。
根据回归方程Sugar、Protein及表3可见,糖蛋白中糖得率回归方程中B、C、A2对糖得率影响显著,二次项D2影响极其显著,而交互项影响不显著;糖蛋白中蛋白质得率回归方程中C、B2 、C2 对蛋白质得率有极显著影响,交互项影响不显著。回归方程优化后得:
Sugar = -3.90787+0.67855A-5.16600B+0.042357C+0.092172D+0.68000AB-1.17500E-003AC+1.02500E-003AD+0.017500BC+0.10300BD-1.85000E-004CD-0.079058 A2-16.17333B2-2.58083E-004C2-1.06683E-003D2 Protein = -7.44546+0.23078A+5.05933B+0.19346C+6.96167E-003D-0.025000AB-5.75000E-004AC+1.07500E-003AD+5.00000E-003BC-0.034000BD-7.25000E-005CD-0.030108 A2-32.34333B2-1.22483E-003C2-3.98333E-005D2
由上述可知,海马糖蛋白提取的最佳工艺参数为:超声波辅助提取20min,浸提时间4.27h、浸提液盐浓度0.08mol/L、温度72.77℃、液料比1:21.41,在此最优提取工艺条件下,海马糖蛋白的理论得率为7.037%。
四、验证试验
海马糖蛋白的纯化:将上述提取的海马糖蛋白混合溶液减压浓缩至原体积的四分之一,得到糖蛋白样品液,将糖蛋白样品液采用Sevage法除游离蛋白,糖蛋白样品液与Sevage试剂比例为4:1,Sevage试剂由氯仿与正丁醇按5:1的比例混合而成,脱蛋白一次,4℃静置过夜,弃下层游离蛋白层;收集上层糖蛋白溶液,采用乙醇分级沉淀去除单糖等小分子物质,依次加入无水乙醇,分别在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%时于4℃沉淀12h进行乙醇分级沉淀,最后收集各乙醇浓度下得到的沉淀,用丙酮、乙醚各洗涤2次,然后用蒸馏水复溶至约10mL,再用3500Da透析袋透析72h脱盐。海马糖蛋白溶液进过上述脱除游离蛋白、小分子糖、盐分等之后,冷冻干燥,得到海马糖蛋白粗纯品。
海马糖蛋白纯度验证:海马糖蛋白的精纯化采取柱层析法,选取DEAE-52纤维素阴离子交换柱纯化。取0.2g海马糖蛋白粗纯品,溶解在5mL去离子水中,过0.45μm滤膜;上样后分别用0.05、0.1、0.5mol/L NaHCO3进行阶段性洗脱,每个浓度洗脱120min,517nm处采用苯酚硫酸法检测糖出峰位置,280nm处采用紫外吸收法检测蛋白质出峰位置。根据图5海马糖蛋白DEAE-52 NaHCO3溶液梯度洗脱曲线可见,经过DEAE-52纤维素阴离子交换柱纯化后,共出现5个峰,其中峰1、2、4既含蛋白又含糖峰,且峰型规整,为糖蛋白主要峰,是结合糖蛋白;峰3既含蛋白又含糖峰,且峰型较规整,但峰相对较小,忽略不计;峰5只有蛋白峰,无糖峰,且峰型不整,不是结合糖蛋白,故忽略不计。由检测结果表明,海马糖蛋白粗纯品基本都是结合糖蛋白,故证明此法可有效的制取海马活性糖蛋白。
当然,上述说明并非对本发明的限制,本发明也并不限于上述举例。本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内作出的变化、改型、添加或替换,也应属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种海马活性糖蛋白的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)海马前处理:将海马洗净冻好后,于-40℃下冷冻干燥48-72h,再用粉碎机粉碎,然后采用CO2超临界流体萃取技术脱除脂肪酸,得到脱脂海马粉;
(2)海马糖蛋白提取:将步骤(1)得到的脱脂海马粉与NaCl浓度为0~0.25mol/L的浸提液按(10~35)g:1mL的比例混合于锥形瓶中摇匀后,首先进行超声波辅助提取20min,再置于水浴锅中于30℃~80℃下浸提1~6h后,用滤纸过滤,得到的上清液即为海马糖蛋白混合溶液;
(3)海马糖蛋白粗纯化:将步骤(2)得到的海马糖蛋白溶液减压浓缩至原体积的四分之一,得到糖蛋白样品液,将糖蛋白样品液采用Sevage法除游离蛋白,脱蛋白一次,4℃静置过夜,弃下层游离蛋白层;收集上层糖蛋白溶液,进行乙醇分级沉淀,然后将沉淀收集,将沉淀用丙酮、乙醚各洗涤2次,然后用蒸馏水复溶至8-12mL,再用3500Da透析袋透析72h脱盐,冷冻干燥,得到海马糖蛋白粗纯品。
2.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述的CO2超临界流体萃取技术进行脱脂的条件为:载气为高纯度CO2,萃取压强35MPa、萃取时间135min、萃取温度58℃、分离釜温度80℃、CO2流量15L/h,其中萃取时间依次由动态萃取10min和静态萃取125min组成。
3.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述的超声波辅助提取的条件为:超声功率500W,超声时间20min。
4.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述的浸提液中NaCl浓度为0.08mol/L,所述的浸提温度为72.77℃,所述的浸提时间为4.27h,所述的脱脂海马粉与所述的NaCl浸提液的料液比21.41 g:1mL。
5.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法,其特征在于步骤(3)中所述的Sevage法除游离蛋白的条件为:糖蛋白样品液与Sevage试剂比例为4:1,所述的Sevage试剂由氯仿与正丁醇按5:1的比例混合而成。
6.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法,其特征在于步骤(3)中所述的乙醇分级沉淀条件为:将收集的糖蛋白溶液层依次加入无水乙醇,分别在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%时于4℃沉淀12h,最后收集各乙醇浓度下得到的沉淀。
7.根据权利要求1所述的一种海马活性糖蛋白的制备方法,其特征在于步骤(3)得到的海马糖蛋白粗纯品进行精纯化的过程为:取海马糖蛋白粗纯品按质量体积比0.2g:5mL的比例溶解在去离子水中,过0.45μm滤膜后取样品液,将样品液上DEAE-52纤维素阴离子交换柱进行分离纯化,上样后分别用0.05、0.1、0.5mol/L NaHCO3进行阶段性洗脱,每个浓度洗脱120min,在280nm处采用紫外吸收法检测糖蛋白的出峰位置,分别收集含有糖蛋白组分的第一吸收峰、第二吸收峰和第四吸收峰,冷冻干燥,得到不同分子量的海马糖蛋白精纯品。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410129587.6A CN103923201B (zh) | 2014-04-01 | 2014-04-01 | 一种海马活性糖蛋白的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410129587.6A CN103923201B (zh) | 2014-04-01 | 2014-04-01 | 一种海马活性糖蛋白的制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103923201A true CN103923201A (zh) | 2014-07-16 |
CN103923201B CN103923201B (zh) | 2016-06-29 |
Family
ID=51141614
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410129587.6A Active CN103923201B (zh) | 2014-04-01 | 2014-04-01 | 一种海马活性糖蛋白的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103923201B (zh) |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104152517A (zh) * | 2013-05-15 | 2014-11-19 | 上海海洋大学 | 一种从海马提取短肽的方法 |
CN104592372A (zh) * | 2015-01-19 | 2015-05-06 | 河南科技大学 | 一种悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法 |
CN108148109A (zh) * | 2017-12-12 | 2018-06-12 | 浙江海洋大学 | 一种鱿鱼性腺糖复合物的制备方法及其水解物的亚铁络合物的制备方法 |
CN108503684A (zh) * | 2018-04-08 | 2018-09-07 | 广州蓝日生物科技有限公司 | 分离蛋白的方法及设备 |
CN110105426A (zh) * | 2019-05-24 | 2019-08-09 | 华南农业大学 | 一种拟海龙糖蛋白的制备方法和应用 |
CN110196333A (zh) * | 2019-05-24 | 2019-09-03 | 华南农业大学 | 一种青鳞鱼糖蛋白的提取方法和应用 |
CN114451505A (zh) * | 2022-02-21 | 2022-05-10 | 福建农林大学 | 一种添加糖蛋白的抗疲劳饮料 |
CN114478687A (zh) * | 2022-04-01 | 2022-05-13 | 青岛浩然海洋科技有限公司 | 一种海马蛋白粗提取工艺 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101962402A (zh) * | 2009-07-23 | 2011-02-02 | 山西中医学院 | 一种黄芪糖蛋白及其制备方法和用途 |
CN103305577A (zh) * | 2013-05-22 | 2013-09-18 | 宁波大学 | 一种海马多肽酶解液的制备方法 |
-
2014
- 2014-04-01 CN CN201410129587.6A patent/CN103923201B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101962402A (zh) * | 2009-07-23 | 2011-02-02 | 山西中医学院 | 一种黄芪糖蛋白及其制备方法和用途 |
CN103305577A (zh) * | 2013-05-22 | 2013-09-18 | 宁波大学 | 一种海马多肽酶解液的制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
YUTING SU ET AL: "Study on the extraction and purification of glycoprotein from the yellow seahorse,Hippocampus kuda Bleeker", 《FOOD SCIENCE & NUTRITION》 * |
刘兴华等: "天然糖蛋白的提取、分离与纯化", 《药学进展》 * |
王芍: "葡萄籽糖蛋白的提取纯化及免疫活性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 * |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104152517A (zh) * | 2013-05-15 | 2014-11-19 | 上海海洋大学 | 一种从海马提取短肽的方法 |
CN104592372A (zh) * | 2015-01-19 | 2015-05-06 | 河南科技大学 | 一种悬浮培养发菜糖蛋白的制备方法 |
CN108148109A (zh) * | 2017-12-12 | 2018-06-12 | 浙江海洋大学 | 一种鱿鱼性腺糖复合物的制备方法及其水解物的亚铁络合物的制备方法 |
CN108503684A (zh) * | 2018-04-08 | 2018-09-07 | 广州蓝日生物科技有限公司 | 分离蛋白的方法及设备 |
CN110105426A (zh) * | 2019-05-24 | 2019-08-09 | 华南农业大学 | 一种拟海龙糖蛋白的制备方法和应用 |
CN110196333A (zh) * | 2019-05-24 | 2019-09-03 | 华南农业大学 | 一种青鳞鱼糖蛋白的提取方法和应用 |
CN110105426B (zh) * | 2019-05-24 | 2022-08-09 | 华南农业大学 | 一种拟海龙糖蛋白的制备方法和应用 |
CN114451505A (zh) * | 2022-02-21 | 2022-05-10 | 福建农林大学 | 一种添加糖蛋白的抗疲劳饮料 |
CN114478687A (zh) * | 2022-04-01 | 2022-05-13 | 青岛浩然海洋科技有限公司 | 一种海马蛋白粗提取工艺 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103923201B (zh) | 2016-06-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103923201B (zh) | 一种海马活性糖蛋白的制备方法 | |
CN104450844B (zh) | 一种从海参加工液中提取多种活性营养成分的方法及其应用 | |
CN101747446B (zh) | 一种抗疲劳人参酸性多糖的提取方法 | |
CN105063139B (zh) | 一种用于醒酒的沙棘籽多肽的制备方法 | |
CN101704899B (zh) | 一种猕猴桃根多糖提取物的制备方法 | |
CN101294186A (zh) | 阿胶低肽的制备方法 | |
CN101461543B (zh) | 一种鹿血深加工方法 | |
CN108341887A (zh) | 一种霍山石斛多糖的制备方法 | |
CN107541533A (zh) | 一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法 | |
CN107412721A (zh) | 一种降血糖苦瓜多肽复方胶囊及其制备方法 | |
CN106084087A (zh) | 一种瓜蒌多糖的制备方法 | |
CN107698659B (zh) | 经蛋白酶M酶解的山杏仁蛋白源ɑ-葡萄糖苷酶抑制肽及其制备方法 | |
CN109601795A (zh) | 以赶黄草为主要原料的组合物解酒饮料及其制备方法 | |
CN105754000A (zh) | 羊栖菜多糖提取工艺 | |
CN107581620A (zh) | 一种降血糖苦瓜多肽复合含片及其制备方法 | |
CN106279462B (zh) | 黄芪多糖的提取方法及兽用黄芪多糖口服液的制备方法 | |
CN105175569A (zh) | 从金花茶叶中提取金花茶多糖的方法 | |
CN107602719A (zh) | 一种具有显著辅助抗肿瘤活性的灵芝子实体精制多糖及其制备方法和应用 | |
CN107722131B (zh) | 一种具有显著辅助抗肿瘤活性的全灵芝孢子粉精制多糖及其制备方法和应用 | |
CN105497109A (zh) | 利用微生物发酵技术生产黄芪总黄酮的工艺 | |
CN1884571B (zh) | 从石蒜属植物中提取多糖的工艺方法 | |
CN107880149A (zh) | 一种铁皮石斛多糖的提取工艺 | |
CN101638444B (zh) | 海滨锦葵多糖制备工艺及用途 | |
CN107903328A (zh) | 一种皱皮木瓜籽多糖及其制备方法 | |
CN103478843B (zh) | 一种解酒饮料及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |