CN105063139B - 一种用于醒酒的沙棘籽多肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于醒酒的沙棘籽多肽的制备方法。具体是以脱脂沙棘籽渣为原料，加入木瓜蛋白酶，在其最适条件下水解，然后通过用截留分子量为3000Da的超滤膜分离酶解液，得到分子量小于3000Da沙棘籽醒酒多肽溶液，体外试验表明，该多肽溶液对乙醇脱氢酶具有明显的激活作用，其中500～2000Da的多肽活性最强；该多肽可以通过增强乙醇脱氢酶的活性，促进体内乙醇的分解和代谢，达到醒酒的作用。动物试验表明，该多肽按体重摄入200mg/kg·bw能起到防醉酒和醒酒作用，可用做醒酒保健食品的原料。
Description
技术领域
本发明涉及沙棘活性多肽的制备，具体是一种用于醒酒的沙棘籽多肽的制备方法。
背景技术
脱脂沙棘籽渣为沙棘提油后的副产物，其蛋白质含量在30％左右。目前对于沙棘籽渣的开发利用主要集中在提取原花青素及黄酮，对沙棘籽蛋白及多肽的研究较少，尚未见到用酶解沙棘籽制备醒酒活性肽的研究。
医学研究表明，长期过量饮酒或一次性大量饮酒会导致乙醇脱氢酶(ADH)活性降低，使人体对乙醇的代谢功能下降，进而加重乙醇对脑、肝脏等器官的危害作用。近年来，随着保健意识的增强，解酒保健品也逐渐增多，其主要成分多为中草药提取物。关于醒酒肽的研究文献包括，田田的《黑豆多肽的制备及体外醒酒活性的研究》，此研究通过酶解法制备出一种具有醒酒作用的黑豆多肽，采用的蛋白酶为碱性蛋白酶。专利号为CN200910073036的专利《玉米醒酒肽的制备方法》，通过复合酶解法制备出一种具有醒酒作用的多肽，所用的酶为Alcalase碱性蛋白酶—Protamex复合蛋白酶复合水解，水解液经粗分离、超滤、浓缩和喷雾成型获得玉米醒酒肽粉。专利号为CN201010540622的专利《一种醒酒肽的提取方法》，此研究以玉米黄粉为主要原料，经过配水、加酒精和亚硫酸钠升温蒸煮、过滤、滤液加蛋白酶酶解、灭酶、脱色、膜分离，将得到的滤液经干燥后即获醒酒肽。但并未见到酶法制备沙棘籽渣醒酒多肽的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于醒酒的沙棘籽多肽的制备方法，该方法简单，制备的沙棘籽多肽醒酒活性更高。
本发明提供的一种用于醒酒的沙棘籽多肽的制备方法，包括如下步骤：
将脱脂沙棘籽渣粉碎后过60～80目筛，取筛下物按料液比1∶10～20加水浸泡6h以上，加入酶活为60～100万U/g的木瓜蛋白酶水解，木瓜蛋白酶的加入量为沙棘籽渣中蛋白质量的1/250～1/130；然后经过离心、超滤和浓缩后制得。
木瓜蛋白酶水解条件：在pH6.0～7.5，温度50～60℃条件下水解2.5～5h。
水解液分离条件：在5000rpm下离心10min；然后用截断分子量3000Da的超滤膜进行超滤，收集滤出液做为活性多肽溶液，将该活性多肽溶液浓缩、冷藏，或喷雾干燥保存。
体外试验表明，该活性多肽溶液在浓度1.5％以上时，对乙醇脱氢酶的激活作用显著，可以通过增强乙醇脱氢酶的活性，促进体内乙醇的分解和代谢，达到醒酒的作用。动物表明，该多肽具有较好的防醉酒和醒酒效果，可开发为解酒产品。
本发明的优点在于：
操作简便，多肽得率高。木瓜蛋白酶水解沙棘籽渣得到的水解液只要通过一次离心和一次超滤就能收集得到具有显著提高乙醇脱氢酶激活率的活性多肽溶液。在相同多肽含量的情况下，1.5％的该活性多肽对乙醇脱氢酶激活率较未经分离的水解原液提高30％以上。
采用本发明方法制备的分子量小于3000Da沙棘籽醒酒多肽溶液中，500Da以下和2000-3000Da的多肽有一定的乙醇脱氢酶激活作用，但是激活率较低，分子量为500-2000Da的多肽乙醇脱氢酶激活作用最强，同时也是所占质量含量最大的分子段，占总水解蛋白质量的56％以上，可做为解酒保健食品开发利用。
具体实施方式
实施例1
取50g粉碎好的脱脂沙棘籽渣(蛋白含量为26.25％)，加入800ml蒸馏水，于常温下放置10小时后，调pH至6.5，加入0.06g木瓜蛋白酶于60℃下水解2.5h，灭酶后将酶解液以5000r/min离心取上清液，浓缩到多肽含量达到1.5％备用。酶解液经微滤后，采用瓦勒-霍赫法测定沙棘籽酶解液对乙醇脱氢酶激活率。经测定，多肽含量为15.8mg/mL时，该多肽溶液对乙醇脱氢酶激活率为30.14％。经截留分子量为3000Da的超滤膜分离得到分子质量Mw>3000Da和Mw<3000Da的两个组分，其中Mw>3000Da的组分无乙醇脱氢酶激活率，Mw<3000Da的组分对乙醇脱氢酶激活率为57.41％，比原酶解液显著提高。
实施例2
取50g粉碎好的脱脂沙棘籽渣，加入600ml蒸馏水，于常温下放置8小时后，调pH至7.0，加入0.07g木瓜蛋白酶于50℃下水解4.5h，灭酶后将酶解液以5000r/min离心取上清液，浓缩到多肽含量达到1.5％。酶解液经微滤后，选用截留分子质量为3000Da、2000Da和500Da的超滤膜及纳滤膜，分离得到4组分，即分子质量Mw>3000Da、Mw在2000～3000Da、Mw在500～2000Da、Mw<500Da。将4种分离液及原酶解液分别蒸发、浓缩到相同多肽含量后，用瓦勒-霍赫法测定不同样品对乙醇脱氢酶的激活率。采用凝胶色谱分析酶解液中各段分子量的分布。实验结果表明(表1、2)，分子量在500-2000Da沙棘籽多肽溶液具有较好的ADH激活率，达到62.52％，比Mw<3000Da的混合多肽组分的乙醇脱氢酶的激活率提高5.11％。凝胶层析分析，该多肽溶液中分子量在500-2000Da的肽段占到56.28％。
表1各级酶解多肽的乙醇脱氢酶的激活率对比
注：与原酶解液相比，**.P＜0.01，差异极显著；*.P＜0.05，差异显著。
表2沙棘酶解产物的主要成分及质量含量/％
实施例3
取50g粉碎好的脱脂沙棘籽渣，加入1000ml蒸馏水，于常温下放置10小时后，调pH至6.0，加入0.09g木瓜蛋白酶于55℃下水解3.5h，灭酶后将酶解液以5000r/min离心取上清液，浓缩到多肽含量达到1.5％后，用截留分子质量为3000Da的超滤膜分离纯化，得到分子量小于3000Da的沙棘籽多肽溶液，浓缩到多肽含量为4％后备用。
防醉试验程序为先灌多肽样品再灌饮用浓度为56°的酒。取40只雄性小鼠(雌雄各半)，随机分为4组：模型组；沙棘多肽低、中、高剂量(100、200、400mg/kg·bw)组。模型组按体重灌胃0.1mL/10g剂量的生理盐水，实验组按体重灌胃0.1mL/10g剂量的相应提取物溶液，30min后所有小鼠灌胃同等剂量的56°白酒。记录各组的醉酒(翻正反射消失)时间(以给酒后开始计时)和醒酒(翻正反射恢复)时间(以给酒后开始计时)。
醒酒试验也是先灌酒再灌样品。分组方法同防醉试验，只是将4组先灌胃0.1mL/10g剂量的56°白酒，30min后再灌胃0.1mL/10g样品溶液或生理盐水。记录4组的醒酒(翻正反射恢复)时间(以给酒后开始计时)。
实验结果表明(表3、4)，沙棘多肽剂量组的醉酒时间及醒酒时间显著低于模型组，说明沙棘籽多肽高、中、低剂量具有明显的防醉及醒酒作用，高剂量组的醉酒时间及醒酒时间明显低于低剂量组，显示出一定的剂量依赖关系。
表3防醉试验
表4醒酒试验
注：与模型组相比，**.P＜0.01，差异极显著；*.P＜0.05，差异显著。
Claims (2)
1.一种用于醒酒的沙棘籽多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将脱脂沙棘籽渣粉碎后过60～80目筛，取筛下物按料液比1∶10～20加水浸泡6h以上，加入酶活为60～100万U/g的木瓜蛋白酶水解，木瓜蛋白酶的加入量为沙棘籽渣中蛋白质量的1/250～1/130；然后经过离心，超滤，收集滤出液浓缩、冷藏，或喷雾干燥保存；
所述木瓜蛋白酶水解条件为：在pH6.0～7.5，温度50～60℃条件下水解2.5～5h；
所述的离心条件为：在5000rpm下离心10min；
所述的超滤是用截断分子量3000Da的超滤膜进行超滤。
2.如权利要求1所述的一种用于醒酒的沙棘籽多肽的制备方法，其特征在于，所述的木瓜蛋白酶的酶活为100万U/g。
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