CN103421873A - 一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法，步骤包括：将沙棘籽渣经过浸泡处理后，用单宁酶、植酸酶组成的复合酶水解处理沙棘籽渣，再用酸性蛋白酶与木瓜蛋白酶联合水解底物中的蛋白质，将多肽水解液低温静置过夜，然后通过低温高速离心去除大分子杂质，离心上清液浓缩、干燥后得到沙棘籽抑菌多肽。体外抑菌培养试验表明，此多肽对大肠杆菌、沙门氏菌等常见细菌都具有良好的抑制作用。本多肽口感好，没有副作用，可以作为防腐剂添加到食品或饲料中使用。

Description

一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法

技术领域

本发明涉及植物多肽的制备，具体涉及沙棘籽脱脂后残渣的再利用，是一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法。

背景技术

脱脂沙棘籽渣为沙棘油加工生产后的废弃物，通常会作为动物饲料或弃去。脱脂沙棘籽渣中含有30%左右的蛋白质，且氨基酸配比良好。目前对于沙棘籽渣的开发利用极少，只有关于提取其中原花青素的开发利用，但是由于其开发成本大于常见的葡萄籽中的原花青素而未被广泛利用。关于沙棘籽多肽的研究有，黄鹏、苏宁等人发表的《沙棘生物活性肽的制备及功效研究》，此研究通过酶解法制备出一种具有抗氧化作用多肽，采用的蛋白酶为中性蛋白酶，没有分离纯化工艺。连伟帅、高英、王常青等人发表的《用沙棘籽渣加工饲料级活性肽》，其中制备沙棘籽多肽采用的蛋白酶为碱性蛋白酶，多肽用截留分子量2000Da和3500Da的超滤膜超滤分离出分子量为2000～3500Da的多肽，该多肽对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用。但是，其采用的蛋白酶直接水解的方法，此法制备多肽的工艺多肽得率低，多步超滤膜分离使得多肽损失大，碱性蛋白酶水解出的多肽口感涩、有异味只能用于饲料用添加剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法，该方法水解得率高、分离过程中多肽损失少、产品口感好。

本发明提供的一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法，以沙棘籽渣（沙棘籽脱脂后的残渣）的为原料，经过植酸酶、单宁酶预处理后，用酸性蛋白酶与木瓜蛋白酶进行水解，后经过高速、低温离心和纳滤分离制得，具体包括以下步骤：

1）、将沙棘籽渣以1:8～20的料液比加水，于20～30℃的环境下放置过夜；

2）、在pH3～5、温度35～50℃条件下，按沙棘籽渣质量的0.1～0.5%分别加入植酸酶与单宁酶，水解,6-15h，水解完后90℃保温10～20min灭酶；

3）、在pH2～4，温度40～55℃条件下，按沙棘籽渣中每100克蛋白加入2～8克的酸性蛋白酶水解2～7h，水解完后90℃灭酶10～20min；

4）、在pH5～7、温度45～55℃条件下，按沙棘籽渣中每100克蛋白加入0.5～5克木瓜蛋白酶水解2～5h，水解完后煮沸灭酶；

5）、将酶解液在0～4℃下放置6～12h后，在0～4℃，以10000～12000r/min高速离心10～20min，取离心上清液，用截留分子量为500Da的纳滤膜纳滤，取截留液浓缩、真空干燥后得到抑菌沙棘籽多肽。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

1.在用蛋白酶水解前，用单宁酶与植酸酶的复合酶水解处理沙棘籽，水解沙棘籽渣中与蛋白质结合的单宁与植酸，提高了沙棘籽渣中蛋白质的溶出量，相比于《用沙棘籽渣加工饲料级活性肽》中所述的沙棘籽多肽制备工艺，多肽水解得率大大提高，从66.46%提高至80%以上。

2.在沙棘籽多肽分离纯化过程中，首先将酶解液在0～4℃下放置，然后在0～4℃高速离心除去大分子杂质，再经截留分子量为500Da的纳滤膜处理除去小分子杂质。在《用沙棘籽渣加工饲料级活性肽》的多肽制备工艺中，采用的多级超滤膜分离，分离过程中随着浓差极化加重，多肽被滤膜吸附的损失率增高，多肽的损失率一般在25%以上。本发明采用低温静置和低温高速离心，可以有效去除绝大多数大分子多肽、蛋白和前工序多酶水解不完全的大分子；然后用500Da的纳滤膜纳滤，可以滤出氨基酸、灰分和小分子杂质，得到了500～5000Da的抑菌多肽。减少了分离过程中多肽损失。与多级超滤膜分离相比，多肽损失率从25～30%降低至8%以下。

3.本工艺采用酸性蛋白酶-木瓜蛋白酶组合水解得到的沙棘籽多肽，不但具有抑菌效果，而且口感好，无异味，不影响食用。《用沙棘籽渣加工饲料级活性肽》所报道的多肽采用碱性蛋白酶制备，由于有大量疏水性肽键被水解，水解出的多肽口感苦涩、有异味，影响食用。

4.通过G-25凝胶柱层析对产品进行分离，采用面积归一法对凝胶色谱图分析，得到本产品多肽的分子量97%以上分布在500～5000Da之间。与《用沙棘籽渣加工饲料级活性肽》所报道的有所不同。

附图说明

图1实施例1沙棘籽多肽样品对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌效果图

图2实施例2沙棘籽多肽样品对金黄色葡萄球菌菌的抑菌效果图

图3实施例3沙棘籽多肽样品对鸡白痢沙门氏菌的抑菌效果图

具体实施方式

实施例1

取20g粉碎好的沙棘籽渣于烧杯中，加入200ml蒸馏水，于25℃室温下放置过夜。调pH至4.0，加入0.1g植酸酶与0.1g单宁酶后于50℃水浴锅中保温8h。然后加热至90℃灭酶处理15min，冷却后调pH至2.5，加入0.33g酸性蛋白酶于45℃下水解7h，加热至90℃灭酶15min，冷却后调pH至7.0，加入0.15g木瓜蛋白酶于55℃下水解3h，加热至90℃灭酶15min。将酶解液在0～4℃下放置8h后。在0～4℃，以12000r/min高速离心10min，取离心上清液用截留分子量为500Da的纳滤膜纳滤，取纳滤截留液做抑菌试验。抑菌试验采用的细菌为鼠伤寒沙门氏菌，培养基为营养琼脂培养基。将培养基加热煮沸，冷却至50～60℃时倒入培养皿中，凝固后分别将2种细菌均匀接种至培养基表面，涂抹均匀。在培养基表面打上直径3～4mm的小孔，在小孔中点稀释到10mg/ml的样品20～30ul后于37℃恒温培养箱中培养48h后观察抑菌圈大小。培养48h后，该样品对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌圈直径为5.8mm（见图1），说明本样品对对以上该菌有抑制作用。

本试验以水解前的沙棘籽渣总蛋白含量为基准，计算酶水解提取和分离步骤的多肽得率。多酶水解液中多肽提取率为81.20%，纳滤样品的多肽提取率为74.29%，分离纯化过程中的多肽损失为8.5%。

实施例2

取20g粉碎好的沙棘籽渣于烧杯中，加入300ml蒸馏水浸泡过夜。调pH至4.5，加入0.2g植酸酶与0.1g单宁酶后于45℃水浴锅中保温8h，期间每1h搅拌2-3min。然后加热至90℃灭酶处理15min，冷却后调pH至3.5，加入0.5g酸性蛋白酶于50℃下水解4h，加热至90℃灭酶15min，冷却后调pH至6.5，加入0.1g木瓜蛋白酶于50℃下水解5h，加热至90℃灭酶15min，然后加热至90℃灭酶处理15min。将酶解液在0～4℃下放置10h后。在0～4℃，以10000r/min高速离心20min，取离心上清液用截留分子量为500Da的纳滤膜纳滤，取纳滤截留液做抑菌试验。抑菌试验采用的细菌为金黄色葡萄球菌，培养基为高盐肉汤培养基，配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，琼脂20g，NaCl 75g，1000ml水。培养与观察方法同实施例1中所述。培养48h后观察实验结果，该样品对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为6.8mm（见图2），金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，说明本产品多肽对该菌具有抑制作用。

以水解前的沙棘籽渣总蛋白含量为基准，计算酶水解提取和分离步骤的多肽得率。多酶水解液中多肽提取率为82.07%，纳滤样品的多肽提取率为75.30%，分离纯化过程中的多肽损失为8.25%。与此同时，本试验同时按照“用沙棘籽渣加工饲料级活性肽”的方法，用沙棘籽渣制备了多肽，计算了总多肽得率和各步多肽得率。结果显示，本发明比《用沙棘籽渣加工饲料级活性肽》所报道方法的多肽得率明显提高。见表1

表1       多肽提取率对照表

实施例3

取20g粉碎好的沙棘籽渣于烧杯中，加入400ml蒸馏水浸泡过夜。调pH至5，加入0.2g植酸酶与0.1g单宁酶后于38℃水浴锅中保温14h。然后加热至90℃灭酶处理15min，冷却后调pH至4.0，加入0.4g酸性蛋白酶于55℃下水解3h，加热至90℃灭酶15min，冷却后调pH至7，加入0.25g木瓜蛋白酶于52℃下水解1.5h，然后加热至90℃灭酶处理15min。将酶解液在0～4℃下放置12h后。在0～4℃，以11000r/min高速离心15min，取离心上清液用截留分子量为500Da的纳滤膜纳滤，取纳滤截留液做抑菌试验。抑菌试验采用的细菌为鸡白痢沙门氏菌，培养基为营养肉汤培养基。培养与观察方法同实施例1中所述。培养48h后，该样品对鸡白痢沙门氏菌的抑菌圈直径为6.4mm（见图3），鸡白痢沙门氏菌为对家禽有危害的致病菌，说明本样品能够抑制禽饲料中常见致病菌的生长。

本试验以水解前的沙棘籽渣总蛋白含量为基准，计算酶水解提取和分离步骤的多肽得率。多酶水解液中多肽提取率为80.82%，纳滤样品的多肽提取率为73.93%，分离纯化过程中的多肽损失为8.53%。

Claims (3)

1.一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）、将沙棘籽渣以1:8～20的料液比加水，于20～30℃的环境下放置过夜；

2）、在pH3～5、温度35～50℃条件下，按沙棘籽渣质量的0.1～0.5%分别加入植酸酶与单宁酶，水解,6-15h，水解完后90℃保温10～20min灭酶；

3）、在pH2～4，温度40～55℃条件下，按沙棘籽渣中每100克蛋白的质量加入2～8克的酸性蛋白酶，水解2～7h，水解完后90℃灭酶10～20min；

4）、在pH5～7、温度45～55℃条件下，按沙棘籽渣中每100蛋白的质量加入木瓜蛋白酶0.5～5克，水解2～5h，水解完后煮沸灭酶；

5）、将酶解液在0～4℃下静置6～12h后，在0～4℃，以10000～12000r/min高速离心10～20min，取离心上清液用截留分子量为500Da的纳滤膜纳滤，取截留液浓缩、干燥后得到抑菌沙棘籽多肽。

2.如权利要求1所述的一种具有抑菌作用的沙棘籽多肽的制备方法，其特征在于，所述的酸性蛋白酶是3.350酸性蛋白酶或537酸性蛋白酶。

3.如权利要求1或2所述制备方法制备的沙棘籽多肽作为防腐剂在食品添加剂或饲料添加剂中的应用。

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