CN113481269A - 一种沙棘蛋白多肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及沙棘蛋白多肽的提取技术领域，具体涉及一种沙棘蛋白多肽的制备方法。主要以沙棘蛋白为原料通过蛋白酶酶解后，然后离心、浓缩及干燥后制备成具有多种生物活性的沙棘多肽产品。本发明方法值得的沙棘多肽得率的最高达到65.09％。其中，沙棘蛋白利用醇提+碱提酸沉+酶解的高效提取方法，产品纯度明显提高，碱酶两步法提取沙棘蛋白是在碱提酸沉法的基础上增加了酶解步骤，将提取蛋白后分离的残渣中的蛋白进一步提取，达到综合利用的目的，且可提高沙棘籽粕蛋白的提取率，沙棘籽蛋白的提取率为78.45％，蛋白含量为82.04％。
Description
技术领域
本发明涉及沙棘蛋白多肽的提取技术领域，具体涉及一种沙棘蛋白多肽的制备方法。
背景技术
沙棘籽粕是沙棘籽经过初级利用(提油或不饱和脂肪酸)以后的工业副产物，目前沙棘籽中共鉴定出了61种化合物，其中酯类化合物24种、脂肪酸12种(8种饱和脂肪酸和4种不饱和脂肪酸)、烷烃类和烯烃类物质22种、氯代烃类物质3种。沙棘籽粕分离出的蛋白几近完全蛋白质，且含量≥20％，现已分鉴定出18种氨基酸，其中包括人体所需的全部必须氨基酸和2种半必须氨基酸。沙棘籽粕所含化合物的种类、含量因其种属、生长环境、产地、采收期等因素的影响会有所不同。沙棘籽粕是一种良好的植物蛋白资源，但通常作为动物饲料使用或被当作废渣丢弃，没有发挥其完全的利用潜质。
生物活性肽是指由10～100个氨基酸分子脱水缩合而成的，对调节生物机体的生命活动有显著作用或具有特殊生理功能的肽类化合物，又称功能肽。沙棘蛋白通过蛋白酶酶解可制备成具有多种生物活性的沙棘多肽产品。将沙棘巧蛋白加工成具有生理活性的多肽，能够开发出多种食品添加剂级及饲料添加剂级的活性肽成分来。不但可以丰富食品添加剂和饲料添加剂市场，填补沙棘多肽产品市场空白，而且可以大大的提高沙棘的综合利用，从而产生良好的经济与社会效益。
发明内容
基于上述技术问题，本发明主要针对从沙棘籽粕中提取的沙棘籽蛋白为原料，通过蛋白酶酶解参数优化制备具有多种生物活性的沙棘多肽产品。目的是提供一种沙棘蛋白多肽的制备方法。
本发明保护一种沙棘蛋白多肽的制备方法，具体步骤包括如下：
步骤1，酶解：称取沙棘蛋白，用纯水混合按照一定料液比与沙棘蛋白溶液，加入蛋白酶，进行酶解；
步骤2，灭酶：酶解至预定时间后，调节pH至沙棘籽蛋白的等电点，而后将酶解体系移至预先升温至90℃的恒温震荡水浴锅内，保持15min使酶的活性丧失；
步骤3，离心：将灭酶后的沙棘蛋白酶解体系冷却，离心取上清液，即为沙棘多肽提取物；
步骤4，浓缩：用旋转蒸发器浓缩离心后的沙棘多肽提取物，浓缩溶液至浓度为45～50％；
步骤5，真空冷冻干燥：将浓缩后的沙棘多肽提取物在5℃条件下预冷，然后将其在-80℃下冷冻，用真空冷冻干燥机在-90℃下真空冷冻干燥36h，即得到沙棘蛋白肽粉末。
进一步的，所述的蛋白酶为酸性蛋白酶，酶解条件为温度为40～50℃、pH值为2～3、加酶量3000～5000u/g、料液比1:15～25。
优化的，所述的蛋白酶为酸性蛋白酶，酶解条件为温度为50℃、pH值为3、加酶量4000u/g、料液比1:20。
进一步的，所述的沙棘蛋白为以沙棘籽粕为原料，利用醇提+碱提酸沉+酶解的提取方法制备，具体步骤为：
步骤1，原料预处理：将沙棘籽粕烘干粉碎后，过40～120目筛，优化的80目，备用；
步骤2，酶解：在步骤1得到的沙棘籽粕中，加120～360u/g纤维素酶去纤维素，优化为加240u/g纤维素酶去纤维素，使与纤维素结合的蛋白分离出来；
步骤3，醇提：将75％乙醇加入提取罐内，开启搅拌，缓慢加入沙棘籽粕粉，严禁把沙棘籽粕一并倒入提取罐，开启蒸汽加热，加热到45℃搅拌90min后离心，留沙棘籽粕沉淀；其中，所加沙棘籽粕与乙醇的料液比为1:6～14，优化为沙棘籽粕与乙醇的料液比为1:12；
步骤4，减解：
S1，第一次减提：将步骤1预处理过的沙棘籽粕与水按1：8～16的料液比加入另一提取罐内，开启搅拌，缓慢加入醇提离心后的沙棘籽粕沉淀，搅拌均匀；开启蒸汽加热，加热到30～70℃时缓慢加入20％NaOH水溶液，调pH至8～12搅拌，在反应过程中，及时监控pH的变化情况，及时加碱调pH至8～12，离心留上清液，沙棘籽粕沉淀用于第二次碱提，其中减提时间为20～60min；
S2，第二次减提：依照步骤S1的方法对沙棘籽粕沉淀进行第二次碱提，离心后将两次上清液混合在一起；
其中，上述减提步骤中，沙棘籽粕原料与水的料液比为1:10～14；蒸汽加热的加热温度为40～50℃；pH为10～11；减解时间为40～50min；
步骤5，酸沉：将步骤4碱提离心后的上清液加入新的提取罐中，在搅拌条件下缓慢加入乳酸，调pH至4.5；pH稳定后停止搅拌，静置6～8h，备用；
步骤6，离心：将酸沉静置后的溶液离心，取出离心后的沉淀；
步骤7，干燥、粉碎：温度在45℃以下将沙棘籽蛋白提取物烘干，粉碎烘干后的蛋白粉并且过80目筛网。
相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：
本发明以沙棘蛋白为原料通过蛋白酶酶解后，然后离心、浓缩及干燥后制备成具有多种生物活性的沙棘多肽产品，对蛋白酶的酶解条件进行了优化，沙棘多肽得率的最高达到65.09％。其中，沙棘蛋白利用醇提+碱提酸沉+酶解的高效提取方法，产品纯度明显提高，碱酶两步法提取沙棘蛋白是在碱提酸沉法的基础上增加了酶解步骤，将提取蛋白后分离的残渣中的蛋白进一步提取，达到综合利用的目的，且可提高沙棘籽粕蛋白的提取率，沙棘籽蛋白的提取率为78.45％，蛋白含量为82.04％。
附图说明
图1为本发明沙棘蛋白多肽提取方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明方法参数优化试验
1、蛋白酶筛选
选取酸性蛋白酶、中性蛋白酶(枯草杆菌)、碱性蛋白酶(枯草杆菌)、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶共5种蛋白酶进行水解试验，测定多肽得率，筛选事宜的蛋白酶用于沙棘多肽的制备，确定最佳制备条件。通过对5种蛋白酶适宜酶解条件下沙棘多肽得率的比较，酸性蛋白酶酶解多肽得率最高，为60％以上，因此选择利用酸性蛋白酶进行沙棘多肽制备。
2、酸性蛋白酶正交试验
酸性蛋白酶的最佳酶解条件选取温度、pH、加酶量与料液比四个因素进行4因素3水平L9(34)正交试验。
表1酸性蛋白酶正交试验表
酸性蛋白酶的酶解正交试验结果表明，RC>RB>RA>RD，各因素对沙棘多肽得率影响的顺序为加酶量>pH值>温度>料液比，其中加酶量对得率影响最大。因此，得到最佳的水解条件为：温度为50℃、pH值为3、加酶量4000u/g、料液比1:20。在此条件下沙棘多肽得率的最高达到65.09％(详见表2)。
表2酸性蛋白酶正交试验结果表
实施例2
一种沙棘蛋白多肽的制备方法，具体步骤包括如下：
步骤1，酶解：称取沙棘蛋白，用纯水混合按照一定料液比与沙棘蛋白溶液，加入酸性蛋白酶，进行酶解，酶解条件为温度为50℃、pH值为3、加酶量4000u/g、料液比1:20；
步骤2，灭酶：酶解至预定时间后，调节pH至沙棘籽蛋白的等电点，而后将酶解体系移至预先升温至90℃的恒温震荡水浴锅内，保持15min使酶的活性丧失；
步骤3，离心：将灭酶后的沙棘蛋白酶解体系冷却，离心取上清液，即为沙棘多肽提取物；
步骤4，浓缩：用旋转蒸发器浓缩离心后的沙棘多肽提取物，浓缩溶液至浓度为45％；
步骤5，真空冷冻干燥：将浓缩后的沙棘多肽提取物在5℃条件下预冷，然后将其在-80℃下冷冻，用真空冷冻干燥机在-90℃下真空冷冻干燥36h，即得到沙棘蛋白肽粉末。
其中，沙棘蛋白为以沙棘籽粕为原料，利用醇提+碱提酸沉+酶解的提取方法制备，具体步骤为：
步骤1，原料预处理：将沙棘籽粕烘干粉碎后，过40～120目筛，优化的80目，备用；
步骤2，酶解：在步骤1得到的沙棘籽粕中，加120～360u/g纤维素酶去纤维素，优化为加240u/g纤维素酶去纤维素，使与纤维素结合的蛋白分离出来；
步骤3，醇提：将75％乙醇加入提取罐内，开启搅拌，缓慢加入沙棘籽粕粉，严禁把沙棘籽粕一并倒入提取罐，开启蒸汽加热，加热到45℃搅拌90min后离心，留沙棘籽粕沉淀；其中，所加沙棘籽粕与乙醇的料液比为1:6～14，优化为沙棘籽粕与乙醇的料液比为1:12；
步骤4，减解：
S1，第一次减提：将步骤1预处理过的沙棘籽粕与水按1：8～16的料液比加入另一提取罐内，开启搅拌，缓慢加入醇提离心后的沙棘籽粕沉淀，搅拌均匀；开启蒸汽加热，加热到30～70℃时缓慢加入20％NaOH水溶液，调pH至8～12搅拌，在反应过程中，及时监控pH的变化情况，及时加碱调pH至8～12，离心留上清液，沙棘籽粕沉淀用于第二次碱提，其中减提时间为20～60min；
S2，第二次减提：依照步骤S1的方法对沙棘籽粕沉淀进行第二次碱提，离心后将两次上清液混合在一起；
其中，上述减提步骤中，沙棘籽粕原料与水的料液比为1:10～14；蒸汽加热的加热温度为40～50℃；pH为10～11；减解时间为40～50min；
步骤5，酸沉：将步骤4碱提离心后的上清液加入新的提取罐中，在搅拌条件下缓慢加入乳酸，调pH至4.5；pH稳定后停止搅拌，静置6～8h，备用；
步骤6，离心：将酸沉静置后的溶液离心，取出离心后的沉淀；
步骤7，干燥、粉碎：温度在45℃以下将沙棘籽蛋白提取物烘干，粉碎烘干后的蛋白粉并且过80目筛网。
实施例3
一种沙棘蛋白多肽的制备方法，具体步骤包括如下：
步骤1，酶解：称取沙棘蛋白，用纯水混合按照一定料液比与沙棘蛋白溶液，加入酸性蛋白酶，进行酶解，酶解条件为温度为40℃、pH值为2、加酶量3000u/g、料液比1:15；
步骤2，灭酶：酶解至预定时间后，调节pH至沙棘籽蛋白的等电点，而后将酶解体系移至预先升温至90℃的恒温震荡水浴锅内，保持15min使酶的活性丧失；
步骤3，离心：将灭酶后的沙棘蛋白酶解体系冷却，离心取上清液，即为沙棘多肽提取物；
步骤4，浓缩：用旋转蒸发器浓缩离心后的沙棘多肽提取物，浓缩溶液至浓度为50％；
步骤5，真空冷冻干燥：将浓缩后的沙棘多肽提取物在5℃条件下预冷，然后将其在-80℃下冷冻，用真空冷冻干燥机在-90℃下真空冷冻干燥36h，即得到沙棘蛋白肽粉末。
其中，沙棘蛋白为以沙棘籽粕为原料，利用醇提+碱提酸沉+酶解的提取方法制备，具体步骤为：
步骤1，原料预处理：将沙棘籽粕烘干粉碎后，过40～120目筛，优化的80目，备用；
步骤2，酶解：在步骤1得到的沙棘籽粕中，加120～360u/g纤维素酶去纤维素，优化为加240u/g纤维素酶去纤维素，使与纤维素结合的蛋白分离出来；
步骤3，醇提：将75％乙醇加入提取罐内，开启搅拌，缓慢加入沙棘籽粕粉，严禁把沙棘籽粕一并倒入提取罐，开启蒸汽加热，加热到45℃搅拌90min后离心，留沙棘籽粕沉淀；其中，所加沙棘籽粕与乙醇的料液比为1:6～14，优化为沙棘籽粕与乙醇的料液比为1:12；
步骤4，减解：
S1，第一次减提：将步骤1预处理过的沙棘籽粕与水按1：8～16的料液比加入另一提取罐内，开启搅拌，缓慢加入醇提离心后的沙棘籽粕沉淀，搅拌均匀；开启蒸汽加热，加热到30～70℃时缓慢加入20％NaOH水溶液，调pH至8～12搅拌，在反应过程中，及时监控pH的变化情况，及时加碱调pH至8～12，离心留上清液，沙棘籽粕沉淀用于第二次碱提，其中减提时间为20～60min；
S2，第二次减提：依照步骤S1的方法对沙棘籽粕沉淀进行第二次碱提，离心后将两次上清液混合在一起；
其中，上述减提步骤中，沙棘籽粕原料与水的料液比为1:10～14；蒸汽加热的加热温度为40～50℃；pH为10～11；减解时间为40～50min；
步骤5，酸沉：将步骤4碱提离心后的上清液加入新的提取罐中，在搅拌条件下缓慢加入乳酸，调pH至4.5；pH稳定后停止搅拌，静置6～8h，备用；
步骤6，离心：将酸沉静置后的溶液离心，取出离心后的沉淀；
步骤7，干燥、粉碎：温度在45℃以下将沙棘籽蛋白提取物烘干，粉碎烘干后的蛋白粉并且过80目筛网。
实施例4
一种沙棘蛋白多肽的制备方法，具体步骤包括如下：
步骤1，酶解：称取沙棘蛋白，用纯水混合按照一定料液比与沙棘蛋白溶液，加入酸性蛋白酶，进行酶解，酶解条件为温度为45℃、pH值为2.5、加酶量5000u/g、料液比1:25；
步骤2，灭酶：酶解至预定时间后，调节pH至沙棘籽蛋白的等电点，而后将酶解体系移至预先升温至90℃的恒温震荡水浴锅内，保持15min使酶的活性丧失；
步骤3，离心：将灭酶后的沙棘蛋白酶解体系冷却，离心取上清液，即为沙棘多肽提取物；
步骤4，浓缩：用旋转蒸发器浓缩离心后的沙棘多肽提取物，浓缩溶液至浓度为48％；
步骤5，真空冷冻干燥：将浓缩后的沙棘多肽提取物在5℃条件下预冷，然后将其在-80℃下冷冻，用真空冷冻干燥机在-90℃下真空冷冻干燥36h，即得到沙棘蛋白肽粉末。
其中，沙棘蛋白为以沙棘籽粕为原料，利用醇提+碱提酸沉+酶解的提取方法制备，具体步骤为：
步骤1，原料预处理：将沙棘籽粕烘干粉碎后，过40～120目筛，优化的80目，备用；
步骤2，酶解：在步骤1得到的沙棘籽粕中，加120～360u/g纤维素酶去纤维素，优化为加240u/g纤维素酶去纤维素，使与纤维素结合的蛋白分离出来；
步骤3，醇提：将75％乙醇加入提取罐内，开启搅拌，缓慢加入沙棘籽粕粉，严禁把沙棘籽粕一并倒入提取罐，开启蒸汽加热，加热到45℃搅拌90min后离心，留沙棘籽粕沉淀；其中，所加沙棘籽粕与乙醇的料液比为1:6～14，优化为沙棘籽粕与乙醇的料液比为1:12；
步骤4，减解：
S1，第一次减提：将步骤1预处理过的沙棘籽粕与水按1：8～16的料液比加入另一提取罐内，开启搅拌，缓慢加入醇提离心后的沙棘籽粕沉淀，搅拌均匀；开启蒸汽加热，加热到30～70℃时缓慢加入20％NaOH水溶液，调pH至8～12搅拌，在反应过程中，及时监控pH的变化情况，及时加碱调pH至8～12，离心留上清液，沙棘籽粕沉淀用于第二次碱提，其中减提时间为20～60min；
S2，第二次减提：依照步骤S1的方法对沙棘籽粕沉淀进行第二次碱提，离心后将两次上清液混合在一起；
其中，上述减提步骤中，沙棘籽粕原料与水的料液比为1:10～14；蒸汽加热的加热温度为40～50℃；pH为10～11；减解时间为40～50min；
步骤5，酸沉：将步骤4碱提离心后的上清液加入新的提取罐中，在搅拌条件下缓慢加入乳酸，调pH至4.5；pH稳定后停止搅拌，静置6～8h，备用；
步骤6，离心：将酸沉静置后的溶液离心，取出离心后的沉淀；
步骤7，干燥、粉碎：温度在45℃以下将沙棘籽蛋白提取物烘干，粉碎烘干后的蛋白粉并且过80目筛网。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (4)
1.一种沙棘蛋白多肽的制备方法，其特征在于，具体步骤包括如下：
步骤1，酶解：称取沙棘蛋白，用纯水混合按照一定料液比与沙棘蛋白溶液，加入蛋白酶，进行酶解；
步骤2，灭酶：酶解至预定时间后，调节pH至沙棘籽蛋白的等电点，而后将酶解体系移至预先升温至90℃的恒温震荡水浴锅内，保持15min使酶的活性丧失；
步骤3，离心：将灭酶后的沙棘蛋白酶解体系冷却，离心取上清液，即为沙棘多肽提取物；
步骤4，浓缩：用旋转蒸发器浓缩离心后的沙棘多肽提取物，浓缩溶液至浓度为45～50％；
步骤5，真空冷冻干燥：将浓缩后的沙棘多肽提取物在5℃条件下预冷，然后将其在-80℃下冷冻，用真空冷冻干燥机在-90℃下真空冷冻干燥36h，即得到沙棘蛋白肽粉末。
2.根据权利要求1所述的一种沙棘蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述的蛋白酶为酸性蛋白酶，酶解条件为温度为40～50℃、pH值为2～3、加酶量3000～5000u/g、料液比1:15～25。
3.根据权利要求2所述的一种沙棘蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述的蛋白酶为酸性蛋白酶，酶解条件为温度为50℃、pH值为3、加酶量4000u/g、料液比1:20。
4.根据权利要求1所述的一种沙棘蛋白多肽的制备方法，其特征在于，所述的沙棘蛋白为以沙棘籽粕为原料，利用醇提+碱提酸沉+酶解的提取方法制备，具体步骤为：
步骤1，原料预处理：将沙棘籽粕烘干粉碎后，过40～120目筛，优化的80目，备用；
步骤2，酶解：在步骤1得到的沙棘籽粕中，加120～360u/g纤维素酶去纤维素，优化为加240u/g纤维素酶去纤维素，使与纤维素结合的蛋白分离出来；
步骤3，醇提：将75％乙醇加入提取罐内，开启搅拌，缓慢加入沙棘籽粕粉，严禁把沙棘籽粕一并倒入提取罐，开启蒸汽加热，加热到45℃搅拌90min后离心，留沙棘籽粕沉淀；其中，所加沙棘籽粕与乙醇的料液比为1:6～14，优化为沙棘籽粕与乙醇的料液比为1:12；
步骤4，减解：
S1，第一次减提：将步骤1预处理过的沙棘籽粕与水按1：8～16的料液比加入另一提取罐内，开启搅拌，缓慢加入醇提离心后的沙棘籽粕沉淀，搅拌均匀；开启蒸汽加热，加热到30～70℃时缓慢加入20％NaOH水溶液，调pH至8～12搅拌，在反应过程中，及时监控pH的变化情况，及时加碱调pH至8～12，离心留上清液，沙棘籽粕沉淀用于第二次碱提，其中减提时间为20～60min；
S2，第二次减提：依照步骤S1的方法对沙棘籽粕沉淀进行第二次碱提，离心后将两次上清液混合在一起；
其中，上述减提步骤中，沙棘籽粕原料与水的料液比为1:10～14；蒸汽加热的加热温度为40～50℃；pH为10～11；减解时间为40～50min；
步骤5，酸沉：将步骤4碱提离心后的上清液加入新的提取罐中，在搅拌条件下缓慢加入乳酸，调pH至4.5；pH稳定后停止搅拌，静置6～8h，备用；
步骤6，离心：将酸沉静置后的溶液离心，取出离心后的沉淀；
步骤7，干燥、粉碎：温度在45℃以下将沙棘籽蛋白提取物烘干，粉碎烘干后的蛋白粉并且过80目筛网。
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