CN114404560A - 沙棘籽粕蛋白肽在制备用于改善肝功能的产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了沙棘籽粕蛋白肽在制备用于改善肝功能的产品中的应用，涉及生物医药技术领域。本发明发现沙棘籽粕蛋白肽其主要通过抑制谷丙转氨酶活性的活性、提高肝组织的抗氧化能力、降低肝脏的一氧化氮水平和丙二醛的含量来改善肝功能，具备安全性高、可长期服用，无副作用等特点。所述沙棘籽粕蛋白肽可用于开发改善肝功能的产品，具有广阔的医用前景和经济价值。

Description

沙棘籽粕蛋白肽在制备用于改善肝功能的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及沙棘籽粕蛋白肽在制备用于改善肝功能的产品中的应用。

背景技术

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)别名醋柳、达布尔、拉巴才尔玛等，是一种雌雄异株的落叶性胡颓子科灌木植物，主要生长于我国的华北、西南、西北等地区，在俄罗斯及印度等国家也均有分布。该植物生态适应性强，具有耐旱、耐盐碱等特点，大面积种植可以作为防风固沙及保持水土的优选物种。由于该植物自然资源丰富，因此其开发利用也备受人们的关注。其中，沙棘果是藏族和蒙古族常用药材，蒙古族《认药白晶鉴》中记述“沙棘膏具有祛肺脓肿、活血、祛巴达干之功效”，藏族医典《晶珠本草》提及到“沙棘果挖除肺病、化血并治培根病”，具有健脾消食、止咳祛痰和活血散瘀的功效。《月王药膳》认为沙棘具有“医治培根、增强体阳、开胃舒胸、饮食爽口、容易消化”等功效，在《四部医典》上载有沙棘在临床上可用于“祛痰止咳、利肺、化湿、壮阴及升阳”等，特别是《本草纲目》认为该植物“实、气味酸、温、无毒、主治久痢不瘥及心腹胀满黄瘦、下寸白虫、单捣为末，酒调服之甚效”。至今为止，沙棘果多用于治疗肺病咳嗽、脘腹胀满、痢疾等疾病，而沙棘叶在藏族药中则多用于治疗诸热、胆热、隐热、火烧伤、瘟病和时疫等。1977年，国家卫生部将沙棘纳入《中国药典》。沙棘因富含营养物质和生物活性成分，又为药食同源植物，因此其果实和种子已在食用、药用等方面被广泛利用。近年来的研究证明，沙棘籽提取油脂后的籽粕蛋白含量丰富，是具有较好的营养价值的优质植物蛋白资源，也沙棘活性物质之一，因此对沙棘籽蛋白及籽粕蛋白来源的生物活性肽的研究和应用开发是十分有必要的。

生物活性肽是由天然氨基酸按不同的序列和数量组合而成，而氨基酸序列构成决定其生物活性。目前，生物活性肽的制备方法主要包括生物发酵法、控制酶解法、定向合成法和直接从微生物及动植物中提取、分离纯化等多种方法。合成法包括液相法、天然化学连接法、固相多肽合成法，酶合成法、DNA重组技术等。但定向合成法技术尚不成熟，成本较高，实现工业化生产难度较大。发酵法主要是利用乳酸菌、曲霉菌等一些微生物发酵过程中产生的蛋白酶水解蛋白质产生活性肽。控制酶解法制备的生物活性肽不仅安全性高、且酶解过程易于控制、水解条件温和，是生产生物活性肽的常用方法。

肝炎是全球性流行疾病，其影响范围广，患病人数多且致病因素多样。肝炎大致可分为乙型肝炎(Hepatitis B virus，HBV)、丙型肝炎(Hepatitis C virus，HCV)和丁型肝炎(Hepatitis D virus，HDV)等病毒性肝炎以及血汲虫病等感染性肝炎；也包括肝豆状核变性、血色病及α1-抗胰蛋白酶缺乏症等先天性代谢缺陷性肝功能障碍；也有慢性酒精性肝病、慢性药物性肝病及化学代谢缺陷等诱发的肝损伤；此外，自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎等也备受人们关注。生活压力的不断增大，加上饮酒、吸烟等习惯及其他环境与遗传因素，肝炎易发展成为肝硬化乃至肝癌，因此开发具有改善肝功能的产品备受人们关注。

发明内容

本发明的目的在于提供沙棘籽粕蛋白肽在制备用于改善肝功能的产品中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：沙棘籽粕蛋白肽在制备用于改善肝功能的产品中的应用。

沙棘籽粕是沙棘籽经过亚临界低温萃取油脂后的固体物，沙棘籽粕中含有丰富的蛋白质、黄体酮和多种微量元素。研究表明，长期食用沙棘籽粕安全可靠，无蓄积性毒害，亦无致癌或促发肿瘤作用，可促进免疫器官生长发育，提高机体抗病能力，并可治疗犊牛腹泻、卡他性肠炎、肠痉挛、皮疹、风湿病。但目前未见其具有改善肝功能的功效的报道。

发明人在研究中意外发现沙棘籽粕蛋白肽可用于减轻、改善及治疗因肝损伤继发的各种临床症状，其具备安全性高、可长期服用，无副作用等特点。因此，沙棘籽粕蛋白肽可用于开发改善肝功能的药物，具有广阔的医用前景和经济价值。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述沙棘籽粕蛋白肽在产品中的质量含量为0.001～100％。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述的沙棘籽粕蛋白肽的制备方法在沙棘籽粕蛋白溶液中加入胰蛋白酶进行酶解，并用分子量为10kDa的滤膜超滤，得所述沙棘籽粕蛋白肽。

本发明还提供沙棘籽粕蛋白肽在制备用于改善肝功能相关指标的药物中的应用。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述改善肝功能相关指标为抑制谷丙转氨酶活性的活性。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述改善肝功能相关指标还包括提高肝组织的抗氧化能力、降低肝脏中一氧化氮的含量和降低肝脏中丙二醛的含量。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物的使用剂量为每千克体重使用该药物100～500mg。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物经口服或静脉注射的形式给药。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述的经口服给药的药物的剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、浸膏剂或糖浆剂中的任一种。

本发明还提供沙棘籽粕蛋白肽在制备用于改善免疫性肝炎的产品中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供的沙棘籽粕蛋白肽在制备用于改善肝功能的产品中的应用，其主要通过抑制谷丙转氨酶活性的活性、提高肝组织的抗氧化能力、降低肝脏的一氧化氮水平和丙二醛的含量来改善肝功能；本发明不仅为制备改善肝功能的产品提供了一种新来源，同时也发掘出了沙棘籽粕蛋白肽新的药用价值。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1沙棘籽粕蛋白制备方法

本实施例的一种沙棘籽粕蛋白制备方法，包括以下步骤：

(1)称取100g脱脂沙棘籽粕粉末，加入9倍重量份的水溶解，调节溶液pH至11，于37℃提取40min，重复提取3次，8000×g离心25min，收集上清液，调节上清液pH为5.0，按照原料重量百分比0.2％的量加入植酸酶，酶解3h，8000×g离心并收集沉淀，将沉淀加水复溶,调节pH至7.0后冷冻干燥，得沙棘籽粕蛋白；

(2)用步骤(1)的沙棘籽粕蛋白配制溶液，调节溶液pH至11，加入0.2％的胰蛋白酶，于50℃进行酶解，酶解结束后将溶液离心，取上清液，得蛋白酶解液；

(3)将步骤(2)的沙棘籽粕蛋白酶解液经分子量为10kDa及3kDa的聚醚砜超滤膜超滤，得所述沙棘籽粕蛋白肽。

实施例2

本实施例对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白、沙棘籽粕蛋白酶解液和沙棘籽粕蛋白肽的分析鉴定

(1)采用凯氏定氮法对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白的蛋白质含量进行测定，测定结果如表1所示。

(2)对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白和沙棘籽粕蛋白酶解液进行氨基酸含量分析，沙棘蛋白酶解液的氨基酸含量测定结果如表2所示。

(3)对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白和沙棘籽粕蛋白酶解液的分子量大小进行测定，测定结果如表3所示。

(4)采用HPLC/MS/MS方法对实施例1制备得到的沙棘籽粕蛋白肽的氨基酸序列进行鉴定，结果如表4所示。

表1沙棘籽粕蛋白的提取率及蛋白含量

表2沙棘籽粕蛋白及蛋白酶解产物中氨基酸含量(g/100g)

由表2可知，谷氨酸，精氨酸等为沙棘籽粕蛋白的主要氨基酸，其次为天冬氨酸及亮氨酸，沙棘籽粕提取蛋白的酸性氨基酸含量相对较高，说明沙棘籽粕蛋白在自然条件下呈酸性，与其等电点结果相一致。酶解前和酶解后的氨基酸种类相同，酶解之后的水解氨基酸总量降低，这可能由于酶解过程中，部分肽段因相互作用而聚集形成沉淀。

表3沙棘蛋白及酶解液的肽分子量分布

由表3可知，本发明中胰蛋白酶酶解沙棘籽粕蛋白的肽分子量分布的结果显示，沙棘籽粕蛋白原料的分子量较大，而经过酶解之后，分子量明显降低。胰蛋白酶酶解之后的肽分子量大多在5kDa～10kDa之间，且具有较多的大分子量的肽段。

表4 HPLC-MS/MS分析结果

由表4可知，共52个肽序列，其中二肽有14个(约占26.92％)，三肽有20个(约占38.46％)，四肽有13个(约占25％)，五肽有3个(约占5.76％)，六肽和八肽各有1个，肽中含有精氨酸基团为24个，且90％以上的精氨酸在碳端。

实施例3沙棘籽粕蛋白肽对肝功能的改善作用

本实施例对实施例1制备的沙棘籽粕蛋白肽对痤疮丙酸杆菌和脂多糖诱发的免疫性肝炎的改善作用进行测定和评价。

(1)实验方法：

a.本实施例的小鼠为雄性7周龄昆明小鼠，洁净级饲养条件：23±2℃，湿度55±5％，换气次数12～15次/小时，照明时间12小时/天(7:00～19:00)，5只/饲养笼(235×325×170H mm)，饲育条件：固体饲料(广东省医学实验动物中心)，自由饮食，适应性饲养一周后进行实验。将实验小鼠随机分组，每组10只，除对照组小鼠外，其他组小鼠均经尾静脉注射20mg/kg热灭活P.acnes生理盐水溶液。其中对照组：每天一次连续7天以同体积的生理盐水灌胃；模型组：于P.acnes负荷前一天起每天一次连续7天以同体积的生理盐水灌胃，末次灌胃在LPS注射30分钟前；小鼠给予同体积的生理盐水；阳性药组：从P.acnes负荷后一天起隔天腹腔注射环孢菌素A；沙棘籽粕蛋白组：于P.acnes负荷前一天起每天一次连续7天以100mg/kg的沙棘籽粕蛋白溶液灌胃，末次灌胃在LPS注射30分钟前；棘籽粕蛋白肽低剂量组：于P.acnes负荷前一天起每天一次连续7天以50mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃，末次灌胃在LPS注射30分钟前；棘籽粕蛋白肽中剂量组：于P.acnes负荷前一天起每天一次连续7天以100mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃，末次灌胃在LPS注射30分钟前；棘籽粕蛋白肽高剂量组：于P.acnes负荷前一天起每天一次连续7天以200mg/kg的沙棘籽粕蛋白肽溶液灌胃，末次灌胃在LPS注射30分钟前。

b.P.acnes负荷5天后尾静脉注射5μg/kg LPS-PBS溶液，诱发小鼠肝炎，对照组小鼠则给予同体积的生理盐水及PBS溶液。LPS给药5小时后，麻醉小鼠，经心脏取血并进行离心，采用赖氏法测定血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性。同时，于冰上迅速摘取小鼠肝脏组织并制成组织匀浆，12,000×g离心15分钟后取上清液，用于测定NO、ORAC及MDA含量；利用Griess试剂盒进行测定NO的含量；以Trolox作为抗氧化剂测定沙棘籽粕蛋白及沙棘籽粕蛋白肽的ORAC；采用MDA试剂盒测定各组小鼠肝脏组织的MDA含量。

(2)实验结果如表5和表6所示。

表5

表6

实验结果表明，与沙棘籽粕蛋白相比，灌胃给予沙棘籽蛋白肽能够有效改善因P.acnes-LPS负荷小鼠引起的血浆ALT水平升高，同时改善肝脏NO水平、ORAC及MDA含量，提示沙棘籽粕蛋白酶降解肽具有较好的改善肝功能的活性。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.沙棘籽粕蛋白肽在制备用于改善肝功能的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述沙棘籽粕蛋白肽在产品中的质量百分比为0.001～100％。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的沙棘籽粕蛋白肽的制备方法在沙棘籽粕蛋白溶液中加入胰蛋白酶进行酶解，并用分子量为10kDa的滤膜超滤，得所述沙棘籽粕蛋白肽。

4.沙棘籽粕蛋白肽在制备用于改善肝功能相关指标的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述改善肝功能相关指标为抑制谷丙转氨酶活性的活性。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述改善肝功能相关指标还包括提高肝组织的抗氧化能力、降低肝脏中一氧化氮的含量和降低肝脏中丙二醛的含量。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物的使用剂量为每千克体重使用该药物100～500mg。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物经口服或静脉注射的形式给药。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的经口服给药的药物的剂型为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、浸膏剂或糖浆剂中的任一种。

10.沙棘籽粕蛋白肽在制备用于改善免疫性肝炎的产品中的应用。