CN109943615A - 一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物肽制备技术领域，公开了一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法。该方法包括以下步骤：脱脂南极磷虾粉与水混匀得匀浆液I；调节pH，加入酸性蛋白酶酶解，得酶解液II；调节pH，加入胰蛋白酶酶解，得酶解液III；加入风味蛋白酶酶解，得酶解液IV；灭酶，降温、离心后，取上清液，得酶解液V；加入氢氧化钙，调pH后进行脱氟，得酶解液VI；用半透膜渗析，得滤液VII；冻干处理后得活性肽干品。本发明采用分步水解法，提高小分子活性肽的得率，对酶解液进行脱氟处理，得到低氟含量的南极磷虾活性肽，提高了产物的食用安全性，采用冻干法制备活性肽产物，减少了对活性肽功能基团的破坏，有助于保持活性肽功能。

Description

一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法

技术领域

本发明涉及活性肽制备技术领域，尤其涉及一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法。

背景技术

活性肽是人体中最重要的活性物质，在人的生长发育，新陈代谢，疾病以及衰老，死亡的过程中起着关键作用。正是因为它在体内分泌量的增多或减少，才使人类有了幼年、童年、成年、老年直到死亡的周期。肽类的提取方法主要有两种，一种是化学法提取，一种是物理法提取。“化学提取法”主要是“化学酶反应提取法”，其反应快，生产量大，但缺点是提取出来的肽类活性较低，该法是市面上肽类产品的主要来源；“物理提取法”主要指“介质电容法活性肽提取技术”，其特点是反应慢，生产量小，但是生产出来的肽类具有很高的活性。

中国发明专利申请号为CN201710125769.X的专利，公开了一种雪蛤活性肽及其制备方法，其是以雪蛤为主原料，经泡发、匀浆、酶解、离心而成的雪蛤活性肽液；中草药经粉碎、蒸煮、酶解、离心而成的中药活性肽液；添加低聚异麦芽糖经复配灭菌按冻干工艺规范灌装冷冻干燥成瓶装冻干粉产品；可加纯净水按口服液生产工艺规范灌装成口服液产品；将混合肽液喷雾干燥或冷冻干燥制备成粉末状颗粒，按胶囊生产工艺规范灌装成胶囊产品。该制备工艺严谨合理，操作性强，适合规模化生产。然而，该方法获得的小分子活性肽的得率较低。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法。本发明采用分步水解法，可以降低酶解产物活性肽的分子量，提高小分子活性肽的得率，对酶解液进行了脱氟处理，得到低氟含量的南极磷虾活性肽，提高产物的食用安全性，并且采用冻干法制备活性肽产物，减少了对活性肽功能基团的破坏，有助于保持活性肽功能。

本发明的具体技术方案为：一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法，包括以下步骤：

(1)脱脂南极磷虾粉与水混匀得到匀浆液I；

(2)用磷酸溶液调节匀浆液I的pH，预热后加入酸性蛋白酶，酶解后得到酶解液II；

(3)用氢氧化钠溶液调节酶解液II的pH，加入胰蛋白酶，酶解后得到酶解液III；

(4)向酶解液III中加入风味蛋白酶，酶解后得到酶解液IV；

(5)对酶解液IV进行灭酶，降温、离心后，取上清液，得到酶解液V；

(6)酶解液V中加入氢氧化钙，用磷酸溶液调pH后进行脱氟，得到酶解液VI；

(7)酶解液VI用半透膜渗析，得到滤液VII；

(8)对滤液VII进行冻干处理，得到活性肽干品。

磷虾是人们今天已经发现的含蛋白质最高的生物，蛋白质含量达百分之五十以上，而且还富含人体组织所必需的氨基酸和维生素A。每十只磷虾所含的蛋白质就可以同两百克烤肉的营养价值相当。南极磷虾肉中含蛋白质17.56％，脂肪2.11％，且含人体所必需的全部氨基酸。人体所必需的8种氨基酸，磷虾中均有，且合起来占蛋白质含量的41.04％。本发明采用分步水解法，首先采用酸性蛋白酶，有助于南极磷虾粉中虾壳成分的酶解；结合胰蛋白酶和风味蛋白酶，可以降低酶解产物活性肽的分子量，提高小分子活性肽的得率，并对酶解液进行了脱氟处理，得到低氟含量的南极磷虾活性肽，提高产物的食用安全性，同时采用冻干法制备活性肽产物，减少了对活性肽功能基团的破坏，有助于保持活性肽功能。

作为优选，步骤(1)中，所述脱脂南极磷虾粉与水的质量比为1:2～3。脱脂南极磷虾粉与水的质量比为1:2～3时，在进行酶解时能够具有合适的底物浓度。

作为优选，步骤(2)中，所述磷酸溶液的浓度为1.5～2.5M，所述匀浆液I的pH调节至3.0～3.5，预热至40～45℃，匀浆液I中酸性蛋白酶的浓度为500～1000U/g，所述酶解为在40～45℃酶解2～3h。

酸性蛋白酶能将脱脂南极磷虾粉中的蛋白质水解成分子量较小的肽。首先在pH较低的条件下用酸性蛋白酶进行酶解，有助于将脱脂南极磷虾粉中的虾壳成分酶解，有助于释放其中的壳聚糖。

作为优选，步骤(3)中，所述氢氧化钠溶液的浓度为1.5～2.5M，所述酶解液II的pH调节至7.0～7.5，酶解液II中胰蛋白酶的浓度为40～80U/g，所述酶解为在45～50℃酶解2～3h。

胰蛋白酶是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，可切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。胰蛋白酶能够将脱脂南极磷虾粉连在一起的细胞表面的具有粘性的蛋白水解掉，使得细胞分散开来，促进细胞中蛋白质的水解。

作为优选，步骤(4)中，所述酶解液III中风味蛋白酶的浓度为150～300U/g，所述酶解为在45～50℃酶解1～2h。

蛋白质在水解过程中，其结构会发生一系列明显的变化，具体表现为肽链被切断，生成分子量不等的多肽，同时一些原来包含在蛋白质内部的疏水性氨基酸被暴露出来，当这些疏水性氨基酸与舌上的苦味受体(味蕾)接触时便会呈现苦味。这些呈现苦味的肽被称为苦味肽，其苦味程度与其疏水度、氨基酸的位置以及苦味肽的空间结构有关。在一定温度，pH及底物浓度下，风味蛋白酶中的外切酶和酶解液中的苦味多肽蛋白质发生反应，生成水解动物蛋白，然后这些水解物和氨基酸一起与还原糖发生美拉德反应，产生各种不同风味的天然香气和味道。因此，风味蛋白酶能够避免和去除水解造成的苦肽链，使其最终降解为氨基酸和小分子多肽，同时增进和改善水解液的风味。

作为优选，步骤(5)中，所述灭酶为在90～95℃灭酶10～15min，降温至50℃以下，3000～5000rpm离心7～14min。

当酶将南极磷虾粉降解至一定分子量的小分子肽时，需要对酶解液进行灭酶处理，防止小分子肽的进一步降解。本发明的灭酶处理方法在灭酶的同时不会使小分子活性肽失活。在本发明的处理条件下，大分子量的酶的结构发生不可逆的改变，导致酶失活，而由于小分子活性肽的分子链较短，在该处理条件下，小分子活性肽不会发生不可逆的改变，因此能够良好的保存小分子活性肽的活性。

作为优选，步骤(6)中，所述氢氧化钙与酶解液V的质量体积比为1:150～250，所述磷酸溶液的浓度为1.5～2.5M，酶解液V的pH调节至6～7；所述脱氟为在40～45℃，搅拌子转速为100～200rpm，反应时间50～70min。

本发明采用氢氧化钙对酶解液中的氟进行沉淀脱除，本发明的脱氟处理方法脱氟效果好，处理后酶解液中的氟含量符合安全标准。

作为优选，步骤(7)中，所述半透膜的截留分子量为2000～3000Da。

利用半透膜将小分子活性肽从酶解液中分离出来，使得小分子活性肽得到纯化。

作为优选，步骤(8)中，所述冻干处理为在真空度为10～20MPa、温度为-30～-20℃条件下冷冻干燥15～24h。

传统的干燥会引起材料皱缩，破坏细胞。而先将食品的湿原料冻结至冰点之下，使原料中的水分变为固态冰，然后在适当的真空环境下，将冰直接转化为蒸汽而除去，再用真空系统中的水汽凝结器将水蒸汽冷凝，从而使物料得到干燥。采用本发明的冷冻干燥处理参数对酶解液进行干燥，得到的活性肽干品中的水分含量低于8％。冻干处理在冰冻干燥的过程中样品的结构不会被破坏，因为固体成份被在其位子上的坚冰支持着。在冰升华时，在干燥的剩余物质里会留下孔隙。这样就保留了产品的生物和化学结构及其活性的完整性。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：

1.本发明采用分步水解法，首先采用酸性蛋白酶，有助于南极磷虾粉中虾壳成分的酶解；结合胰蛋白酶和风味蛋白酶，可以降低酶解产物活性肽的分子量，提高小分子活性肽的得率。

2.本发明对酶解液进行了脱氟处理，得到低氟含量的南极磷虾活性肽，提高产物的食用安全性。

3.本发明采用冻干法制备活性肽产物，减少了对活性肽功能基团的破坏，有助于保持活性肽功能。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。在本发明中所涉及的装置、连接结构和方法，若无特指，均为本领域公知的装置、连接结构和方法。

实施例1

一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法，包括以下步骤：

(1)脱脂南极磷虾粉与水以质量比为1:3的比例混匀得到匀浆液I；

(2)用浓度为2M磷酸溶液调节匀浆液I的pH至3.2，预热至42℃后加入胃蛋白酶，匀浆液I中胃蛋白酶的浓度为600U/g，42℃酶解3h后得到酶解液II；

(3)用浓度为2M氢氧化钠溶液调节酶解液II的pH至7.2，加入胰蛋白酶，酶解液II中胰蛋白酶的浓度为50U/g，在47℃酶解3h后得到酶解液III；

(4)向酶解液III中加入风味蛋白酶，酶解液III中风味蛋白酶的浓度为150U/g，在47℃酶解1h后得到酶解液IV；

(5)对酶解液IV在92℃灭酶10min，降温至49℃、4000rpm离心10min后，取上清液，得到酶解液V；

(6)酶解液V中加入氢氧化钙，所述氢氧化钙与酶解液V的质量体积比为1:200，用浓度为2M的磷酸溶液调pH至6.5后在42℃、搅拌子转速为150rpm脱氟60min，得到酶解液VI；

(7)酶解液VI用2500Da的半透膜渗析，得到滤液VII；

(8)对滤液VII在真空度为15MPa、温度为-25℃条件下冷冻干燥20h，得到活性肽干品。

实施例2

一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法，包括以下步骤：

(1)脱脂南极磷虾粉与水以质量比为1:2.5的比例混匀得到匀浆液I；

(2)用浓度为2.5M磷酸溶液调节匀浆液I的pH至3.5，预热至45℃后加入木瓜蛋白酶，匀浆液I中木瓜蛋白酶的浓度为500U/g，45℃酶解2.5h后得到酶解液II；

(3)用浓度为2.5M氢氧化钠溶液调节酶解液II的pH至7.5，加入胰蛋白酶，酶解液II中胰蛋白酶的浓度为80U/g，在50℃酶解2.5h后得到酶解液III；

(4)向酶解液III中加入风味蛋白酶，酶解液III中风味蛋白酶的浓度为220U/g，在50℃酶解1.5h后得到酶解液IV；

(5)对酶解液IV在95℃灭酶12min，降温至40℃、5000rpm离心7min后，取上清液，得到酶解液V；

(6)酶解液V中加入氢氧化钙，所述氢氧化钙与酶解液V的质量体积比为1:250，用浓度为2.5M的磷酸溶液调pH至7后在45℃、搅拌子转速为200rpm脱氟50min，得到酶解液VI；

(7)酶解液VI用3000Da的半透膜渗析，得到滤液VII；

(8)对滤液VII在真空度为10MPa、温度为-30℃条件下冷冻干燥24h，得到活性肽干品。

实施例3

一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法，包括以下步骤：

(1)脱脂南极磷虾粉与水以质量比为1:2的比例混匀得到匀浆液I；

(2)用浓度为1.5M磷酸溶液调节匀浆液I的pH至3.0，预热至40℃后加入胃蛋白酶，匀浆液I中胃蛋白酶的浓度为700U/g，40℃酶解2h后得到酶解液II；

(3)用浓度为1.5M氢氧化钠溶液调节酶解液II的pH至7.0，加入胰蛋白酶，酶解液II中胰蛋白酶的浓度为80U/g，在45℃酶解2h后得到酶解液III；

(4)向酶解液III中加入风味蛋白酶，酶解液III中风味蛋白酶的浓度为220U/g，在45℃酶解2h后得到酶解液IV；

(5)对酶解液IV在90℃灭酶15min，降温至45℃、3000rpm离心14min后，取上清液，得到酶解液V；

(6)酶解液V中加入氢氧化钙，所述氢氧化钙与酶解液V的质量体积比为1:150，用浓度为1.5M的磷酸溶液调pH至6后在40℃、搅拌子转速为100rpm脱氟50min，得到酶解液VI；

(7)酶解液VI用2000Da的半透膜渗析，得到滤液VII；

(8)对滤液VII在真空度为20MPa、温度为-20℃条件下冷冻干燥15h，得到活性肽干品。

对比例1

一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法，包括以下步骤：

(1)脱脂南极磷虾粉与水以质量比为1:3的比例混匀得到匀浆液I；

(2)用浓度为2M磷酸溶液调节匀浆液I的pH至3.2，预热至42℃后加入胃蛋白酶，匀浆液I中胃蛋白酶的浓度为1000U/g，42℃酶解3h后得到酶解液II；

(3)对酶解液II在92℃灭酶10min，降温至49℃、4000rpm离心10min后，取上清液，得到酶解液III；

(4)酶解液III中加入氢氧化钙，所述氢氧化钙与酶解液V的质量体积比为1:200，用浓度为2M的磷酸溶液调pH至6.5后在42℃、搅拌子转速为150rpm脱氟60min，得到酶解液IV；

(5)酶解液IV用2500Da的半透膜渗析，得到滤液V；

(6)对滤液V在真空度为15MPa、温度为-25℃条件下冷冻干燥20h，得到活性肽干品。

对比例2

对比例2与对比例1的不同之处在于：用浓度为2M磷酸溶液调节匀浆液I的pH至7.0，预热至42℃后，用中性蛋白酶代替胃蛋白酶。其他均与对比例1相同。

对比例3

对比例3与对比例1的不同之处在于：用浓度为2M磷酸溶液调节匀浆液I的pH至12.5，预热至42℃后，用碱性蛋白酶代替胃蛋白酶。其他均与对比例1相同。

对比例4

对比例4与对比例1的不同之处在于：用浓度为2M磷酸溶液调节匀浆液I的pH至7.0，预热至42℃后，用复配蛋白酶代替胃蛋白酶，复配蛋白酶包括质量比为75:6:22的胃蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶。其他均与对比例1相同。

对比例5

对比例5与实施例1的不同之处在于：对滤液VII在真空度为9MPa、温度为-18℃条件下冷冻干燥24h。其他均与实施例1相同。

对比例6

对比例6与实施例1的不同之处在于：将滤液VII在70℃干燥8h，得到活性肽干品。其他均与实施例1相同。

将实施例1～3和对比例1～6制得小分子活性肽的收率、氟含量及其活性进行检测，结果见表1。

脱氟前氟含量为采用氢氧化钙按照本专利描述的方法对酶解液处理前后的氟含量。小分子活性肽的活性用DPPH自由基清除率表示。DPPH自由基清除率为采用表中所列酶解制备的活性肽溶解于水中，浓度为10mg/mL时，对DPPH自由基的清除率。

表1

由表1可以看出，本发明采用分布酶解的方法对南极磷虾粉进行水解，小分子肽的得率较高；通过对酶解液进行脱氟处理后，酶解液中的氟含量大幅度降低，提高了食用安全性；采用冻干法制备活性肽，活性肽对DPPH自由基清除率较高，说明得到的活性肽具有较高的活性。采用实施例1中等量的酶复配得到的复配蛋白酶对南极磷虾粉进行一步酶解，小分子活性肽的收率较实施例1明显下降，且活性肽的活性也有所降低。分别用等量的酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶代替复配蛋白酶，对南极磷虾粉进行一步酶解，小分子肽的收率进一步降低，且活性肽的活性也进一步降低。在超出本发明限定的冷冻干燥参数范围的条件下对酶解液进行冷冻干燥，发现所得到的活性肽的活性与实施例1相比有明显的降低。采用常规的干燥手段，将酶解液在70℃干燥8h得到的活性肽干品的活性与实施例1得到的活性肽干品的活性具有较大的差别，主要原因在于，冷冻干燥能够较好的保存活性肽的物理、化学结构，减少对活性肽官能团的破坏；而在70℃进行常规的干燥后，活性肽的结构被破坏，得到的活性肽干品的活性较低。

以上所述，仅是发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (9)

1.一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）脱脂南极磷虾粉与水混匀得到匀浆液I；

（2）用磷酸溶液调节匀浆液I的pH，预热后加入酸性蛋白酶，酶解后得到酶解液II；

（3）用氢氧化钠溶液调节酶解液II的pH，加入胰蛋白酶，酶解后得到酶解液III；

（4）向酶解液III中加入风味蛋白酶，酶解后得到酶解液IV；

（5）对酶解液IV进行灭酶，降温、离心后，取上清液，得到酶解液V；

（6）酶解液V中加入氢氧化钙，用磷酸溶液调pH后进行脱氟，得到酶解液VI；

（7）酶解液VI用半透膜渗析，得到滤液VII；

（8）对滤液VII进行冻干处理，得到活性肽干品。

2.如权利要求1所述的一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述脱脂南极磷虾粉与水的质量比为1:2~3。

3.如权利要求1或2所述的一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述磷酸溶液的浓度为1.5~2.5M，所述匀浆液I的pH调节至3.0~3.5，预热至40~45℃，匀浆液I中酸性蛋白酶的浓度为500~1000U/g，所述酶解为在40~45℃酶解2~3h。

4.如权利要求3所述的一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述氢氧化钠溶液的浓度为1.5~2.5M，所述酶解液II的pH调节至7.0~7.5，酶解液II中胰蛋白酶的浓度为40~80U/g，所述酶解为在45~50℃酶解2~3h。

5.如权利要求1或4所述的一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述酶解液III中风味蛋白酶的浓度为150~300U/g，所述酶解为在45~50℃酶解1~2h。

6.如权利要求1所述的一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法，其特征在于：步骤（5）中，所述灭酶为在90~95℃灭酶10~15min，降温至50℃以下，3000~5000rpm离心7~14min。

7.如权利要求1所述的一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法，其特征在于：步骤（6）中，所述氢氧化钙与酶解液V的质量体积比为1:150~250，所述磷酸溶液的浓度为1.5~2.5M，酶解液V的pH调节至6~7；所述脱氟为在40~45℃，搅拌子转速为100~200rpm，反应时间50~70min。

8.如权利要求1所述的一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法，其特征在于：步骤（7）中，所述半透膜的截留分子量为2000~3000Da。

9.如权利要求5所述的一种利用南极磷虾粉制备活性肽的方法，其特征在于：步骤（8）中，所述冻干处理为在真空度为10~20MPa、温度为-30~-20℃条件下冷冻干燥15~24h。