CN112342260A - 一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法及其产品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法及其产品，方法的步骤为：脱脂南极磷虾粉溶于pH6.5～7.5的磷酸缓冲液得脱脂南极磷虾粉溶液；将脱脂南极磷虾粉溶液超声波处理，而后加入包括内切酶、外切酶和风味酶的复合蛋白酶，摇匀得酶解体系；酶解体系在pH6.5～7.5的条件下酶解；将酶解产物灭酶后冷却、离心，取上清液即为分子量3000u以下多肽占比≥90％的酶解液；对酶解液依次进行超滤、浓缩、干燥即得脱脂南极磷虾粉降血糖肽。本发明的方法，采用特定的复合蛋白酶实现了对脱脂南极磷虾粉蛋白的针对性酶切，不仅提高产品的降血糖效果，而且提高了产品收率，同时工艺简单，生产效率高，极具应用前景。

Description

一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法及其产品
技术领域
本发明属于降血糖肽制备技术领域，涉及一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法及其产品，特别涉及一种利用超声波辅助蛋白质酶解技术以脱脂南极磷虾粉为原料制备降血糖肽的方法及其产品。
背景技术
糖尿病是一种严重威胁人类健康的疾病，主要特征是由胰高血糖素或胰岛素缺乏或两者都有导致身体中糖分代谢混乱，并伴有脂肪、蛋白质、水、电解质等代谢障碍。根据世界卫生组织统计，全球约有4亿多人饱受糖尿病痛苦的折磨，我国糖尿病人约占全世界糖尿病人口的三分之一。由于该疾病的复杂发病机制和众多影响因素，目前尚无有效的防治措施。
二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV)是一种非常稳定的在细胞表面的丝氨酸蛋白酶，在肠中高度表达，部分以可溶形式存在于循环血液中，作用于组织和器官。DPP-IV也可以作用于生理激素，如胰高血糖素样肽(GLP-1)等，目前的研究发现，GLP-1可通过结合相应的受体来减缓胃排空，抑制食欲，增加胰岛素的分泌和降低胰高血糖素的分泌。抑制DPP-IV的活性可以促进胰岛素分泌，从而降低体内的血糖浓度。近十年来，DPP-IV抑制肽得到普遍的认可，具有较好的辅助降糖作用，因此开发一种具有DPP-IV抑制活性的降血糖肽具有很大的应用价值。
南极磷虾被喻为“人类未来的蛋白资源仓库”。南极磷虾氨基酸种类齐全，富含成人所需的8种必需氨基酸及婴儿所需的9种必需氨基酸。以干重计南极磷虾肌肉组织中氨基酸总量约达57.21％，必需氨基酸占总氨基酸含量约40.2％，富含活性物质和药用原料，因此对其活性物质进行功能研究和开发利用具有实际意义。目前，研究人员已经从南极磷虾体内提取了磷虾油、蛋白水解酶、磷虾肽等物质，其中南极磷虾蛋白肽的开发空间巨大，但是其利用尚不够广泛，因而需要进一步开发研究。
因此，开发一种基于南极磷虾制备降血糖肽的方法极具现实意义。
发明内容
本发明的目的在于克服目前针对南极磷虾开发不充分的缺陷，提供一种基于南极磷虾制备降血糖肽的方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，包括如下步骤：
(1)将脱脂南极磷虾粉溶于pH6.5～7.5的磷酸缓冲液制得脱脂南极磷虾粉溶液；
(2)将脱脂南极磷虾粉溶液超声波处理(辅助酶解)，而后加入复合蛋白酶，摇匀即得酶解体系，所述复合蛋白酶包括内切酶、外切酶和风味酶；
(3)所述酶解体系在pH保持在6.5～7.5的条件下酶解得到酶解产物；
(4)将所述酶解产物灭酶后冷却、离心，取上清液即为酶解液，所述酶解液中相对分子质量小于3000u的多肽占比≥90％；
(5)对所述酶解液依次进行超滤、浓缩、干燥即得脱脂南极磷虾粉降血糖肽。
本发明的一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，采用特定的复合蛋白酶实现了对脱脂南极磷虾粉蛋白的针对性酶切，能够将脱脂南极磷虾粉蛋白酶解为分子量3000u以下且含有DPP-IV抑制肽的多肽，这不仅能够大大提高最终产品(脱脂南极磷虾粉降血糖肽)的降血糖效果，而且大大提高了产品收率(超滤处理正是滤除酶解产物中分子量较大的产物)，其在实现靶向酶切的同时还大大提高了酶解效率，为南极磷虾→降血糖肽提供了整套可靠的制备工艺。此外，本发明还采用超声波等技术手段辅助酶解，能够大大缩短工艺所需时长，提高生产效率便于工业化生产。同时，本发明的工艺条件简单，设备要求低，极具应用前景。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，步骤(1)中，所述脱脂南极磷虾粉蛋白和磷酸缓冲液的料液比为1g:4～8mL。本发明的保护范围并不仅限于此，此处仅给出一种可行的技术方案而已，料液比本领域技术人员可根据实际情况在一定范围内调整但调整幅度不宜过大，料液比过大，脱脂南极磷虾粉不能完全被酶酶解，造成原料浪费；料液比过小，过量的溶剂添加使酶浓度降低，影响酶与底物的充分结合，降低酶解效率。
如上所述的一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，步骤(2)中，所述复合蛋白酶的添加量是脱脂南极磷虾粉质量的6～8％。复合蛋白酶的添加量本领域技术人员可根据实际情况在一定范围内进行调整但调整幅度不宜过大，复合蛋白酶的添加量过多，造成复合蛋白酶的浪费，大大增大了成本，复合蛋白酶的添加量过少，脱脂南极磷虾粉蛋白难以充分酶解。
如上所述的一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，步骤(2)中，所述超声波处理的功率为240～600W，时长为5～20min。
如上所述的一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，步骤(3)中，所述酶解体系是在恒温磁力搅拌的条件下发生酶解反应的；
所述酶解反应的温度为45～60℃，时长为5～7h。酶解反应的具体条件本领域技术人员可根据实际情况在一定范围内进行调整但调整幅度不宜过大，酶解反应温度过高，酶逐渐失去活性，酶解速度变慢，酶解液中释放的多肽量减少，DPP-IV抑制率逐渐减小。酶解反应温度过低，酶活性较小，酶解速度较慢，降低酶解效率。酶解反应时间过长，酶液中的多肽会被进一步水解，抑制肽的数量也随之减少。酶解反应时间过短，底物难于被酶充分酶解，影响酶解液中多肽的含量。
如上所述的一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，步骤(4)中，所述灭酶为高温灭酶，其温度为90～100℃，时长为5～15min；
所述离心是在4℃下进行的，离心的转速为5000～10000rpm，时长为10～25min。
如上所述的一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，步骤(5)中，所述超滤是使用超滤膜进行操作的，超滤膜的截留分子质量为3kD。超滤膜是根据产品的实际需要进行选择的。
如上所述的一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，步骤(5)中，所述干燥为真空冷冻干燥。
本发明还提供采用如上所述的一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法制得的脱脂南极磷虾粉降血糖肽。
有益效果：
(1)本发明的利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，采用特定的复合蛋白酶实现了对脱脂南极磷虾粉蛋白的针对性酶切，能够将脱脂南极磷虾粉蛋白酶解为分子量3000u以下多肽，这不仅能够大大提高最终产品(脱脂南极磷虾粉降血糖肽)的降血糖效果，而且大大提高了产品收率(超滤处理正是滤除酶解产物中分子量较大的产物)；
(2)本发明的利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，在实现靶向酶切的同时还大大提高了酶解效率，为南极磷虾→降血糖肽提供了整套可靠的制备工艺；
(3)本发明的利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，采用超声波等技术手段辅助酶解，能够大大缩短工艺所需时长，提高生产效率便于工业化生产，同时，本发明工艺条件简单，设备要求低，极具应用前景；
(4)本发明制得的脱脂南极磷虾粉降血糖肽，降血糖活性好(相对分子质量小于3000u的蛋白质水解物达90％以上)，且其原料丰富，价格低廉，可满足市场需要的大规模工业化生产，有助于对南极磷虾的进一步开发和利用。
附图说明
图1为实施例1～3和对比例1～2所得的酶解液中分子量分布情况图；
图2为实施例1～3和对比例1～2所得脱脂南极磷虾粉降血糖肽对DPP-IV酶的抑制活性图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明，此处所描述的具体实例仅以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面为具体实施例部分。
实施例1
一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，包括如下步骤：
(1)称取5g脱脂南极磷虾粉并加入30mL pH＝7的磷酸缓冲液中，充分溶解，得到脱脂南极磷虾粉溶液；
(2)然后在步骤(1)所得的脱脂南极磷虾粉溶液利用超声波破碎仪提前处理，超声波功率为360W，10min停止超声，再加入脱脂南极磷虾粉质量的7％的复合蛋白酶(复合蛋白酶的生产厂家为天津市诺奥科技发展有限公司，型号为FH-G-NA-X，酶活力6.22×104U/g)，搅拌均匀，然后所得酶解体系于恒温磁力搅拌器中继续酶解，反应温度50℃，pH保持在7，酶解时间6h，接着将酶解液在90℃灭酶15min，10000rpm离心15min，取上清液，即为酶解液。酶解液留一部分冻干然后采用凝胶色谱法测定分子量分布，其中相对分子质量小于3000u的蛋白质水解物达98.21％。
(3)采用截留分子质量为3kD的超滤膜将步骤(2)所得酶解液进行超滤处理，接着将所得超滤液进行真空浓缩，冷冻干燥得到脱脂南极磷虾粉降血糖肽。
对所得降血糖肽进行DPP-IV抑制率分析，浓度30mg/mL的样品其对DPP-IV抑制率为66.57％，说明所制备的脱脂南极磷虾粉降血糖肽具有显著的降血糖作用。
对比例1
一种制备降血糖肽的方法，其步骤与实施例1基本相同，不同在于，其选用的蛋白酶为胰蛋白酶(胰蛋白酶的生产厂家为上海源叶生物科技有限公司，酶活力5.326×104U/g)。对其酶解液进行测试后发现，酶解液中相对分子质量小于3000u的蛋白质水解物占比为90.75％。浓度30mg/mL的样品其对DPP-IV抑制率为44.56％。
对比例2
一种制备降血糖肽的方法，其步骤与实施例1基本相同，不同在于，将脱脂南极磷虾粉替换成凡纳滨对虾虾头。对其酶解液进行测试后发现，酶解液中相对分子质量小于3000u的蛋白质水解物占比为94.5％。浓度30mg/mL的样品其对DPP-IV抑制率为1.65％。
对比实施例1和对比例1～2，可以发现，只有本申请的复合蛋白酶酶解本申请的特定对象即脱脂南极磷虾粉，能够完成靶向酶切即将蛋白酶解为相对分子质量小于3000u且含有较高DPP-IV抑制活性的多肽，进而制得降血糖肽，在大大简化了工艺的同时，提高了产品收率。
实施例2
一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，包括如下步骤：
(1)称取5g脱脂南极磷虾粉并加入40mL pH＝7的磷酸缓冲液，充分溶解，得到脱脂南极磷虾粉溶液；
(2)然后在步骤(1)所得的脱脂南极磷虾粉溶液利用超声波破碎仪提前处理，超声波功率为400W，15min停止超声。再加入脱脂南极磷虾粉质量的6％的复合蛋白酶(复合蛋白酶的生产厂家为天津市诺奥科技发展有限公司型号为FH-G-NA-X，酶活力6.22×104U/g)，搅拌均匀后，然后所得酶解体系于恒温磁力搅拌器中继续酶解，反应温度50℃，pH保持在7，酶解时间5h，接着将酶解液在100℃灭酶5min，8000rpm离心20min，取上清液，即为酶解液。酶解液留一部分冻干然后采用凝胶色谱法测定分子量分布，其中相对分子质量小于3000u的蛋白质水解物达97.72％。
(3)采用截留分子质量为3kD的超滤膜将步骤(2)所得酶解液进行超滤处理，接着将所得超滤液进行真空浓缩，冷冻干燥得到脱脂南极磷虾粉降血糖肽。
对所得降血糖肽进行DPP-IV抑制率分析，浓度30mg/mL的样品其对DPP-IV抑制率为66.28％，说明所制备的脱脂南极磷虾粉降血糖肽具有显著的降血糖作用。
实施例3
一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，包括如下步骤：
(1)称取5g脱脂南极磷虾粉并加入35mL pH＝7的磷酸缓冲液中，充分溶解，得到脱脂南极磷虾粉溶液；
(2)然后在步骤(1)所得的脱脂南极磷虾粉溶液利用超声波破碎仪提前处理，超声波辅助酶解，超声波功率为600W，20min停止超声。再加入脱脂南极磷虾粉质量的7％的复合蛋白酶(复合蛋白酶的生产厂家为天津市诺奥科技发展有限公司型号为FH-G-NA-X，酶活力6.22×104U/g)，搅拌均匀后，然后所得酶解体系于恒温磁力搅拌器中继续酶解，反应温度60℃，pH保持在7，酶解时间7h，接着将酶解液在90℃灭酶15min，10000rpm离心20min，取上清液，即为酶解液。酶解液留一部分冻干然后采用凝胶色谱法测定分子量分布，其中相对分子质量小于3000u的蛋白质水解物达98.23％，实施例1～3的相关对比示意图如图1所示。
(3)采用截留分子质量为3kD的超滤膜将步骤(2)所得酶解液进行超滤处理，接着将所得超滤液进行真空浓缩，冷冻干燥得到脱脂南极磷虾粉降血糖肽。
对所得降血糖肽进行DPP-IV抑制率分析，浓度30mg/mL的样品其对DPP-IV抑制率为62.37％(实施例1～3的DPP-IV抑制率对比示意图如图2所示)，说明所制备的脱脂南极磷虾粉降血糖肽具有显著的降血糖作用。
以上实施例及对比例中测定DPP-IV抑制率和分子量分布的方法具体如下：
DPP-IV抑制率测定
采用试剂盒法(荧光法)对DPP-IV抑制率进行测定。依次将50μL DPP-IV酶液(49μL缓冲液和1μL酶)、10μL抑制剂(样品)加入酶标板混匀，加入25μL底物启动反应。37℃孵育15min，荧光检测(激发波长360nm，发射波长460nm)。记录结果为F样品，10μL缓冲液代替10μL抑制剂(样品)为F对照。按如下计算公式得出DPP-IV抑制肽的抑制率。
抑制率＝(F对照-F样品)/F对照×100％。
分子量分布的测定
采用凝胶色谱法测定分子量分布。以细胞色素C(相对分子质量12384u)，抑肽酶(相对分子质量6511u)，杆菌肽(相对分子质量1450u)，Gly-Gly-Tyr-Arg(相对分子质量451u)，Gly-Gly-Gly(相对分子质量189u)为标准品，以各标准品的分子量与高效液相色谱法检测的各标准品的洗脱体积作标准曲线。通过比较样品的洗脱体积计算样品的分子量分布。高效液相色谱条件：色谱柱TSK-GEL G2000 SWxl 7.8mm×300mm，进样量10μL，检测波长220nm，温度30℃，流动相为乙腈:水:三氟乙酸＝45:55:0.1，流速0.5mL/min。样品过0.22μm微孔滤膜后进入仪器进行分析检测。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应该理解，这些仅是举例说明，在不违背本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。

Claims (9)

1.一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将脱脂南极磷虾粉溶于pH6.5～7.5的磷酸缓冲液制得脱脂南极磷虾粉溶液；
(2)将脱脂南极磷虾粉溶液超声波处理，而后加入复合蛋白酶，摇匀即得酶解体系，所述复合蛋白酶包括内切酶、外切酶和风味酶；
(3)所述酶解体系在pH保持在6.5～7.5的条件下酶解得到酶解产物；
(4)将所述酶解产物灭酶后冷却、离心，取上清液即为酶解液，所述酶解液中相对分子质量小于3000u的多肽占比≥90％；
(5)对所述酶解液依次进行超滤、浓缩、干燥即得脱脂南极磷虾粉降血糖肽。
2.根据权利要求1所述的一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述脱脂南极磷虾粉蛋白和磷酸缓冲液的料液比为1g:4～8mL。
3.根据权利要求1所述的一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述复合蛋白酶的添加量是脱脂南极磷虾粉质量的6～8％。
4.根据权利要求1所述的一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述超声波处理的功率为240～600W，时长为5～20min。
5.根据权利要求1所述的一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述酶解体系是在恒温磁力搅拌的条件下发生酶解反应的；
所述酶解反应的温度为45～60℃，时长为5～7h。
6.根据权利要求1所述的一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述灭酶为高温灭酶，其温度为90～100℃，时长为5～15min；
所述离心是在4℃下进行的，离心的转速为5000～10000rpm，时长为10～25min。
7.根据权利要求1所述的一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述超滤是使用超滤膜进行操作的，超滤膜的截留分子质量为3kD。
8.根据权利要求1所述的一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述干燥为真空冷冻干燥。
9.采用如权利要求1～8任一项所述的一种利用脱脂南极磷虾粉制备降血糖肽的方法制得的脱脂南极磷虾粉降血糖肽。
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