CN109258916A - 一种鱼鳞胶原肽钙及其制备方法、用途 - Google Patents

一种鱼鳞胶原肽钙及其制备方法、用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品加工技术领域，尤其涉及一种鱼鳞胶原肽钙及其制备方法、用途。本发明的制备方法不需添加外源钙，利用鱼鳞胶原和其自身钙，即可制备得到低聚胶原肽钙聚合物，该聚合物可用于牙槽骨的修复以及脱矿牙本质的再矿化，具有很好的促进作用。

Description

一种鱼鳞胶原肽钙及其制备方法、用途
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，尤其涉及一种鱼鳞胶原肽钙及其制备方法、用途。
背景技术
肽钙聚合物具有良好的促钙吸收作用。钙被称为人体必需的营养素，约占体重的1.5％，其中大部分(约99％)以磷酸钙的形式存在于骨中。人类最容易获取的钙形式是能够离子化的钙，如碳酸钙、乳酸钙和葡萄糖酸钙。然而，离子化钙的缺点是它容易在碱性肠环境中形成钙沉淀。因此，膳食钙的吸收和生物利用度严重降低。此外，钙与摄入过多的碳酸盐可能导致胃肠道副作用，包括便秘，气体，胀气，和肿胀。螯合钙已被推荐作为离子化钙的优良替代品。它克服了电离钙的两个主要限制：低浓度的低吸收和生物利用度和高水平的生物毒性。氨基酸螯合钙和肽基复合物在消化过程中始终保持可溶性pH的变化，并且是电中性的。然而，螯合物中钙的吸收取决于配体。与氨基酸相比，小肽的吸收具有消耗能量少、运输速度快等优点。酪蛋白磷酸肽(CPPS)，来自牛奶的磷酸化肽，可以与钙螯合形成可溶性和稳定的复合物，已证明能有效的促进钙吸收。因此，肽螯合钙可能是作为改善人体钙吸收的新来源。
肽钙聚合物的制备多采用酶水解蛋白多肽与外源性钙相结合的方法。酶水解是一种常用的生物活性肽的制备方法。蛋白酶的使用是水解过程中的一个非常重要的因素，因为它们产生不同分子量的水解产物，并具有不同的生物活性性质。目前已有报道用于制备钙结合肽的蛋白酶包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶和风味酶，这些蛋白水解酶是基于催化基团对肽键的羰基碳亲核攻击来选择的。目前已分离出钙螯合肽的蛋白来源包括牛奶酪蛋白、乳清蛋白、罗非鱼鱼肉、鳞片、鱼骨和鱼皮、虾、小球藻、猪血浆、牛血清、大豆、小麦胚芽等，既包括动物蛋白质也包括植物蛋白。且上述与肽结合的钙源都为易溶性的外源无机盐钙，如氯化钙、柠檬酸钙和草酸钙等，其中氯化钙采用较多。
例如在《罗非鱼鱼鳞肽钙复合物的稳定性研究》(食品工业科技，2014(4)88-90)中提到一种罗非鱼鱼鳞肽钙聚合物，其制备工艺如下：罗非鱼鱼鳞→清洗、脱盐(盐酸脱钙)粉碎→1∶10(w/v)加蒸馏水→调p H加酶酶解→灭酶→离心→上清液→加Ca Cl2→无水乙醇沉淀→离心去上清→沉淀冷冻燥→鱼鳞肽钙复合物。
因硬骨鱼鱼鳞主要有羟基磷灰石Ca10(OH)2(PO4)6和胶原纤维组成，两者共同构成高度有规律的空间排列结构。硬骨鱼的鱼鳞一般可分为两层，上层为骨质层，主要成分是羟基磷灰石，并零散地分布着一些胶原纤维；下层为纤维质层，胶原纤维在同一薄层中紧密地平行排列，且与相邻薄层中的胶原纤维成不同夹角的夹板结构。这种结构使得鱼鳞具有一定的硬度和韧性，如果不先破坏掉，蛋白很难溶出，很难进行后续的酶解。所以好多研究，如以上制备工艺方案基本是先用酸将富含胶原的材料进行脱钙处理，把钙溶出，破坏这种结构，然后采用酶将溶出的蛋白水解，获得胶原多肽，然后再加入外源CaCl2，用6-7倍体积的无水乙醇沉淀制备鱼鳞胶原肽钙聚合物，但脱去的钙没有被利用，在取得肽钙结合物的时候要消耗大量的盐酸和乙醇，都造成了一定程度的资源浪费。同时，目前肽钙功能研究主要集中在促进肠道钙吸收方面，防止骨质疏松方面，在其他方面的研究还未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是现有的制备工艺方案基本是先用酸将富含胶原的材料进行脱钙处理，然后采用酶将蛋白水解，获得胶原多肽，然后再加入外源CaCl2，用6-7倍体积的无水乙醇沉淀制备鱼鳞胶原肽钙聚合物。但脱去的钙没有被利用，在取得肽钙结合物的时候要消耗大量的盐酸和乙醇，都造成了一定程度的资源浪费。同时，目前肽钙功能研究主要集中在促进肠道钙吸收方面，防止骨质疏松方面，在其他方面的研究还未见报道。
为解决上述问题，本发明提出一种鱼鳞胶原肽钙及其制备方法、用途，通过工艺调整，利用机械力破坏掉鱼鳞的致密的结构，然后热处理变性，使得酶可以充分的接触到肽键，酶解蛋白成小分子多肽，不添加外源钙，充分利用鱼鳞胶原和其自身钙，制备低聚(肽的分子量较小)胶原肽钙聚合物，且该聚合物对牙槽骨的修复以及脱矿牙本质的再矿化有很好的促进作用。
为达到上述目的，本发明由以下技术方案实现：一种鱼鳞胶原肽钙的制备方法，由以下步骤组成：
(1)鱼鳞预处理：新鲜的鱼鳞用清水清洗，去除附着物和杂质后沥水；-20℃冷48h；解冻，加20倍的水，强力搅拌，中间换水直至鱼银粉和附着在鱼鳞上的杂蛋白去除；将脱掉银粉和杂蛋白的鱼鳞洗净晾干后采用干粉机粉碎；银粉和杂蛋白是有颜色的，如果事先不去除，会影响后期的酶解和螯合以及产品的色泽，如果放在后期分离纯化更难，而鱼鳞表面的银粉不易去除，冷冻后在强力搅拌的情况下，不需要特殊处理，银粉会因为鱼鳞间的相互摩擦而去除，且去除的较干净，不会对后续的制备造成不良影响；之后通过粉碎，在机械力作用下，鱼鳞的致密结构被破坏，便于蛋白的溶出。
(2)将鱼鳞与水按照重量比1:20的比例混合，在压力100-105kPa，进一步优选为101.33kPa、温度120℃的条件下处理50-70min，进一步优化为处理1h；在热处理的条件下能够使得鱼鳞胶原纤维吸水溶胀，及变性溶出，以利于后期的酶解；
(3)将热处理后的混合物降温至50℃，加入A.S.1398酶，添加量为质量比5％-7％，进一步优选为6％，酶解2-4h，进一步优选为3h；在酶解时不断加酸并搅拌至pH开始下降；
(4)鳌合：将步骤(3)的酶解液进行离心，取上清液用NaOH微调pH至6-7，进一步优化为微调pH至6.5，在45-55℃条件下，进一步优化为在50℃条件下螯合1h，此时肽的羧基与钙形成配位键从而螯合形成胶原肽钙。
(5)吸附、洗脱：过非极性大孔吸附树脂柱吸附后用蒸馏水洗脱，收集洗脱液；
(6)脱盐：采用凝胶过滤色谱G10脱盐之后冷冻干燥，得肽钙聚合物。
进一步的，步骤(2)的热处理方式为高温蒸熟或微波加热。
进一步的，步骤(3)在酶解时不断加入0.5mol/L的盐酸或醋酸、柠檬酸中的一种。
进一步的，步骤(4)的离心条件为10000×g离心30min。
进一步的，步骤(5)用水洗脱之后再用70％的乙醇洗脱得到没有聚合的肽段，回收利用。
本发明还保护一种采用上述制备方法制成鱼鳞胶原肽钙，其分子量分布范围主要在1200-200之间
另外，我国正步入老龄化社会，年龄的增大和伴随发生的疾病将导致大量的骨缺损重建需求，其中因牙缺失导致的骨缺损问题在国人口腔中普遍存在，第三次全国口腔流行病学调查结果发现：35～44岁年龄段人群有牙齿缺失的为37.0％，平均缺牙两颗：65～74岁老年人有牙缺失的为86.1％,平均牙缺失11颗，缺牙患者常伴有不同程度的牙槽骨缺损，将严重影响种植修复的成功率,需用植骨材料进行骨修复重建。目前引导骨组织再生技术(Guided Bone Regeneration，GBR)作为一种创伤小、引导成骨效果好的术式已经广泛应用于临床，并随着种植修复的发展GBR得到了更广泛的应用。来源于哺乳动物的骨诱导材料-羟基磷灰石虽然表现出了比较好的生物相容性，但又存在不易吸收、人畜共患传染病、宗教文化、价格昂贵等问题，因此，选取好的骨替代材料成为了现在研究的重点。
引起牙槽骨缺损或缺失的口腔局部原因主要包括在牙槽突部位实施外科手术时引起局部组织过度或意外损伤、拔牙后牙槽骨废用性吸收、牙源性炎症及牙外伤、颌骨囊肿及肿瘤。其中，牙外伤及牙源性炎症是引起牙槽骨缺损或缺失的最常见因素，而牙槽骨缺损是制约种植成功的一个重要因素。现阶段临床所用生物骨材料种类繁多，有自体骨，异种骨，组织工程化骨，人工骨替代材料等。其中人工骨替代材料已成为发展趋势，是因为其能克服自体骨以及同种异体的骨移植的缺点。目前有研究报道的骨替代品有：天然和合成生物可降解聚合物(如：胶原蛋白、纤维蛋白、明胶、淀粉、透明质酸酸或壳聚糖等)、陶瓷、生物玻璃、金属和复合材料等富含钙或易于与钙结合的材料。
L.B.Rocha等用具有骨诱导作用的胶原蛋白支架用于大鼠骨缺损的治疗显示，阴离子胶原蛋白能够促进大鼠骨缺损处骨的愈合。研究表明牙周膜细胞的募集、增殖及向成骨细胞的分化是牙槽骨缺损区域形成新骨的主要机制。刘超等研究发现水解罗非鱼胶原能促进人牙周膜细胞的增殖，使成骨分化相关基因ALP、COLI、OCN和RUNX2的基因上调,诱导骨钙蛋白的产生，这些生物效应与水解罗非鱼胶原可激活整合素-ERK信号通路有关。有此可见，胶原蛋白多肽也具有潜在的骨诱导性。
本方法制备的鱼鳞胶原肽钙聚合物能够阻止牙缺损引起的牙槽骨吸收，促进骨细胞的生张和分化。其还可以促进离体脱矿牙本质再矿化，表面形成以羟基磷灰石为主的矿物质沉积。因此，本发明还保护一种上述鱼鳞胶原肽钙的用途，用于牙槽骨的修复以及脱矿牙本质的再矿化。
本发明的有益效果在于：
1、利用鱼鳞本身的钙源，无需添加外源钙制备得到了低聚胶原肽钙聚合物。
2、在制备过程中无需采用大量的盐酸对鱼鳞进行脱钙处理，因而节省了酸的使用量；同时从采用蒸馏水洗脱，降低了乙醇的使用量，节省了资源。
3、蒸馏水洗脱后可用70％的乙醇洗脱得到没有聚合的肽段，回收利用，实现了资源利用率的最大化。
4、首次提出将鱼鳞胶原肽钙用于牙槽骨的修复以及脱矿牙本质的再矿化，并获得了良好的效果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种鱼鳞胶原肽钙的制备方法，由以下步骤组成：
(1)鱼鳞预处理：新鲜的鱼鳞用清水清洗，去除附着物和杂质后沥水；-20℃冷48h；解冻，加20倍的水，强力搅拌，中间换水直至鱼银粉和附着在鱼鳞上的杂蛋白去除；将脱掉银粉和杂蛋白的鱼鳞洗净晾干后采用干粉机粉碎；
(2)将鱼鳞与水按照重量比1:20的比例混合，在压力101.33kPa、温度120℃的条件下高温蒸熟处理1h；在热处理的条件下能够使得鱼鳞胶原纤维吸水溶胀，及变性溶出，以利于后期的酶解；
(3)将热处理后的混合物降温至50℃，加入A.S.1398酶，添加量为质量比6％，酶解3h；在酶解时不断加入0.5mol/L的盐酸并搅拌至pH开始下降；
(4)鳌合：将步骤(3)的酶解液进行离心，离心条件为10000×g离心30min；取上清液用NaOH微调pH至6.5，在50℃条件下螯合1h；
(5)吸附、洗脱：过非极性大孔吸附树脂柱吸附后用蒸馏水洗脱，收集洗脱液；用水洗脱之后再用70％的乙醇洗脱得到没有聚合的肽段，回收利用。
(6)脱盐：采用凝胶过滤色谱G10脱盐之后冷冻干燥，得肽钙聚合物。
一种采用上述制备方法制成鱼鳞胶原肽钙，分子量分布范围主要在1200-200之间。
一种上述鱼鳞胶原肽钙的用途，用于牙槽骨的修复以及脱矿牙本质的再矿化。
实施例2：
一种鱼鳞胶原肽钙的制备方法，由以下步骤组成：
(1)鱼鳞预处理：新鲜的鱼鳞用清水清洗，去除附着物和杂质后沥水；-20℃冷48h；解冻，加20倍的水，强力搅拌，中间换水直至鱼银粉和附着在鱼鳞上的杂蛋白去除；将脱掉银粉和杂蛋白的鱼鳞洗净晾干后采用干粉机粉碎；
(2)将鱼鳞与水按照重量比1:20的比例混合，在压力100kPa、温度120℃的条件下微波加热处理70min；在热处理的条件下能够使得鱼鳞胶原纤维吸水溶胀，及变性溶出，以利于后期的酶解；
(3)将热处理后的混合物降温至50℃，加入A.S.1398酶，添加量为质量比5％，酶解4h；在酶解时不断加入0.5mol/L的醋酸并搅拌至pH开始下降；
(4)鳌合：将步骤(3)的酶解液进行离心，离心条件为10000×g离心30min；取上清液用NaOH微调pH至6，在55℃条件下螯合1h；
(5)吸附、洗脱：过非极性大孔吸附树脂柱吸附后用蒸馏水洗脱，收集洗脱液；用水洗脱之后再用70％的乙醇洗脱得到没有聚合的肽段，回收利用。
(6)脱盐：采用凝胶过滤色谱G10脱盐之后冷冻干燥，得肽钙聚合物。
一种采用上述制备方法制成鱼鳞胶原肽钙，分子量分布范围主要在1200-200之间。
一种上述鱼鳞胶原肽钙的用途，用于牙槽骨的修复以及脱矿牙本质的再矿化。
实施例3：
一种鱼鳞胶原肽钙的制备方法，由以下步骤组成：
(1)鱼鳞预处理：新鲜的鱼鳞用清水清洗，去除附着物和杂质后沥水；-20℃冷48h；解冻，加20倍的水，强力搅拌，中间换水直至鱼银粉和附着在鱼鳞上的杂蛋白去除；将脱掉银粉和杂蛋白的鱼鳞洗净晾干后采用干粉机粉碎；
(2)将鱼鳞与水按照重量比1:20的比例混合，在压力105kPa、温度120℃的条件下高温蒸熟处理50min；在热处理的条件下能够使得鱼鳞胶原纤维吸水溶胀，及变性溶出，以利于后期的酶解；
(3)将热处理后的混合物降温至50℃，加入A.S.1398酶，添加量为质量比7％，酶解2h；在酶解时不断加入0.5mol/L的柠檬酸并搅拌至pH开始下降；
(4)鳌合：将步骤(3)的酶解液进行离心，离心条件为10000×g离心30min；取上清液用NaOH微调pH至7，在45℃条件下螯合1h；
(5)吸附、洗脱：过非极性大孔吸附树脂柱吸附后用蒸馏水洗脱，收集洗脱液；用水洗脱之后再用70％的乙醇洗脱得到没有聚合的肽段，回收利用；
(6)脱盐：采用凝胶过滤色谱G10脱盐之后冷冻干燥，得肽钙聚合物。
一种采用上述制备方法制成鱼鳞胶原肽钙，分子量分布范围主要在1200-200之间。
一种上述鱼鳞胶原肽钙的用途，用于牙槽骨的修复以及脱矿牙本质的再矿化。

Claims (8)

1.一种鱼鳞胶原肽钙的制备方法，其特征在于：不添加外源钙，利用鱼鳞胶原和其自身钙，制备得到低聚胶原肽钙聚合物。
2.如权利要求1所述的鱼鳞胶原肽钙的制备方法，其特征在于由以下步骤组成：
(1)鱼鳞预处理：新鲜的鱼鳞用清水清洗，去除附着物和杂质后沥水；-20℃冷48h；解冻，加20倍的水，强力搅拌，中间换水直至鱼银粉和附着在鱼鳞上的杂蛋白去除；将脱掉银粉和杂蛋白的鱼鳞洗净晾干后采用干粉机粉碎；
(2)溶胀：将鱼鳞与水按照重量比1:20的比例混合，在压力100-105kPa、温度120℃的条件下热处理50-70min；
(3)酶解：将热处理后的混合物降温至50℃，加入A.S.1398酶，添加量为质量比5％-7％，酶解2-4h；在酶解时不断加酸并搅拌至pH开始下降；
(4)鳌合：将步骤(3)的酶解液进行离心，取上清液用NaOH微调pH至6-7，在45-55℃条件下螯合1h；
(5)吸附、洗脱：过非极性大孔吸附树脂柱吸附后用蒸馏水洗脱，收集洗脱液；
(6)脱盐：采用凝胶过滤色谱G10脱盐之后冷冻干燥，得肽钙聚合物。
3.如权利要求2所述的鱼鳞胶原肽钙的制备方法，其特征在于：步骤(2)的热处理方式为高温蒸熟或微波加热。
4.如权利要求2所述的鱼鳞胶原肽钙的制备方法，其特征在于：步骤(3)在酶解时不断加入0.5mol/L的盐酸或醋酸、柠檬酸中的一种。
5.如权利要求2所述的鱼鳞胶原肽钙的制备方法，其特征在于：步骤(4)的离心条件为10000×g离心30min。
6.如权利要求2所述的鱼鳞胶原肽钙的制备方法，其特征在于：步骤(5)用水洗脱之后再用70％的乙醇洗脱得到没有聚合的肽段，回收利用。
7.一种鱼鳞胶原肽钙，其特征在于：采用权利要求1或2的制备方法制成，其分子量分布范围在1200-200之间。
8.一种权利要求1中鱼鳞胶原肽钙的用途，其特征在于：用于牙槽骨的修复以及脱矿牙本质的再矿化。
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