CN107759685A - 一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽及其制备方法 - Google Patents
一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107759685A CN107759685A CN201711018713.0A CN201711018713A CN107759685A CN 107759685 A CN107759685 A CN 107759685A CN 201711018713 A CN201711018713 A CN 201711018713A CN 107759685 A CN107759685 A CN 107759685A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bone
- gly
- sturgeon fish
- iron chelating
- chelating peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 93
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 65
- 241000881711 Acipenser sturio Species 0.000 title claims abstract description 60
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 44
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 title claims abstract description 35
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 title claims abstract description 35
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 title claims abstract description 35
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 title claims abstract description 35
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 4
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 34
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 33
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 33
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 33
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 25
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 14
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 13
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 12
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 7
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000000428 dust Substances 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 3
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000010792 warming Methods 0.000 claims description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 2
- NLOGSHMIAWCODV-UHFFFAOYSA-N 2-piperazin-4-ium-1-ylethanesulfonate Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCNCC1 NLOGSHMIAWCODV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 abstract description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 2
- YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YNCHFVRXEQFPBY-BQBZGAKWSA-N 0.000 abstract 1
- POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N Asp-Gly-Pro Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O POTCZYQVVNXUIG-BQBZGAKWSA-N 0.000 abstract 1
- NQKRILCJYCASDV-QWRGUYRKSA-N His-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 NQKRILCJYCASDV-QWRGUYRKSA-N 0.000 abstract 1
- RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N Lys-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N 0.000 abstract 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 abstract 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000040710 Chela Species 0.000 description 2
- 241000276446 Gadiformes Species 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- -1 iron ion Chemical class 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 2
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000252344 Acipenser gueldenstaedtii Species 0.000 description 1
- 241000883303 Acipenser sinensis Species 0.000 description 1
- ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N Ala-Gly-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZVFVBBGVOILKPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- MQIGTEQXYCRLGK-BQBZGAKWSA-N Ala-Gly-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O MQIGTEQXYCRLGK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 1
- 241000251464 Coelacanthiformes Species 0.000 description 1
- RGPWUJOMKFYFSR-QWRGUYRKSA-N His-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RGPWUJOMKFYFSR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 101000993059 Homo sapiens Hereditary hemochromatosis protein Proteins 0.000 description 1
- 241000556189 Huso Species 0.000 description 1
- 206010067997 Iodine deficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010022971 Iron Deficiencies Diseases 0.000 description 1
- YFBBUHJJUXXZOF-UWVGGRQHSA-N Leu-Gly-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YFBBUHJJUXXZOF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 101800004193 Peptide P3 Proteins 0.000 description 1
- 206010048259 Zinc deficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 235000006479 iodine deficiency Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 108010082483 polypeptide-Fe Proteins 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108700042769 prolyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000011218 segmentation Effects 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
本发明涉及一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽及其制备方法，属于水产品精深加工技术领域，本铁螯合肽是以鲟鱼鱼骨为原料，制备明胶，利用胰蛋白酶和碱性蛋白酶对明胶进行酶解，采用超滤、大孔树脂柱层析、亲和层析和反相高效液相色谱分离纯化得到铁螯合肽Asp‑Gly‑Pro‑Lys‑Gly‑Pro‑His‑Gly‑Lys‑Asp‑Gly‑Arg（DGPKGPHGKDGR），ESI/MS检测分子量为1220.28 Da，本发明的铁螯合肽对铁螯合能力强，用于制备补铁药物和保健品。
Description
技术领域
本发明属于水产品精深加工技术领域，特别是涉及一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽及其制备方法。
背景技术
明胶与胶原具有同源性，是胶原部分水解而得到的一类蛋白质，但因处理工艺的差异，分子量一般为15000～250000Da。目前，明胶以其在医药、保健品、食品和化妆品等应用上的独特功效被越来越多的消费者所青睐，成为食品行业和保健品行业、日化行业所竞相关注的焦点。
微量元素与人的生存和健康息息相关，对人的生命起至关重要的作用。微量元素的摄入过量、不足、不平衡或缺乏都会不同程度地引起人体生理的异常或发生疾病，研究表明约30%的疾病直接是微量元素缺乏或不平衡所致。如：缺铁导致贫血；缺锌使免疫力下降并影响发育和智力，缺碘发生甲状腺肿大等。目前，微量元素的补充有多种形式，金属盐类、金属螯合肽等。其中，金属螯合肽生物利用度高、稳定性强和易吸收等优点受到普遍关注。
鲟鱼（Sturgeon），就是指鲟形目的鱼类，鲟鱼隶属于硬骨鱼纲、辐鳍亚纲、硬鳞总目、鲟形目。目前，我国已经成功解决了俄罗斯鲟、欧洲鳇等引进品种的人工养殖技术，养殖产品也出国国外多个国家。养殖鲟鱼在加工过程中会产生大量鲟鱼软骨（鲟鱼头骨、脊椎骨等），约占与体重的6%。鲟鱼软骨富含硫酸软骨素和胶原蛋白等活性物质。鲟鱼鱼肉出口过程中，剩余部分鱼骨副产物，合理利用鲟鱼鱼骨产生更多经济价值成为行业急需解决的技术难题。
经检索，以鲟鱼鱼骨为原料制备明胶和金属螯合肽的技术未见报道。基于此，本发明根据鲟鱼鱼骨的研究现状，提供一种铁螯合肽，并提供这种铁螯合肽的制备方法。
发明内容
本发明针对上述的技术现状提供一种的鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽的制备方法。
本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽，铁螯合肽的氨基酸序列为Asp-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-His-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg（DGPKGPHGKDGR），ESI/MS检测分子量为1220.28 Da。
作为优选，铁螯合肽Asp-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-His-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg（DGPKGPHGKDGR）对铁离子的螯合能力为167.13 μg/mg。
作为优选，鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽用于制备补铁药片和保健品的用途。
本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽的制备方法，包括以下步骤：
1）鲟鱼鱼骨的预处理：按照料液比1 g:10~15 mL向鲟鱼鱼骨中加0.1 mol/L NaOH溶液于4℃下浸泡3~5 h，脱除非胶原蛋白；处理后鱼骨用蒸馏水反复洗涤至pH 6.5~7.0、沥干，按照料液比1 g: 5~10 mL加入pH 7.4的0.5 mol/L EDTA溶液，于4℃下浸泡3~5天，每天更换1次EDTA溶液，脱钙，干燥、粉碎，得脱钙鱼骨粉；
2）鲟鱼鱼骨明胶的制备：按照料液比1 g:8～10 mL将脱钙鱼骨粉加入到双蒸水中，于60～70℃动态提取6～8 h，然后于6 000g离心25～30 min，取上清液，冻干得鲟鱼鱼骨明胶；
3）鲟鱼鱼骨胶原蛋白的酶解：按照料液比1g:15~20 mL向鲟鱼鱼骨明胶中加入超纯水，用HCl调溶液pH到7.0~8.0，按照胶原蛋白质量的1.5~2.0%向胶原蛋白溶液中加入胰蛋白酶，酶活力≥2.5×104 U/g，酶解3~5 h后，将溶液升温至90~ 95℃，并于此温度保持10~15min后，冷却至室温；用NaOH调溶液pH到9.0~10.0，按照胶原蛋白质量的1.2 ~1.5%向溶液中加入碱性蛋白酶，酶活力≥2.5×105 U/g，于温度50~60℃下酶解3~4 h，酶解液冷却至室温，于12000g离心20～25 min，取上清液，得酶解产物；
4）鲟鱼鱼骨铁螯合肽胶原肽的制备：将制备的胶原蛋白酶解产物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有10～15倍D101大孔树脂的层析柱中，用3～5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的95%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得胶原肽混合物，胶原肽混合物依次经亲和层析、凝胶过滤层析和反相高效液相色谱RP-HPLC纯化，得到鲟鱼鱼骨铁螯合肽。
作为优选，鲟鱼鱼骨铁螯合肽胶原肽的制备步骤中的亲和层析、凝胶过滤层析和反相高效液相色谱RP-HPLC纯化的具体过程为：
亲和层析：将IDA-Sepharose装柱，加入3～5倍柱体积的FeSO4 0.2 mol/L，反应12～24h后，分别用纯净水和pH 4.5～5.5 NaAC-HAC缓冲液流洗3～5个床体积；将胶原肽混合物溶于NaAC-HAC缓冲液，10 mmol/L，pH 4.5～5.5制成浓度为20~25 mg/mL溶液，按照样品溶液:IDA-Sepharose体积比1: 6～8加入到制备的亲和层析柱，用NaAC-HAC缓冲液，10 mmol/L，pH 4.5～5.5，流洗3～5个床体积除去未结合多肽，最后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液，10mmol/L，pH 7.5～8.5，洗脱，紫外214波长检测，富集洗出多肽。
RP-HPLC纯化：将上述亲和层析洗出多肽配成45~55 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对Fe的螯合活性得1个高Fe螯合活性肽Asp-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-His-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg（DGPKGPHGKDGR）。
作为优选， RP-HPLC条件为：进样量15~20 μL；色谱柱为Eclipse XDB-C18(9.4mm×250mm,5μm)；流动相：乙腈-水；梯度洗脱：30min内乙腈浓度由0匀速升至40%；洗脱速度1.5~2.0 mL/min；紫外检测波长214 nm。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明基于多肽与金属离子螯合的理论基础，以及多肽-Fe螯合物的独特功效，如可同时补充多肽/氨基酸和Fe，以鲟鱼鱼骨为原材料，通过对胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶解条件控制，制备具有高Fe螯合活性的胶原肽。本发明为补铁保健食品和药物开发提供了一种技术支持，同时提高了鲟鱼鱼骨的利用价值。
附图说明
图1是本发明的超滤分段组分（MW≦3000 Da）的IDA-Sepharose亲和层析图；
图2是本发明的亲和层析制备多肽混合物的RP-HPLC分析图。
具体实施方式
以下结合实施例和附图对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽的制备方法，制备工艺流程如下：鲟鱼鱼骨"明胶提取"双酶酶解"酶解物"超滤"大孔树脂纯化"亲和层析"RP-HPLC制备"铁螯合肽。
1）鲟鱼鱼骨的预处理：按照料液比1 g:10 mL向鲟鱼鱼骨中加0.1 mol/L NaOH溶液于4℃下浸泡5 h，脱除非胶原蛋白；处理后鱼骨用蒸馏水反复洗涤至pH 7.0、沥干，按照料液比1 g: 8 mL加入pH 7.4的0.5 mol/L EDTA溶液，于4℃下浸泡4天，每天更换1次EDTA溶液，脱钙，干燥、粉碎，得脱钙鱼骨粉；
2）鲟鱼鱼骨明胶的制备：按照料液比1 g:10 mL将脱钙鱼骨粉加入到双蒸水中，于65℃动态提取8 h，然后于6000g离心30 min，取上清液，冻干得鲟鱼鱼骨明胶。
3）鲟鱼鱼骨胶原蛋白的酶解：按照料液比1g:15 mL向鲟鱼鱼骨明胶中加入超纯水，用HCl调溶液pH到7.5，按照胶原蛋白质量的2.0%向胶原蛋白溶液中加入胰蛋白酶（酶活力≥2.5×104 U/g），酶解4 h后，将溶液升温至95℃，并于此温度保持15min后，冷却至室温；用NaOH调溶液pH到9.5，按照胶原蛋白质量的1.5%向溶液中加入碱性蛋白酶（酶活力≥2.5×105 U/g），于温度55℃下酶解4 h，酶解液冷却至室温，于12000g离心20 min，取上清液，得酶解产物；
4）鲟鱼鱼骨铁螯合肽胶原肽的制备：将制备的胶原蛋白酶解产物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有15倍D101大孔树脂的层析柱中，用3倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5倍柱体积的95%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得胶原肽混合物，胶原肽混合物依次经亲和层析、凝胶过滤层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到鲟鱼鱼骨铁螯合肽。
利用氨基酸序列分析和质谱测定其结构，具体过程为：
a）亲和层析：将IDA-Sepharose装柱，加入4倍柱体积的FeSO4（0.2 mol/L），反应15 h后，分别用纯净水和pH 5.0 NaAC-HAC缓冲液流洗5个床体积；将胶原肽混合物溶于NaAC-HAC缓冲液（10 mmol/L，pH 5.0）制成浓度为45 mg/mL溶液，按照样品溶液:IDA-Sepharose体积比1:8加入到制备的亲和层析柱，用NaAC-HAC缓冲液（10 mmol/L，pH 5.0）流洗4个床体积除去未结合多肽，最后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液（10 mmol/L，pH 7.5～8.5）洗脱，紫外214波长检测，富集洗出多肽Frac-II，如图1所示；
b）RP-HPLC纯化：将上述亲和层析酶解物Frac-II用双蒸水配成25~35 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（所述RP-HPLC条件为：进样量15 μL；色谱柱为Eclipse XDB-C18(9.4mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-水；梯度洗脱：30min内乙腈浓度由0匀速升至40%；洗脱速度1.5 mL/min；紫外检测波长214 nm），根据对Fe的螯合活性得1个高Fe螯合活性胶原肽P3，如图2所示。
c）结构检测：Fe螯合胶原肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Asp-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-His-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg（DGPKGPHGKDGR），ESI/MS检测分子量为1220.28 Da。
测定结果表明：纯化得到的Fe螯合胶原肽Asp-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-His-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg（DGPKGPHGKDGR），对铁离子的螯合能力为167.13 μg/mg，与明胶酶解产物（55.68 μg/mg）相比其对Fe的螯合能力有很大提高。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细描述。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成(Acipenser sinensis)
<400> 1
Ala Gly Pro Leu Gly Pro His Gly Leu Ala Gly Ala
1 5 10
Claims (7)
1.一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽，其特征在于：铁螯合肽的氨基酸序列为Asp-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-His-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg（DGPKGPHGKDGR），ESI/MS检测分子量为1220.28Da。
2. 根据权利要求1所述的一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽，其特征在于：所述铁螯合肽Asp-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-His-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg（DGPKGPHGKDGR）对铁离子的螯合能力为167.13 μg/mg。
3.根据权利要求1所述的一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽，其特征在于：所述鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽用于制备补铁药片和保健品的用途。
4.一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）鲟鱼鱼骨的预处理：按照料液比1 g:10~15 mL向鲟鱼鱼骨中加0.1 mol/L NaOH溶液于4℃下浸泡3~5h，脱除非胶原蛋白；处理后鱼骨用蒸馏水反复洗涤至pH 6.5~7.0，沥干，按照料液比1 g: 5~10mL加入pH 7.4的0.5 mol/L EDTA溶液，于4℃下浸泡3~5天，每天更换1次EDTA溶液，脱钙，干燥、粉碎，得脱钙鱼骨粉；
2）鲟鱼鱼骨明胶的制备：按照料液比1 g:8～10mL将脱钙鱼骨粉加入到双蒸水中，于60～70℃动态提取6～8h，然后于6000g离心25～30min，取上清液，冻干得鲟鱼鱼骨明胶；
3）鲟鱼鱼骨胶原蛋白的酶解：按照料液比1g:15~20mL向鲟鱼鱼骨明胶中加入超纯水，用HCl调溶液pH到7.0~8.0，按照胶原蛋白质量的1.5~2.0%向胶原蛋白溶液中加入胰蛋白酶（酶活力≥2.5×104 U/g），酶解3~5h后，将溶液升温至90~ 95℃，并于此温度保持10~15min后，冷却至室温；用NaOH调溶液pH到9.0~10.0，按照胶原蛋白质量的1.2~1.5%向溶液中加入碱性蛋白酶（酶活力≥2.5×105U/g），于温度50~60℃下酶解3~4h，酶解液冷却至室温，于12000g离心20～25min，取上清液，得酶解产物；
4）鲟鱼鱼骨铁螯合肽胶原肽的制备：将制备的胶原蛋白酶解产物采用3kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3kDa部分，得超滤酶解液，超滤酶解液按照体积比加入到装有10～15倍D101大孔树脂的层析柱中，用3～5倍柱体积水洗脱除去杂质，然后用5～8倍柱体积的95%乙醇进行洗脱，乙醇洗脱液于50 ℃以下低压旋蒸除去乙醇、冷冻干燥得胶原肽混合物，胶原肽混合物依次经亲和层析、凝胶过滤层析和反相高效液相色谱纯化，得到鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽。
5. 根据权利要求4所述的一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽的制备方法，其特征在于：所述步骤4中亲和层析的具体过程为：将IDA-Sepharose装柱，加入3～5倍柱体积的FeSO4（0.2mol/L），反应12～24 h后，分别用纯净水和pH 4.5～5.5 NaAC-HAC缓冲液流洗3～5个床体积；将胶原肽混合物溶于NaAC-HAC缓冲液（10 mmol/L，pH 4.5～5.5）制成浓度为20~25 mg/mL溶液，按照样品溶液:IDA-Sepharose体积比1: 6～8加入到制备的亲和层析柱，用NaAC-HAC缓冲液（10 mmol/L，pH 4.5～5.5）流洗3～5个床体积除去未结合多肽，最后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液（10 mmol/L，pH 7.5～8.5）洗脱，紫外214波长检测，富集洗出多肽。
6. 根据权利要求4所述的一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽的制备方法，其特征在于：所述反相高效液相色谱纯化具体过程为：将亲和层析洗出多肽配成45~55 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对Fe的螯合活性得1个高Fe螯合活性肽Asp-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-His-Gly-Lys-Asp-Gly-Arg（DGPKGPHGKDGR）。
7. 根据权利要求4所述的一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽的制备方法，其特征在于：所述RP-HPLC条件为：进样量15~20 μL；色谱柱为Eclipse XDB-C18(9.4mm×250mm,5μm)；流动相：乙腈-水；梯度洗脱：30min内乙腈浓度由0匀速升至40%；洗脱速度1.5~2.0 mL/min；紫外检测波长214 nm。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711018713.0A CN107759685B (zh) | 2017-10-26 | 2017-10-26 | 一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711018713.0A CN107759685B (zh) | 2017-10-26 | 2017-10-26 | 一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107759685A true CN107759685A (zh) | 2018-03-06 |
| CN107759685B CN107759685B (zh) | 2020-08-11 |
Family
ID=61271295
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711018713.0A Active CN107759685B (zh) | 2017-10-26 | 2017-10-26 | 一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107759685B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108611330A (zh) * | 2018-05-03 | 2018-10-02 | 大连理工大学 | 一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法 |
| CN112480207A (zh) * | 2020-11-06 | 2021-03-12 | 浙江海洋大学 | 南极磷虾金属螯合肽 |
| CN112877390A (zh) * | 2021-01-28 | 2021-06-01 | 江苏大学 | 一种功能性醇溶鲟鱼软骨制剂的制备方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103788193A (zh) * | 2014-03-06 | 2014-05-14 | 福州大学 | 一种利用双酶协同水解制备金属螯合肽的方法 |
| CN103992384A (zh) * | 2014-05-22 | 2014-08-20 | 浙江海洋学院 | 一种大黄鱼鱼骨胶原肽及其制备方法和用途 |
| CN104774896A (zh) * | 2015-04-15 | 2015-07-15 | 浙江海洋学院 | 带鱼鱼骨铁螯合胶原肽制备方法 |
-
2017
- 2017-10-26 CN CN201711018713.0A patent/CN107759685B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103788193A (zh) * | 2014-03-06 | 2014-05-14 | 福州大学 | 一种利用双酶协同水解制备金属螯合肽的方法 |
| CN103992384A (zh) * | 2014-05-22 | 2014-08-20 | 浙江海洋学院 | 一种大黄鱼鱼骨胶原肽及其制备方法和用途 |
| CN104774896A (zh) * | 2015-04-15 | 2015-07-15 | 浙江海洋学院 | 带鱼鱼骨铁螯合胶原肽制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 林慧敏 等: "超滤法制备高抗菌抗氧化活性带鱼蛋白亚铁螯合肽(Fe-HPH)的工艺研究", 《中国食品学报》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108611330A (zh) * | 2018-05-03 | 2018-10-02 | 大连理工大学 | 一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法 |
| CN108611330B (zh) * | 2018-05-03 | 2022-02-01 | 大连理工大学 | 一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法 |
| CN112480207A (zh) * | 2020-11-06 | 2021-03-12 | 浙江海洋大学 | 南极磷虾金属螯合肽 |
| CN112877390A (zh) * | 2021-01-28 | 2021-06-01 | 江苏大学 | 一种功能性醇溶鲟鱼软骨制剂的制备方法 |
| CN112877390B (zh) * | 2021-01-28 | 2024-04-19 | 湖北嫦娥生物股份有限公司 | 一种功能性醇溶鲟鱼软骨制剂的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107759685B (zh) | 2020-08-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102533914B (zh) | 一种高纯度无腥异味的鱼胶原蛋白肽及其制备方法 | |
| CN104710525B (zh) | 一种金枪鱼鱼骨胶原蛋白源锌螯合胶原肽及其制备方法和用途 | |
| US20180258147A1 (en) | Pearl protein preparation method and a water-soluble pearl protein and acid-soluble pearl protein obtained by adopting this method | |
| CN107759685A (zh) | 一种鲟鱼鱼骨明胶铁螯合肽及其制备方法 | |
| CN102808010A (zh) | 一种酶解金枪鱼碎肉蛋白制备降压肽的方法 | |
| CN104710511A (zh) | 一种源于带鱼鱼肉蛋白的铁螯合肽及其制备方法和用途 | |
| CN109349419A (zh) | 一种修复人体细胞的复合牦牛骨胶原蛋白肽粉 | |
| CN103626847A (zh) | 一种小麦胚芽蛋白源锌螯合肽及其制备方法 | |
| CN101096697B (zh) | 从禽卵中酶法制取卵蛋白多肽的工业生产方法 | |
| CN101603038A (zh) | 一种溶菌酶的制备方法 | |
| CN101392035A (zh) | 高含量硫酸软骨素的生产方法 | |
| CN104530207A (zh) | 一种从大豆乳清中分离纯化大豆凝集素的方法 | |
| CN108893515B (zh) | 高f值寡肽及其制备方法 | |
| TWM554269U (zh) | 分離純化雞骨架中２型膠原蛋白之裝置 | |
| CN109957045A (zh) | 一种从动物肝脏中提取肝素钠和蛋白肽的联产工艺 | |
| CN113321705B (zh) | 一种弹性蛋白酶抑制肽及其制备方法与应用 | |
| CN101473886A (zh) | 用动物骨骼制备骨胶原多肽的方法 | |
| CN109258916A (zh) | 一种鱼鳞胶原肽钙及其制备方法、用途 | |
| CN104531813A (zh) | 一种山羊角活性多肽的制备方法 | |
| CN108159283A (zh) | 石斛叶片复合游离氨基酸的提取方法及用途 | |
| CN114573682B (zh) | 一种弹性蛋白肽及其制备方法 | |
| CN106978463A (zh) | 一种高效生产肠膜蛋白粉的方法 | |
| CN107022593B (zh) | 一种富含脯氨酸多肽的初乳肽及其制备方法 | |
| CN103554221A (zh) | 一组蛇毒来源的活性肽的制备方法 | |
| CN109481331A (zh) | 一种具有抗敏作用的机体保护多肽及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230926 Address after: No. 87-2 Dingshan Middle Road, Haicang District, Xiamen City, Fujian Province, 361000 Patentee after: Sturgeon Litaiyue (Xiamen) Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 400000 No. 107, datagu Middle Road, Xiantao street, Yubei District, Chongqing Patentee before: Chongqing supersonic Intellectual Property Operation Co.,Ltd. Effective date of registration: 20230926 Address after: 400000 No. 107, datagu Middle Road, Xiantao street, Yubei District, Chongqing Patentee after: Chongqing supersonic Intellectual Property Operation Co.,Ltd. Address before: 316000 plot C2-10, Xiaohui Industrial Zone, Putuo Zhanmao, Putuo marine science and Technology Industrial Park, Zhoushan City, Zhejiang Province Patentee before: Zhejiang Ocean University |