CN108611330A - 一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法 - Google Patents

Abstract

一种改善黄素蛋白纯化的方法属于蛋白纯化技术领域。包括：以含有黄素蛋白TrxR的大肠杆菌为原材料，加入TE buffer使菌体充分混匀，再加入溶菌酶37℃作用0.5‑1h，充分破碎细胞得到混合液A，破碎其中核酸，对混合液A进行离心处理得到含有黄素蛋白TrxR的上清液B。将EDTA加入到上清液B中，再将上清液B加入ADP Sepharose亲和层析柱中，洗脱柱子收集洗脱液C，对洗脱液C离心浓缩得浓缩液D。对浓缩液D进行凝胶过滤，收集过滤组分得到纯黄素蛋白TrxR。本发明简化了黄素蛋白TrxR纯化方法，方法简单，成本低廉，纯化效果较好；EDTA能够保护ADP Sepharose亲和层析配基；具有较高的利用价值。

Description

一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法

技术领域

本发明属于蛋白纯化技术领域，提供一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法。

背景技术

哺乳动物硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)是黄素蛋白，在生物体的氧化还原平衡中发挥着重要作用，与肿瘤等疾病发病机制密切相关。TrxR是唯一能够还原氧化态硫氧还蛋白(Trx)的酶，通过调控Trx活性和氧化还原状态来调控细胞增殖、活性和凋亡。根据分布位置的不同，TrxR有三种类型，其中位于细胞质和细胞核的是单亚基为55kDa的TrxR。

对于黄素蛋白的分离纯化，王敏等采用HiTrap Chealting HP柱一步亲和层析法分离纯化亚硫酸还原酶的α亚基黄素蛋白(cysJ)，cysJ酶回收率为12.15％(王敏,曾嘉,黄霞等.嗜酸氧化亚铁硫杆菌亚硫酸还原酶的α亚基黄素蛋白(cysJ)的表达、纯化及活性测定[J].现代生物医学进展,2008,8(3):453-455.)。刘辉等通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换柱、Toyopearl疏水层析柱和Sephadex G-75分子筛层析纯化得到肌氨酸氧化酶，得率为22.3％(刘辉,孙桂琴,马晓航,等.芽胞杆菌BSD-8肌氨酸氧化酶的纯化与性质[J].生物工程学报,2010,26(3):335-340.)。陈文波等通过硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose FastFlow弱阴离子交换凝胶色谱柱层析、Blue-Sepharose亲和色谱柱层析、Resource Q强阴离子交换色谱柱层析和Superdex 200prepgrade凝胶过滤色谱柱层析等方法从猪脑中分离并纯化TrxR，最终产率仅为13.9％(陈文波等,猪脑中硫氧还蛋白还原酶的纯化与表征.安徽农业科学,2013(18):第7832-7835页)。

综上所述，我们可以知道，在黄素蛋白的分离纯化中，大多采用硫酸铵分级沉淀、亲和层析、离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤等一种或多种方法联用的策略制备黄素蛋白纯品。黄素蛋白的分离纯化策略多种多样，为了得到黄素蛋白纯品，需要两步或者更多步骤的策略，过程繁琐。而且这些分离纯化策略普遍存在黄素蛋白收率低等问题。

发明内容

针对现有纯化技术中黄素蛋白TrxR收率低和成本高的问题，本发明提供一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法。2’5’ADP Sepharose亲和层析与Sephacryl S-300凝胶过滤联用纯化黄素蛋白TrxR。通过改进工艺提高了黄素蛋白TrxR的收率，用高性价比的SephacrylS-300替代价格高昂的Superdex 200凝胶过滤柱进行TrxR的精细分离纯化，极大降低了整个黄素蛋白TrxR纯化工程的成本。

为了达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法，包括以下步骤：

(1)以含有黄素蛋白TrxR的大肠杆菌为原材料，每1g质量的大肠杆菌湿菌体加入4-9ml TE buffer(Tris-EDTA缓冲液)使菌体充分混匀得到混合液，再加入溶菌酶使混合液中溶菌酶终浓度为50μg/ml，37℃作用0.5-1h，反复冻融三次，充分破碎细胞得到混合液A。采用超声破碎仪破碎混合液A中核酸。在4℃，13000rpm/min的条件下，采用离心机对混合液A进行离心处理20min，得到含有黄素蛋白TrxR的上清液B。

(2)将EDTA(乙二胺四乙酸)加入到上清液B中，使上清液B中EDTA的终浓度为20mM，用于保护ADP配基，提高黄素蛋白TrxR的ADP Sepharose亲和层析收率。再将上清液B加入2’5’ADP Sepharose亲和层析柱中，采用TE buffer清洗柱子。接着采用TE+0.5M NaCl洗脱柱子，收集洗脱液C。最后采用截留分子量为30 kDa的超滤离心管对洗脱液C离心浓缩得浓缩液D。

(3)在 start层析系统上对浓缩液D进行Sephacryl S-300(聚丙烯酰胺葡聚糖)凝胶过滤，以TE+0.15 M NaCl为流动相，用UV 280 nm监测凝胶过滤过程中蛋白含量变化，收集过滤组分，得到纯黄素蛋白TrxR。

优选地，所述方法步骤(1)中超声破碎仪破碎混合液A中核酸的方法是冰上操作，70％振幅，开2 s停3 s，工作2 min。

优选地，所述方法步骤(2)中上清液B的2’5’ADP Sepharose亲和层析过程为两个柱体积(CV)上样，20 CV TE buffer清洗非特异性结合在配基上的杂蛋白，3 CV TE+0.5 MNaCl洗脱特异性结合在ADP配基上的TrxR。

优选地，所述方法步骤(3)中使用高性价比的Sephacryl S-300凝胶过滤柱进一步精细纯化黄素蛋白TrxR。

相比现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)黄素蛋白TrxR纯化方法简便，仅采用2’5’ADP Sepharose亲和层析和Sephacryl S-300凝胶过滤的方法，SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)电泳分析显示为单一条带，说明纯化效果好。

(2)通过向上清液B中补充终浓度为20 mM的EDTA，有效提高了黄素蛋白TrxR的总收率，TrxR总收率达到77％。

(3)用高性价比的Sephacryl S-300替代价格高昂的Superdex 200凝胶过滤柱进行黄素蛋白TrxR的进一步精细分离纯化，极大降低了整个黄素蛋白TrxR纯化工程的成本。

附图说明

图1是上清液B中不同EDTA浓度对TrxR的2’5’-ADP Sepharose亲和层析收率的影响；

图2是Sephacryl S-300凝胶过滤色谱图，UV280nm吸光度曲线代表蛋白含量的变化。

具体实施方式

结合实施例详细阐述本发明的具体实施方式如下：

对比例1

将2L含有黄素蛋白TrxR的大肠杆菌菌液低速离心收集到约7g湿菌体，加入50mlTE buffer使菌体充分混匀，加入50μl浓度为50mg/ml的溶菌酶，37℃作用0.5h，反复冻融三次，充分破碎细胞得到混合液A。使用超声破碎仪冰上操作，70％振幅，工作2s停止3s，持续2min破碎混合液A中核酸。使用离心机，4℃、13000rpm离心混合液A20min，获得50ml含有黄素蛋白TrxR的上清液B。

每次取5ml上清液B上样进5ml柱体积的2’5’ADP Sepharose亲和层析柱1中，用100ml TE buffer清洗柱子，接着用15ml TE+0.5M NaCl洗脱柱子，收集到15ml洗脱液C。共进行10次亲和层析，得到150ml洗脱液C。使用截留分子量为30kDa的超滤离心管对洗脱液C离心浓缩得0.95ml浓缩液D。

在 start系统上对浓缩液D进行Sephacryl S-300凝胶过滤，以120ml TE+0.15M NaCl为流动相，用UV 280nm监测凝胶过滤过程中蛋白含量变化，收集过滤组分，得到纯黄素蛋白TrxR。

用DTNB法对上清液B和最终的纯黄素蛋白TrxR进行动力学测试，计算总活力，得到TrxR的终收率为44％。

实施例2

将2L含有黄素蛋白TrxR的大肠杆菌菌液低速离心收集到约7g湿菌体，加入60mlTE buffer使菌体充分混匀，加入60μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用0.8h，反复冻融三次，充分破碎细胞得到混合液A。使用超声破碎仪冰上操作，70％振幅，工作2s停止3s，持续2min破碎混合液A中核酸。使用离心机，4℃，13000rpm离心混合液A20min，获得60ml含有黄素蛋白TrxR的上清液B。

向上清液B中加入2.5ml 0.5M的EDTA，使上清液B中EDTA的终浓度为20mM。每次取10ml上清液B上样进5ml柱体积的2’5’ADP Sepharose亲和层析柱2中，用100ml TE buffer清洗柱子，接着用15ml TE+0.5M NaCl洗脱柱子，收集到15ml洗脱液C。共进行6次亲和层析，得到90ml洗脱液C。使用截留分子量为30kDa的超滤离心管对洗脱液C离心浓缩得1.95ml浓缩液D。

在 start系统上对浓缩液D进行Sephacryl S-300凝胶过滤，以120ml TE+0.15M NaCl为流动相，用UV 280nm监测凝胶过滤过程中蛋白含量变化，收集过滤组分，得到纯黄素蛋白TrxR。

用DTNB法对上清液B和最终的纯黄素蛋白TrxR进行动力学测试，计算总活力，得到TrxR的终收率为77％。

实施例3

将4L含有黄素蛋白TrxR的大肠杆菌菌液低速离心收集到约14g湿菌体，加入55mlTE buffer使菌体充分混匀，加入55μl浓度为50mg/ml的溶菌酶，37℃作用1h，反复冻融三次，充分破碎细胞得到混合液A。使用超声破碎仪冰上操作，70％振幅，工作2s停止3s，持续2min破碎混合液A中核酸。使用离心机，4℃，13000rpm离心混合液A20min，获得55ml含有黄素蛋白TrxR的上清液B。

向上清液B中加入2.3ml 0.5M的EDTA，使上清液B中EDTA的终浓度为20mM。每次取5ml上清液B上样进5ml柱体积的2’5’ADP Sepharose亲和层析柱2中，用100ml TE buffer清洗柱子，接着用15ml TE+0.5M NaCl洗脱柱子，收集到15ml洗脱液C。共进行11次亲和层析，得到170ml洗脱液C。使用截留分子量为30kDa的超滤离心管对洗脱液C离心浓缩得3.95ml浓缩液D。

在 start系统上对浓缩液D进行Sephacryl S-300凝胶过滤，以120ml TE+0.15M NaCl为流动相，用UV 280nm监测凝胶过滤过程中蛋白含量变化，收集过滤组分，得到纯黄素蛋白TrxR。

用DTNB法对上清液B和最终的纯黄素蛋白TrxR进行动力学测试，计算总活力，得到TrxR的终收率为67％。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法，其特征在于以下步骤：

(1)以含有黄素蛋白TrxR的大肠杆菌为原材料，每1g质量的大肠杆菌湿菌体加入4-9mlTE buffer缓冲液使菌体充分混匀得到混合液；再加入溶菌酶，使混合液中溶菌酶的最终浓度为50μg/ml，37℃作用0.5-1h，反复冻融三次，充分破碎细胞得到混合液A；采用超声破碎仪破碎混合液A中核酸；采用离心机对混合液A进行离心处理，得到含有黄素蛋白TrxR的上清液B；

(2)将乙二胺四乙酸EDTA加入上清液B中，使上清液B中EDTA的终浓度为20mM；再将上清液B加入ADP Sepharose亲和层析柱中，采用TE buffer清洗柱子；接着采用TE+0.5M NaCl洗脱柱子，收集洗脱液C；最后采用截留分子量为30kDa的超滤离心管对洗脱液C离心浓缩得浓缩液D；

(3)在 start层析系统上对浓缩液D进行聚丙烯酰胺葡聚糖Sephacryl S-300凝胶过滤，以TE+0.15M NaCl为流动相，用UV 280nm监测凝胶过滤过程中蛋白含量变化，收集过滤组分，得到纯黄素蛋白TrxR。

2.根据权利要求1所述的一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中超声破碎仪破碎混合液A中核酸的方法是冰上操作，70％振幅，开2s停3s，工作2min。

3.根据权利要求1或2所述的一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中上清液B的ADP Sepharose亲和层析过程为两个柱体积CV上样，20 CV TE buffer清洗非特异性结合在配基上的杂蛋白，3CV TE+0.5M NaCl洗脱特异性结合在ADP配基上的TrxR。

4.根据权利要求1或2所述的一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中采用离心机对混合液A进行离心处理的温度为：4℃，转速为13000rpm/min，离心时间为20分钟。

5.根据权利要求3所述的一种改善黄素蛋白TrxR纯化的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中采用离心机对混合液A进行离心处理的温度为：4℃，转速为13000rpm/min，离心时间为20分钟。