CN113698494A - 纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了纯化CR2‑crry重组蛋白的制备方法，涉及重组蛋白制备纯化技术领域，该纯化CR2‑crry重组蛋白的制备方法，包括基因筛选→基因重组→基因克隆→克隆筛选→蛋白表达→蛋白纯化，CR2‑crry重组蛋白作为目的蛋白，纯化包括以下步骤：S1：发酵表达，通过过滤固液分离收集发酵液，浓缩，S2：加入蛋白酶抑制剂，采用PEI沉淀法分开目的蛋白和其他细胞成分，首先在低盐浓度下沉淀核酸以及含有目的蛋白的组分，经过低盐浓度缓冲液的洗杂步骤后，使用高盐缓冲液将目的蛋白从沉淀中复溶，再经过硫酸铵沉淀的方式沉淀目的蛋白，含有的PEI保持在上清液中，最后将沉淀用缓冲试剂复溶得到含有目的蛋白的粗纯样品。解决了CR2‑crry重组蛋白构建和高效纯化的问题。

Description

纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法
技术领域
本发明涉及重组蛋白制备纯化技术领域，具体为纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法。
背景技术
重组蛋白是应用基因重组技术，将可以翻译成目的蛋白的基因片段整合到重组表达载体中，再将整合后的重组表达载体转入可以表达目的蛋白的宿主细胞从而表达特定的重组蛋白分子。
随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的不断深入，人们意识到仅仅依靠基因组的序列分析来试图阐明生命活动的现象和本质是远远不够的。只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究，才能更科学地掌握生命现象和活动规律，更完善地揭示生命的本质。研究蛋白质首要的步骤是将目的蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来，得到高纯度具有生物学活性的目的物。因此，高效的纯化技术和手段是蛋白质研究的重要基础和关键之一。
产生的重组蛋白作为生物制药的产物，在医学中作用显著，不同蛋白质的氨基酸序列及空间结构不同，导致其在物理、化学、生物学等性质上存在差异，利用待分离蛋白质与其它蛋白质性质上的差异纯化，结合重组蛋白制备，我们提供了纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法。
发明内容
(一)解决的技术问题
本发明提供了纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，解决了CR2-crry重组蛋白构建和高效纯化的问题。
(二)技术方案
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，包括基因筛选→基因重组→基因克隆→克隆筛选→蛋白表达→蛋白纯化，CR2-crry重组蛋白作为目的蛋白，纯化包括以下步骤：
S1：发酵表达，通过过滤固液分离收集发酵液，浓缩；
S2：加入蛋白酶抑制剂，采用PEI沉淀法分开目的蛋白和其他细胞成分，首先在低盐浓度下沉淀核酸以及含有目的蛋白的组分，经过低盐浓度缓冲液的洗杂步骤后，使用高盐缓冲液将目的蛋白从沉淀中复溶；
再经过硫酸铵沉淀的方式沉淀目的蛋白，含有的PEI保持在上清液中，最后将沉淀用缓冲试剂复溶得到含有目的蛋白的粗纯样品；
S3：超滤处理，利用离心力，使水和其他小的溶质分子通过半透膜，蛋白质留在膜上，选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质，去除颗粒物，净化，用于层析纯化，净化后立即使用；
S4：通过Heparin亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析以及分子筛中的一种或几种方式组合进一步纯化。
优选的，在步骤S1中，所述发酵参数为：pH5.0，温度29℃，溶氧控制大于30％。
优选的，在步骤S1中，所述过滤用的过滤组件为0.22μm中空纤维膜超滤。
优选的，为了将CR2连接到crry，使用链接序列编码(GGGGS)2，采用标准pcr方法制备基因构建物。
优选的，所述基因克隆步骤在PBM载体中进行，PBM载体也用于蛋白表达。
优选的，通过限制稀释法筛选稳定转染的克隆，通过ELISA法定量检测克隆蛋白的表达。
优选的，在步骤S2中，加入DNA酶，降解DNA。
优选的，在步骤S4中，所述离子交换层析的填料为球形，且粒径分布均一。
优选的，在步骤S4中，所述凝胶过滤层析的填料为葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶的分层多层组合层。
优选的，所述纯化CR2-crry重组蛋白在使用前放入-80℃温度下冷冻。
(三)有益效果
本发明提供了纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，具备以下有益效果：
本发明应用基因重组技术，通过结合以PEI沉淀法为基础进行的重组蛋白粗分离纯化，以超滤处理为过渡进行的层析预处理净化，以层析纯化为后序精细纯化处理的重组蛋白精纯化，利用粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如RNA、DNA等分开，利用精细纯化阶段把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，达到制备得到高效纯化的CR2-crry重组蛋白的目的。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，包括基因筛选→基因重组→基因克隆→克隆筛选→蛋白表达→蛋白纯化；
基因筛选：筛选到可翻译表达目的蛋白的基因序列；
基因重组：将得到的目的基因序列和其它辅助基因序列连接起来，形成新的基因序列；
基因克隆：把重组的基因序列导入可繁殖的受体细胞中；
克隆筛选：将带有重组基因的克隆细胞从细胞群中筛选出来，通过限制稀释法筛选稳定转染的克隆；
蛋白表达：将克隆细胞扩大培养，在培养中让目的基因得以翻译表达，表达出蛋白，用ELISA法定量检测克隆蛋白的表达；
为了将CR2连接到crry，使用链接序列编码(GGGGS)2，采用标准pcr方法制备基因构建物，基因克隆步骤在PBM载体中进行，PBM载体也用于蛋白表达；
CR2-crry重组蛋白作为目的蛋白，纯化包括以下步骤：
S1：发酵表达，通过过滤固液分离收集发酵液，浓缩，其中发酵参数为：pH5.0，温度29℃，溶氧控制大于30％，过滤用的过滤组件为0.22μm中空纤维膜超滤，使用10000MW纤维素浓缩器浓缩；
S2：加入蛋白酶抑制剂，采用PEI沉淀法分开目的蛋白和其他细胞成分，首先在低盐浓度下沉淀核酸以及含有目的蛋白的组分，经过低盐浓度缓冲液的洗杂步骤后，使用高盐缓冲液将目的蛋白从沉淀中复溶；
再经过硫酸铵沉淀的方式沉淀目的蛋白，含有的PEI保持在上清液中，最后将沉淀用缓冲试剂复溶得到含有目的蛋白的粗纯样品，粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如RNA、DNA等分开；
S3：超滤处理，利用离心力，使水和其他小的溶质分子通过半透膜，蛋白质留在膜上，选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质，去除颗粒物，净化，用于层析纯化，净化后立即使用；
S4：通过Heparin亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析以及分子筛中的一种或几种方式组合进一步纯化，组合使用纯化效果更佳，利用精细纯化阶段把目的蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，其中，凝胶过滤层析柱加细、加长设计。
作为本发明的一种技术优化方案，在步骤S2中，核酸是一类常见的杂质成分，加入DNA酶，降解DNA杂质。
作为本发明的一种技术优化方案，在步骤S4中，所述离子交换层析的填料为球形，且粒径分布均一。
作为本发明的一种技术优化方案，在步骤S4中，所述凝胶过滤层析的填料为葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶的分层多层组合层。
作为本发明的一种技术优化方案，纯化CR2-crry重组蛋白在使用前放入-80℃温度下冷冻。
需要说明的是，在本文中，诸如术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：包括基因筛选→基因重组→基因克隆→克隆筛选→蛋白表达→蛋白纯化，CR2-crry重组蛋白作为目的蛋白，纯化包括以下步骤：
S1：发酵表达，通过过滤固液分离收集发酵液，浓缩；
S2：加入蛋白酶抑制剂，采用PEI沉淀法分开目的蛋白和其他细胞成分，首先在低盐浓度下沉淀核酸以及含有目的蛋白的组分，经过低盐浓度缓冲液的洗杂步骤后，使用高盐缓冲液将目的蛋白从沉淀中复溶；
再经过硫酸铵沉淀的方式沉淀目的蛋白，含有的PEI保持在上清液中，最后将沉淀用缓冲试剂复溶得到含有目的蛋白的粗纯样品；
S3：超滤处理，利用离心力，使水和其他小的溶质分子通过半透膜，蛋白质留在膜上，选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质，去除颗粒物，净化，用于层析纯化，净化后立即使用；
S4：通过Heparin亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析以及分子筛中的一种或几种方式组合进一步纯化。
2.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S1中，所述发酵参数为：pH5.0，温度29℃，溶氧控制大于30％。
3.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S1中，所述过滤用的过滤组件为0.22μm中空纤维膜超滤。
4.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：为了将CR2连接到crry，使用链接序列编码(GGGGS)2，采用标准pcr方法制备基因构建物。
5.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述基因克隆步骤在PBM载体中进行，PBM载体也用于蛋白表达。
6.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：通过限制稀释法筛选稳定转染的克隆，通过ELISA法定量检测克隆蛋白的表达。
7.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S2中，加入DNA酶，降解DNA。
8.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S4中，所述离子交换层析的填料为球形，且粒径分布均一。
9.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：在步骤S4中，所述凝胶过滤层析的填料为葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶的分层多层组合层。
10.根据权利要求1所述的纯化CR2-crry重组蛋白的制备方法，其特征在于：所述纯化CR2-crry重组蛋白在使用前放入-80℃温度下冷冻。
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