CN116790578B - 一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺 - Google Patents
一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116790578B CN116790578B CN202311054482.4A CN202311054482A CN116790578B CN 116790578 B CN116790578 B CN 116790578B CN 202311054482 A CN202311054482 A CN 202311054482A CN 116790578 B CN116790578 B CN 116790578B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hollow fiber
- flow rate
- plasmid
- liquid
- concentrating
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000005336 cracking Methods 0.000 title abstract description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 61
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 34
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 28
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims abstract description 27
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 26
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims abstract description 13
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims abstract description 13
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims description 47
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 21
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 18
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 17
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 16
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 15
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 14
- 238000005352 clarification Methods 0.000 claims description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 9
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims description 7
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 7
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 43
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 14
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 14
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 12
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 12
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 6
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 4
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000013622 capto Q Substances 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- IOQPZZOEVPZRBK-UHFFFAOYSA-N octan-1-amine Chemical group CCCCCCCCN IOQPZZOEVPZRBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007142 ring opening reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺,涉及生物技术领域。该生产工艺包括以下步骤:对裂解液进行澄清过滤和浓缩换液,得到浓缩液;对所述浓缩液进行羟基磷灰石层析,得到超螺旋质粒洗脱液;对所述超螺旋质粒洗脱液进行终浓缩处理,即得目的质粒;所述裂解液是菌体原料经碱裂解和中和处理后所得到;所述浓缩液中含有100‑250mM NaCl;所述羟基磷灰石层析采用的洗脱液包括0.5M NaCl。本发明的生产工艺使用羟基磷灰石层析方法,在浓缩换液后,使浓缩液保持一定的氯化钠浓度,直接流穿,然后经过高浓度的氯化钠进行洗脱,即可得到较高质量的超螺旋质粒。该生产工艺可以有效提升质粒的回收率和生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺。
背景技术
碱性裂解法是DNA提取成本最低、所需时间最短的方法。所谓碱性裂解提取法,即在强碱作用下,快速破坏蛋白质的一级结构,正因为强碱对蛋白质有强烈的变性乃至裂解作用,所以,检材在强碱性PH条件及一定温度状况下能迅速破碎细胞及核膜,使核酸酶变性及DNA释放。但是现有的碱性裂解法也存在一些不足之处,例如大量生产质粒,在经破碎重悬、裂解、中和后,样品体积会呈2倍-3倍的增加,为后续纯化增加工作时间。例如:200g菌,经过重悬(10:1)、裂解(1:1)和中和(1:1),体积就达到了5500mL,为后续层析步骤增加很多工作量。因此碱裂解的步骤所产生的大体积的溶液,需要澄清和浓缩的步骤缩小体积,再配合传统工艺的三步法(图1)层析纯化质粒。常用的澄清方法是离心或者添加絮凝剂(如:硫酸铵沉淀,CaCl2沉淀等),也有添加NH4HCO3或NaHCO3的,使之自然分层,但结果往往是操作繁琐,容易产生污染,难以工艺放大,工艺验证困难,成本高昂。传统三步法中使用Sepharose 6 FF分子筛层析,可收获质粒DNA,去除RNA、蛋白等大量杂质,分辨率高,但通量只能做到柱体积的0.3 CV,而且对柱效的要求极高,还需要衔接Capto PlasmidSelect进行开环质粒的去除和Capto Q ImpRes内毒素、宿主蛋白及宿主核酸的去除,如果需要处理大体积菌液,需要填装大体积层析柱或者分多批次进行层析,直接导致不易操作或者步骤繁琐。
目前,有改良后的两步层析法(图2),使用复合层析填料(Core 700+疏水层析)代替三步法中的分子筛和阴离子交换层析进行质粒的生产纯化,Capto Core 700为复合模式层析填料,质粒DNA等大分子不能通过其惰性外壳的孔进入核内,经过外水直接流穿,而较小杂质如RNA片段、蛋白质与内毒素片段等经过小孔进入内核,与核内的辛胺基团结合,达到分离的目的,再配合PlasmidSelect Xtra嗜硫亲和层析,来分离ocDNA(开环质粒)和scDNA(超螺旋质粒),提高质粒的均一性。虽然两步法使层析步骤减少,提高了纯化效率,但是回收率一般,只有75%左右,造成回收率损失较大。为进一步提高纯化收率和生产效率,有必要继续对质粒生产工艺进行优化。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺,以解决上述现有技术存在的问题,利用该生产工艺进行质粒生产,可以有效提升质粒的回收率和生产效率。
为实现上述目的,本发明提供了如下方案:
本发明提供一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺,包括以下步骤:
对裂解液进行澄清过滤和浓缩换液,得到浓缩液;
对所述浓缩液进行羟基磷灰石层析,得到超螺旋质粒洗脱液;
对所述超螺旋质粒洗脱液进行终浓缩处理,即得目的质粒;
所述裂解液是菌体原料经碱裂解和中和处理后所得到;
所述浓缩液中含有100-250mM NaCl;
所述羟基磷灰石层析采用的洗脱液包括0.5M NaCl。
进一步地,所述澄清过滤包括离心和中空纤维柱过滤处理;所述中空纤维柱为0.5μm中空纤维柱。
进一步地,所述中空纤维柱过滤处理的流速为1200mL/min,压力为3-8Psi。
进一步地,所述浓缩换液采用300KD中空纤维柱。
进一步地,所述浓缩换液的流速为420mL/min,压力为3-8Ps。
进一步地,所述浓缩换液采用平衡液进行溶液置换,所述平衡液包括100mM Tris-HCl和150mM NaCl。
进一步地,所述羟基磷灰石层析包括平衡、上样、再平衡和洗脱处理;
所述平衡、所述上样、所述再平衡和所述洗脱的流速均为15mL/min。
进一步地,所述终浓缩采用30KD中空纤维柱。
进一步地,所述终浓缩的流速为50mL/min,压力为3-5Psi。
本发明公开了以下技术效果:
本发明使用羟基磷灰石层析的方法进行层析,在浓缩换液后,使浓缩液保持一定的氯化钠浓度,使开环质粒和一些相关杂质不易与羟基磷灰石填料进行结合,直接流穿,然后经过含有高浓度氯化钠的洗脱液的洗脱,即可得到较高质量的超螺旋质粒。
本发明不需要额外的增加凝胶过滤或者疏水层析的步骤,即可使杂质流穿,然后一步洗脱即得目的质粒,回收率达到95%以上,大大提高了质粒的生产效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为三步法纯化质粒的工艺流程图;
图2为两步法纯化质粒的工艺流程图;
图3为本发明质粒生产工艺的工艺流程图;
图4为羟基磷灰石CHT层析的图谱;
图5为实施例1中羟基磷灰石CHT层析步骤的酶切验证结果;其中,M:Mark;1:原菌液;2:流穿杂质;3:目的质粒;
图6为对比例1中Core 700层析的图谱;
图7为对比例1中PlasmidSelect Xtra层析的图谱;
图8为对比例1中PlasmidSelect Xtra层析步骤的酶切验证结果;其中,1:原菌液;2:core700层析后(除去RNA);3:原质粒(Core 700层析后);4:洗杂(开环质粒);5:亲和流穿;6:目的质粒;
图9为对比例2中Sepharose 6 FF层析的图谱;
图10为对比例2中Sepharose 6 FF层析步骤的酶切验证结果;其中,1:原质粒(未过6FF层析);2:经过6FF层析后(去除RNA)。
图11为对比例2中PlasmidSelect Xtra层析的图谱;
图12为对比例2中PlasmidSelect Xtra层析步骤的酶切验证结果;
图13为对比例2中Capto Q ImpRes层析的图谱。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值,以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明,否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料,但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入,用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时,以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下,可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化,这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等,均为开放性的用语,即意指包含但不限于。
以下实施例或对比例所用的菌体是对重组基因工程菌发酵培养后得到;该重组基因工程菌是委托赛奥斯博生物科技(北京)有限公司构建,具体是先合成目的基因序列VSVG(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示),再采用质粒全序列合成加环化的克隆方式构建成环状质粒(根据addgene网站上获得表达载体质粒的骨架序列pLenti-EF1a-Backbone(NG),ID:#27963),再通过化学转化方式将构建的质粒导入Stbl3大肠杆菌宿主菌株,最后鉴定筛选出符合要求的重组基因工程菌。
以下实施例或对比例中使用的溶液配方如表1所示:
表1 溶液配方
实施例1
本实施例采用一步法纯化质粒,工艺流程见图3。
1.碱裂解
实验目的:裂解菌体,提取质粒。
将菌体按菌体湿重重量(g):P1体积(mL)=1:10加入缓冲液P1,用匀浆机(均质机)将其充分重悬;将缓冲液P2按P1:P2=1:1的体积比快速加入菌体重悬液中,缓慢轻轻搅拌15次混匀,此操作过程应严格控制时间1min,混合均匀,之后再加入缓冲液P3(按P1:P3=1:1的体积比快速加入),搅拌混合均匀后,静置15min,得到碱裂解液,继续进行下一步澄清过滤。
2.澄清过滤
实验目的:去除菌体碎片。
通过离心和中空纤维过滤进行澄清:
2.1离心:打开离心机,放入转子,设置参数离心力10000g(7500rpm),20min,4ºC;将碱裂解液倒入离心杯中,配平,把离心杯放入转子,将转子的盖子拧紧,盖上离心机的盖,启动机器;待离心机停止后,取出离心杯,将上清透过16层纱布倒入烧杯中,弃去沉淀。
2.2中空纤维过滤:打开超滤浓缩系统,将0.5μm中空纤维柱进液端以硅胶管连接至仪器并固定;输入中空纤维柱型号、管道型号,设置流速为1200mL/min,过滤过程中控制所有压力8Psi(3-8Psi可达相同效果),在过滤完成后,用PBS缓冲液循环3次并冲洗中空纤维柱,收取透过端过滤液,过滤液与PBS洗液合在一起称为澄清过滤液。
3.浓缩换液
打开超滤浓缩系统,将300KD中空纤维柱进液端以硅胶管连接至仪器并固定,设置流速为420mL/min,取出澄清过滤液,将进液端和回流端硅胶管插入澄清过滤液中,透过端插入废液桶中;浓缩过程中控制所有压力8Psi(3-8Psi可达相同效果),在浓缩至250mL后,加入等体积平衡液A1,浓缩换液3次,将中空纤维柱中的溶液全部顶出;封闭透过端,将进液端和回流端硅胶管插入50mL平衡液中循环冲洗中空纤维柱2min,重复冲洗1次。
本步骤得到的浓缩液中含有150mM NaCl(NaCl浓度控制在100mM-250mM范围可达相同效果)。
4.层析(羟基磷灰石CHT)
实验目的:利用离子交换原理,去除大部分的RNA、HCP(宿主细胞蛋白)、HCD(宿主细胞残留DNA)杂质。
4.1上柱纯化:
平衡:15mL/min流速(线性流速为80cm/h),用纯化水冲洗层析柱直至电导率为0,然后用100%平衡液A1平衡柱子,至电脑界面显示电导率、紫外260、pH基线平稳,调UV260ZERO。
上样:15mL/min流速上样。当紫外信号出现时,开始收集流穿,流穿的紫外峰为开环质粒杂质(图4)。
再平衡:15mL/min流速,使用平衡液A1,平衡至紫外基线处,停止收集流穿,待洗脱。
洗脱:15mL/min流速,使用洗脱液B1进行洗脱,紫外峰出现,开始收集,此为目的超螺旋质粒(图4)。
本步骤酶切验证结果见图5。
5.终浓缩
实验目的:缩小样品体积,提高质粒浓度。
取出4.1得到的目的超螺旋质粒的洗脱液,利用30KD中空纤维柱进行浓缩:将进液端和回流端硅胶管插入洗脱液中,透过端插入废液桶中;设置流速为50mL/min,开始浓缩,浓缩过程中控制所有压力5Psi(3-5Psi可达相同效果)。在浓缩至40mL时,加入10倍体积的PBS溶液,继续浓缩至40mL,将中空纤维柱中的质粒溶液全部顶出,封闭透过端;将进液端和回流端硅胶管插入5mL PBS中循环冲洗中空纤维柱2min,重复循环1次,2次冲洗液和顶出液混合为终浓缩液,即提取得到的目标质粒产品。
对比例1
1.碱裂解
实验目的:裂解菌体,提取质粒。
将菌体按菌体湿重重量(g):P1体积(mL)=1:10加入缓冲液P1,用匀浆机(均质机)将其充分重悬;将缓冲液P2按P1:P2=1:1的体积比快速加入菌体重悬液中,缓慢轻轻搅拌15次混匀,此操作过程应严格控制时间1min,混合均匀,之后再加入缓冲液P3(按P1:P3=1:1的体积比快速加入),搅拌混合均匀后,静置15min,得到碱裂解液,继续进行下一步澄清过滤。
2.澄清过滤
实验目的:去除菌体碎片。
通过离心和中空纤维过滤进行澄清:
2.1离心:打开离心机,放入转子,设置参数离心力10000g(7500rpm),20min,4ºC;将碱裂解液倒入离心杯中,配平,把离心杯放入转子,将转子的盖子拧紧,盖上离心机的盖,启动机器;待离心机停止后,取出离心杯,将上清透过16层纱布倒入烧杯中,弃去沉淀。
2.2中空纤维过滤:打开超滤浓缩系统,将0.5μm中空纤维柱进液端以硅胶管连接至仪器并固定;输入中空纤维柱型号、管道型号,设置流速为1200mL/min,过滤过程中控制所有压力8Psi,在过滤完成后,用PBS缓冲液循环3次并冲洗中空纤维柱,收取透过端过滤液,过滤液与PBS洗液合在一起称为澄清过滤液。
3.浓缩换液
打开超滤浓缩系统,将300KD中空纤维柱进液端以硅胶管连接至仪器并固定,设置流速为420mL/min,取出澄清过滤液,将进液端和回流端硅胶管插入澄清过滤液中,透过端插入废液桶中;浓缩过程中控制所有压力8Psi,在浓缩至250mL后,加入等体积平衡液A1,浓缩换液3次,将中空纤维柱中的溶液全部顶出;封闭透过端,将进液端和回流端硅胶管插入50mL平衡液A1中循环冲洗中空纤维柱2min,重复冲洗1次。
4.复合层析
实验目的:利用分子筛原理,去除大部分的RNA、HCP、HCD杂质。
Core 700层析:
4.1上柱纯化:
平衡:15mL/min流速(线性流速为80cm/h),用纯化水冲洗层析柱直至电导率为0,然后用100%平衡液A2平衡柱子,至电脑界面显示电导率:229.235ms/cm,pH:7.50;调UV260ZERO。
上样:15mL/min流速上样,当紫外信号出现时,开始收集流穿(图6)。
平衡:15mL/min流速,使用平衡液A2液,平衡至紫外基线处,停止收集流穿,待亲和层析。
5.亲和层析(AC)
实验目的:利用超螺旋质粒与介质配基的特异性结合的特性,去除开环质粒(产品相关杂质)。
PlasmidSelect Xtra层析:
5.1上柱纯化:
平衡:10mL/min流速,用纯化水冲洗层析柱直至电导率为0,然后用100%平衡液A2平衡柱子,至电脑界面显示电导率为219.033ms/cm,pH:7.55;调UV 260 ZERO。
上样:10mL/min流速上样(保留时间≥3min);样品电导值应在210.324ms/cm左右,上柱前应再次用电导率仪验证。
平衡:10mL/min流速,100%平衡液A2冲洗5CV。
洗脱1:10mL/min流速,100%平衡液A3洗脱,洗脱杂质(主要是开环质粒)。
洗脱2:10mL/min流速,100%洗脱液B2,当UV260为50.256mAu时收取,当紫外峰降至300.258mAu时停止收取洗脱液,待浓缩换液(图7)。
本步骤的酶切验证结果见图8。
6.终浓缩
实验目的:缩小样品体积,提高质粒浓度。
取出亲和洗脱液,利用30KD中空纤维柱进行浓缩:将进液端和回流端硅胶管插入洗脱液中,透过端插入废液桶中;设置流速为50mL/min,开始浓缩,浓缩过程中控制所有压力5Psi。在浓缩至40mL时,加入10倍体积的PBS溶液,继续浓缩至40mL,将中空纤维柱中的质粒溶液全部顶出,封闭透过端;将进液端和回流端硅胶管插入5mL PBS中循环冲洗中空纤维柱2min,重复循环1次,2次冲洗液和顶出液混合为终浓缩液,即提取得到的目标质粒产品。
对比例2
1.碱裂解
实验目的:裂解菌体,提取质粒。
将菌体按菌体湿重重量(g):P1体积(mL)=1:10加入缓冲液P1,用匀浆机(均质机)将其充分重悬;将缓冲液P2按P1:P2=1:1的体积比快速加入菌体重悬液中,缓慢轻轻搅拌15次混匀,此操作过程应严格控制时间1min,混合均匀,之后再加入缓冲液P3(按P1:P3=1:1的体积比快速加入),搅拌混合均匀后,静置15min,得到碱裂解液,继续进行下一步澄清过滤。
2.分级沉淀,梯度离心
本步骤的目的是去除菌体碎片。
2.1离心:打开离心机,放入转子,设置参数离心力10000g(7500rpm),20min,4ºC;将碱裂解液倒入离心杯中,配平,把离心杯放入转子,将转子的盖子拧紧,盖上离心机的盖,启动机器;待离心机停止后,取出离心杯,将上清透过16层纱布倒入烧杯中,弃去沉淀。
2.2氯化钙沉淀:向2.1得到的离心上清液中缓慢加入5M氯化钙溶液至终浓度为1M,搅拌均匀后,静置1h,之后再次离心,去除沉淀。氯化钙加入的目的是沉淀宿主菌长链RNA、宿主菌基因组DNA及宿主蛋白等杂质。
2.3中空纤维过滤:打开超滤浓缩系统,将0.5μm中空纤维柱进液端以硅胶管连接至仪器并固定;输入中空纤维柱型号、管道型号,设置流速为1200mL/min,过滤过程中控制所有压力8Psi,在过滤完成后,用PBS缓冲液循环3次并冲洗中空纤维柱,收取透过端过滤液,过滤液与PBS洗液合在一起称为澄清过滤液。
3.浓缩换液
打开超滤浓缩系统,将300KD中空纤维柱进液端以硅胶管连接至仪器并固定,设置流速为420mL/min,取出澄清过滤液,将进液端和回流端硅胶管插入澄清过滤液中,透过端插入废液桶中;浓缩过程中控制所有压力8Psi,在浓缩至250mL后,加入等体积平衡液A1,浓缩换液3次,将中空纤维柱中的溶液全部顶出;封闭透过端,将进液端和回流端硅胶管插入50mL平衡液中循环冲洗中空纤维柱2min,重复冲洗1次。
4.凝胶过滤(GFC)
本步骤的目的是利用分子筛原理,去除大部分的RNA、HCP、HCD杂质。
Sepharose 6 FF层析:
平衡:100mL/min流速(线性流速为80cm/h),用纯化水冲洗层析柱直至电导率为0,然后用100%平衡液A2平衡柱子,至电脑界面显示电导率:229.230ms/cm,pH:7.55;调UV260ZERO。
上样:设置流速100mL/min,将步骤三种超滤浓缩液依次经3μm与0.45μm滤膜过滤得到的样品上样。上样体积为0.3CV。
洗脱:100mL/min流速,100%平衡液A2液洗脱,当UV为20mAu时开始收取,当紫外峰降至18mAu时停止收取洗脱液,待亲和层析(图9)。
本步骤的酶切验证结果见图10。
5.亲和层析(AC)
本步骤的目的是利用超螺旋质粒与介质配基的特异性结合的特性,去除开环质粒(产品相关杂质)。
PlasmidSelect Xtra层析:
5.1上柱纯化:
平衡:10mL/min流速,用纯化水冲洗层析柱直至电导率为0,然后用100%平衡液A2平衡柱子,至电脑界面显示电导率为221.230ms/cm,pH:7.55;调UV 260 ZERO。
上样:10mL/min流速上样(保留时间≥3min);样品电导值为210.154ms/cm,上柱前应再次用电导率仪验证。
平衡:10mL/min流速,100%平衡液A2冲洗5CV。
洗脱1:10mL/min流速,100%平衡液A3洗脱,洗脱杂质(主要是开环质粒)。
洗脱2:10mL/min流速,100%洗脱液B2,当UV260为34.235mAu时收取,当紫外峰降至300.258mAu时停止收取洗脱液(图11),待浓缩换液。
本步骤的酶切验证结果见图12。
6.阴离子层析(AEC)
本步骤的目的是利用质粒与HCD、HCP、内毒素不同的等电点以至其与介质的结合强度不同,将目的质粒与HCD、HCP、内毒素杂质分子分离开。
Capto Q ImpRes层析:
平衡:30mL/min流速,用纯化水冲洗层析柱直至电导率为0,然后100%平衡液A3平衡柱子,至电脑界面显示电导率为43.286ms/cm,pH:7.55;调UV 260 ZERO。
上样:设置流速20mL/min,将步骤5亲和层析得到的洗脱液上样(保留时间≥3min)。
平衡:20mL/min流速,100%平衡液A4冲洗至电脑界面显示电导率为43.368ms/cm,pH:7.50。
洗脱:20mL/min流速,100%洗脱液B3,UV260为30.587mAu收取,当紫外峰降至50.289mAu或拐平不再下降时停止收取洗脱液(图13),待浓缩换液。
7.终浓缩
本步骤的目的是缩小样品体积,提高质粒浓度。
取出亲和洗脱液,利用30KD中空纤维柱进行浓缩:将进液端和回流端硅胶管插入洗脱液中,透过端插入废液桶中;设置流速为50mL/min,开始浓缩,浓缩过程中控制所有压力3-5Psi。在浓缩至40mL时,加入10倍体积的PBS溶液,继续浓缩至40mL,将中空纤维柱中的质粒溶液全部顶出,封闭透过端;将进液端和回流端硅胶管插入5mL PBS中循环冲洗中空纤维柱2min,重复循环1次,2次冲洗液和顶出液混合为终浓缩液,即提取得到的目标质粒产品。
以下以200g菌体原料为例,对实施例1和对比例1-2纯化质粒所需要的步骤、时间、耗材及鉴定结果进行对比,结果见表2-5。
表2 实验步骤对比结果
注:“-”为不涉及步骤。
表3 实验时间对比结果
注:“-”为不涉及步骤。
表4 实验耗材使用对比结果
注:“-”为不涉及步骤。
表5 检测结果对比结果
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (5)
1.一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺,其特征在于,包括以下步骤:
对裂解液进行澄清过滤和浓缩换液,得到浓缩液;
对所述浓缩液进行羟基磷灰石层析,得到超螺旋质粒洗脱液;
对所述超螺旋质粒洗脱液进行终浓缩处理,即得目的质粒;
所述裂解液是菌体原料经碱裂解和中和处理后所得到;
所述浓缩换液的具体步骤为:打开超滤浓缩系统,将300KD中空纤维柱进液端以硅胶管连接至仪器并固定,设置流速为420mL/min,取出澄清过滤液,将进液端和回流端硅胶管插入所述澄清过滤液中,透过端插入废液桶中;浓缩过程中控制所有压力3-8Psi,在浓缩至250mL后,加入等体积平衡液A1,浓缩换液3次,将中空纤维柱中的溶液全部顶出;封闭透过端,将进液端和回流端硅胶管插入50mL平衡液A1中循环冲洗中空纤维柱2min,重复冲洗1次,最终得到浓缩液,所述浓缩液中含有100-250mM NaCl;
所述羟基磷灰石层析的具体步骤为:
平衡:15mL/min流速,用纯化水冲洗层析柱直至电导率为0,然后用100%平衡液A1平衡柱子,至电脑界面显示电导率、紫外260和pH基线平稳,调UV260 ZERO;
上样:15mL/min流速上样,当紫外信号出现时,开始收集流穿;
再平衡:15mL/min流速,使用平衡液A1,平衡至紫外基线处,停止收集流穿,待洗脱;
洗脱:15mL/min流速,使用洗脱液B1进行洗脱,紫外峰出现,开始收集得到所述目的质粒;
所述平衡液A1的配方为:100mM Tris-HCl和150mM NaCl,pH 7.50;
所述洗脱液B1的配方为:100mM Tris-HCl和0.5M NaCl,pH 7.50;
所述生产工艺不包括凝胶过滤或疏水层析步骤。
2.根据权利要求1所述的生产工艺,其特征在于,所述澄清过滤包括离心和中空纤维柱过滤处理;所述中空纤维柱为0.5μm中空纤维柱。
3.根据权利要求2所述的生产工艺,其特征在于,所述中空纤维柱过滤处理的流速为1200mL/min,压力为3-8Psi。
4.根据权利要求1所述的生产工艺,其特征在于,所述终浓缩采用30KD中空纤维柱。
5.根据权利要求4所述的生产工艺,其特征在于,所述终浓缩的流速为50mL/min,压力为3-5Psi。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311054482.4A CN116790578B (zh) | 2023-08-22 | 2023-08-22 | 一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202311054482.4A CN116790578B (zh) | 2023-08-22 | 2023-08-22 | 一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116790578A CN116790578A (zh) | 2023-09-22 |
CN116790578B true CN116790578B (zh) | 2023-12-12 |
Family
ID=88044005
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202311054482.4A Active CN116790578B (zh) | 2023-08-22 | 2023-08-22 | 一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116790578B (zh) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6111096A (en) * | 1997-10-31 | 2000-08-29 | Bbi Bioseq, Inc. | Nucleic acid isolation and purification |
US6406892B1 (en) * | 2001-05-23 | 2002-06-18 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Acetate-free purification of plasmid DNA on hydroxyapatite |
US6730781B1 (en) * | 1996-03-21 | 2004-05-04 | Gencell S.A. | Purification of plasmid DNA of pharmaceutical quality |
CN114456940A (zh) * | 2022-01-23 | 2022-05-10 | 和元生物技术(上海)股份有限公司 | 一种提高大肠杆菌裂解过程中质粒稳定性的方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0028361D0 (en) * | 2000-11-21 | 2001-01-03 | Glaxo Group Ltd | Method of separating extra chromosomal dna from other cellular components |
-
2023
- 2023-08-22 CN CN202311054482.4A patent/CN116790578B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6730781B1 (en) * | 1996-03-21 | 2004-05-04 | Gencell S.A. | Purification of plasmid DNA of pharmaceutical quality |
US6111096A (en) * | 1997-10-31 | 2000-08-29 | Bbi Bioseq, Inc. | Nucleic acid isolation and purification |
US6406892B1 (en) * | 2001-05-23 | 2002-06-18 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Acetate-free purification of plasmid DNA on hydroxyapatite |
CN114456940A (zh) * | 2022-01-23 | 2022-05-10 | 和元生物技术(上海)股份有限公司 | 一种提高大肠杆菌裂解过程中质粒稳定性的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN116790578A (zh) | 2023-09-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109456963B (zh) | 一种大规模纯化质粒dna的方法 | |
CN114456940B (zh) | 一种提高大肠杆菌裂解过程中质粒稳定性的方法 | |
CN111876393A (zh) | 一种大规模快速生产高纯度高活性慢病毒载体的方法 | |
US20220145283A1 (en) | Purification Process for Biological Molecules Such as Plasmid DNA Using Anionic Exchange Chromatography | |
Hillebrandt et al. | Integrated process for capture and purification of virus-like particles: enhancing process performance by cross-flow filtration | |
CN112391383B (zh) | 一种质粒dna的产业化纯化方法及质粒dna | |
JPH10503086A (ja) | 大規模プラスミド精製方法 | |
CN111304193A (zh) | 一种大规模快速纯化质粒dna的方法 | |
CN116790578B (zh) | 一种基于碱裂解法快速纯化质粒的生产工艺 | |
EP3645139B1 (en) | Periodic countercurrent chromatography separation of plasmids | |
CN111304176A (zh) | 基于q-6xl和4ff的腺病毒载体规模化纯化方法 | |
CN114395015B (zh) | 一种适合工业化生产的重组颗粒蛋白产品及其制备方法 | |
US20230227791A1 (en) | Enhanced purification of adeno-associated virus to more effectively remove contaminating dna | |
WO2023031858A1 (en) | Plasmid dna purification methods | |
Guerrero‐Germán et al. | Purification of plasmid DNA from Escherichia coli ferments using anion‐exchange membrane and hydrophobic chromatography | |
CN115925890A (zh) | 一种抗新冠病毒中和抗体纯化方法 | |
CN116769736B (zh) | 一种快速纯化慢病毒的生产工艺 | |
CN108570098B (zh) | 一种百日咳多种抗原成分的分离纯化方法 | |
CN111733145A (zh) | 重组酶的纯化方法 | |
CN108048456A (zh) | 一种质粒提取方法 | |
CN106867994B (zh) | 应用于质粒dna提取的快速沉淀缓冲液及其应用 | |
CN115612684A (zh) | Gmp级质粒dna大规模简化生产方法 | |
JPH0330691A (ja) | 形質転換酵母細胞からb型肝炎表面抗原を単離する方法 | |
KR20220139697A (ko) | 제2형 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 수용체 결합도메인 정제방법 | |
CN116200282A (zh) | 乙型肝炎疫苗及其生产方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |