CN116769736B - 一种快速纯化慢病毒的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速纯化慢病毒的生产工艺，涉及生物技术领域。该生产工艺包括在经核酸酶预处理后的病毒原液中加入病毒保护剂，再依次经过澄清过滤、浓缩换液、复合层析和终浓缩，纯化得到所述慢病毒的步骤；所述澄清过滤、所述浓缩换液和所述终浓缩均采用中空纤维柱进行处理，并且所述澄清过滤、所述浓缩换液和所述终浓缩中的浓缩步骤的压力均控制在大于8Psi并不超过14Psi的范围内。该生产工艺提高了慢病毒的稳定性和回收率，使得在室温条件下，即可生产出高滴度和高回收率的慢病毒，从而为慢病毒的大规模生产奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种快速纯化慢病毒的生产工艺。
背景技术
现有的慢病毒生产工艺，比较常见的分离方法主要包括差速离心、尺寸排阻、超滤、聚合物沉淀、免疫亲和及集成微流控法，但无法大规模进行工艺处理，或者只是将病毒原液进行浓缩，以得到较高滴度的慢病毒。受慢病毒自身条件的影响，其具有降解速度快，对温度敏感等特性，所以工艺上无法得到高滴度且有高回收率的慢病毒产品。
慢病毒的上游工艺难以产生差异化，最大的挑战在于慢病毒的纯化过程。慢病毒由于具有包膜结构，理化性质不稳定，对剪切力敏感，容易造成下游工艺中的回收率较低，通常只有10%左右。因此对下游纯化工艺的开发和优化是解决慢病毒规模化生产瓶颈的关键。
现有技术常用的慢病毒的大规模生产技术为复合层析+阴离子层析技术（如图1所示），其缺点是步骤繁琐、纯化效率较低和时间过长等。这些缺点直接导致慢病毒不稳定，回收率较低。本发明尝试对现有技术进行优化，研发一种快速纯化慢病毒的生产工艺，以提高慢病毒的稳定性和回收率，从而方便扩大生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速纯化慢病毒的生产工艺，以解决上述现有技术存在的问题，该生产工艺提高了慢病毒的稳定性和回收率，使得在室温条件下，即可生产出高滴度和高回收率的慢病毒，从而为慢病毒的大规模生产奠定了基础。
病毒的特点是在室温条件下，一般6小时左右，生物滴度就会有40%-60%的降解，慢病毒在常温下的降解速度，随着时间的增加，病毒的滴度在降低。在收获慢病毒料液后，在不进行任何操作下，慢病毒也会缓慢降解：在6小时左右，测得该病毒液的生物滴度只有1.46E+06，损失约为42%，（如图6和表1所示），病毒不超过6小时，滴度呈缓慢下降，当超过6小时，病毒的降解加快，当达到8小时至10小时后，病毒基本到达衰亡期。
表1
慢病毒的培养原液生物滴度较低，一般在4.0E+05vg/mL-3.0E+06vg/mL，如果提取纯化过程的时间效率过低，将造成操作过程中的损失过大，进而直接影响整个慢病毒的回收率。因此，缩短提取纯化过程的操作时间，对提高慢病毒的回收率具有重要的意义。本发明考虑到提高浓缩处理的进样流速。然而随着流速的增加，压力同时在增加，压力的增加直接影响剪切力，从而造成病毒的蛋白外壳损坏，降低病毒的回收率。经验证，利用中空纤维柱进行浓缩处理时，慢病毒常规的耐受压力范围为2-8psi，超过这个范围将造成病毒回收率的大幅降低。为了解决操作时间对病毒回收率的影响，本发明省略阴离子层析步骤，采用澄清过滤-浓缩换液-复合层析-终浓缩的工艺进行病毒纯化，并提高了各浓缩步骤中空纤维柱的压力，此外，为了增加病毒对压力和剪切力的耐受性，本发明还添加了病毒保护剂（海藻糖、蔗糖、KCL、泊洛沙姆粉末和HAS溶液），从而提高了慢病毒的稳定性，最终提高了慢病毒回收率。
基于此，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种快速纯化慢病毒的生产工艺，其特征在于，包括在经核酸酶预处理后的病毒原液中加入病毒保护剂，再依次经过澄清过滤、浓缩换液、复合层析和终浓缩，纯化得到所述慢病毒的步骤；
所述澄清过滤、所述浓缩换液和所述终浓缩均采用中空纤维柱进行处理，并且所述澄清过滤、所述浓缩换液和所述终浓缩中的浓缩步骤的压力均控制在大于8Psi并不超过14Psi的范围内。
进一步地，所述澄清过滤采用规格为0.5μm的中空纤维柱；所述浓缩换液采用规格为500KD的中空纤维柱；所述浓缩换液采用规格为300KD的中空纤维柱。
进一步地，所述澄清过滤的进样流速为1200mL/min；所述浓缩换液的进样流速为420mL/min；所述浓缩换液的进样流速为50mL/min。
进一步地，所述复合层析采用的填料为Core700。
进一步地，所述病毒保护剂包括海藻糖、蔗糖、KCL、表面活性剂和HAS溶液。
进一步地，所述表面活性剂为泊洛沙姆。
进一步地，所述HAS溶液中HAS的质量分数为20%；所述海藻糖、所述蔗糖、所述KCL、所述泊洛沙姆和所述HAS溶液相对于经核酸酶预处理后的病毒原液的添加量分别为5wt%、5wt%、2mM、0.01wt%和10wt%。
本发明公开了以下技术效果：
本发明针对复合层析+阴离子层析技术进行优化，提出了一种快速纯化慢病毒的生产工艺，其采用澄清过滤-浓缩换液-复合层析-终浓缩的工艺，对经核酸酶预处理后的病毒原液进行纯化。其中，澄清过滤和各浓缩步骤均采用中空纤维柱的切向流工艺，澄清过滤步骤可以使病毒液透过，但使一些细胞碎片或者一些因细胞代谢产生的可见杂质不可透过，从而实现样本的澄清；浓缩换液和终浓缩步骤截留比中空纤维孔径大的病毒颗粒，使之反复回流，但在病毒培养过程添加的培养基可以透过孔径，使样本体积逐渐减少，但单位体积所含有的病毒量不断增加。本发明采用的复合层析的特点是处理样本量大，且具有分子筛和离子交换层析的功能，所以可以很有效地去除RNA、宿主蛋白、宿主核酸及内毒素，同时可以分离比柱体积多5-20倍体积的样本，并且病毒样本可以直接流穿，从而得到纯度较高的病毒液。
为了解决操作时间对病毒回收率的影响，本发明省略阴离子层析步骤，采用澄清过滤-浓缩换液-复合层析-终浓缩的工艺进行病毒纯化，并提高了各浓缩步骤中空纤维柱的压力，此外，为了增加病毒对压力和剪切力的耐受性，还使用了病毒保护剂（海藻糖、蔗糖、KCL、表面活性剂和HAS溶液），从而提高了慢病毒的稳定性，最终提高了慢病毒回收率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为复合层析+阴离子层析技术的工艺流程图；
图2为本发明快速纯化慢病毒的生产工艺的流程图；
图3为实施例1中复合层析步骤收集的流穿峰图；
图4为对比例1中复合层析步骤收集的流穿峰图；
图5为对比例1中Capto Q ImpRes层析步骤的流穿和洗脱峰图；
图6为慢病毒液在常温下不同降解时间的滴度。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
病毒的特点是在室温条件下，一般6小时左右，生物滴度就会有70%左右的降解。慢病毒的培养原液生物滴度较低，一般在4.0E+05vg/mL-2.0E+06vg/mL，如果提取纯化过程的时间效率过低，将造成操作过程中的损失过大，进而直接影响整个慢病毒的回收率。因此，缩短提取纯化过程的操作时间，对提高慢病毒的回收率具有重要的意义。本发明考虑到提高浓缩处理的进样流速。然而随着流速的增加，压力同时在增加，压力的增加直接影响剪切力，从而造成病毒的蛋白外壳损坏，降低病毒的回收率。经验证，利用中空纤维柱进行浓缩处理时，慢病毒常规的耐受压力范围为2-8psi，超过这个范围将造成病毒回收率的大幅降低。为了解决操作时间对病毒回收率的影响，本发明省略阴离子层析步骤，采用澄清过滤-浓缩换液-复合层析-终浓缩的工艺进行病毒纯化，并提高了各浓缩步骤中空纤维柱的压力，此外，为了增加病毒对压力和剪切力的耐受性，还添加了病毒保护剂（海藻糖、蔗糖、KCL、泊洛沙姆粉末和HAS溶液），从而提高了慢病毒的稳定性，最终提高了慢病毒回收率。基于上述研发思路形成的技术方案详述如下：
以下实施例或对比例中所使用的病毒原液是将含MSLN基因（序列如SEQ ID NO.1所示）的质粒转染至293T细胞所获得，其中表达MSLN基因的质粒是通过将MSLN基因插入PLX313 MSLN载体中而得到。
SEQ ID NO.1：
ATCAACAAGTTTGTACAAAAAAGTTGGCATGGCCTTGCTAACGGCTCGACCCCTGTTGGGGTCCTGTGGGACCCCCGCCCTCGGCAGCCTCCTGTTCCTGCTCTTCAGCCTCGGATGGGTGCAGCCCTCGAGGACCCTGGCTGGAGAGACAGGGCAGGAGGCTGCGCCCCTGGACGGAGTCCTGGCCAACCCACCTAACATTTCCAGCCTCTCCCCTCGCCAACTCCTTGGCTTCCCGTGTGCGGAGGTGTCCGGCCTGAGCACGGAGCGTGTCCGGGAGCTGGCTGTGGCCTTGGCACAGAAGAATGTCAAGCTCTCAACAGAGCAGCTGCGCTGTCTGGCTCACCGGCTCTCTGAGCCCCCCGAGGACCTGGACGCCCTCCCATTGGACCTGCTGCTATTCCTCAACCCAGATGCGTTCTCGGGGCCCCAGGCCTGCACCCGTTTCTTCTCCCGCATCACGAAGGCCAATGTGGACCTGCTCCCGAGGGGGGCTCCCGAGCGACAGCGGCTGCTGCCTGCGGCTCTGGCCTGCTGGGGTGTGCGGGGGTCTCTGCTGAGCGAGGCTGATGTGCGGGCTCTGGGAGGCCTGGCTTGCGACCTGCCTGGGCGCTTTGTGGCCGAGTCGGCCGAAGTGCTGCTACCCCGGCTGGTGAGCTGCCCGGGACCCCTGGACCAGGACCAGCAGGAGGCAGCCAGGGCGGCTCTGCAGGGCGGGGGACCCCCCTACGGCCCCCCGTCGACATGGTCTGTCTCCACGATGGACGCTCTGCGGGGCCTGCTGCCCGTGCTGGGCCAGCCCATCATCCGCAGCATCCCGCAGGGCATCGTGGCCGCGTGGCGGCAACGCTCCTCTCGGGACCCATCCTGGCGGCAGCCTGAACGGACCATCCTCCGGCCGCGGTTCCGGCGGGAAGTGGAGAAGACAGCCTGTCCTTCAGGCAAGAAGGCTCCCGAGATAGACGAGAGCCTCATCTTCTACAAGAAGTGGGAGCTGGAAGCCTGCGTGGATGCGGCCCTGCTGGCCACCCAGATGGACCGCGTGAACGCCATCCCCTTCACCTACGAGCAGCTGGACGTCCTAAAGCATAAACTGGATGAGCTCTACCCACAAGGTTACCCCGAGTCTGTGATCCAGCACCTGGGCTACCTCTTCCTCAAGATGAGCCCTGAGGACATTCGCAAGTGGAATGTGACGTCCCTGGAGACCCTGAAGGCTTTGCTTGAAGTCAACAAAGGGCACGAAATGAGTCCTCAGGTGGCCACCCTGATCGACCGCTTTGTGAAGGGAAGGGGCCAGCTAGACAAAGACACCCTAGACACCCTGACCGCCTTCTACCCTGGGTACCTGTGCTCCCTCAGCCCCGAGGAGCTGAGCTCCGTGCCCCCCAGCAGCATCTGGGCGGTCAGGCCCCAGGACCTGGACACGTGTGACCCAAGGCAGCTGGACGTCCTCTATCCCAAGGCCCGCCTTGCTTTCCAGAACATGAACGGGTCCGAATACTTCGTGAAGATCCAGTCCTTCCTGGGTGGGGCCCCCACGGAGGATTTGAAGGCGCTCAGTCAGCAGAATGTGAGCATGGACTTGGCCACGTTCATGAAGCTGCGGACGGATGCGGTGCTGCCGTTGACTGTGGCTGAGGTGCAGAAACTTCTGGGACCCCACGTGGAGGGCCTGAAGGCGGAGGAGCGGCACCGCCCGGTGCGGGACTGGATCCTACGGCAGCGGCAGGACGACCTGGACACGCTGGGGCTGGGGCTACAGGGCGGCATCCCCAACGGCTACCTGGTCCTAGACCTCAGCATGCAAGAGGCCCTCTCGGGGACGCCCTGCCTCCTAGGACCTGGACCTGTTCTCACCGTCCTGGCACTGCTCCTAGCCACCACCCTGGCCTGCC。
核酸酶预处理方法：在病毒原液中先加入氯化镁，再加入核酸酶，使氯化镁的在病毒原液中的终浓度为2mmol/mL，再加入10U/mL的核酸酶，最后在4℃，125rpm的摇床中振荡1h。
实施例1
将4.8L病毒原液经核酸酶预处理后，加入海藻糖、蔗糖、KCL、泊洛沙姆粉末（表面活性剂）和HAS（人血清白蛋白）溶液（其中海藻糖、蔗糖、KCL、泊洛沙姆粉末和HAS溶液相对于预处理后病毒原液的添加量分别为5wt%、5wt%、2mM、0.01wt%和10wt%，HAS溶液中HAS的含量为10wt%），按照图2所示的工艺流程进行如下操作：
（1）澄清过滤
利用0.5μm中空纤维柱进行澄清过滤：0.5μm中空纤维柱进液端、透过端、回流端分别连接至仪器并固定；设置流速为1200mL/min，Feed端压力控制在14Psi以下，将透过端和回流端硅胶管插进废液桶，进液端放入经核酸酶预处理后的病毒原液中，开始过滤，过滤过程中控制所有压力14Psi，在过滤完成后，用200mL PBS冲洗中空纤维柱，收取透过端过滤液，过滤液与PBS洗液合在一起称为澄清过滤液。
（2）浓缩换液
利用500KD中空纤维柱进行浓缩换液：将进液端和回流端硅胶管插入步骤（1）得到的澄清过滤液中，透过端插入废液桶中；设置流速为420mL/min，开始浓缩，浓缩过程中控制所有压力14Psi，在浓缩至200mL后，加入200mL置换液，浓缩换液3次；最后将中空纤维柱中的溶液全部顶出，封闭透过端，将进液端和回流端硅胶管插入50mL PBS中循环冲洗中空纤维柱2min，重复冲洗1次，2次冲洗液和顶出液混合为超滤浓缩液。
（3）复合层析
利用Core700进行复合层析：
平衡：25mL/min流速，用含有保护剂的PBS（即1×PBS中添加5wt%海藻糖、5wt%蔗糖、2mM KCL、0.01wt%泊洛沙姆粉末和10wt% HAS溶液），平衡层析柱至基线平稳。添加保护剂的目的是保护病毒颗粒的完整性和减缓慢病毒的降解，并使病毒在层析步骤也始终存在于保护液的环境中。
上样：步骤（2）得到的超滤浓缩液，以25mL/min流速上样。当紫外信号出现时，开始收集流穿（图3）。
平衡：25mL/min流速，再次使用含有保护剂的PBS平衡至紫外基线处，停止收集流穿。
收集流穿得到的液体即为复合层析液。
（4）终浓缩
利用300KD中空纤维柱进行浓缩：将300KD中空纤维柱进液端和回流端硅胶管插入步骤（3）得到的复合层析液中，透过端插入废液桶中；设置流速为50mL/min，开始浓缩，浓缩过程中控制所有压力14Psi。在浓缩至20mL时，加入1倍体积的PBS缓冲溶液，继续浓缩至20mL，将压力调整至8Psi，重复3次浓缩换液后，将中空纤维柱中的溶液全部顶出，封闭透过端；将进液端和回流端硅胶管插入5mL保存缓冲溶液中循环冲洗中空纤维柱2min，重复循环1次，2次冲洗液和顶出液混合为终浓缩液，即为提取纯化得到的慢病毒液。
统计本实施例中整体操作流程的生物滴度及回收率，结果见表2；对提取纯化得到的慢病毒液进行质量鉴定，结果见表3。
表2
表3
对比例1
将4.8L病毒原液经核酸酶预处理后，按照图1所示的工艺流程进行如下操作：
（1）澄清过滤
利用0.5μm中空纤维柱进行澄清过滤：0.5μm中空纤维柱进液端、透过端、回流端分别连接至仪器并固定；设置流速为1200mL/min，Feed端压力控制在3-5Psi以下，将透过端和回流端硅胶管插进废液桶，进液端放入经核酸酶预处理后的病毒原液中，开始过滤，过滤过程中控制所有压力3-5Psi，在过滤完成后，用200mL PBS冲洗中空纤维柱，收取透过端过滤液，过滤液与PBS洗液合在一起称为澄清过滤液。
（2）浓缩换液
利用500KD中空纤维柱进行浓缩换液：将进液端和回流端硅胶管插入步骤（1）得到的澄清过滤液中，透过端插入废液桶中；设置流速为420mL/min，开始浓缩，浓缩过程中控制所有压力3-5Psi以内，在浓缩至200mL后，加入200mL置换液，浓缩换液3次；最后将中空纤维柱中的溶液全部顶出，封闭透过端，将进液端和回流端硅胶管插入50mL PBS中循环冲洗中空纤维柱2min，重复冲洗1次，2次冲洗液和顶出液混合为超滤浓缩液。
（3）复合层析
利用Core700进行复合层析：
平衡：25mL/min流速，用PBS平衡层析柱至基线平稳。
上样：步骤（2）得到的超滤浓缩液，以25mL/min流速上样。当紫外信号出现时，开始收集流穿（图4）。
平衡：25mL/min流速，再次使用PBS平衡至紫外基线处，停止收集流穿。
收集流穿得到的液体即为复合层析液。
（4）Capto Q ImpRes层析
利用Capto Q ImpRes进行层析：
平衡液A配方：20mM PB-K 150mM NaCl，pH7.5；
洗脱液B配方：20mM PB-K 1M NaCl，pH7.5。
平衡：20mL/分钟流速，用纯化水冲洗层析柱直至电导率为0，然后100%平衡液A平衡柱子，至电脑界面显示电导率：20.223ms/cm，pH：7.50；调UV 280 ZERO。
上样：20mL/分钟流速，将步骤（3）中得到的复合层析液上样（上样量10CV）；
平衡：20mL/分钟流速，100%平衡液A冲洗至电导率20.583ms/cm。
洗脱：20mL/分钟流速，100%洗脱液B洗脱，当UV为25.863mAu时开始收取Capto QImpRes洗脱液，当UV为25.758mAu时停止收取（图5）。
（5）终浓缩
利用300KD中空纤维柱进行浓缩：将300KD中空纤维柱进液端和回流端硅胶管插入步骤（4）得到的Capto Q ImpRes洗脱液中，透过端插入废液桶中；设置流速为50mL/min，开始浓缩，浓缩过程中控制所有压力3-5Psi以内。在浓缩至20mL时，加入1倍体积的保存缓冲溶液，继续浓缩至20mL，重复3次浓缩换液后，将中空纤维柱中的溶液全部顶出，封闭透过端；将进液端和回流端硅胶管插入5mL保存缓冲溶液中循环冲洗中空纤维柱2min，重复循环1次，2次冲洗液和顶出液混合为终浓缩液，即为提取纯化得到的慢病毒液。
统计本对比例中整体操作流程的生物滴度及回收率，结果见表4；对提取纯化得到的慢病毒液进行质量鉴定，结果见表5。
表4
表5
对比例2
同实施例1，区别仅在于，4.8L病毒原液经核酸酶预处理后，未加入海藻糖、蔗糖、KCL、泊洛沙姆粉末和HAS溶液，直接进行澄清过滤操作。
对比例3
同实施例1，区别仅在于，步骤（3）复合层析中平衡操作使用的PBS不添加保护剂。
统计对比例2和3中整体操作流程的生物滴度及回收率，结果见表6；对提取纯化得到的慢病毒液进行质量鉴定，结果见表7。
表6
表7
将实施例1和对比例1的实验数据进行对比（见表8）发现，实施例1的最终回收率要比对比例1高5%，而且实施例1的方法减少了一步层析步骤，可以提高工作效率；在最终样品的检测中发现，实施例1纯化得到的病毒同对比例1一样，均达到了质检标准。
表8
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (2)
1.一种快速纯化慢病毒的生产工艺，其特征在于，所述生产工艺由以下步骤组成：在经核酸酶预处理后的病毒原液中加入病毒保护剂，再依次经过澄清过滤、浓缩换液、复合层析和终浓缩，纯化得到所述慢病毒；
所述澄清过滤、所述浓缩换液和所述终浓缩均采用中空纤维柱进行处理，并且所述澄清过滤、所述浓缩换液和所述终浓缩中的浓缩步骤的压力均控制在大于8Psi并不超过14Psi的范围内；
所述复合层析采用的填料为Core700；
所述病毒保护剂由海藻糖、蔗糖、KCL、表面活性剂和HAS溶液组成；
所述澄清过滤采用规格为0.5μm的中空纤维柱；所述浓缩换液采用规格为500KD的中空纤维柱；所述浓缩换液采用规格为300KD的中空纤维柱；
所述澄清过滤的进样流速为1200mL/min；所述浓缩换液的进样流速为420mL/min；所述浓缩换液的进样流速为50mL/min；
所述HAS溶液中HAS的质量分数为10%；所述海藻糖、所述蔗糖、所述KCL、所述表面活性剂和所述HAS溶液相对于经核酸酶预处理后的病毒原液的添加量分别为5wt%、5wt%、2mM、0.01wt%和10wt%。
2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，所述表面活性剂为泊洛沙姆。
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN107254449A (zh) * | 2017-07-04 | 2017-10-17 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法 |
| CN111505277A (zh) * | 2020-03-10 | 2020-08-07 | 四川省人民医院 | 2019新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒 |
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|---|---|---|---|---|
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107254449A (zh) * | 2017-07-04 | 2017-10-17 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种大规模生产高纯度猪伪狂犬病毒的方法 |
| CN111505277A (zh) * | 2020-03-10 | 2020-08-07 | 四川省人民医院 | 2019新型冠状病毒IgG抗体检测试剂盒 |
| CN115141813A (zh) * | 2022-07-29 | 2022-10-04 | 深圳源兴基因技术有限公司 | 一种高效去除宿主细胞残留蛋白的腺病毒纯化方法 |
| CN115927541A (zh) * | 2023-01-09 | 2023-04-07 | 山东博科生物产业有限公司 | 一种稳定抗冻的病毒保存液 |
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