CN115058414B - 一种纯化质粒dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物大分子分离纯化领域，涉及一种纯化质粒DNA的方法，该方法包括以下步骤：在碱裂解菌体后加入CaCl2溶液去除样品中80%‑90%的RNA得到产物1；将所获取的产物1通过核壳结构复合模式层析介质进行纯化得到产物2；所获取的产物2通过疏水层析柱进行纯化即得。本发明提供了一种批处理量大，成本低，周期短，生产风险低，工艺摸索简单，对产品开发人员专业能力要求低的纯化质粒DNA的方法。
Description
技术领域
本发明属于生物大分子分离纯化领域，涉及一种纯化质粒DNA的方法。
背景技术
随着生物科学的不断进步，质粒DNA作为一种基因载体在基因治疗、细胞治疗和mRNA疫苗的发展中得到了更广泛的应用，这使得开发规模化、稳定、高效的质粒纯化方法迫在眉睫。在现有的纯化质粒的方法中，比较常规的方案是在碱裂解后采用三步层析完成。其中，碱裂解是离心收集菌体—菌体洗涤—菌体重悬—碱裂解—碱中和—离心收集上清—澄清过滤浓缩换液。由于碱裂解后存在大量的RNA，对后续工艺存在巨大的挑战。而三步层析的过程是第一步采用凝胶过滤层析，主要去除RNA；凝胶过滤层析是根据分子大小的差别分离蛋白。凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质，当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时，由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢，在缓冲液洗脱时，分子量大的物质不能进入凝胶孔内，而在凝胶间几乎是垂直的向下运动，而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运动，这样就可以按分子量的大小，先后流出凝胶柱，达到分离的目的。因此凝胶过滤层析的原理决定需要降低上样体积，才能保证较高的分辨率。通常凝胶过滤层析的上样体积是柱体积的2%-5%，一般不超过10%。第二步采用亲和层析，去除质粒中的开环亚型。例如采用Cytiva公司的亲和层析PlamsidSelect填料，成本高。第三步采用阴离子交换层析去除内毒素、宿主蛋白和RNA等微量杂质。
然而，该方法目前存在较多的生产放大问题：首先，第一步凝胶过滤层析的上样体积受料液粘度和柱体积所限，一般最多为柱体积的5-10%，在规模化生产中所需的层析柱直径大，填料用量多，成本较高；而且凝胶过滤层析柱在使用过程中普遍存在流速偏低、易塌陷的问题，生产过程耗时相对较长、层析柱重装频率高；其次，由于该方案是三步层析，导致整体收率较低。此外，该方法整体使用三步层析法，其原材料成本贵，三步层析工艺复杂，摸索工艺耗时长，而且这三步工艺对产品开发人员专业能力要求高；三步工艺转生产，生产批次周期长；三步层析周期长，提升了质粒降解开环的风险。
因此，非常有必要开发一套效率高、成本低、易于规模化放大的质粒DNA纯化方法。
发明内容
发明目的：为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种批处理量大，成本低，周期短，生产风险低，工艺摸索简单，对产品开发人员专业能力要求低的纯化质粒DNA的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种纯化质粒DNA的方法，所述纯化质粒DNA的方法包括以下步骤：
1）在碱裂解菌体后加入CaCl2溶液去除样品中80%-90%的RNA得到产物1；
2）将步骤1）所获取的产物1通过核壳结构复合模式层析介质进行纯化得到产物2；
3）将步骤2）所获取的产物2通过疏水层析柱进行纯化即得。
其中，步骤1）中所述CaCl2溶液的终浓度为0.3~0.75M。
其中，步骤2）中所述核壳结构复合模式层析介质为Monomix Core 1000层析填料柱。
其中，步骤2）中所述产物1按照1~3 mg/ml载量上样Monomix Core 1000层析填料柱。
其中，步骤2）的具体方法为，先采用缓冲液A1进行平衡，然后加入产物1，再次用缓冲液A1平衡，收集流穿和后平衡得到产物2，然后加入缓冲液A2再生层析柱。
其中，所述缓冲液A1为50 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，pH7.2，所述缓冲液A2为1 mol/L NaOH溶液。
其中，步骤3）所述疏水层析柱为Monomix MC30-HIC Butyl填料柱。
其中，步骤3）所述产物2按照1~3 mg/ml载量上样Monomix MC30-HIC Butyl填料柱。
其中，步骤3）的具体方法为：先采用缓冲液A进行填料柱的平衡，然后加入产物2，再次用缓冲液A平衡，平衡后，使用0%-100%缓冲液B线性洗脱，按照信号收集不同洗脱组分检测分析得到产物，CIP清洗再生层析柱。
其中，缓冲液A为50 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，3 mol/L (NH4)2SO4，pH7.2；缓冲液B为50 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，pH7.2。
作为优选，本发明所采用的步骤1）的具体实现方式是：
1.1）取100 g菌体放入1000 ml烧杯；
1.2）在烧杯中加入700 ml 第一溶液并搅拌使菌体悬浮，重复溶解无明显颗粒，所述第一溶液的组成及配比是：20 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，50 mmol/L 葡萄糖，pH8.0；
1.3）在烧杯中加入700 ml 第二溶液，轻柔搅拌混匀，搅拌时间是3-4 min，所述第二溶液的组成及配比是1% SDS，200 mmol/L NaOH；
1.4）在烧杯中加入700 ml 第三溶液，轻柔搅拌至混匀直至呈蛋花状，所述第三溶液的组成及配比是3 mol/L KAC，5 mol/L HAC；
1.5）于4℃的环境下离心20 min，取上清，离心的转速是8000 rpm；
1.6）在上清中加入氯化钙母液沉淀大量RNA；所述氯化钙母液的浓度是4 mol/LCaCl2；所述氯化钙的终浓度是0.3-0.75 mol/L；
1.7）沉淀后在4℃的环境下离心10 min，取上清，离心的转速是8000 rpm；
1.8）浓缩至300 ml洗滤；
1.9）脱盐至20 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，pH7.2。
作为优选，本发明所采用的步骤2）中所述赛分科技Monomix Core 1000层析填料柱的参数是：
Monomix Core 1000，规格具体按照上样量装填柱子型号；
流动相：A1：50 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，pH7.2；A2：1 mol/L NaOH；
流速：5 min柱留时间；
探测器：UV 260 nm；
柱温是室温。
作为优选，本发明所采用的步骤2）的具体实现方式是：
2.1）平衡，100%A1，5CV ；
2.2）上样，按照合适载量上样；
2.3）后平衡，100%A1，5CV，收集流穿；
2.4）CIP，100% A2，5CV；
2.5）再平衡，100%A1，7CV，最后保存至20%乙醇。
作为优选，本发明所采用的步骤3）中赛分科技Monomix MC30-HIC Butyl填料柱的参数是：规格具体按照上样量装填柱子型号：
流动相：A：50 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，3 mol/L （NH4）2SO4，pH7.2；B：50mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，pH7.2；
流速：5 min柱留时间；
探测器：UV 260 nm；
柱温：室温；
作为优选，本发明所采用的步骤3）的具体实现方式是：
3.1）向步骤2）处理得到的产物2中加2.7~3 M硫酸铵；
3.2）平衡，100%A，5CV；
3.3）上样，按照合适载量上样；
3.4）后平衡，100%A，6CV；
3.5）洗脱，线性100%A-0%A，30CV；100%B保持5CV，信号收集，收集不同洗脱组分检测；
3.6）CIP，0.5 mol/L NaOH清洗5CV。
作为优选，本发明所采用的步骤3）的具体实现方式在步骤3.6）之后还包括：
3.7）采用HPLC/电泳分析检测纯度。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：
本发明旨在给出一种易放大，批处理量大，收率高，成本低，周期短，生产风险低，工艺摸索简单，对产品开发人员专业能力要求低的质粒纯化工艺，具体是：
1）批次处理量大：本发明中，碱裂解后加CaCl2去除绝大多数RNA，避免了因RNA占据填料配基，使得第一步处理量变低。该步CaCl2处理不是为了完全去除RNA，因此也不需要考虑使用很高的CaCl2浓度，从而降低收率。第一步纯化使用Monomix Core 1000层析填料柱，微球孔径100 nm，质粒是大分子，不会进入微球的孔里，其他所有小分子（RNA，内毒素，HCP）会进入微球，被吸附。Monomix Core 1000层析填料柱处理样品量不受上样体积影响，传统的分子筛由于纯化原理决定，上样体积只有柱体积的5%左右，所以同样柱体积的Monomix Core 1000层析填料柱处理样品量是分子筛的几十倍。
2）收率高：本发明第一步使用赛分科技的Monomix Core1000层析填料柱，MonomixCore 1000核壳结构复合模式层析介质专为生物大分子的分离纯化而设计，以高聚物微球为基质，粒径为60 μm，粒径均一，具有良好的物理化学稳定性。Monomix Core 1000层析填料柱的介质表面经赛分科技特殊处理，具有更好的亲水性，最大程度地避免了与生物类样品的非特异性吸附。其次Monomix Core1000的壳层孔径大小均一，直径100nm以上大分子物质不会进入微球被吸附，通常经过第一步层析，收率在95%以上。传统的纯化方案通常使用分子筛加阴离子交换介质分离去除本发明第一步去除的杂质，每步层析目标物都有较大的损失，因此两步处理后收率都会较低。
3）工艺摸索简单：本发明共使用两步层析，第一步复合型填料可代替传统的分子筛加阴离子交换，并且相对于分子筛来说，柱体积大大减小，两个生产步骤变成一个步骤，所以总体成本大大降低；其次两步层析改为一步层析后，整体生产周期会大大缩短。第一步层析，只需要摸索合适的载量和较合适的上样电导即可，工艺简单，纯度和收率不需要优化工艺来实现。传统工艺分子筛和离子交换工艺摸索较为复杂，并且往往收率和纯度不能同时保证，因此为找到最佳条件，需要反复摸索，且需要评判工艺稳定性。
4）生产风险低：本发明第一步采用核壳结构的复合型填料，其纯化原理类似膜过滤，因此生产很少受到细微条件变化影响。传统的分子筛加离子交换层析纯化工艺，分子筛上样浊度需要很低，不然可能会导致上样压力过高，柱子塌陷造成严重生产事故；再生很难恢复到初始水平，使用几次后由于压力高需要重装柱子，但凝胶过滤层析装柱工艺是行业难题。离子交换分离效果收样品及洗脱液的pH和电导影响很大，尤其当杂质和目标物性质较为接近，电导或pH稍微偏差，就会发生生产事故，导致收率降低或者纯度变低。
附图说明
图1是实施例1中采用Monomix Core 1000层析填料柱的纯化图谱；
图2是对图1的琼脂糖凝胶电泳照片；
图3是实施例1中Monomix MC30-HIC Butyl填料柱纯化后的图谱；
图4是实施例1中对纯化后的产物进行HPLC检测结果图；
图5是实施例2中加入不同浓度CaCl2对去除RNA的电泳图。
具体实施方式
本发明提供了一种纯化质粒DNA的方法，包括以下步骤：
1、碱裂解并加入氯化钙进行处理
（1）取100 g菌体放入1000ml烧杯；
（2）加入700 ml 溶液I（20 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，50 mmol/L 葡萄糖，pH8.0），搅拌使菌体悬浮，重复溶解无明显颗粒；
（3）加入700 ml 溶液II（1% SDS，200 mmol/L NaOH），轻柔搅拌混匀（单一颜色，粘稠度较高），时间控制在3-4 min内；
（4）加入700 ml 溶液III（3 mol/L KAC，5 mol/L HAC），轻柔搅拌至混匀，样品最后呈蛋花状；
（5）4℃，8000 rpm， 离心20 min，取上清；
（6）上清加入氯化钙母液（4 mol/L CaCl2），使得终浓度为0.3-0.75 mol/L（依据样品性质，CaCl2浓度过高会降低质粒收率），沉淀大量RNA；
（7）沉淀后4℃，8000 rpm， 10 min离心，取上清；
（8）浓缩至300 ml洗滤（选做，若浓度低可超滤浓缩换液）；
（9）脱盐至20 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，pH7.2。
2、使用赛分科技Monomix Core 1000层析填料柱纯化
层析柱：Monomix Core 1000 （规格按照上样量装填柱子型号）；
缓冲液：A1：50 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，pH7.2；A2：1 mol/L NaOH；
流速：5 min柱留时间；信号检测：UV 260 nm； 柱温：室温；
实验步骤：①平衡，100%A1，5CV ；②上样，按照合适载量上样；③后平衡，100%A1，5CV，收集流穿；④CIP，100% A2，5CV；⑤再平衡，100%A1，7CV，最后保存至20%乙醇；纯化结果使用电泳/HPLC分析。
3、使用赛分科技股份有限公司的Monomix MC30-HIC Butyl填料柱纯化
1）样品处理：Monomix Core 1000制备得到的样品加2.7~3mol/L硫酸铵（根据样品不同性质）
色谱柱：Monomix MC30-HIC Butyl （规格按照上样量装填柱子型号）；流动相：A：50 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，3 mol/L （NH4）2SO4，pH7.2；B：50 mmol/L Tris，10mmol/L EDTA，pH7.2；流速：5 min柱留时间；探测器：UV 260 nm；柱温：RT；注射量：（载量可按照1~3 mg/ml上样，可测试具体项目载量）
2）实验步骤①平衡，100%A，5CV；②上样，输液泵进样；③后平衡，100%A，6CV； ④洗脱，线性100%A-0%A，30CV；100%B保持5CV，信号收集，收集不同洗脱组分检测；⑤CIP，0.5mol/L NaOH清洗5CV；洗脱采用HPLC/电泳分析检测纯度。
实施例1：
1、纯化原样基本信息：样品为大肠杆菌发酵湿菌体，扩增质粒6000 bp。
2、碱裂解并加入氯化钙去除RNA
（1）取100 g大肠杆菌发酵菌体放入1000ml烧杯；
（2）加入700 ml 溶液I（20 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，50mmol/L 葡萄糖，pH8.0），搅拌重悬菌体，悬液中不能有明显颗粒；
（3）加入700 ml 溶液II（1% SDS，200 mmol/L NaOH），轻柔搅拌混匀（单一颜色，粘稠度较高），充分反应3min；
（4）加入700 ml 溶液III（3 mol/L KAC，5 mol/L HAC），轻柔搅拌充分混匀，样品呈现蛋花状；
（5）4℃，8000 rpm，离心20 min，取上清；
（6）上清加入氯化钙母液（4 mol/L CaCl2），使得终浓度为0.5 mol/L，沉淀大量RNA，经图2电泳结果灰度值分析，可去除样品85%的RNA；
（7）沉淀后4℃，8000 rpm，10 min离心，取上清；
（8）浓缩至300 ml，换液至20 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，pH7.2。使用Nanodrop one超微量分光光度计测试双链DNA浓度为442 ng/μL。
3、使用赛分科技股份有限公司的Monomix core1000层析填料柱纯化，去除RNA，内毒素，宿主蛋白。
（1）层析填料柱：Monomix Core 1000（25mm*100mm）；
缓冲液：A1：50 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，pH7.2；A2：1 mol/L NaOH；流速：5min柱留时间；信号检测：UV 260 nm；柱温：室温；上样体积：100mL（碱裂解得到的浓缩液，双链DNA浓度为442 ng/μL）。
（2）实验步骤①平衡，100%A1，5CV；②上样，样品泵进样100 mL，收集流穿；③后平衡，100%A1，5CV，收集流穿；④CIP，100% A2，5CV；⑤再平衡，100%A1，7CV，最后保存至20%乙醇；纯化结果后续使用电泳或HPLC分析。
（3）纯化图谱
参见图1，通过Monomix Core1000层析填料柱的纯化图谱上看出，通过以上实验步骤依次得到组分1-A1、1-A2、1-A3、1-A4；分别将DNA Marker、1-A1、1-A2、1-A3、1-A4、CIP（1mol/L NaOH）、碱裂解得到的浓缩液按照表1进行琼脂糖凝胶电泳，其结果参见图2。
由图2的琼脂糖凝胶电泳显示，RNA被完全去除，且CIP清洗组分不含可见的目的物，经Nanodrop one双链DNA浓度检测后，计算目的物收率为95%。
表1
4、使用赛分科技股份有限公司的Monomix MC30-HIC Butyl填料柱纯化，去除质粒开环亚型：
（1）样品处理：步骤3中由Monomix core 1000层析填料柱制备得到的样品加入硫酸铵使得终浓度为2.7M；
（2）层析柱：Monomix MC30-HIC Butyl（1mL预装柱）； 缓冲液：A：50 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，3 mol/L（NH4）2SO4，pH7.2；B：50 mmol/L Tris，10 mmol/L EDTA，pH7.2；流速：0.5 mL/min；信号检测：UV 260 nm；柱温：室温；上样量：（载量按照3mg/ml上样）。
（3）实验步骤 ①平衡，90%A，5CV；②上样，输液泵进样；③后平衡，90%A，6CV；④洗脱，线性90%A-70%A，30CV；100%B保持5CV，信号收集（20 mAU-20 mAU），收集不同洗脱组分检测；⑤CIP，0.5 M NaOH清洗5CV。
（4）纯化图谱
参见图3，由纯化图谱显示，开环亚型质粒和超螺旋质粒在洗脱中分离出两个单一峰，分离度较好。参见图3，通过Monomix MC30-HIC Butyl填料柱的纯化图谱上看出，通过以上实验步骤依次得到组分2-A1、2-A2、2-A3……2-A9、2-A10、2-A11、2-B11、2-B10……2-B7、……。
（5）结果分析
分析方法：HPLC阴离子分析检测：
分析柱：Proteomix SAX-NP5（5um，Non-Porous，4.6×250 mm，SN：8F48013）
流动性：A：100 mmol/L Tris，pH8.0；B：100 mmol/L Tris+1 mol/L NaCl，pH8.0；
流速：0.5 mL/min；信号检测：UV 260 nm；柱温：RT
样品：脱盐后的2-A9、2-A10、2-A11合样；上样量：60 μL；压力：110bar。
测试方法见表2：
表2
参见图4，由HPLC检测结果（HPLC的检测时间及峰面积等信息如表3所示）得出：经Monomix MC30-HIC Butyl填料柱纯化后，超螺旋质粒占比96.073%，大于目前业界主流要求90%以上。
表3
实施例2：不同CaCl2浓度去除RNA效果
实验方案：本实施例基本和实施例1相同，区别在于摸索不同CaCl2浓度去除RNA效果。取碱裂解后上清液分别加入氯化钙母液（4 mol/L CaCl2），使得CaCl2终浓度分别为0.3mol/L，0.5 mol/L和0.75 mol/L，不加氯化钙作为阴性对照，其他步骤同实施例1，按照表4的上样量将最终得到的样品进行琼脂糖凝胶电泳对本发明的纯化质粒DNA的效果进行比较，泳道2为原样（碱裂解后上清液），泳道3为加入0.3 mol/L的CaCl2，泳道4为加入0.5mol/L的CaCl2，泳道5为加入0.75 mol/L的CaCl2，RNA去除效果如图5所示。
表4
结果分析：如图5所示，每条泳道上边亮的条带为质粒，下边亮的条带为RNA。泳道3RNA去除较少，泳道5质粒条带亮度变低说明有部分损失，因此终浓度为0.5 mol/L的CaCl2效果最好。
Claims (1)
1.一种纯化质粒DNA的方法，其特征在于，所述纯化质粒DNA的方法包括以下步骤：
1）在碱裂解菌体后加入CaCl2溶液去除样品中80%-90%的RNA得到产物1；
2）将步骤1）所获取的产物1通过核壳结构复合模式层析介质进行纯化得到产物2；
3）将步骤2）所获取的产物2通过疏水层析柱进行纯化即得；
步骤1）中所述CaCl2溶液的终浓度为0.5M，步骤2）中所述核壳结构复合模式层析介质为Monomix Core 1000层析填料，步骤2）中所述产物1按照1~3mg/ml载量上样Monomix Core1000层析填料柱；
步骤2）的具体方法为，先采用缓冲液A1进行平衡，然后加入产物1，再次用缓冲液A1平衡，收集流穿和后平衡得到产物2，然后加入缓冲液A2再生层析柱；
所述缓冲液A1为50mmol/L Tris，10mmol/L EDTA，pH7.2，所述缓冲液A2为1mol/L NaOH溶液；
步骤3）所述疏水层析柱为Monomix MC30-HIC-Butyl填料柱，步骤3）所述产物2按照1~3mg/ml载量上样Monomix MC30-HIC-Butyl填料柱，步骤3）的具体方法为：先采用缓冲液A进行平衡，然后加入产物2，再次用缓冲液A平衡，平衡后，使用0%-100%缓冲液A线性洗脱，按照信号收集不同洗脱组分检测分析得到产物，CIP清洗再生层析柱，缓冲液A为50mmol/LTris，10mmol/L EDTA，3mol/L (NH4)2SO4，pH7.2；缓冲液B为50mmol/L Tris，10mmol/LEDTA，pH7.2。
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