DE60033505T2 - Partikelmaterial für wirbelbettreinigung von biomakromolekülen wie plasmid-dns, chromosomen-dns, rns,virale dns, bakterien und viren - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Es wird ein Fließbett/„Expanded Bed"-Adsorptionsverfahren zur Reinigung von Bio-Makromolekülen beschrieben. Das Verfahren ist so entwickelt worden, dass es ein erster Einfangschritt in einem nachgeschaltet ausgeführten Verfahren bei der Herstellung von Bio-Makromolekülen, wie Nukleinsäuren, z.B. Plasmid-DNA, chromosomaler DNA, RNA und Virus-DNA, und Viren selbst und sogar Bakterien, ist.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Mit dem zunehmenden Interesse an der Gentherapie wird die Notwendigkeit, große Mengen von Gentherapie-Vektoren herzustellen, drängender. Gegenwärtig setzen 24% der Protokolle, die sich derzeit in der Erprobung befinden, Plasmid-DNA als Abgabevehikel für die Gentherapie und Impfanwendungen ein. In vielen Gentherapie-Fällen wird auch virale DNA als Abgabevehikel eingesetzt. Angesichts der großen Größe von Genvektor-Molekülen und der Scherempfindlichkeit der Feststoffe, die nach Zelllyse und Neutralisation, um die Genvektoren aus mikrobiellen Zellen oder viralem Material zu extrahieren, gewonnen werden, sind traditionelle Grundverfahren, wie Zentrifugation, Filtration und an einem gepackten Bett erfolgende Chromatographie, nicht besonders attraktiv. Fließbett-Adsorption oder „Expanded Bed"-Adsorption, Techniken, die auf einer Fluidisierung basieren, bieten beträchtliche vielversprechende Aussichten bei schwer zu handhabenden biologischen Ausgangsmaterialien, die unlösliche Verunreinigungen enthalten.
  • Ein expandiertes Bett („expanded bed") ist gekennzeichnet durch ein geringes Ausmaß an Rückvermischung des Adsorptionsmittelmediums. Dies bedeutet, dass jedes Adsorptionsmittel-Partikel sich innerhalb eines begrenzten Volumens des gesamten Betts bewegt. Ein expandiertes Bett wird als ein stabilisiertes Fließbett bezeichnet. Die Stabilität tritt auf, wenn die Adsorptionsmittel-Partikel ein sogenanntes klassiertes Bett bilden, in welchem die größeren und/oder dichtesten Adsorptionsmittel-Partikel am weitesten unten im Bett positioniert sind und die kleineren und/oder weniger dichten Adsorptionsmittel-Partikel weiter oben in dem Bett positioniert sind. Das im Rahmen dieser Erfindung verwendete Adsorptionsmittelmedium ist speziell für eine Verwendung in einem Fließbett und vorzugsweise in einem expandierten Bett gestaltet. Die Größenverteilung und Dichtevariation bestimmen die Stabilität des Betts. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Fließbett/Expanded Bed" darauf, dass das Grundverfahren zumindest ein Fließbett und vorzugsweise ein expandiertes Bett ist.
  • Es gibt gegenwärtig wenigstens zwei kommerzielle Lieferanten von Adsorptionsmitteln für eine „Expanded Bed"-Chromatographie. Pharmacia Biotech AB (Uppsala, Schweden) vertreibt StreamlineTM (welches Adsorptionsmittel aus quervernetzten Polysacchariden (Agarose) mit Quarz-Partikeln, welche als Füllstoffe von hoher Dichte eingearbeitet sind, einsetzt. Die Adsorptionsmittel haben eine Dichte von etwa 1,2 g/ml, wobei die Durchmesser im Bereich von 125-315 μm liegen. WO92/18237 (Pharmacia LKB Biotechnology AB) beschreibt Körnchen für eine nachgeschaltet erfolgende Weiterverarbeitung, umfassend eine Polymermatrix, in welche Glas- oder Siliciumdioxid-Partikel eingearbeitet worden sind, und deren Verwendung im Rahmen einer nachgeschaltet erfolgenden Weiterverarbeitung, speziell im Rahmen von Trennungen mittels eines stabilisierten Fließbetts. Die Körnchen haben einen Durchmesser von 100-1000 μm und eine Dichte von 1,10-1,50 g/ml von hydratisierten Körnchen. Die Kernmaterialien sind typischerweise Glas oder Siliciumdioxid.
  • WO 92/00799 (Kern-En-Tec, UpFront Chromatography A/S) beschreibt Adsorptionsmittel-Partikel mit einer Struktur, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie pellikulär (von einer Umhüllung umgeben) oder ein Konglomerat ist. Diese Veröffentlichung offenbart eine große Anzahl von Adsorptionsmitteln für eine Verwendung im Rahmen einer Fließbett/"Expanded Bed"-Chromatographie.
  • WO 97/17132 (Pharmacia Biotech AB (Uppsala, Schweden)) beschreibt Adsorptionsmittel für eine Verwendung bei einer „Expanded Bed"-Chromatographie, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine Dichte von mehr als 1 g/ml aufweisen und eine poröse Polymer-Grundmatrix umfassen, in welche ein partikulärer Füllstoff eingearbeitet ist. Der Füllstoff ist dadurch gekennzeichnet, dass er eine Dichte ≥ 3 g/ml aufweist, aber die Größe der Kernmaterial-Partikel „wird stets viel kleiner als die Größe der Körnchen sein („will always be much smaller than the size of the beads"). Dementsprechend liegt die Dichte der Körnchen normalerweise gerade über 1,0 g/cm3.
  • In der Literatur (mündlicher Vortrag von E. Boschetti, BioSepra, auf der Second International Conference on Expanded Bed Adsorption, Napa Valley, CA, U.S.A., 21.-23. Juni 1998, siehe „Conference Abstract"-Buch, Seite 14) wird auch die Verwendung von kleinen Partikeln von hoher Dichte, welche für Fließbett-Anwendungen geeignet sind, beschrieben. Die beschriebenen Adsorptionsmittel sind so gestaltet, dass sie den Diffusionsabstand in einem porösen Medium innerhalb der Adsorptionsmittel verringern. Die beschriebenen Adsorptionsmittel sind für eine schnelle Diffusion günstig und dementsprechend mit hohen Flussraten verträglich.
  • Die für eine Fließbett/„Expanded Bed"-Chromatographie heutzutage kommerziell erhältlichen Adsorptionsmittelmedien sind hauptsächlich für die Proteinreinigung entwickelt worden. Ein Teil des Mediums weist eine hohe Dichte (> 1 g/ml) auf, um die benötigten Sedimentationseigenschaften sicherzustellen. Der Anteil von hoher Dichte ist idealerweise unter den während der jeweiligen Reinigung verwendeten Bedingungen inert und nicht-korrosiv. Der Anteil von hoher Dichte ist mit einer Polymerphase mit einer offenen Porenstruktur, wo das Zielmolekül (üblicherweise ein Protein) von Interesse an einen an das Polymer gekoppelten Ligand binden kann, kombiniert. Das Zielmolekül ist in der Lage, in die Poren zu diffundieren. Dadurch wird das Zielmolekül gegenüber Bindungsstellen in dem gesamten Volumen der Polymerphase exponiert. Die das Ziel darstellenden Bio-Makromoleküle, die in dem hiesigen Verfahren beschrieben werden, z. B. Plasmid-DNA, chromosomale DNA, RNA, Virus-DNA und Viren selbst und sogar Bakterien, sind nicht in der Lage, in die Poren der kommerziell erhältlichen Medien, die für eine „Expanded Bed"-Chromatographie gestaltet worden sind, zu diffundieren. Dementsprechend wird die Bindung wahrscheinlich hauptsächlich an der Oberfläche der Medien auftreten. Bei den gegenwärtig erhältlichen Medien bedingt dies eine bedeutende Einschränkung der Kapazität/Beladefähigkeit aufgrund von deren relativ geringen verfügbaren Oberflächen.
  • WO 97/29190 beschreibt eine Technik zur Herstellung von hochgradig gereinigter Plasmid-DNA in E. coli, welches Verfahren umfasst, Plasmid enthaltende Zellen bis zu einer hohen Biomasse in exponentieller Vermehrung zu vermehren und die Zellen zu lysieren, indem der pH der Kultur auf einen sorgfältig kontrollierten pH-Wert, bei welchem chromosomale DNA denaturiert wird, aber Plasmid-DNA reversibel renaturiert wird, erhöht wird. Das Plasmid enthaltende Ausgangsmaterial wird nachfolgend an einem Diethylaminoethyl (DEAE)-Anionenaustauscher in einem „Expanded Bed"-Verfahren weiterverarbeitet.
  • Journal of Chromatography A, 806 (1998) 31-45 beschreibt die präparative Reinigung von supergeknäulter Plasmid-DNA unter Verwendung einer quaternären Aminoethyl (QAE)-Anionenaustauschchromatographie.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Dementsprechend besteht das der Erfindung zugrunde liegende Problem darin, verbesserte Materialien für eine Fließbett-Adsorption oder „Expanded Bed"-Adsorption, insbesondere Materialien für die Reinigung von Bio-Makromolekülen bereitzustellen.
  • Die Erfindung stellt dementsprechend ein Verfahren zur Verwendung von Fließbett-Adsorption oder einer „Expanded Bed"-Adsorption als ein erster Einfangschritt für die Rückgewinnung von Bio-Makromolekülen, z.B. von Plasmid-DNA, chromosomaler DNA, RNA, viraler DNA und Viren selbst und sogar Bakterien, aus einem rohen biologischen Ausgangsmaterial, z.B. die Gewinnung von Plasmid-DNA aus einem E. coli-Lysat-Ausgangsmaterial, bereit. Es werden auch neue partikuläre Materialien beschrieben.
  • Ein erstes Ziel besteht darin, ein partikuläres Material (ein Adsorptionsmittelmedium), das eine verbesserte Bindungskapazität für Bio-Makromoleküle, z.B. Plasmid-DNA, chromosomale DNA, RNA, Virus-DNA, Viren als solche und Bakterien, aufweist, durch eine bislang unrealisierte Kombination von Partikelgröße, Partikeldichte und angefügten Gruppen (Liganden) bereitzustellen, wodurch bestimmte Vorteile in chromatographischen Verfahren, wie Fließbettverfahren, ermöglicht werden. Dementsprechend stellt die Erfindung auch ein partikuläres Material mit einer Dichte von wenigstens 2,5 g/ml bereit, wobei die Partikel des partikulären Materials einen durchschnittlichen Durchmesser von 20-40 μm aufweisen und die Partikel des partikulären Materials im Wesentlichen aus einer polymeren Grundmatrix und einem nicht-porösen Kernmaterial aufgebaut sind, wobei das Kernmaterial eine Dichte von wenigstens 3,0 g/ml aufweist, wobei die polymere Grundmatrix mit einer Ladung versehbare angefügte Gruppen oder Affinitätsliganden für ein Biomolekül umfasst.
  • Ein zweites Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, das eine in großem Maßstab ausgeführte Produktion von Bio-Makromolekülen, z.B. von Plasmid-DNA, chromosomaler DNA, RNA, Virus-DNA und Viren selbst und sogar Bakterien, aus einem rohen Ausgangsmaterial unter Verwendung einer Fließbett/„Expanded Bed"-Adsorption als ein erster Einfangschritt handhaben kann. Dementsprechend stellt die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung oder Reinigung eines Bio-Makromoleküls bereit, in welchem das Bio-Makromolekül an ein partikuläres Material, wie hier definiert, adsorbiert wird.
  • Es wird allgemein ins Auge gefasst, dass die Anwendung der Materialien in nicht-gepackten Systemen, wie nicht-gepackten Säulen oder nicht-gepackten Reaktoren und Kontaktoren unterschiedlicher Arten ausgeführt wird.
  • Es wird insbesondere ins Auge gefasst, dass die Materialien in den Gebieten der „Expanded Bed"-Verfahren und Fließbett-Verfahren wie auch im Rahmen von Verfahren, die turbulente Fließbetten, chargenweise Adsorption („batch adsorption") und chargenweise Elution („batch elution") einsetzen, und einer chargenweise erfolgenden Adsorption („batch adsorption"), gefolgt von einer „Expanded Bed"-Elution, verwendet werden können. Wie sich verstehen wird, können die Materialien in einem relativ breiten Spektrum von chromatographischen Verfahren verwendet werden, es sollte jedoch erwähnt werden, dass die Materialien nicht für Anwendungen, die mittels eines gepackten Betts erfolgen, bestimmt sind.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfinder haben ein Verfahren entdeckt, das bei dem Einfang von Bio-Makromolekülen im Rahmen einer Fließbett/„Expanded Bed"-Adsorption eine hohe dynamische Kapazität/Beladefähigkeit ermöglicht. Das Verfahren ist in der Lage, große Volumen von rohen Ausgangsmaterialien, welche das das Ziel darstellende Bio-Makromolekül enthalten, handzuhaben.
  • Der Begriff Bio-Makromolekül soll eine jegliche Entität von biologischer Herkunft mit einem Molekulargewicht von wenigstens 20.000 D, z.B. Plasmid-DNA, chromosomale DNA, RNA, Virus-DNA oder Viren selbst und sogar Bakterien, bedeuten. Es sollte sich verstehen, dass modifizierte Varianten und Analoga von diesen Entitäten innerhalb des Umfangs des Begriffs ebenfalls möglich sind, solange die Modifizierung oder die Analoga den Charakter des nativen Bio-Makromoleküls beibehalten. Die Bio-Makromoleküle, die gemäß der Erfindung isoliert/gereinigt werden sollen, haben vorzugsweise ein Molekulargewicht von wenigstens 50.000 D, wie wenigstens 100.000 D oder wenigstens 500.000 D, wie wenigstens 5.000.000. Als Beispiel wird bei E. coli das Molekulargewicht typischerweise 4.200.000 Basenpaare, was 2,7 × 109 D entspricht, betragen. Es wird sich verstehen, dass keine definierte Obergrenze für das Molekulargewicht Anwendung findet, da die Bio-Makromoleküle auch ganze Zellen umfassen. Jedoch wird in Bezug auf Nukleinsäuren, z.B. Plasmid-DNA, chromosomale DNA, RNA, Virus-DNA u.s.w., der „Moleküldurchmesser" typischeweise im Bereich von 0,5-5,0 μm liegen. Viren haben typischerweise einen „Durchmesser" im Bereich von 50-100 nm.
  • Partikuläres Material
  • Wie oben erwähnt, betrifft die Erfindung u.a. ein partikuläres Material, das für die Isolierung/Reinigung von Bio-Makromolekülen nützlich ist, d.h. ein partikuläres Material mit einer Dichte von wenigstens 2,5 g/ml, wobei die Partikel des partikulären Materials einen durchschnittlichen Durchmesser von 20-40 μm aufweisen und die Partikel des partikulären Materials im Wesentlichen aus einer polymeren Grundmatrix und einem nicht-porösen Kernmaterial aufgebaut sind, wobei das Kernmaterial eine Dichte von wenigstens 3,0 g/ml aufweist, wobei die polymere Grundmatrix mit einer Ladung versehbare angefügte Gruppen oder Affinitätsliganden für ein Bio-Makromolekül umfasst.
  • Im vorliegenden Kontext werden die Begriffe „Adsorptionsmittel", „partikuläres Material" und „Adsorptionsmedium" synonym verwendet.
  • Im vorliegenden Kontext soll der Ausdruck „Konglomerat" einen Partikel eines partikulären Materials bezeichnen, der Körner von Kernmaterial von unterschiedlicher Art und Größe, die durch die polymere Grundmatrix zusammengehalten werden, umfasst, z.B. einen Partikel, bestehend aus zwei oder mehreren Partikeln von hoher Dichte, die durch umgebende Agarose (polymere Grundmatrix) zusammengehalten werden. Der Ausdruck „pellikulär" (von einer Umhüllung umgeben; „pellicular") soll einen Verbund von Partikeln bezeichnen, in welchem jeder Partikel aus nur einem Kernmaterial von hoher Dichte, überzogen mit einer Schicht der polymeren Grundmatrix, besteht, z.B. einem Edelstahlkorn von hoher Dichte, das mit Agarose überzogen ist (siehe 1).
  • Es wird angenommen, dass der relativ kleine Durchmesser der Partikel kombiniert mit der hohen Dichte eine wichtige Rolle für die nützlichen Eigenschaften des partikulären Materials, insbesondere die nützlichen Eigenschaften bei der Isolierung/Reinigung von Bio-Makromolekülen in Fließbett-Verfahren spielt. Dementsprechend liegt der durchschnittliche Durchmesser der Partikel des partikulären Materials im Bereich von 20-40 μm.
  • Darüber hinaus wird angenommen, dass eine relativ enge Partikelgrößenverteilung vorteilhaft ist (bei Berücksichtigung, dass eine bestimmte Breite der Verteilung vorteilhaft ist, wenn das Material in einer Fließbett-Konstellation verwendet werden soll); dementsprechend wird angenommen, dass wenigstens 95% der Partikel einen Durchmesser im Bereich von 20-40 μm haben sollten.
  • Wie oben erwähnt, scheint die hohe Dichte der Partikel extrem relevant zu sein; dementsprechend sollte die Dichte allgemein wenigstens 2,5, z.B. wenigstens 3,0, wie wenigstens 3,5 betragen, vorzugsweise im Bereich von 3,5-10,0 g/ml liegen.
  • Die hohe Dichte wird primär durch die Aufnahme eines hohen Anteils eines dichten, nicht-porösen Kernmaterials, vorzugsweise mit einer Dichte von wenigstens 3,0 g/ml, wie wenigstens 5,0, vorzugsweise im Bereich von 6,0-12,0 g/ml, erhalten. Dies wird zu Partikeln führen, die von der Zusammensetzung her pellikulär oder ein Konglomerat sind. Beispiele von geeigneten nicht-porösen Kernmaterialien sind anorganische Verbindungen, Metalle, elementare Nichtmetalle, Metalloxide, Nichtmetalloxide, Metallsalze und Metalllegierungen u.s.w., solange die obigen Dichtekriterien erfüllt werden. Beispiele für solche Kernmaterialien sind Metallsilicate, Metallborosilicate; Keramiken, einschließlich Titandiborid, Titancarbid, Zirconiumdiborid, Zirconiumcarbid, Siliciumcarbid, Aluminiumnitrid, Siliciumnitrid, Titannitrid, Yttriumoxid, Siliciummetall-Pulver und Molybdändisilid; Metalloxide und -sulfide, einschließlich Magnesium-, Aluminium-, Titan-, Vanadium-, Chrom-, Zirconium-, Hafnium-, Mangan-, Eisen-, Cobalt-, Nickel-, Kupfer- und Silberoxid, Nichtmetalloxide; Metallsalze, einschließlich Bariumsulfat; metallische Elemente, einschließlich Zirconium, Titan, Hafnium, Vanadium, Chrom, Mangan, Eisen, Cobalt, Nickel, Indium, Kupfer, Silber, Gold, Palladium, Platin, Ruthenium, Osmium, Rhodium und Iridium; und Legierungen von metallischen Elementen, wie Legierungen, die zwischen diesen metallischen Elementen gebildet werden, z.B. Edelstahl; kristalline und amorphe Formen von Kohlenstoff, einschließlich Graphit, Carbon-Black und künstliche Kohle. Bevorzugt sind Stahl- und Titan-Körnchen wie auch Edelstahlkörnchen.
  • Es ist bevorzugt, dass das Kernmaterial von wenigstens 95% der Partikel ein Stahlkörnchen mit einem Durchmesser im Bereich von 2-40, wie 15-38 μm, vorzugsweise 15-35 μm ist.
  • Darüber hinaus ist bevorzugt, dass wenigstens 95% der Partikel ein nicht-poröses Kernmaterial mit einem Durchmesser, der wenigstens das 0,70-fache, wie wenigstens das 0,80-fache, vorzugsweise wenigstens das 0,85-fache des Durchmessers des Partikel ist, umfassen.
  • Alternativ wird das Kernmaterial aus mehr als einem Körnchen, z.B. Körnchen mit einem Durchmesser von weniger als 20 μm, gebildet.
  • Typischerweise macht das Kernmaterial 10-99%, vorzugsweise 50-95% des Volumens der Partikel aus und die Polymergrundmatrix macht 1-90%, vorzugsweise 5-50% des Volumens des Partikels aus.
  • Wenn das Kernmaterial eines großen Anteils der Partikel (>95%) aus einem einzelnen Körnchen gebildet wird, weist die polymere Grundmatrix typischerweise weniger als 20 μm Dicke (der geometrische Abstand zwischen dem Kernmaterial und der Oberfläche des Partikels) und vorzugsweise weniger als 10 μm und am meisten bevorzugt weniger als 5 μm Dicke auf. In einer Ausführungsform wird ins Auge gefasst, dass die polymere Grundmatrix eine monomolekulare Schicht, die das Kernmaterial umhüllt, bilden könnte. Dementsprechend wird in diesem Falle ins Auge gefasst, dass die polymere Matrix durch eine Spezies mit niedrigem Molekulargewicht, die eine vorherrschende Affinität für das Kernmaterial aufweist, ersetzt werden könnte. Diese Affinität zwischen der niedermolekularen Spezies und dem Kernmaterial könnte durch eine Oberflächenbehandlung des Kernmaterials, z.B. durch Organosilylierung von keramischen Materialien, verbessert werden. Die monomolekulare Schicht könnte auch durch chemische Mittel oder Maßnahmen, die per se bekannt sind, kovalent an die Oberfläche des Kernmaterials gekoppelt werden.
  • Ein anderes wichtiges Merkmal der Erfindung ist die Tatsache, dass die polymere Grundmatrix entweder mit einer Ladung versehbare angefügte Gruppen oder Affinitätsliganden für ein Bio-Makromolekül als angefügte Gruppen umfasst. Es ist auch möglich, die beiden Unterarten von angefügten Gruppen zu kombinieren. Es ist gegenwärtig bevorzugt, dass die angefügten Gruppen mit einer Ladung versehbare Gruppierungen, ausgewählt aus Polyethylenimin, modifiziertem Polyethylenimin, Polyethylenimin/oxyethylen), quaternärem Aminoethyl (QAE) und Diethylaminoethyl (DEAE), umfassen. Solche Gruppen können mit der polymeren Grundmatrix mittels eines Divinylsulfon- oder eines Epichlorhydrin-Linkers oder durch andere Verknüpfungsmittel oder -maßnahmen, die per se bekannt sind, oder durch Verwendung des der Gruppe entsprechenden Chlorids verknüpft werden. Die zuerst erwähnte Möglichkeit ist besonders relevant für mit einer Ladung versehbare Gruppierungen, wie Polyethylenimine, modifizierte (z.B. alkylierte) Polyethylenimine und Polyethylenimin/oxyethylen)e. Das entsprechende Chlorid ist besonders relevant für mit einer Ladung versehbare Gruppen, wie quaternäres Aminoethyl (QAE) und Diethylaminoethyl (DEAE).
  • Für das Binden von Bio-Makromolekülen an die Oberfläche des partikulären Materials gemäß der Erfindung kann eine große Anzahl von unterschiedlichen Liganden, die per se bekannt sind, eingesetzt werden durch Koppeln an die Polymerphase direkt oder durch die nachfolgend erwähnten aktivierenden Gruppen. Positiv geladene Ionenaustausch-Liganden sind für das Binden von Nukleinsäuren, wie DNA und RNA, gut geeignet, wobei wohlbekannte Liganden DEAE, QAE, PEI und andere Aminogruppen enthaltende Liganden sind. Es können jedoch auch interchelatbildende („interchelating") Liganden eingesetzt werden wie auch sequenzspezifische Liganden, wie komplementäre DNA/RNA-Stränge und künstliche Oligonukleotide, wie PNA.
  • Polyklonale und monoklonale Antikörper, synthetische Peptide und andere synthetische chemische Oligomere, Lectine, Kohlenhydrate und hydrophobe Liganden können für das Binden von Viren, Bakterien und anderen Bio-Makromolekülen ebenfalls relevant sein.
  • Solche Affinitätsliganden können wie die mit einer Ladung versehbaren Gruppierungen mit der Grundmatrix verknüpft werden durch Methoden, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, z.B. wie in „Immobilized Affinity Ligand Techniques" von Hermanson et al., Academic Press, Inc., San Diego, 1992, beschrieben. In Fällen, wo die polymere Grundmatrix nicht die Eigenschaften aufweist, um als aktive Substanz zu funktionieren, kann die polymere Grundmatrix (oder Matrices, wenn eine Mischung von Polymeren verwendet wird), derivatisiert werden, um als eine aktive Substanz in den Aktivierungs- oder Derivatisierungsverfahren zu funktionieren. Dementsprechend können Materialien, welche Hydroxyl-, Amino-, Amid-, Carboxyl- oder Thiolgruppen umfassen, aktiviert oder derivatisiert werden unter Verwendung von verschiedenen aktivierenden Chemikalien, z.B. Chemikalien, wie Bromcyan, Divinylsulfon, Epichlorhydrin, Bisepoxyranen, Dibrompropanol, Glutarsäuredialdehyd, Carbodiimiden, Anhydriden, Hydrazinen, Periodaten, Benzochinonen, Triazinen, Tosylaten, Tresylaten und Diazoniumionen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die angefügte Gruppe eine Polyethylenimin-Kette, mehr bevorzugt eine Polyethylenimin-Kette mit einer massegemittelten Molekülmasse von wenigstens 10.000 D, wie 50.000-2.000.000 D.
  • Es ist auch bevorzugt, dass, unabhängig davon, ob die angefügte Gruppe ein Polyethylenimin ist, die angefügten Gruppen eine Tentakel-artige Struktur auf der Oberfläche des Partikels bilden. Eine Tentakel-artige Oberflächenstruktur ist bevorzugt, um die Oberfläche und/oder die Bindungsstellen für große Bio-Makromoleküle selbst zu erhöhen. Es sollte sich verstehen, dass Gruppierungen, wie Polyethylenimin, eine geknäulte Struktur bilden können, von welcher angenommen wird, dass sie die Adsorption von Bio-Makromolekülen vereinfacht. Andere Liganden, die für einen Einfang von Bio-Makromolekülen, wie Plasmid-DNA, geeignet sind, sind DEAE und QAE. Sie bilden ihrerseits keine Tentakel-artige Struktur, wenn sie an ein Adsorptionsmittelmedium gekoppelt werden. In Kombination mit Spacern (Abstandshaltern), Liganden, wie DEAE und QAE, kann sich jedoch eine Tentakel-artige Struktur mit erhöhter Oberfläche bilden. Es können auch anderen Liganden mit niedrigem Molekulargewicht, z. B. Oligonukleotide, nützlich sein, insbesondere in Kombination mit einer Tentakel-artigen Oberflächenstruktur.
  • Die polymere Grundmatrix wird verwendet als ein Mittel, um Kernmaterial zu bedecken und eine Mehrzahl von Kernmaterialien (oder ein einzelnes Kernmaterial) zusammenzuhalten, und als ein Mittel zum Binden der aktiven Substanz. Dementsprechend muss die polymere Grundmatrix ausgesucht werden unter bestimmten Arten von natürlichen oder synthetischen organischen Polymeren, typischerweise ausgewählt aus
    • A) natürlichen und synthetischen Polysacchariden und anderen auf Kohlenhydraten basierenden Polymeren, einschließlich Agar, Alginat, Carragheen, Guar Gum, Gummiarabikum, Ghatti Gum, Tragantgummi, Karayagummi, Johannisbrotgummi, Xanthan Gum, Agarosen, Cellulosen, Pektinen, Mucinen, Dextranen, Stärken, Heparinen, Chitosanen, Hydroxystärken, Hydroxypropylstärken, Carboxymethylstärken, Hydroxyethylcellulosen, Hydroxypropylcellulosen und Carboxymethylcellulosen.
    • b) synthetischen organischen Polymeren und Monomeren, die zu Polymeren führen, einschließlich acrylischer Polymere, Polyamide, Polyimide, Polyester, Polyether, polymerer Vinylverbindungen, Polyalkene und substituierter Derivate davon, wie auch Copolymere, welche mehr als ein solches Polymer funktional umfassen, und substituierte Derivate davon; und
    • c) Mischungen davon.
  • Eine bevorzugte Gruppe von polymeren Grundmatrices sind Polysaccharide, wie Agarose.
  • Die ideale und bevorzugte Gestalt eines einzelnen Partikels ist im Wesentlichen kugelförmig. Die Gesamtgestalt der Partikel ist jedoch normalerweise nicht extrem kritisch; dementsprechend können die Partikel andere Arten von abgerundeten Gestalten, z.B. ellipsoid, tröpfchenförmig und bohnenförmig, aufweisen. Jedoch ist es für bestimmte Anwendungen (z.B. wenn die Partikel in einer Fließbett-Konstellation verwendet werden) bevorzugt, dass wenigstens 95% der Partikel im Wesentlichen kugelförmig sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform weist das partikuläre Material eine Dichte im Bereich von 3,2-5,0 g/ml auf, wobei die Partikel des partikulären Materials einen durchschnittlichen Durchmesser von 20-40 μm aufweisen und die Partikel des partikulären Materials im Wesentlichen aus einer Polysaccharid-Grundmatrix und einem Kernmaterial aufgebaut sind, wobei das Kernmaterial eine Dichte im Bereich von 6,0-12,0 g/m3 aufweist, wobei die Polysaccharid-Grundmatrix angefügte Ketten von Polyethylenimin, modifiziertem Polyethylenimin oder Poly(ethylenimin/oxyethylen) umfasst, wobei die angefügten Gruppen eine Tentakel-artige Struktur auf der Oberfläche des Partikels bilden.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein partikuläres Material mit einer Dichte von wenigstens 2,5 g/ml bereit, wobei die Partikel des partikulären Materials einen durchschnittlichen Durchmesser von 20-40 μm aufweisen und die Partikel des partikulären Materials im Wesentlichen aus einer polymeren Grundmatrix, ausgewählt aus Polysacchariden, bevorzugt Agarose, und einem nicht-porösen Kernmaterial aufgebaut sind, wobei das Kernmaterial eine Dichte im Bereich von 6,0-12,0 g/ml aufweist, wobei wenigstens 95% der Partikel ein nicht-poröses Kernmaterial-Körnchen mit einem Durchmesser, der das wenigstens 0,70-fache des Durchmessers des Partikels ist, umfassen, wobei die polymere Grundmatrix angefügte Gruppen umfasst, die bei pH 4,0 positiv geladen sind oder die Affinitätsliganden für ein Biomolekül sind.
  • Die Herstellung des erfindungsgemäßen partikulären Materials kann durch verschiedene Verfahren, die per se bekannt sind, ausgeführt werden (z.B. durch herkömmliche Verfahren, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, siehe z.B. EP 0 538 350 B1 (UpFront Chromatography A/S) oder WO 97/17132 (Pharmacia Biotech AB)), beispielsweise durch Block-Copolymerisation von Monomeren; Suspensionspolymerisation von Monomeren; Block- oder Suspensionsgelierung von gelbildenden Materialien, z.B. durch Erwärmen und Abkühlen (z. B. von Agarose) oder durch Zugabe von Gelbildungs-„Katalysatoren" (z. B. Zugeben eines geeigneten Metallions zu Alginaten oder Karragheenen); Block- oder Suspensionsvernetzung von geeigneten löslichen Materialien (z.B. Vernetzung von Dextranen, Cellulosen oder Stärken oder Gelatinen, oder von anderen organischen Polymeren mit z.B. Epichlorhydrin oder Divinylsulfon); Bildung von Siliciumdioxid-Polymeren durch Ansäuern von Siliciumdioxid-Lösungen (z.B. Block- oder Suspensionslösungen); gemischte Vorgehensweisen, z.B. Polymerisation und Gelierung; Sprühverfahren; und Fließbett-Beschichten von Dichtekontrollierenden Partikeln; Abkühlen von Emulsionen von Dichte-kontrollierenden Partikeln, die in polymeren Grundmatrices in erwärmten Öl-Lösemitteln suspendiert sind; oder durch Suspendieren von Dichte-kontrollierenden Partikeln und Wirkstoffen in einer geeigneten Monomer- oder Copolymer-Lösung, gefolgt von einer Polymerisation.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform (die für die Herstellung des partikulären Materials gemäß der Erfindung allgemein anwendbar zu sein scheint) wird ein partikuläres Material, welches Agarose als die polymere Grundmatrix und Stahlkörnchen als das Kernmaterial umfasst, erhalten, indem eine Mischung von Agarose in Wasser erwärmt wird (auf etwa 90°C), die Stahlkörnchen zu der Mischung hinzugegeben werden und die Mischung in ein heißes Öl (z.B. pflanzliches Öl) transferiert wird, die Mischung durch kräftiges Rühren emulgiert wird (gegebenenfalls durch Zugabe eines herkömmlichen Emulgators) und die Mischung abgekühlt wird. Es versteht sich für den Fachmann auf diesem Gebiet, dass die Partikelgröße (d.h. die Menge von polymerer Grundmatrix (hier: Agarose), die in jedes Teilchen eingebracht wird), angepasst werden kann, indem die Geschwindigkeit des Mischers und der Abkühlungsprozess variiert werden.
  • Wie aus dem Folgenden ersichtlich wird, ist das partikuläre Material hochgradig nützlich für eine Verwendung in jeglichen chromatographischen Verfahren, insbesondere in Fließbett-Adsorptionsverfahren.
  • Das Verfahren
  • Für das Verfahren wird eine Säule, die für eine Fließbett/„Expanded Bed"-Chromatographie gestaltet ist, verwendet, z.B. eine Säule mit einer Verteilungsplatte an dem Einlass oder eine Säule, in welcher das Rohmaterial korrekt in einer lokalen Mischzone in dem Bett durch einen mechanischen Rührer verteilt wird. Die Menge an Ausgangsmaterial und dadurch die Menge an Adsorptionsmittel, die benötigt wird, bestimmen die Größe der Säule, die für die Reinigung benötigt wird. Eine geeignete Säule können die kommerziell erhältlichen FastlineTM-Säulen von UpFront Chromatography A/S, Dänemark, oder wie in EP 0 538 350 (UpFront Chromatography A/S) veranschaulicht, sein.
  • Eine Fluidisierung oder Expansion der eine hohe Dichte aufweisenden partikulären Materialien (Adsorptionsmittel) gemäß der Erfindung innerhalb eines Reaktors liefert die Möglichkeit, rohe Ausgangsmaterialien handzuhaben. Bei einer Fluidisierung/Expansion werden die Adsorptionsmittel durch einen nach oben gerichteten Flüssigkeitsstrom von Puffer oder Ausgangsmaterial nach oben gehoben. Das expandierte Volumen zwischen den fluidisierten Adsorptionsmitteln erlaubt, dass Ausgangsmaterial, das unlösliche Verunreinigungen enthält, durch den Reaktor hindurchströmt, ohne das System zu verstopfen. Dementsprechend können Adsorptionsmittel-Partikel, welche eine höhere Dichte als das Fluid aufweisen und sich aufgrund von Schwerkraft nach unten bewegen, in einer freien fluiden Phase durch einen nach oben gerichteten Strom von Fluid gehalten werden.
  • Die Reinigung von Nukleinsäure (wie DNA, z.B. Plasmid-DNA) unter Verwendung von mit einer Ladung versehbaren Gruppierungen, wie DEAE, PEI und QAE, ist vorteilhaft, indem die Wechselwirkung zwischen den negativ geladenen Phosphatgruppen in dem DNA-Molekül und positiv geladenen Aminogruppen in DEAE, PEI und QAE die Trennung vereinfacht. Es wird angenommen, dass andere positiv geladene Liganden die gleichen Vorteile bieten.
  • Wie oben erwähnt, stellt die Erfindung auch ein Verfahren zur Isolierung oder Reinigung eines Bio-Makromoleküls bereit, in welchem das Bio-Makromolekül an ein partikuläres Material, wie oben und in den Ansprüchen definiert, adsorbiert wird. Es sollte sich verstehen, dass das partikuläre Material vorzugsweise in einer fluidisierten Form in einer Fließbettsäule vorliegt.
  • In einer spezielleren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung oder Isolierung von Bio-Makromolekülen, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    • (a) ein Ausgangsmaterial, welches ein oder mehrere Bio-Makromoleküle umfasst, mit einem Fließbett eines partikulären Materials, wie oben und in den Ansprüchen definiert, in Kontakt zu bringen;
    • (b) das partikuläre Material gegebenenfalls zu waschen, um Verunreinigungen von dem partikulären Material und dem bzw. den Bio-Makromolekül(en) abzutrennen; und
    • (c) das bzw. die Bio-Makromolekül(e) von dem partikulären Material zu eluieren.
  • Das Adsorptionsmittel wird in der Säule mit einem Strom von Äquilibrierungspuffer, welcher 10-500 cm/h und vorzugsweise 200-400 cm/h entspricht, fluidisiert/expandiert. Der Äquilibrierungspuffer kann aus 10-100 mM Puffer (z.B. Tris, Acetat, Citrat, Glycin, Carbonat, Phosphat) bestehen und typischerweise einen pH-Wert zwischen 2,0 und 13,0, wie 4,0 bis 8,0 und typischerweise eine NaCl-Konzentration im Bereich zwischen 0,0 und 0,5 M aufweisen. Dementsprechend wird das Fließbett des partikulären Materials vorzugsweise mit einem Äquilibrierungspuffer gewaschen, bevor es mit dem Ausgangsmaterial in Kontakt gebracht wird. Das Adsorptionsmittel wird am bequemsten in der Säule äquilibriert und der Äquilibrierungspuffer wird vorzugsweise zumindest solange angewendet, bis das Bett stabilisiert ist.
  • Nach der Stabilisierung des Betts wird das Bio-Makromolekül enthaltende Ausgangsmaterial auf das Fließbett mit einer Flussrate typischerweise im Bereich von 100-500 cm/h aufgeladen.
  • Ein Ausgangsmaterial mit Bio-Makromolekülen wird typischerweise vorbehandelt, bevor es auf das Fließbett/„Expanded Bed" aufgetragen wird. Die Vorbehandlung ist z.B. pH-Einstellung, Lyse von Wirtszellen, die Plasmid-DNA enthalten, Zermahlen von Zellen, Präzipitation, mechanische Entfernung von festen Verunreinigungen u.s.w. Wirtszellen werden geerntet und mechanisch, z.B. durch Mahlen, oder chemisch zerstört. Zellen werden üblicherweise durch eine alkalische Lyse mit NaOH und SDS zerstört. Der Lyse kann eine Neutralisation oftmals durch die Zugabe von Acetat zu der Lösung folgen. Es kann sinnvoll sein, einen Hauptteil der Zellrückstände mechanisch zu entfernen, bevor das Rohmaterial auf die Säule aufgeladen wird.
  • Im Allgemeinen liegt die Konzentration des Bio-Makromoleküls, wie von Plasmid-DNA, in dem Ausgangsmaterial im Bereich von 0,1-3.000 μg/ml, wie im Bereich von 10-1.000 μg/ml. In einigen Systemen können jedoch viel höhere Konzentrationen relevant sein.
  • In Hinblick auf die Herstellung des Ausgangsmaterials ist es bevorzugt, dass das Ausgangsmaterial, das das oder die Bio-Makromolekül(e) umfasst, des Weiteren ein Salz, wie NaCl, KCl, K2HPO4 oder NaSO4, in einer Konzentration von 0,0 bis 2,0 M, vorzugsweise 0,0-1,0 M, insbesondere 0,0-0,5 M umfasst. Darüber hinaus umfasst das Ausgangsmaterial, das das oder die Bio-Makromolekül(e) umfasst, typischerweise des Weiteren einen Puffer, durch welchen der pH im Bereich von 2,0-13,0 gehalten wird. Der Puffer kann ein beliebiger sein, der in Kombination mit den fraglichen Bio-Makromolekülen geeignet ist, typischerweise ein z.B. Tris-, Acetat-, Citrat-, Glycin-, Carbonat-, Phosphatpuffer in einer Konzentration von 5-100 mM.
  • Als ein Modellsystem, um die Erfindung zu veranschaulichen und sowohl statische als auch dynamische Bindungskapazitäten zu bestimmen, ist eine Kalbsthymus-DNA enthaltende Lösung verwendet worden (siehe Beispiele). Die Konzentration von Kalbsthymus-DNA lag im Bereich von 18-2200 μg/ml in einem 10 mM Tris-Puffersystem bei pH 8-0.
  • Ein anderer Parameter von Bedeutung ist die Menge von partikulärem Material (Adsorptionsmittel), die verwendet wird, um eine bestimmte Menge des Bio-Makromoleküls zu reinigen oder zu isolieren. Typischerweise liegt das Verhältnis zwischen dem Bio-Makromolekül und dem partikulären Material (Adsorptionsmittel) im Bereich von 0,1-10,0 mg Bio-Makromolekül/ml Adsorptionsmittel.
  • Die Wirkung von NaCl auf die Bindungseffizienz kann getestet werden, indem NaCl in variierenden Konzentrationen im Bereich von 0,0-3,0 M zu der Kalbsthymus enthaltenden Lösung zugesetzt wird. In Ausgangsmaterial mit einer verdünnten DNA-Konzentration ist es normalerweise erforderlich, NaCl zu dem Ausgangsmaterial zuzusetzen, um eine Vernetzung der Adsorptionsmittel-Partikel zu unterdrücken oder zu verhindern.
  • In dem Fall, wo Plasmid-DNA das Bio-Makromolekül von Interesse ist, können ausgefeilte pH-Einstellungen bei dem Vorbehandlungsverfahren (oder als ein wesentlicher Teil des Adsorptionsverfahrens – siehe unten) verwendet werden und werden normalerweise zu einer Denaturierung von chromosomaler DNA führen, während Plasmid-DNA reversibel renaturiert wird. Die Konzentration von Verunreinigungen kann verringert werden. Eine andere Verunreinigung ist RNA. Die RNA-Konzentration kann durch eine Behandlung des Ausgangsmaterials mit RNAse verringert werden. Auf die gleiche Weise kann die Konzentration von Protein-Verunreinigungen durch eine Behandlung mit proteolytischen Enzymen verringert werden. Eine enzymatische Behandlung des Ausgangsmaterials kann auf verschiedene Weisen ausgeführt werden, z.B. durch Zugeben der Enzyme zu dem Ausgangsmaterial oder durch Auftragen des Ausgangsmaterials auf ein fluidisiertes/expandiertes Bett, wo die enzymatische Aktivität auf den fluidisierten/expandierten Partikeln immobilisiert ist. Eine enzymatische Behandlung kann auch an dem Eluat aus dem Fließbett/„Expanded bed"-Chromatographieschritt ausgeführt werden, z.B. wenn die Auftrennung von Plasmid-DNA und RNA gering ist, kann das eluierte Material mit RNAse behandelt werden, um die Konzentration an jener Verunreinigung zu verringern.
  • Das Ausgangsmaterial wird normalerweise aufgetragen, bis ein Zielmolekül-Durchbruch von 0-100%, vorzugsweise 0-50% und am meisten bevorzugt von 0-10% beobachtet wird.
  • Nach der Adsorption wird das partikuläre Material, an welches das Bio-Makromolekül adsorbiert ist, normalerweise (aber optional) gewaschen (Schritt b) mit einem wässrigen Äquilibrierungspuffer, welcher NaCl umfasst. Der Äquilibrierungspuffer kann aus einem 10 mM Puffer (z.B. Tris, Acetat oder Citrat) bestehen und kann einen pH-Wert zwischen 2,0 und 13,0 und eine NaCl-Konzentration im Bereich zwischen 0,0 und 1,5 M, vorzugsweise 0,0 bis 0,5 M aufweisen.
  • Sofern wünschenswert, wird das partikuläre Material, an welches das Bio-Makromolekül adsorbiert ist, nachfolgend mit einem NaCl-Gradienten und/oder NaOH-Puffer (0,001-1,0 M) oder einem Puffer mit einem pH von 2,0-13,0 (wie z.B. Tris, Acetat, Citrat, Glycin, Carbonat, Phosphat) oder wässrigen Lösungen von Monosacchariden eluiert. Der Gradient erstreckt sich typischerweise von 0-3,0 M NaCl, mehr bevorzugt 0-2,0 M NaCl und am meisten bevorzugt 0- 1,0 M NaCl. Die Elution kann in einem Fließbett/expandierten oder gepackten Bett stattfinden; ein Fließbett/expandiertes Bett ist bevorzugt.
  • Besonders interessante Bio-Makromoleküle, die durch das vorliegende Verfahren isoliert oder gereinigt werden sollen, sind Nukleinsäuren, insbesondere Plasmid-DNA.
  • Eine andere interessante Anwendung der erfindungsgemäßen Materialien ist die Verwendung als Träger für Zellen. Wie in Beispiel 11 veranschaulicht worden ist, sind die Materialien für den Einfang von Zellen geeignet (veranschaulicht durch Hefezellen) und es wird dementsprechend daran gedacht, dass die Materialien auch als Mikroträger (Mikrocarrier) für Zellen in z.B. Fermentationsverfahren verwendet werden können.
  • Die hohe Dichte und kleine Partikelgröße des Materials kann dementsprechend in nützlicher Weise als Träger für lebende Zellen in einem stabilisierten expandierten Bett, einem turbulenten Fließbett oder in chargenweise betriebenen Fermentationssystemen ausgenutzt werden. In diesem Falle wird ein signifikanter Vorteil darin bestehen, dass das Material aufgrund der kleinen Partikelgröße eine sehr hohe Oberfläche hat, so dass eine maximale Anzahl von Zellen sich pro Liter Material anheften und zur gleichen Zeit direkten Zugang zu dem Nährmedium haben kann. Dies steht in deutlichem Kontrast zu einer Anzahl von bekannten Trägern, die es ermöglichen, dass Zellen sich innerhalb von großen Poren eines partikulären Materials anheften und dementsprechend in Hinblick auf die Zugänglichkeit von Nährstoffen eingeschränkt werden. Die kleine Partikelgröße des Materials gemäß dieser Erfindung kombiniert mit der hohen Dichte ermöglicht eine schnelle Abtrennung der immobilisierten Zellen, wann immer dies während oder am Ende des Fermentationsverfahrens gewünscht wird.
  • Basierend auf der Fähigkeit, Zellen und Bio-Moleküle anzuziehen, wird auch ins Auge gefasst, dass die Materialien als Mikroträger für lebende und tote Zellen wie auch Enzyme und andere Biokatalysatoren in Anwendungen verwendet werden können, wo die katalytische Aktivität der Zellen oder Enzyme und anderen Biokatalysatoren verwendet wird. Wie sich aus dem Obigen verstehen sollte, können Zellen, Enzyme oder andere Biokatalysatoren an das partikuläre Material adsorbiert werden entweder durch angefügte Gruppen, die bei pH 4,0 positiv geladen sind, oder angefügte Gruppen, die Affinitätsliganden für Biomoleküle sind. Wenn Affinitätsliganden für Biomoleküle als angefügte Gruppen verwendet werden, wird es möglich sein, zwischen verschiedenen Arten von Zellen, Enzymen oder anderen Biokatalysatoren basierend auf der Erkennung zwischen dem Ligand und dem fraglichen Ziel zu unterscheiden.
  • In dem Falle von immobilisierten Enzymen oder anderen Biokatalysatoren kann es auch vorteilhaft sein, eine kovalente chemische Kopplungsmethode, die per se bekannt ist, einzusetzen, um das Enzym oder den anderen Biokatalysator an das Material anzuheften.
  • Dementsprechend betrifft die Erfindung auch ein partikuläres Material (wie hier definiert), in welchem jedes Partikel wenigstens eine, vorzugsweise eine Mehrzahl von Zellen, Enzymen oder anderen Biokatalysatoren trägt.
  • FIGURENLEGENDEN
  • 1. Lichtmikroskop-Photographie von Partikeln mit Durchmessern im Bereich von 20-40 μm. Die Photographie veranschaulicht das feste nicht-poröse Kernmaterial (Edelstahl – dunkel) der Partikel und die äußere polymere Grundmatrix (Agarose – durchscheinend) (UFC PEI(20-40)).
  • 2. Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel von Fraktionen aus dem in Beispiel 8 beschriebenen „Expanded Bed"-Experiment. Bahn 1: alkalisches Lysat-Ausgangsmaterial; Bahnen 2-3: RNA-Elutionspeak; Bahnen 4-8: DNA-Elutionspeak; Bahn 9: Abstreifmittel-Peak; Bahn 10: Plasmid-DNA, verdaut mit BamHI; Bahn M, λ, verdaut mit HindIII und EcoRI. CCC: supergeknäulte Plasmid-DNA.
  • 3: Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel von Fraktionen aus dem in Beispiel 9 beschriebenen „Expanded Bed"-Experiment. Bahn 1: alkalisches Lysat-Ausgangsmaterial; Bahn 2: RNA-Elutionspeak; Bahn 3: DNA-Elutionspeak; Bahn 4: Abstreifmittelpeak; Bahn M: λ, verdaut mit HindIII und EcoRI. CCC: supergeknäulte Plasmid-DNA.
  • 4: Ethidiumbromid-gefärbtes Agarosegel von Proben aus dem in Beispiel 10 beschriebenen Experiment. Bahnen 1, 5 & 9: Molekulargewichtsmarker; Bahnen 2-4: Ausgangsmaterial, welches pcDNA3, pV1 bzw. pV2 enthält; Bahnen 6-8: eluiertes pcDNA3, pV1 bzw. pV2.
  • 5: Schrittweise Elution von Hefezellen (aus dem in Beispiel 12 beschriebenen Experiment) unter Verwendung von 50 mM Tris/HCl, pH 7,0, enthaltend 0,5 M NaCl, gefolgt von dem gleichen Puffer, welcher 1 M NaCl enthält. Optische Dichte bei 600 nm (----), NaCl-Konzentration (---).
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • In diesem Beispiel wird die Herstellung einer Kalbsthymus-DNA-Lösung beschrieben.
  • Die Lösung wird in Beispiel 4-7 für Modell-Bindungsuntersuchungen verwendet.
  • Die in den Beispielen 4-7 für Modelluntersuchungen verwendeten Lösungen von Kalbsthymus-DNA werden auf die folgende Weise hergestellt:
    100 mg Kalbsthymus-DNA (Sigma D 1501) werden zu 50 ml 10 mM Tris/HCl, pH 8,0 zugegeben. Die Lösung wird über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Lösung wird 30 min beschallt. Die Lösung wird dann in Aliquots von 2 ml aufgeteilt. Die Aliquots werden bei 13000 Upm 5 min zentrifugiert. Die Überstände von den zentrifugierten Aliquots werden zu neuen Röhrchen transferiert und bei –20°C aufbewahrt.
  • Um die DNA-Konzentration zu bestimmen, werden die Proben bei A260 nm unter Verwendung von Milli Q-Wasser als Leerwert gemessen. A260 nm = 1 entspricht einer DNA-Konzentration von 50 μg/ml.
  • Die Hauptmenge der DNA ist zwischen 3000 und 20000 Basenpaare lang, wie durch Gelelektrophorese gezeigt worden ist.
  • Beispiel 2
  • In diesem Beispiel wird die Derivatisierung der Adsorptionsmittel von UpFront Chromatography. die in Beispiel 3-7 verwendet werden
  • Der Begriff „UFC PEI (20-40)" bezieht sich auf ein Adsorptionsmedium, wo die Populationsgröße innerhalb des Bereichs von 20-40 μm liegt und PEI anzeigt, dass Polyethylenimin als angefügte Gruppe (Ligand) verwendet wird. Das Medium wird ausgehend von einer Population von Adsorptionsmitteln mit einer pellikulären Struktur hergestellt. Sie weisen ein aus Edelstahlkörnern (1-PSR-2, Anval, Schweden) im Größenbereich von 22-44 μm bestehendes Kernmaterial (vorzugsweise nur ein Körnchen pro Partikel) auf. Eine Schicht von Agarose umgibt das Edelstahl-Kernkörnchen. Die Population wird gesiebt, um eine Populationsgröße im Bereich von 20-40 μm zu erhalten. (Ein Beispiel dieses partikulären Materials ist in 1 veranschaulicht).
  • Der Begriff „UFC PEI (100-300)" bezieht sich auf ein Adsorptionsmedium, wo die Populationsgröße im Bereich von 100-300 liegt. PEI zeigt an, dass Polyethylenimin als die angefügte Gruppe (Ligand) verwendet wird. Das Medium wird ausgehend von einer Population von Adsorptionsmitteln mit einer pellikulären Struktur hergestellt. Sie weisen ein aus Glaskörnchen im Größenbereich von 90-150 μm bestehendes Kernmaterial (vorzugsweise nur ein Körnchen pro Partikel) auf. Eine Schicht von Agarose umgibt das Glas-Kernkörnchen. Die Population wird gesiebt, um eine Populationsgröße im Bereich von 100-300 μm zu erhalten (Referenzmaterial).
  • Die Adsorptionsmittel werden auf die folgende Weise mit PEI derivatisiert:
    50 ml Adsorptionsmittel (20-40 μm oder 100-300 μm), 40 ml Milli Q-Wasser (75°C), 6,3 ml Epichlorhydrin und 5 ml 32,5%-ige NaOH werden gemischt und die Lösung wird 3,5 h geschüttelt. Nachfolgend werden die Adsorptionsmittel mit Milli-Q-Wasser gewaschen. Die gewaschenen Epoxy-aktivierten Adsorptionsmittel werden auf die folgende Weise mit PEI gekoppelt: 50 ml Epoxy-aktivierte Adsorptionsmittel plus 50 ml PEI-Lösung, 0,4 g/ml, pH 10,5, werden über Nacht geschüttelt. Nachfolgend werden die mit PEI derivatisierten Adsorptionsmittel mit Milli-Q-Wasser gewaschen.
  • Die ionische Kapazität/Beladefähigkeit von UFC PEI (20-40) beträgt 0,14 mmol (Cl–)/ml Adsorptionsmittel.
  • Die ionische Kapazität/Beladefähigkeit von UFC PEI (100-300) beträgt 0,185 mmol (Cl–)/ml Adsorptionsmittel.
  • Der Begriff „UFC DEAE (20-40)" bezieht sich auf ein Adsorptionsmedium, wo die Populationsgröße im 20-40 μm-Bereich liegt, wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass DEAE als die angefügte Gruppe (Ligand) verwendet wird.
  • Der Begriff „UFC DEAE (100-300)" bezieht sich auf ein Adsorptionsmedium, wo die Populationsgröße im 100-300 μm-Bereich liegt, wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass DEAE als die angefügte Gruppe (Ligand) verwendet wird.
  • Die Adsorptionsmittel werden auf die folgende Weise mit DEAE derivatisiert:
    50 ml Adsorptionsmittel (20-40 μm oder 100-300 μm), 40 ml Milli Q-Wasser (75°C), 4,3 ml Epichlorhydrin und 2,5 ml 32,5%-ige NaOH werden gemischt und die Lösung wird 3 h gerührt. Die Lösung wird auf 65°C erwärmt und es werden 6,7 g NaOH und 6,1 g DEAE zu der Lösung zugesetzt. Die Lösung wird 1 h gerührt. Nachfolgend werden 5,8 ml 32,5%-ige NaOH und 6,1 g DEAE zweimal in Abständen von 1 h zugegeben. Das Erwärmen wird beendet und die Lösung wird über Nacht gerührt.
  • Die ionische Kapazität/Beladefähigkeit von UFC DEAE (20-40) beträgt 0,05 mmol (Cl–)/ml Adsorptionsmittel.
  • Die ionische Kapazität/Beladefähigkeit von UFC DEAE (100-300) beträgt 0,08 mmol (Cl–)/ml Adsorptionsmittel.
  • Bei den in diesem Beispiel hergestellten Chargen beträgt die Dichte der 20-40 μm-Adsorptionsmittel (Edelstahl-Kern) 3,7 g/ml und die Dichte der 100-300 μm-Adsorptionsmittel (Glaskern) 1,35.
  • Beispiel 3
  • In diesem Beispiel werden Expansions- oder Ausdehnungseigenschaften für UFC PEI (20-40) beschrieben.
  • Ausrüstung: Ein FastlineTM 10 (UpFront Chromatography) und eine Säulenrohrlänge von 30 cm, eine Verder-Pumpe (Pericor) und ein magnetischer Rührer (Mini MR IKA Labortechnik).
  • Methode: Die abgesetzte Betthöhe (h0) beträgt 5,0 cm. Milli-Q-Wasser wird verwendet, um die Adsorptionsmittel in die Säule zu transferieren, wie auch als das während des Experiments verwendete Fluid. Die Säule wird geebnet und der einstellbare Auslass an der obersten Spitze der Säule platziert. Die Pumpe und der magnetische Rührer werden gestartet. Die Geschwindigkeit des magnetischen Rührers führt zu einer lokalen Mischzone am Boden der Säule, die weniger als 1 cm Betthöhe ausmacht. Die Flussrate wird so eingestellt, dass das Bett um ungefähr das 3-fache sich ausdehnt bzw. expandiert (ungefähr 4 ml/min). Das Bett wird visuell inspiziert, um zu sehen, ob das Bett stabil ist und es keine Kanalbildung gibt. Die Expansionsdaten werden gesammelt, indem die Expansion (h), die einer bestimmten Flussrate entspricht, gemessen wird. Die Messungen erfolgen bei unterschiedlichen Flussraten. Der Expansionsgrad wird 15 min gemessen, wenn die Betthöhe nach einer Anpassung der Flussrate stabil ist.
  • Figure 00180001
  • Kommentar/Schlussfolgerungen:
  • Ungünstige Bettexpansionsmerkmale von typischen Körnchen von kleinem Durchmesser werden durch die Verwendung eines Trägers von sehr hoher Dichte (3,7 mg/ml) negiert. Der Expansionsgrad liegt unter 3,5, wenn die Flussrate im Bereich von 60-300 cm/h liegt, was ein typischer Bereich für den Betrieb einer Fließbett/„Expanded Bed"-Chromatographie ist.
  • Beispiel 4
  • In diesem Beispiel werden statische Bindungskapazitäten von Kalbsthymus-DNA beschrieben. Es werden Experimente ausgeführt um die Adsorptionskinetik zu beschreiben. Es werden Vergleichsuntersuchungen von unterschiedlichen Anionenaustauschern ausgeführt.
  • Kinetische Untersuchungen:
  • Es wurden 6 identische Inkubationen ausgeführt:
    400 μl 2,1 mg Kalbsthymus-DNA/ml, 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, werden zu 0,1 ml UFC PEI (20-40)-Adsorptionsmittel zugegeben. Dies bedeutet, dass 8,4 mg DNA pro ml Adsorptionsmittel zugegeben worden sind. Das Adsorptionsmittel wird in 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, äquilibriert. Die Inkubationen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten gestoppt: nach 5, 10, 30, 60, 120 und 300 s. Die Lösungen mit DNA wurden bei A260 nm analysiert und mit dem A260 nm-Wert der Lösung vor der Inkubation verglichen.
  • Figure 00180002
  • Figure 00190001
  • A260nm in der DNA-Lösung vor der Inkubation wurde durch Messung zu 42,8, was 2,1 mg DNA/ml entspricht, bestimmt.
  • Vergleichsuntersuchungen von Bindungseffizienzen von unterschiedlichen Anionenaustauschern: Statisches Experiment mit DNA:
  • 400 μl 2,1 mg Kalbsthymus-DNA/ml, 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, werden zu 0,1 ml Adsorptionsmittel hinzugegeben. Dies bedeutet, dass 8,4 mg DNA pro ml Adsorptionsmittel zugegeben worden sind. Das Adsorptionsmittel wird in 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, äquilibriert. Die Inkubationen wurden nach 300 s gestoppt. Die Lösungen mit DNA wurden bei A260 nm analysiert und mit dem A260 nm-Wert der Lösung vor der Inkubation verglichen. A260nm in der DNA-Lösung vor der Inkubation wurde durch Messung zu 42,8, was 2,1 mg DNA/ml entspricht, bestimmt.
  • Statisches Experiment mit Rinderserumalbumin (BSA):
  • 4000 μl 2,2 mg BSA/ml, 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, werden zu 0,1 ml Adsorptionsmittel hinzugegeben. Dies bedeutet, dass 88 mg BSA pro ml Adsorptionsmittel zugegeben worden sind. Das Adsorptionsmittel wird in 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, äquilibriert. Die Inkubationen wurden nach 300 s gestoppt. Die Lösungen mit BSA wurden bei A280 nm analysiert und mit dem A280 nm-Wert der Lösung vor der Inkubation verglichen. A280nm in der BSA-Lösung vor der Inkubation wurde durch Messung zu 1,41 bestimmt.
    Figure 00190002
    • a) Zahlen des Herstellers
    • b) bestimmt in statischen Bindungsexperimenten
    • c) Zahlen des Herstellers für dynamische Kapazitäten
  • Kommentare/Schlussfolgerungen:
  • In vergleichenden statischen Bindungstests mit Kalbsthymus-DNA von hohem Molekulargewicht weist der erfindungsgemäße Träger, der insbesondere mit DEAE und PEI derivatisiert ist, DNA-Bindungskapazitäten auf, die signifikant höher sind als jene von kommerziell erhältlichen Anionenaustauschmedien. Nicht überraschend wurden diese Verbesserungen zu Lasten von verringerten Kapazitäten für die Proteinadsorption angesichts der dünnen Agarose-Schicht auf dem Prototyp-Träger erzielt.
  • Die Kinetiken der Gleichgewichtsadsorption von DNA an diese Träger waren extrem schnell (10-30 s).
  • Beispiel 5
  • In diesem Beispiel werden statische Bindungsexperimente an UFC PEI (20-40) mit einer Lösung von Kalbsthymus-DNA mit einer DNA-Konzentration (ungefähr 20 μg/ml), die ungefähr die Konzentration von Plasmid-DNA in Fermentationsbrühen darstellt, ausgeführt. Die Experimente werden mit variierenden NaCl-Konzentrationen ausgeführt.
  • Das Adsorptionsmittel wird in 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, äquilibriert.
  • Die Kalbsthymus-DNA-Lösung wird ausgehend von einer Stammlösung (2,0 mg/ml, 10 mM Tris, pH 8,0) durch Verdünnung mit einem 10 mM Tris/HCl-Puffer, pH 8,0, hergestellt. NaCl wird zu Anteilen der verdünnten Lösungen zugesetzt, um variierende NaCl-Konzentrationen zu erhalten (siehe Inkubationsbedingungen):
  • Inkubationsbedingungen (für 10 min):
    • 0.1 ml UFC PEI (20-40) + 4.0 ml 20 μg DNA/ml, 10 mM Tris/HCl, pH 8.0
    • 0.1 ml UFC PEI (20-40) + 4.0 ml 20 μg DNA/ml, 25 mM NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8.0
    • 0.1 ml UFC PEI (20-40) + 4.0 ml 20 μg DNA/ml, 75 mM NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8.0
    • 0.1 ml UFC PEI (20-40) + 4.0 ml 20 μg DNA/ml, 0.2 M NaCl, 10 mM TrisIHCl, pH 8.0
    • 0.1 ml UFC PEI (20-40) + 4.0 ml 20 μg DNA/ml, 0.5 M NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8.0
    • 0.1 ml UFC PEI (20-40) + 4.0 ml 20 μg DNA/ml, 0.75 M NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8.0
    • 0.1 ml UFC PEI (20-40) + 4.0 ml 20 μg DNA/ml, 1.0 M NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8.0
    • 0.1 ml UFC PEI (20-40) + 4.0 ml 20 μg DNA/ml, 1.5 M NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8.0
    • 0.1 ml UFC PEI (20-40) + 4.0 ml 20 μg DNA/ml, 2.1 M NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8.0
    • 0.1 ml UFC PEI (20-40) + 4.0 ml 20 μg DNA/ml, 3.1 M NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8.0
  • Pro ml Adsorptionsmittel lässt man 0,8 mg DNA inkubieren. Die Absorption wird nach 10 min Inkubationszeit bei 260 nm detektiert und mit der Absorption in den DNA-Lösungen vor der Inkubation verglichen. Die Adsorptionsmittel wurden nach der Inkubation visuell inspiziert, um zu sehen, ob es eine Vernetzung oder Ausflockung der einzelnen Körnchen gab.
  • Figure 00210001
  • Bestimmung der DNA-Bindungskapazität von UFC PEI (20-40) ausgehend von einer 20 μg DNA/ml-Lösung mit 0,5 M NaCl
  • Inkubationsbedingungen (für 60 min):
    • 0.1 ml UFC PEI (20-40) + 10 ml 20 μg DNA/ml, 0.5 M NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8.0
    • 0.1 ml UFC PEI (20-40) + 20 ml 20 μg DNA/ml, 0.5 M NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8.0
    • 0.1 ml UFC PEI (20-40) + 30 ml 20 μg DNA/ml, 0.5 M NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8.0
    • 0.1 ml UFC PEI (20-40) + 40 ml 20 μg DNA/ml, 0.5 M NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8.0
  • In der inkubierten Lösung wird nach 60 min die Absorption bei 260 nm gemessen und mit der Absorption bei 260 nm in der DNA-Lösung vor der Inkubation verglichen.
  • Figure 00210002
  • Die Absorption bei 260 nm wird in der Lösung vor den Inkubationen gemessen: 0,40, was einer Konzentration von 20 μg/ml entspricht.
  • Kommentare/Schlussfolgerungen:
  • Bei chargenweise ausgeführten Adsorptionsuntersuchungen bei geringen DNA-Konzentrationen (20 μg/ml) haben wir eine intensive Gelbildung des auf PEI basierenden Anionenaustauscher-Prototyps beobachtet, wohingegen dieser Effekt bei viel höheren DNA-Konzentrationen, z.B. 2 mg/ml, nicht festgestellt wurde. Die Zugabe von NaCl bis zu einer Molarität von etwa 0,5 verhinderte, dass dies auftrat, ohne die Bindungskapazität zu verringern. Wenn jedoch die NaCl-Konzentration über 0,5 M erhöht wurde, wurde eine scharfe Abnahme der DNA-Adsorption beobachtet.
  • In statischen Bindungstests mit einer DNA-Konzentration von 20 μg/ml und 0,5 M NaCl beträgt die Kapazität/Beladefähigkeit des Adsorptionsmittels etwa 4 mg/ml Adsorptionsmittel.
  • Beispiel 6
  • In diesem Beispiel werden Durchbruchkurven, erstellt für UFC PEI (20-40) im Rahmen einer Fließbett/„Expanded Bed"-Adsorption mit einer DNA-Lösung von ungefähr 20 μg/ml DNA 0 5 M NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, beschrieben.
  • Ausrüstung: Pumpe, Säule, 1 cm Durchmesser, magnetischer Rührer
  • Methode: Adsorptionsmittel: UFC PEI (20-40). Äquilibriertes Adsorptionsmittel wird in die Säule, die bereits einen Magnetstab enthält, eingefüllt. Das Adsorptionsmittel wird mit 0,5 M NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, äquilibriert. Die abgesetzte Betthöhe beträgt 4 cm, was 3,2 ml Adsorptionsmittel entspricht. Das Adsorptionsmittel wird durch eine Flussrate von 300 cm/min Äquilibrierungspuffer auf 12 cm expandiert bzw. ausgedehnt und der magnetische Rührer wird mit einer Geschwindigkeit gestartet, die nicht zu einer Mischzone am Boden der Säule, die mehr als 1 cm ausmacht, führt. Der einstellbare Auslass der Säule wird ungefähr 1 cm oberhalb des expandierten Betts platziert.
  • Der Pumpeneinlass wird zu einer DNA-Lösung, 18,0 μg/ml DNA, 0,5 M NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, verlagert. Der Durchlauf der Säule wird in 50 ml-Fraktionen gesammelt, die durch A260nm analysiert werden, und die DNA-Konzentration, C, wird berechnet. Die Absorption bei 260 nm der DNA-Lösung, bevor sie auf die Säule aufgetragen wird, beträgt 0,36, was einer DNA-Konzentration, Co, von 18,0 μg/ml entspricht.
  • Figure 00220001
  • Figure 00230001
  • Kommentare/Schlussfolgerung:
  • Es gibt einen 10%-igen Durchbruch, nachdem 1000 ml aufgetragen worden sind. Das entspricht 18 mg aufgetragener DNA. Damit beträgt die dynamische Kapazität 5,6 mg/ml Adsorptionsmittel bei 10% Durchbruch.
  • Beispiel 7
  • In diesem Beispiel werden Durchbruchkurven, erstellt für UFC PEI (20-40) im Rahmen einer Fließbett/„Expanded Bed"-Adsorption mit einer DNA-Lösung von ungefähr 20 μg/ml DNA, 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, beschrieben.
  • Ausrüstung: Pumpe, Säule, 1 cm Durchmesser, magnetischer Rührer
  • Methode: Adsorptionsmittel: UFC PEI (20-40). Äquilibriertes Adsorptionsmittel wird in die Säule, die bereits einen Magnetstab enthält, eingefüllt. Das Adsorptionsmittel wird mit 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, äquilibriert. Die abgesetzte Betthöhe beträgt 4 cm, was 3,2 ml Adsorptionsmittel entspricht. Das Adsorptionsmittel wird durch eine Flussrate von 300 cm/min Äquilibrierungspuffer auf 12 cm expandiert bzw. ausgedehnt und der magnetische Rührer wird gestartet mit einer Geschwindigkeit, die nicht zu einer lokalen Mischzone am Boden der Säule, die mehr als 1 cm ausmacht, führt. Der einstellbare Auslass der Säule wird ungefähr 1 cm oberhalb des expandierten Betts platziert. Der Pumpeneinlass wird zu der DNA-Lösung, 20,0 μg/ml DNA, 10 mM Tris/HCl, pH 8,0, verlagert. Der Durchlauf der Säule wird in 50 ml-Fraktionen gesammelt, die durch A 260 nm analysiert werden. Die Absorption bei 260 nm der DNA-Lösung, bevor sie auf die Säule aufgetragen wird, beträgt 0,39, was einer DNA-Konzentration von 19,5 μg/ml entspricht.
  • Figure 00240001
  • Kommentare/Schlussfolgerung
  • In Abwesenheit von NaCl trat ein Durchbruch auf, nachdem ~ 4 mg DNA pro ml Adsorptionsmittel aufgetragen worden waren. An diesem Punkt wurde eine schwerwiegende Gelbildung beobachtet und die Medien dehnten sich in Form eines Pfropfens aus der Säule hinaus aus. Das Experiment musste gestoppt werden.
  • Beispiel 8
  • Trennung von RNA und Plasmid-DNA aus neutralisierten Escherichia coli-Lysaten unter Verwendung von UFC DEAE (20-40 μm)-Adsorptionsmittel und kontinuierlicher linearer Ionenstärke-Gradienten-Elution.
  • Das in diesem Beispiel verwendete Ausgangsmaterial wurde, wie folgt, hergestellt: Escherichia coli DH5-alpha-Zellen werden mit einem 8,5 kb-Runaway-Plasmid (pOU61) transformiert und durch Fermentation vermehrt. Nach der Fermentation werden Zellen durch Zentrifugation geerntet, in einem RNase (100 μg/ml) enthaltenden Puffer resuspendiert und unter alkalischen Bedingungen in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat lysiert. Das alkalische Lysat wird dann mit 3 M Kaliumacetat, pH 5,5, neutralisiert, und die Plasmid enthaltende Brühe unterhalb einer aufschwimmenden ausgeflockten Schicht von denaturierten Proteinen und chromosomaler DNA ablaufen gelassen. Die endgültigen DNA-, RNA- und Proteingehalte des neutralisierten Lysats betragen 53 μg/ml, 680 μg/ml bzw. 360 μg/ml.
  • Ausrüstung: FastLineTM 10-Säule (1 cm Durchmesser und 30 cm Höhe), magnetischer Rührer, GradiFracTM System, umfassend eine HiLoad Pump P-50, einen Fraktionensammler und einen REC102-Bandschreiber.
  • Methode: Adsorptionsmittel: UFC DEAE (20-40 μm). Das Adsorptionsmittel wird zu der Säule hinzugegeben, die bereits einen magnetischen Rührstab enthält. Das Adsorptionsmittel wird mit 0,1 M NaOH 1 h mit einer linearen Flussrate von 153 cm/h gewaschen. Man lässt das Bett sich absetzen und lässt es in 0,1 M NaOH über Nacht stehen. Das Adsorptionsmittel wird dann mit 0,8 M Kaliumacetat, 10 mM EDTA, pH 5,5, äquilibriert. Die abgesetzte Betthöhe beträgt 5,5 cm, was 4,3 ml Adsorptionsmittel entspricht. Das Adsorptionsmittel wird auf eine Höhe von 11,4 cm mit Äquilibrierungspuffer mit einer linearen Flussrate von 153 cm/h expandiert und der magnetische Rührer wird mit einer Geschwindigkeit von 750 Upm, die während des gesamten Experiments konstant gehalten wird, gestartet. Der einstellbare Auslass der Säule wird ungefähr 1 cm oberhalb des expandierten Bettes platziert. Nach der Äquilibrierung für 2 h werden 40 ml neutralisiertes E. coli-Lysat durch die Säule mit einer linearen Flussrate von 153 cm/h gepumpt. Das Adsorptionsmittel wird dann mit Äquilibrierungspuffer 26 min gewaschen, gefolgt von 25 mM Kaliumacetat, 10 mM EDTA, pH 5,5, bis das mitlaufende Absorptionssignal auf dem Bandschreiber die Grundlinie erreicht. Gebundene RNA wird von dem Adsorptionsmittel schrittweise unter Verwendung von 0,66 M NaCl (in 25 mM Kaliumacetat, 10 mM EDTA, pH 5,5) eluiert. Plasmid-DNA wird dann eluiert, indem ein linearer Ionenstärke-Gradient, beginnend von 0,66 M NaCl (in 25 mM Kaliumacetat, 10 mM EDTA, pH 5,5) und endend bei 1 M NaCl (in 25 mM Kaliumacetat, 10 mM EDTA, pH 5,5), in einem Zeitraum von 2 h aufgetragen wird. Nach der Elution wird noch an das Adsorptionsmittel gebundenes Material mit einem Abstreifpuffer (2 M NaCl, 0,2 M NaOH) entfernt. Die aus der Säule austretende Flüssigkeit wird in 4 ml-Fraktionen gesammelt und die Zusammensetzungen von jeder Fraktion werden durch Elektrophorese und Assays auf Protein, RNA und DNA analysiert.
  • Kommentare/Schlussfolgerung:
  • Unter Verwendung der oben beschriebenen Bedingungen wird eine vollständige Trennung von RNA von DNA erzielt (2) und >95% des Proteins werden während des Aufladens der Probe gesammelt. Nahezu 80% der supergeknäulten Plasmid-DNA, die auf das expandierte Bett von UFC DEAE (20-40 μm)-Adsorptionsmittel aufgeladen worden war, wird in dem angewendeten linearen Gradienten eluiert und ist vollständig frei von RNA und Protein.
  • Beispiel 9
  • Trennung von RNA und Plasmid-DNA aus neutralisierten Escherichia coli-Lysaten unter Verwendung von UFC DEAE (20-40 μm)-Adsorptionsmittel und schrittweiser Ionenstärke-Gradienten-Elution.
  • Das in diesem Beispiel verwendete Ausgangsmaterial wird, wie folgt, hergestellt: Escherichia coli DH5-alpha-Zellen werden mit einem 8,5 kb-Runaway-Plasmid (pOU61) transformiert und durch Fermentation vermehrt. Nach der Fermentation werden Zellen durch Zentrifugation geerntet, in einem RNase (100 μg/ml) enthaltenden Puffer resuspendiert und unter alkalischen Bedingungen in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat lysiert. Das alkalische Lysat wird dann mit 3 M Kaliumacetat, pH 5,5, neutralisiert, und die Plasmid enthaltende Brühe unterhalb einer aufschwimmenden ausgeflockten Schicht von denaturierten Proteinen und chromosomaler DNA ablaufen gelassen. Die endgültigen DNA-, RNA- und Proteingehalte des neutralisierten Lysats betragen 53 μg/ml, 650 μg/ml bzw. 320 μg/ml.
  • Ausrüstung: FastLineTM 10-Säule (1 cm Durchmesser und 30 cm Höhe), magnetischer Rührer, GradiFracTM System, umfassend eine HiLoad Pump P-50, einen Fraktionensammler und einen REC102-Bandschreiber.
  • Methode: Adsorptionsmittel: UFC DEAE (20-40 μm). Das Adsorptionsmittel wird zu der Säule hinzugegeben, die bereits einen magnetischen Rührstab enthält. Das Adsorptionsmittel wird mit 0,1 M NaOH 1 h mit einer linearen Flussrate von 153 cm/h gewaschen. Man lässt das Bett sich absetzen und lässt es in 0,1 M NaOH über Nacht stehen. Das Adsorptionsmittel wird dann mit 0,8 M Kaliumacetat, 10 mM EDTA, pH 5,5, äquilibriert. Die abgesetzte Betthöhe beträgt 5,4 cm, was 4,2 ml Adsorptionsmittel entspricht. Das Adsorptionsmittel wird auf eine Höhe von 11,3 cm mit Äquilibrierungspuffer mit einer linearen Flussrate von 153 cm/h expandiert und der magnetische Rührer wird mit einer Geschwindigkeit von 750 Upm, die während des gesamten Experiments konstant gehalten wird, gestartet. Der einstellbare Auslass der Säule wird ungefähr 1 cm oberhalb des expandierten Bettes platziert. Nach der Äquilibrierung für 2 h werden 40 ml neutralisiertes Escherichia coli-Lysat durch die Säule mit einer linearen Flussrate von 153 cm/h gepumpt. Das Adsorptionsmittel wird dann mit Äquilibrierungspuffer 25 min gewaschen, gefolgt von 25 mM Kaliumacetat, 10 mM EDTA, pH 5,5, bis das mitlaufende Absorptionssignal auf dem Bandschreiber die Grundlinie erreicht. Gebundene RNA wird von dem Adsorptionsmittel unter Verwendung von 0,66 M NaCl (in 25 mM Kaliumacetat, 10 mM EDTA, pH 5,5) eluiert. Plasmid-DNA wird dann unter Verwendung von 1 M NaCl (in 25 mM Kaliumacetat, 10 mM EDTA, pH 5,5) eluiert. Nach der Elution wird noch an das Adsorptionsmittel gebundenes Material mit einem Abstreifpuffer (2 M NaCl, 0,2 M NaOH) entfernt. Die aus der Säule austretende Flüssigkeit wird in 4 ml-Fraktionen gesammelt und die Zusammensetzungen von jeder Fraktion werden durch Elektrophorese und Assays auf Protein, RNA und DNA analysiert.
  • Kommentare/Schlussfolgerung:
  • Durch Anwendung einer einfachen schrittweisen Ionenstärke-Gradienten-Elution wird eine Abtrennung von RNA von DNA erzielt (3). Die Ausbeute an supergeknäulter Plasmid-DNA ist >75%.
  • Beispiel 10:
  • Affinitäts-Einfang von Plasmid-DNA aus Escherichia coli-Lysaten unter Verwendung von UFC (20-40 μm)-Adsorptionsmittel. welches mit einem Affinitätsligand derivatisiert ist.
  • Ein DNA-Fragment, welches die Sequenz d(GAA)17·d(TTC)17 enthält, wird in einen kommerziellen Expressionsvektor (pcDNA3, Invitrogen, USA) in die Bst1 107 l-Restriktionsstelle inseriert, um das Plasmid pV1 zu erzeugen, oder in die Bst1 107 l-Restriktionsstelle und die BglII-Restriktionsstelle inseriert, um das Plasmid pV2 zu erzeugen. E. coli DH5-alpha-Zellen werden mit jedem Plasmid transformiert und durch Fermentation vermehrt.
  • Nach der Fermentation werden Zellen geerntet und unter alkalischen Bedingungen in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat lysiert. Das Lysat wird neutralisiert und auf Bindungsbedingungen (2 M NaCl, 0,2 M Acetatpuffer, pH 4,5) und auf einen DNA-Endgehalt von 8 ± 1 μg/l eingestellt.
  • Methode: Adsorptionsmittel: UFC (CTT)7-Affinität (20-40 μm), Avidin-beschichtetes UFC (20-40 μm)-Adsorptionsmittel wird mit 1 nmol Biotin-markiertem (CTT)7-Oligonukleotid pro ml Matrix derivatisiert, um das Affinitätsadsorptionsmittel herzustellen.
  • Das Affinitätsadsorptionsmittel wird einmal mit 0,15 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,5, gewaschen und dann in 2 M NaCl, 0,2 M Kaliumacetat-Puffer, pH 4,5, äquilibriert. Das Adsorptionsmittel wird dann durch vollständiges Umkippen sanft mit Bakterienlysat, welches entweder pV0, pV1 oder pV2 enthält, in einem Verhältnis von 160 ± 20 μg DNA pro ml Affinitätsadsorptionsmittel gemischt. Nach 20 h wird das Adsorptionsmittel zweimal mit 0,5 Volumen 2 M NaCl, 0,2 M Kaliumacetat-Puffer, pH 4,5, gewaschen und dann wird eine Elution des Plasmids durch Inkubation für 30 min in 0,5 Volumen Elutionspuffer (1 M Tris, 1 mM EDTA, pH 10,6) erzielt. Der Plasmid enthaltende Überstand wird abgetrennt und durch Agarose-Gelelektrophorese, gefolgt von Ethidiumbromid-Färbung und Sichtbarmachen unter UV-Licht, analysiert (4).
  • Kommentare/Schlussfolgerung:
  • Nur Plasmide, die die spezielle Zielsequenz tragen, werden durch das UFC (20-40 μm)-Affinitätsadsorptionsmittel aus dem Plasmid enthaltenden Bakterienlysat heraus eingefangen (4).
  • Beispiel 11
  • Einfang von Hefezellen aus Puffer unter Verwendung von UFC DEAE (20-40 μm)-Adsorptionsmittel.
  • Ausrüstung: FastLineTM 10-Säule (1 cm Durchmesser und 30 cm Höhe), Verder CD70-Pumpe, magnetischer Rührer, Spektrophotometer.
  • Methode: Adsorptionsmittel: UFC DEAE (20-40 μm). Das Adsorptionsmittel wird zu der Säule hinzugegeben, die bereits einen magnetischen Rührstab enthält. Das Adsorptionsmittel wird gewaschen und mit 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,0, 2 h mit einer linearen Flussgeschwindigkeit von 153 cm/h äquilibriert. Die abgesetzte Betthöhe beträgt 4 cm, was 3,15 ml Adsorptionsmittel entspricht. Das Adsorptionsmittel wird bis auf eine Höhe von 9,5 cm mit Äquilibrierungspuffer mit einer linearen Flussrate von 153 cm/h expandiert und der magnetische Rührer wird mit einer Geschwindigkeit von 750 Upm, die während des gesamten Experiments konstant gehalten wird, gestartet. Es wird eine lineare Flussgeschwindigkeit von 153 cm/h für alle Lösungen, die durch die Säule hindurchgeleitet werden, verwendet. Der einstellbare Auslass der Säule wird ungefähr 1 cm oberhalb des expandierten Bettes platziert. Zu Äquilibrierungspuffer wird kommerzielle Bäckerhefe zugegeben, um eine optische Dichte bei 600 nm (O.D. 600) von 1,42 zu erhalten, was äquivalent zu 0,39 g/l Trockengewicht ist. Die zellhaltige Lösung wird zu der Säule gepumpt und die aus der Säule austretende Flüssigkeit wird in 2 ml-Fraktionen gesammelt und auf den Hefezell-Gehalt analysiert, indem die optische Dichte bei 600 nm in einem Spektrophotometer überwacht wird.
  • Kommentare/Schlussfolgerung:
  • Es wird kein Durchbruch von Hefezellen detektiert, wenn 760 ml Puffer, welcher Zellen enthält (0,30 g Trockengewicht), durch die Säule geleitet wurden. Die dynamische Durchbruch-Kapazität des UFC (20-40 μm) DEAE-Adsorptionsmittels für Hefezellen ist unter diesen Bedingungen dementsprechend höher als 0,095 g Trockengewicht Zellen pro ml Adsorptionsmittel.
  • Beispiel 12
  • Einfang von Hefezellen aus Fermentationsmedium unter Verwendung von UFC DEAE (20-40 μm)-Adsorptionsmittel und schrittweiser Ionenstärke-Gradientenelution.
  • Ausrüstung: FastLineTM 10-Säule (1 cm Durchmesser und 30 cm Höhe), Verder CD70-Pumpe, magnetischer Rührer, Spektrophotometer.
  • Methode: Adsorptionsmittel: UFC DEAE (20-40 μm). Das Adsorptionsmittel wird zu der Säule hinzugegeben, die bereits einen magnetischen Rührstab enthält. Das Adsorptionsmittel wird gewaschen und mit 50 mM Tris/HCl-Puffer, pH 7,0, 2 h mit einer linearen Flussgeschwindigkeit von 153 cm/h äquilibriert. Die abgesetzte Betthöhe beträgt 3,9 cm, was 3,05 ml Adsorptionsmittel entspricht. Das Adsorptionsmittel wird bis auf eine Höhe von 9,5 cm mit Äquilibrierungspuffer mit einer linearen Flussrate von 153 cm/h expandiert und der magnetische Rührer wird mit einer Geschwindigkeit von 750 Upm, die während des gesamten Experiments konstant gehalten wird, gestartet. Es wird eine lineare Flussgeschwindigkeit von 153 cm/h für alle Lösungen, die durch die Säule hindurchgeleitet werden, verwendet. Der einstellbare Auslass der Säule wird ungefähr 1 cm oberhalb des expandierten Bettes platziert. Es wird ausreichend kommerzielle Bäckerhefe, um eine Trockengewicht (Trockengew.)-Konzentration von 0,52 g/l zu erhalten, was einer optischen Dichte bei 600 nm (O.D. 600) von 1,82 entspricht, zu einem definierten Fermentationsmedium, welches Mineralsalze, Glucose (10 g/l) und Spurenelemente enthält (Verduyn et al., 1992, Yeast, 8: 501-517), zugegeben. Das Hefe enthaltende Medium (84 ml) wird durch die Säule gepumpt, das Adsorptionsmittel wird dann mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, währenddessen die O.D. 600 die Grundlinie erreicht. Hefezellen werden von dem Adsorptionsmittel schrittweise unter Verwendung von 0,5 M NaCl enthaltendem Äquilibrierungspuffer und in einem nachfolgenden Elutionsschritt unter Zugabe von Äquilibrierungspuffer, welcher 1 M NaCl enthält, eluiert. Die aus der Säule austretende Flüssigkeit wird in 2 ml-Fraktionen gesammelt.
  • Kommentare/Schlussfolgerung:
  • Es tritt ein zehnprozentiger Durchbruch auf, nachdem 10 ml Zellsuspension aufgetragen worden sind. Die bei 10% Durchbruch bestimmte dynamische Bindungskapazität beträgt 1,7 mg Trockengewicht Zellen pro ml Adsorptionsmittel. Die Anwendung eines Puffers, welcher 0,5 und 1 M NaCl enthält, führt zu der Elution von Hefezellen (5) aus dem UFC (20-40 μm)-Adsorptionsmittelbett.

Claims (31)

  1. Partikuläres Material mit einer Dichte von mindestens 2,5 g/ml, wobei die Partikel des partikulären Materials im Wesentlichen aus einer polymeren Grundmatrix und einem nicht-porösen Kernmaterial aufgebaut sind, wobei das Kernmaterial eine Dichte von mindestens 3,0 g/ml aufweist, wobei die polymere Grundmatrix entweder mit einer Ladung versehbare angefügte Gruppen oder Affinitätsliganden für ein Bio-Makromolekül umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel des partikulären Materials einen durchschnittlichen Durchmesser von 20-40 μm aufweisen.
  2. Material nach Anspruch 1, wobei die polymere Grundmatrix angefügte Gruppen, die bei pH 4,0 positiv geladen sind, umfasst.
  3. Material nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei mindestens 95% der Partikel einen Durchmesser im Bereich von 20-40 μm aufweisen.
  4. Material nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Dichte der Partikel mindestens 3,0 g/ml, wie mindestens 3,5 g/ml, beträgt, vorzugsweise im Bereich von 3,5-10,0 g/ml liegt.
  5. Material nach Anspruch 1, wobei die angefügten Gruppen mit einer Ladung versehbare Gruppierungen, ausgewählt aus Polyethylenimin, modifiziertem Polyethylenimin, Polyethylenimin/oxyethylen), quaternärem Aminoethyl (QAE) und Diethylaminoethyl (DEAE), umfassen.
  6. Material nach Anspruch 5, wobei die angefügten Gruppen Polyethylenimin-Ketten mit einer massegemittelten Molekülmasse von mindestens 10.000 D, wie 10.000-200.000 D, sind.
  7. Material nach Anspruch 5 oder 6, wobei die angefügten Gruppen eine Tentakel-artige Struktur auf der Oberfläche des Partikels bilden.
  8. Material nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Kernmaterial eine Dichte im Bereich von 6,0-12,0 g/ml aufweist.
  9. Material nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Kernmaterial von mindestens 95% der Partikel ein Stahlkörnchen mit einem Durchmesser im Bereich von 2-40 μm, wie 15-38 μm, vorzugsweise 15-35 μm ist.
  10. Material nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei mindestens 95% der Partikel ein einzelnes nicht-poröses Kernmaterial-Körnchen mit einem Durchmesser, der mindestens das 0,70-fache, wie mindestens das 0,80-fache, vorzugsweise mindestens das 0,85-fache des Durchmessers des Partikels ist, umfassen.
  11. Material nach einem der Ansprüche 1-8, wobei das Kernmaterial aus mehr als einem Körnchen gebildet wird.
  12. Material nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Kernmaterial 10-99%, vorzugsweise 50-95% des Volumens der Partikel ausmacht und die Polymer-Grundmatrix 1-90%, vorzugsweise 5-50% des Volumens des Partikels ausmacht.
  13. Material nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die polymere Grundmatrix aus Polysacchariden, vorzugsweise Agarose ausgewählt wird.
  14. Material nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei mindestens 95% der Partikel im Wesentlichen kugelförmig sind.
  15. Verfahren zur Isolierung oder Reinigung eines Bio-Makromoleküls, wobei das Bio-Makromolekül an ein partikuläres Material, wie in einem der Ansprüche 1-14 definiert, adsorbiert wird, wobei das partikuläre Material in fluidisierter Form in einer Fließbett-Säule vorliegt.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, in welchem: (a) ein Ausgangsmaterial, welches ein oder mehrere Bio-Makromoleküle umfasst, mit einem fluidisierten Bett eines partikulären Materials, wie in einem der Ansprüche 1-14 definiert, in Kontakt gebracht wird; und (b) das oder die Bio-Makromolekül(e) von dem partikulären Material eluiert wird (werden).
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das partikuläre Material, nachdem es mit einem Ausgangsmaterial in Kontakt gebracht worden ist, und vor einer Elution gewaschen wird.
  18. Verfahren nach den Ansprüchen 16 und 17, wobei das fluidisierte Bett des partikulären Materials mit einem Äquilibrierungspuffer vor dem Inkontaktbringen mit dem Ausgangsmaterial gewaschen wird.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16-18, wobei die Konzentration des Bio-Makromoleküls in dem Ausgangsmaterial im Bereich von 0,1-3.000 μg/ml liegt.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Ausgangsmaterial, das das oder die Bio-Makromolekül(e) umfasst, des Weiteren NaCl in einer Konzentration von 0,01-2,0 M umfasst.
  21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, wobei das Ausgangsmaterial, das das oder die Bio-Makromolekül(e) umfasst, des Weiteren einen Puffer umfasst, wodurch der pH im Bereich von 2,0-13,0 liegt.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 16-21, wobei das Verhältnis zwischen dem Bio-Makromolekül und dem partikulären Material (Adsorptionsmittel) im Bereich von 0,1-7,0 mg Bio-Makromolekül/ml Adsorptionsmittel liegt.
  23. Verfahren nach einem der Ansprüche 16-22, wobei das Makromolekül ein Molekulargewicht von mindestens 20.000 D aufweist.
  24. Verfahren nach einem der Ansprüche 16-23, wobei das partikuläre Material, an welches das Bio-Makromolekül adsorbiert ist, mit einem wässrigen Äquilibrierungspuffer, welcher NaCl enthält, gewaschen wird.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 16-24, wobei das partikuläre Material, an welches das Bio-Makromolekül adsorbiert ist, mit einem NaCl-Gradient und/oder NaOH-Puffer eluiert wird.
  26. Verfahren nach einem der Ansprüche 15-25, wobei das fluidisierte Bett ein stabilisiertes expandiertes Bett („Expanded Bed") ohne signifikante Rückvermischung ist.
  27. Verfahren nach einem der Ansprüche 16-26, wobei das partikuläre Material eines, das in Anspruch 15 definiert wird, ist.
  28. Verfahren nach einem der Ansprüche 15-27, wobei das Bio-Makromolekül eine Nukleinsäure ist.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Nukleinsäure Plasmid-DNA ist.
  30. Verwendung eines partikulären Materials, wie in einem der Ansprüche 1-14 definiert, zur Verwendung in chromatographischen Verfahren.
  31. Partikuläres Material nach einem der Ansprüche 1-14, wobei das partikuläre Material eine hohe dynamische Kapazität beim Einfang von Bio-Makromolekülen von mindestens 22 mg BSA/ml bereitstellt.
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