DE3336235C2

DE3336235C2 -

Info

Publication number: DE3336235C2
Application number: DE3336235A
Authority: DE
Inventors: Shmuel Maloev Dk Amotz; Susanne Rungsted Kyst Dk Rugh; Erik Kjaer Vaerloese Dk Markussen; Kurt Alleroed Dk Thomsen
Original assignee: Novo Industri AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1982-10-06
Filing date: 1983-10-05
Publication date: 1992-01-30
Also published as: AR241793A1; DE3336235A1; IT1163946B; US4572897A; FI833614A0; FR2541305B1; JPS5985291A; NL8303414A; FR2541305A1; ES8600392A1; IE832346L; FI85283C; ES526246A0; FI85283B; IE56080B1; DK442783A; DK149079C; FI833614L; IT8323148A0; DK149079B

Description

Die Erfindung betrifft das in den Ansprüchen 1 bis 8 angegebene granulatförmige immobilisierte Enzym sowie nach den Ansprüchen 9 bis 16 ein Verfahren zu dessen Herstellung. Das granulatförmige immobilisierte Enzym besteht aus einem Träger, auf dessen Oberfläche das Enzym immobilisiert ist. Unter "Oberfläche des Trägers" ist hier sowohl die äußere Oberfläche als auch bei einem porösen Träger die innere Oberfläche zu verstehen.

Das Gebiet der immobilisierten Enzyme und Träger zur Immobilisierung von Enzymen weitet sich rasch aus. Üblicherweise besitzt der Träger die Form kleiner Teilchen, möglicherweise abgewogen bzw. mit vorbestimmtem Gewicht, in die das Enzym eingebettet oder auf deren Oberfläche das Enzym gebunden oder fixiert ist. In der US-PS 42 66 029, US-PS 41 16 771 und DK-PS 1 33 380 sind Träger beschrieben (auf oder in denen Enzyme fixiert sind).

Der erfindungsgemäß angewandte Träger gehört zu der Gruppe von Trägern, auf deren Oberfläche das Enzym fixiert ist im Gegensatz zu der Gruppe von Trägern, bei denen das Enzym in der gesamten Masse des Trägers verteilt ist, wie das z. B. nach Biotechnology and Bioengineering, Vol. XVI, S. 1393-1398 (1974), der Fall ist.

In der EP 00 14 003 B1 sind komplexe Körnchen beschrieben, die aktive Proteinsubstanzen enthalten, welche auf einem festen, mineralischen, porösen, in Wasser unslöslichen Träger, bestehend aus Körnchen, fixiert sind. Sie sind dadurch gekennzeichnet, daß die Körnchen des Trägers im Inneren ihrer Struktur Hohlräume aufweisen, von denen der überwiegende Anteil mittlere Abmessungen zwischen 5 und 200 µm besitzt. Diese Druckschrift beschreibt ferner ein Verfahren zur Herstellung solcher Körnchen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einer Imprägnierung des mineralischen Trägers mit den aktiven Proteinsubstanzen und den eventuellen weiteren Bestandteilen der Zusammensetzung eine Vernetzung vornimmt. Als mineralischer Träger dient gemäß Anspruch 6 vorzugsweise ein Titanschwamm.

Ein typisch bekannter Träger, der zu der Gruppe von Trägern gehört, auf deren Oberfläche das Enzym fixiert ist, besteht aus teilchenförmiger (granulatförmiger) Gelatine und ist beschrieben in Derwent 080 C/5 (J 5 4156-892). Teilchen aus reiner Gelatine sind jedoch nicht hart genug, um bei Festbettverfahren im großen Maßstab angewandt zu werden, wenn hohe Fließgeschwindigkeiten erforderlich sind. Auch sind Teilchen von reiner Gelatine verhältnismäßig teuer.

Ein ähnlicher Träger, der auch zu dieser Gruppe gehört und bei dem ein inerter Kern mit Gelatine überzogen ist, kann nach der US-PS 42 66 029 hergestellt werden. Obwohl dieser Träger gute Fließcharakteristika aufweist, besitzt er den Nachteil, daß die Form und Größe der Trägerteilchen nicht so gewählt werden kann, daß sie die beste Wirkung in einer Säule ergeben, sondern durch die spezielle Sandfraktion oder andere Fraktion eines feinteiligen dichten Materials, das als Rohmaterial angewandt wird, vorgegeben sind. Darüber hinaus ist dieser Träger, obwohl er leicht im Labormaßstab hergestellt werden kann, schwierig oder unter Umständen gar nicht im industriellen Maßstab herstellbar.

Ein anderer typischer bekannter Träger, der zu dieser Gruppe gehört, ist beschrieben in Advances in Experimental Medicine and Biology, Bd. 42, S. 191-212, Immobilized Biochemicals and Affinity Chromatography. Dieser Träger besteht aus Glasperlen mit einem Silan-Kupplungsmittel. Diese Perlen besitzen ausgezeichnete Fließeigenschaften und eine verhältnismäßig hohe Beladbarkeit. Sie sind jedoch sehr teuer und wie bei allen anorganischen Trägern müssen mühsame chemische Behandlungen durchgeführt werden, die auch die Anwendung unerwünschter bzw. unangenehm zu handhabender Substanzen umfassen, um die Träger zur Immobilisierung von Enzymen geeignet zu machen.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein granulatförmiges immobilisiertes Enzym sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung zu entwickeln, wobei das Enzym auf der Oberfläche eines Trägers festgehalten wird, wodurch der Träger bzw. das auf dem Träger immobilisierte Enzym alle oben erwähnten wünschenswerten Eigenschaften besitzt, d. h. eine ausreichende Härte, eine leichte Herstellbarkeit im industriellen Maßstab mit Hilfe einer einfachen chemischen Behandlung und geringe Herstellungskosten.

Diese Aufgabe wird gelöst durch das im Hauptanspruch näher gekennzeichnete granulatförmige immobilisierte Enzym. Vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Enzymgranulats sind in den Ansprüchen 2 bis 8 angegeben. Dieses Enzymgranulat kann hergestellt werden entsprechend den Ansprüchen 9 bis 16.

Das Enzymgranulat umfaßt einen Träger, auf dessen Oberfläche die Enzyme festgehalten werden, wobei der Träger gebildet wird durch Kombination von zwei Phasen, d. h. a) einer kontinuierlichen Phase aus einem wasserlöslichen Bindemittel, das zumindest teilweise in einem wäßrigen Medium gelöst oder dispergiert ist, und b) einer diskontinuierlichen Phase aus einer Vielzahl diskreter harter inerter Teilchen, die klein genug sind, daß sie bei der Formung des Trägers nicht stören und durch Unlöslichmachen des Bindemittels in dem Medium, in dem das Enzym gegebenenfalls angewandt wird, soweit erforderlich, und wobei der Träger mit einem Enzym zusammengebracht wird, das auf der Oberfläche des Trägers festgehalten wird. Wenn das Medium, in dem das immobilisierte Enzym letzten Endes angewandt werden soll, ein wäßriges Medium ist, ist es erforderlich, das ursprünglich wasserlösliche Bindemittel durch chemische oder physikalische Behandlung, z. B. durch Vernetzen oder Erhitzen, unlöslich zu machen. Wenn das Medium, in dem das immobilisierte Enzym schließlich angewandt werden soll, ein nichtwäßriges Medium ist, kann das ursprünglich wasserlösliche Bindemittel in diesem nichtwäßrigen Medium unlöslich sein, und in diesem Fall ist es nicht erforderlich, das Bindemittel unlöslich zu machen. Aus Gründen der Vollständigkeit wird auf die Tatsache hingewiesen, daß der Träger andere Bestandteile neben den oben erwähnten notwendigen Bestandteilen a) und b) enthalten kann, z. B. Füllstoffe und/oder Granulationshilfsmittel.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß der Träger bzw. das Enzymgranulat seinen ausgezeichneten physikalischen Zusammenhalt beibehält, selbst bei hohen Anteilen inerter Teilchen bis zu 98 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Trägers. Das ist sehr wichtig, da der Träger um so härter und die Kosten um so niedriger werden, je höher der Anteil an inerten Teilchen (bis zu der oben angegebenen Grenze) ist.

Wenn das immobilisierte Enzym eine Lipase ist und die Lipase angewandt werden soll, um Lipide in einer Petroletherlösung umzuestern, können Albumin, Casein, Sojaprotein, Hydroxyethylcellulose, Agar, Alginate, Polyvinylalkohole, Stärke, Methylcellulose oder Carboxymethylcellulose als Bindemittel angewandt werden, da diese Materialien in Petrolether unlöslich sind. In diesem Fall ist nur eine lose Haftung zwischen dem Träger und dem Enzym erforderlich. Wenn andererseits das Enzym Amyloglukosidase ist und die Amyloglukosidase angewandt werden soll, um Dextrine in wäßriger Lösung zu spalten, ist es notwendig, das ursprünglich wasserlösliche Bindemittel unlöslich zu machen. Üblicherweise wird die Amyloglukosidase durch Vernetzung bzw. Verknüpfung mit Glutaraldehyd auf der Oberfläche des Trägers fixiert bzw. immobilisiert.

Selbstverständlich ist nicht zwangsläufig jede beliebige Kombination irgendeines Enzyms und irgendeiner der beiden Trägerphasen a) und b) wirksam. Der Fachmann weiß, daß einige Enzyme mit bestimmten Kationen nicht verträglich sind, die in geringen Mengen von der Phase b) abgegeben werden können, und wenn das immobilisierte Enzym zur Verwendung in der Nahrungsmittelindustrie vorgesehen ist, können einige der Komponenten für die Phase a) weniger günstig sein, da schädliche Bestandteile in den Auslauf aus dem Enzymreaktor gelangen können.

In der DK-Anmeldung 1592/78 (Standard Brands, entsprechend US-PS 41 10 164 bzw. BE-PS 8 65 900) ist immobilisierte Glukoseisomerase beschrieben, die durch Ionenaustausch an einem Träger festgehalten wird, bestehend aus faseriger ionenaustauschender Cellulose, die eingebaut ist in ein hydrophobes Polymer und gegebenenfalls ein Verdichtungsmittel wie pulverförmige Metalloxide enthält. Der Träger wird hergestellt durch Schmelzen des hydrophoben Polymers und Vermischen der Cellulose und des Verdichtungsmittels mit dem geschmolzenen Polymer. Dieses Verfahren besitzt jedoch verschiedene Nachteile. In erster Linie ist der Preis derartiger hydrophober Polymeren verhältnismäßig hoch, und zweitens ist es wesentlich einfacher, mit wäßrigen Lösungen oder Suspensionen von Bindemitteln gemäß der Erfindung zu arbeiten als mit hydrophoben Polymeren. Auch ist das in der DK-Anmeldung 1592/78 beschriebene Verfahren streng begrenzt auf Enzyme, die auf Ionenaustauscherharzen immobilisiert sind, d. h. mit einer monomolekularen Enzymschicht, während das erfindungsgemäße Verfahren geeignet ist für alle Anbindungs- bzw. Fixierungsverfahren von Enzymen auf Trägern und sowohl für monomolekulare Enzymschichten als auch für multimolekulare Enzymschichten. So ist es z. B. im Fall von Glukoseisomerase aufgrund der freien Wahl der Schichtdicke des Enzyms erfindungsgemäß möglich, sehr hohe Werte für die spezifische Aktivität zu erhalten, während der Maximalwert für die spezifische Aktivität der immobilisierten Glukoseisomerase nach der DK-Anmeldung 1592/78 verhältnismäßig niedrig ist und eindeutig zu niedrig für industrielle Anwendungen.

Bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Arbeitsweise besteht das Zusammenbringen der beiden Phasen in einem Vermischen der kontinuierlichen Phase und der diskontinuierlichen Phase, woraufhin das Gemisch anschließend zu einem teilchenförmigen, vorzugsweise kugelförmigen Träger geformt wird. Auf diese Weise werden billige und leicht zugängliche Trägerteilchen erhalten.

Bekannte Verfahren zur Herstellung von Gelatinekugeln oder abgerundeten Gelatineteilchen sind verhältnismäßig kostspielig und mühsam. Es wird auf die DK-PS 1 33 380 verwiesen, in der beschrieben wird, daß derartige Gelatineteilchen hergestellt werden durch Zusatz einer wäßrigen Lösung von Gelatine (und Enzym) zu n-Butanol und Abtrennung der entstandenen tropfenartigen Teilchen. Erfindungsgemäß hat es sich jedoch gezeigt, daß Kugeln oder runde Teilchen aus einem Gemisch aus einem Bindemittel und einem inerten Material auf wesentlich billigere Weise hergestellt werden können, z. B. mit Hilfe eines Marumerizer (s. zum Beipiel US-PS 32 77 520) oder mit Hilfe einer speziellen Granuliervorrichtung (s. zum Beispiel US-PS 41 06 991). Darüber hinaus verleiht der Einschluß einer Mehrzahl von kleinen harten Teilchen den Trägerteilchen eine hohe Härte, was ihre Fließeigenschaften wesentlich verbessert und sie für Arbeiten in Säulen im großen Maßstab mit sehr hohen Fließgeschwindigkeiten geeignet macht.

Bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Arbeitsweise besteht die Formgebung in einer Behandlung zur Erzeugung kugelförmiger Teilchen, die in einem Marumerizer entsprechend US-PS 32 77 520 durchgeführt wird. Auf diese Weise können Kugeln, die geeignet sind zum Arbeiten in Säulen und die ausgezeichnete physikalische Eigenschaften besitzen, hergestellt werden.

Bei einer weiteren bevorzugten Arbeitsweise nach der Erfindung wird die Kugelform erhalten mit Hilfe einer Granuliervorrichtung, wie in der US-PS 41 06 991 beschrieben. Auf diese Weise können sehr billige Kügelchen mit ausgezeichneten physikalischen Eigenschaften hergestellt werden.

Es ist ebenfalls erfindungsgemäß bevorzugt, ein gelierbares Mittel zu der kontinuierlichen Phase zuzusetzen vor, während oder nach dem Vermischen mit der diskontinuierlichen Phase, woraufhin die so erhaltene Masse in ein Geliermedium extrudiert oder getropft wird, wobei ein Vernetzungsmittel während irgendeiner Stufe zugesetzt werden kann. Hierdurch können Teilchen mit sehr gleichmäßiger Form erhalten werden.

Das gelierbare Mittel ist vorzugsweise Gelatine, Alginat, Carrageen oder Chitosan. Hierdurch können sehr gleichmäßige Teilchen mit ausgezeichneter Kohäsion erhalten werden.

Das Geliermeidum ist vorzugsweise eine Lösung, enthaltend Ca⁺⁺, Ba⁺⁺, K⁺, Polyphosphat oder Ferricyanid oder kaltes Wasser oder ein kalter Luftstrom. Hierdurch werden ebenfalls Teilchen mit einer sehr gleichmäßigen Form und ausgezeichneten Kohäsion erhalten.

Bei einer weiteren bevorzugten Arbeitsweise nach der Erfindung ist die kontinuierliche Phase ein wasserlösliches Portein, insbesondere Gelatine, Sojaprotein, Casein, Albumin, Zein, Gluten oder ein Proteinhydrolysat oder ein Polysaccharid, insbesondere Agar, Alginat oder ein anderer Gummi, Mehl, Stärke oder Chitosan oder ein synthetisches Material, Carboxymethylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon oder Natriumsilicat. Die kontinuierliche Phase kann irgendein Gemisch von geeigneten Bindemitteln, z. B. irgendein Gemisch der oben angegebenen Materialien, sein. Mit diesen Bindemitteln ist es möglich, einen Träger mit ausgezeichneten physikalischen Eigenschaften zu erhalten, selbst bei einem sehr niedrigen Anteil in Beziehung auf die diskontinuierliche Phase.

Die diskonstinuierliche Phase ist vorzugsweise Diatomeenerde, zerstoßener Sand, Ziegelstaub, Ton, Nylonpulver, unlösliche Metalloxide oder unlösliche Metallsalze, gemahlene Kieselsäure, Aerosil, gemahlene Tonerde, Korund, gemahlenes Glas, gemahlener Flint, gemahlener Quarz, gemahlener Granit, Aluminiumphosphat, Kaolin, Bentonit, Perlit, Zeolite, Calciumsilicat, Filterhilfe mit Mikrozellen, zerstoßenes Magnesiumsilicat, Talkum, Asbest, abgeriebene Hornblende, Titandioxid, Zinnoxid, Polierpulver, gemahlenes Zirkoniumsilicat, Ruß, Aktivkohle, Knochenmehl, Flugasche oder Metallpulver. Die diskontinuierliche Phase kann irgendein Gemisch der diskreten bzw. feinteiligen harten inerten Teilchen sein, z. B. irgendein Gemisch der oben angegebenen Materialien. Diese Materialien sind billig und führen zu einem Träger mit guten mechanischen Eigenschaften.

Die Menge der diskontinuierlichen Phase liegt vorzugsweise zwischen etwa 10 und etwa 98 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Trägers, vorzugsweise zwischen 50 und 95 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Trägers. Auf diese Weise kann eine günstige Kombination von niedrigen Kosten und ausgezeichneten physikalischen Eigenschaften des Trägers erreicht werden.

Die lineare Größe eines einzelnen inerten Teilchens in der diskontinuierlichen Phase, berechnet als Durchmesser einer Kugel mit dem gleichen Volumen als einzelnes inertes Teilchen, beträgt weniger als ¹/₅ des Durchmessers des Trägerteilchens, vorzugsweise weniger als ½₀ des Durchmessers des Trägerteilchens. Mit inerten Teilchen dieser Größe kann die Formung ohne Schwierigkeiten durchgeführt werden.

Die kontinuierliche Phase wird vorzugsweise durch Vernetzen mit Hilfe eines geeigneten Vernetzungsmittels, vorzugsweise Glutaraldehyd, unlöslich gemacht. Auf diese Weise wird der mechanische Zusammenhalt der Trägerteilchen noch weiter verbessert.

Vorzugsweise ist gemäß der Erfindung die Form der Trägerteilchen sphärisch oder rund, und der mittlere Durchmesser der Trägerteilchen liegt zwischen 0,1 und 5, vorzugsweise zwischen 0,2 und 2 mm, insbesonder zwischen 0,2 und 1 mm. Hierdurch wird ein Träger mit einem guten Kompromiß zwischen den Fließeigenschaften und dem Oberflächenbereich erhalten.

Es ist besonders günstig, den Träger mit einer Lösung des Enzyms und mit einem Vernetzungsmittel zu behandeln. Hierdurch wird eine ausgezeichnete Haftung zwischen dem Träger und dem Enzym erreicht und damit ein immobilisiertes Enzym mit einer außerordentlich guten physikalischen Stabilität.

Es ist bevorzugt, den Träger als fluidisierte Masse in einen Turm einzubringen und die Lösung des löslichen Enzyms in den Turm einzusprühen, woraufhin die so entstandene Masse aus dem Turm entfernt und mit dem Vernetzungsmittel behandelt wird. Das immobilisierte Enzym kann so erfindungsgemäß mit einem sehr hohen Gehalt an Enzym auf dem Träger hergestellt werden.

Besonders günstig ist es, wenn der Träger als fluidisierte Masse in einen Turm eingebracht und ein Gemisch aus der Lösung des löslichen Enzyms und des Vernetzungsmittels in den Turm eingesprüht wird, woraufhin die so gebildete Masse aus dem Turm entfernt wird. Hierdurch kann das immobilisierte Enzym mit einem sehr hohen Enzymgehalt auf dem Träger erhalten werden.

Im Zusammenhang mit den in den beiden vorhergehenden Absätzen angegebenen bevorzugten Arbeitsweisen ist zu berücksichtigen, daß der Träger, das Vernetzungsmittel, Enzym und weitere Zusätze, soweit vorhanden, in beliebiger Reihenfolge zusammengebracht werden können. Derartige weitere Zusätze können z. B. Granulierhilfen (wie Cellulosefasern oder feinstteilige harte und inerte Teilchen), lösliche Substanzen, die als die Porosität erhöhende Mittel vorgesehen sind (z. B. NaCl), oder andere Proteine sein.

Das Enzym ist erfindungsgemäß vorzugsweise Glukoseisomerase, insbesondere solche von Bacillus coagulans. Es hat sich gezeigt, daß bei der so durchgeführten Immobilisierung von Glukoseisomerase die Aktivität ausgezeichnet zurückgewonnen werden kann und die anderen Eigenschaften bei kontinuierlichen Arbeiten in einer Säule hervorragend sind.

Die erfindungsgemäß immobilisierte Enzymzubereitung kann als Schicht in eine Säule eingebracht werden, und anschließend kann eine Lösung eines Substrats für das Enzym durch diese Schicht mit einer Geschwindigkeit hindurch geleitet werden, die es erlaubt, daß zumindest ein Teil des Substrats durch das Enzym umgewandelt wird.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert. Dabei ist in einigen Beispielen nur die Herstellung des Trägers beschrieben. Diese Beispiele sind so zu verstehen, daß der Träger anschließend mit der gleichen Enzymlösung wie bei Beispiel 12 angegeben behandelt und aufgearbeitet wird, wodurch ein immobilisiertes Enzym erhalten wird.

Im folgenden wird auf verschiedene Veröffentlichungen von Novo verwiesen. Kopien aller dieser Veröffentlichungen können von Novo Industri A/S, Novo Alle, 2880, Bagsvaerd, Dänemark, erhalten werden.

In einigen Beispielen ist ein Wert für den Druckabfall (physikalische Festigkeit) während des Arbeitens in der Säule angegeben. Dieser Wert wurde bestimmt gemäß AF 166/2, einer Beschreibung eines Novo-Laborverfahrens. Einige theoretische Überlegungen bezüglich dieser Bestimmung des Druckabfalls sind beschrieben in Starch/Stärke 31 (1979), Nr. 1, S. 13-16. Zum Vergleich mit bekannten Handelsprodukten ist zu erwähnen, daß die besten Werte für den Druckabfall für die immobilisierten Glukoseisomerasezubereitungen Sweetzyme etwa 9,81 mbar (10 g/cm²) beträgt. Aus den Beispielen geht hervor, daß der Druckabfall für die erfindungsgemäßen immobilisierten Enzymzubereitungen so gering sein kann wie 1,96 mbar (2 g/cm²) und daß alle Werte wesentlich niedriger liegen als 9,81 mbar (10 g/cm²), woraus der technische Fortschritt für das erfindungsgemäße Produkt bzw. Verfahren deutlich hervorgeht.

Beispiel 1

10 g Gelatine Bloom 260 wurden in 60 ml H₂O dispergiert, dann wurden 33 g 6%iges (Gew./Vol.) Natriumalginat zugegeben, das Gemisch wurde auf 60°C erhitzt, um die Gelatine zu lösen, und dann 10 g Diatomeenerde (Hyflo Celite) zugesetzt, das ganze Gemisch 10 min bei 55°C gerührt und durch eine vibrierende Spritze gepumpt, um sehr feine Tröpfchen zu erzeugen, die in eine 2%ige (Gew./Vol.) CaCl₂ · 2 H₂O-Lösung, die auf 5°C gehalten wurde, tropfen konnten. Die so erhaltenen kugelartigen Teilchen wurden einige Minuten in der CaCl₂-Lösung gerührt, dann aus der Lösung entfernt, mit entionisiertem Wasser gewaschen und 2 Tage bei Raumtemperatur getrocknet. Die Teilchen wurden dann 1 h in 20 ml 1%iger (Gew./Vol.) Glutaraldehydlösung bei pH 8,5 leicht gerührt, daraus entfernt, in entionisiertem Wasser gewaschen und erneut getrocknet. Auf diese Weise wurden kugelförmige, außerordentlich harte, zusammenhaltende Teilchen mit einem Durchmesser von etwa 2 mm, die ausgezeichnete Fließeigenschaften besaßen, erhalten. Der Druckabfall betrug 1,96 mbar (2 g/cm²). Die Teilchen konnten mit Citrat oder Phosphat behandelt werden, um Ca⁺⁺ und das Alginat zu entfernen, wenn dies erwünscht war, ohne irgendeine nachteilige Wirkung auf die Teilchen.

Beispiel 2

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die Hälfte der Gelatine, d. h. 5 g, und die doppelte Menge Diatomeenerde, d. h. 20 g, verwendet wurden und die Teilchen vor der Behandlung mit Glutaraldehyd nicht getrocknet wurden. Auf diese Weise wurden im wesentlichen identische Teilchen erhalten mit einer etwas geringeren Härte, aber noch nahezu den gleichen ausgezeichneten Fließeigenschaften. Der Druckabfall betrug 2,94 mbar (3 g/cm²).

Beispiel 3

Das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß Gelatine Bloom 200 verwendet wurde und deren Menge auf 4 g verringert wurde. Die Konzentration an Glutaraldehyd wurde ebenfalls verringert, und zwar auf 0,2% (Gew./Vol.). Es wurden Teilchen mit im wesentlichen identischen Eigenschaften (wie in Beispiel 2) erhalten.

Beispiel 4

In diesem Beispiel wurde eine Pilotanlage angewandt. So wurden 0,7 kg Cellulosefasern, Typ Arbocel BC 200, 2,8 kg Diatomeenerde (Clarcel Celite) und 4 kg einer 20%igen (Gew./Gew.) Gelatine Bloom 200-Lösung jeweils von 60°C in einem Mischer mit geringen Scherkräften vom Typ Lödige FM 130 D vermischt und die so erhaltene dicke Masse durch einen Extruder mit einem 1,5-mm-Gitter extrudiert und dann in einem Marumerizer, wie in der US-PS 32 77 520 beschrieben, zu Kugeln geformt. Der Extruder war das Doppelschneckenmodell EXDC-100 und die Vorrichtung zur Herstellung der Kugeln Q-400. Die so erhaltenen Teilchen wurden in einem Wirbelbett-Turm (Glatt Typ WSG 15) getrocknet und gesiebt und die Fraktion mit einer Teilchengröße von 1,2 bis 2,0 mm gesammelt und der Rest wieder zurückgeführt. Eine Probe von 10 g wurde dann 3 h bei Raumtemperatur mit 100 ml 1%iger (Gew./Vol.) Glutaraldehydlösung, die auf pH 7,0 eingestellt war, behandelt, aus der Lösung entfernt und gründlich mit entionisiertem Wasser gewaschen. Die so erhaltenen Teilchen waren selbst ohne Trocknen außerordentlich hart und fest zusammenhaltend und besaßen ausgezeichnete Fließeigenschaften. Der Druckabfall betrug 1,96 mbar (2 g/cm²). Nach diesem Beispiel machte die diskontinuierliche Phase 65 Gew.-% der Teilchen aus.

Beispiel 5

In diesem Beispiel wurde der gleiche Marumerizer angewandt wie in Beispiel 4 mit der Ausnahme, daß kein Extruder angewandt wurde. Außerdem wurde der Anteil an diskontinuierlicher Phase auf 94 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Trägers, erhöht. So wurden 1,5 kg teilchenförmiger Skamol-Ton mit einer Teilchengröße von 0,7 bis 1,0 mm in die Vorrichtung zur Herstellung der Kugeln eingebracht und 0,4 kg Diatomeenerde (Hyflo Celite) und 1,15 kg einer 10%igen (Gew./Gew.) Gelatine Bloom 80-Lösung bei 60°C abwechselnd zugegeben, um die Bildung von Klumpen zu vermeiden. Die so erhaltenen Teilchen wurden wie in Beispiel 4 behandelt, wobei man harte Teilchen mit sehr guten Fließeigenschaften erhielt. Der Druckabfall betrug 4,9 mbar (5 g/cm²).

Beispiel 6

In diesem Beispiel wurde ein Granulator vom Pflugschar- Typ (Gegenstrom-Tellermischer) Lödige FM 50, der mit einem Messer, das mit hoher Geschwindigkeit lief, versehen war, wie in der US-PS 41 06 991 beschrieben, beschickt mit 5,0 kg Diatomeenerde (Clarcel Celite), und 5,95 kg einer 16%igen (Gew./Gew.) Gelatine-Lösung Bloom 200 wurden in den Granulator gesprüht. Die Behandlungsdauer, die Rotationsgeschwindigkeit des Mischers und des Messers wurde so gewählt, daß eine Teilchengröße von 0,7 bis 1,5 mm entstand. Diese Teilchen wurden wie in Beispiel 4 behandelt, wobei Trägerteilchen mit im wesentlichen den gleichen Eigenschaften wie in Beispiel 4 erhalten wurden. Der Druckabfall betrug 3,92 mbar (4 g/cm²).

Beispiel 7

1 kg Cellulosefadern, 4 kg Diatomeenerde (Clarcel Celite) und 10 kg zurückgeführtes Material, das entsprechend diesem Beispiel entstanden war, wurden mit 10,5 kg einer 10%igen (Gew./Gew.) Gelatine Bloom 200-Lösung in einem Pflugschar Lödige-Mischer Typ FM 130 D besprüht, wobei runde Teilchen unterschiedlicher Größe gebildet wurden. Während aller oben beschriebenen Verfahrensstufen wurden die Bestandteile und die Vorrichtungen auf 55°C gehalten. Die runden Teilchen wurden in einem Wirbelbett-Turm getrocknet und gesiebt, und die Fraktion von 0,5 bis 0,7 mm Teilchengröße, die 32% ausmachte, wurde gesammelt. Der Rest, der gröbere Teilchen enthielt, die vermahlen wurden, und feinere, die direkt verwendet wurden, wurde zurückgeführt, wie zu Beginn dieses Beispiels beschrieben.

Beispiel 8

Der gleiche Mischer wie in Beispiel 4, d. h. ein Lödige FM 130-Mischer, wurde beschickt mit 3 kg Cellulosefasern, 10,5 kg Diatomeenerde (Clarcel Celite) und 1,5 g Albumin von Raumtemperatur und mit 15,2 kg Wasser besprüht. Die Behandlungszeit und die Rotationsgeschwindigkeiten des Mischers und des Messers wurden so gewählt, daß Teilchen der bevorzugten Größe gebildet wurden. Die Teilchen wurden in einem Wirbelbett getrocknet, und eine Siebanalyse der getrockneten Teilchen zeigte die folgende Teilchengrößeverteilung:

<1000 µm - 19,7%
< 850 µm - 35,6%
< 707 µm - 58,8%
< 600 µm - 78,2%
< 500 µm - 92,1%
< 420 µm - 1,1%

Beispiel 9

Das Verfahren des Beispiels 8 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß 1,5 kg isoelektrisch lösliches Sojaproteinhydrolysat anstelle des Albumins verwendet wurde und daß die Menge an Wasser 14,8 kg betrug. Die Siebanalyse der getrockneten Teilchen zeigte die folgende Teilchengrößeverteilung:

<1000 µm - 24,2%
< 850 µm - 43,2%
< 707 µm - 66,1%
< 600 µm - 84,4%
< 500 µm - 95,2%
< 420 µm - 1,0%

Beispiel 10

Der gleiche Mischer wie in Beispiel 6, d. h. ein Lödige FM 50-Mischer, wurde beschickt mit 11,3 kg Al₂O₃ und 3,0 kg Cellulosefasern, und 650 g Gelatine Bloom 200 in 4,55 kg Wasser wurden eingesprüht. Die Temperatur wurde auf 55°C gehalten. Die durch Rotation des Mischers und des Messers entstandenen Teilchen wurden in einem Wirbelbett getrocknet. Die Siebanalyse zeigte die folgende Teilchengrößeverteilung:

<1000 µm - 8,5%
< 850 µm - 16,1%
< 707 µm - 31,2%
< 600 µm - 46,2%
< 500 µm - 65,3%
< 420 µm - 15,6%

Beispiel 11

In den Lödige FM 130 D-Mischer wurden 2,1 kg Cellulosefasern, 8,4 kg Diatomeenerde (Clarcel Celite) und 4,5 kg Natriumchlorid gegeben und das Gemisch mit 10,0 kg 10%iger (Gew./Gew.) Gelatine Bloom 80-Lösung besprüht. Die Temperatur betrug 55°C. Die entstandenen Teilchen wurden getrocknet. Die Siebanalyse zeigte die folgende Teilchengrößeverteilung:

<1000 µm - 14,2%
< 850 µm - 23,7%
< 707 µm - 40,1%
< 600 µm - 59,1%
< 500 µm - 79,1%
< 420 µm - 5,8%

Beispiel 12

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten Enzymzubereitung nach der Erfindung. So wurden 4,5 kg Trägerteilchen, die wie in Beispiel 1 hergestellt worden, mit Glutaraldehyd behandelt, gewaschen und getrocknet waren, in einer Wirbelbettvorrichtung im Pilotmaßstab (Glatt Typ WSG 15) fluidisiert, und 9,3 kg einer 19%igen (Gew./Gew.) Lösung von teilweise gereinigter Glukoseisomerase von Bacillus coagulans NRRL 5650 (Aktivität 3240 Einheiten/g Feststoffe, wobei die Aktivitätseinheit definiert ist in NOVO analyseforskrift AF 189/1) wurden bei 50 bis 55°C auf die Teilchen gesprüht, und die Teilchen konnten trocknen. Das so erhaltene Produkt enthielt 28 Gew.-% teilweise gereinigte Glukoseisomerase mit einer 85%igen Aktivitätsausbeute. 20 g dieser Teilchen wurden dann in 500 ml einer Lösung, enthaltend 0,06 m NaH₂PO₄ · 2 H₂O, 1,4 m Na₂SO₄ und 0,1% (Gew./Vol.) Glutaraldehyd, die mit 1n NaOH auf pH 7,0 eingestellt worden war, behandelt. Nach 1 h bei Raumtemperatur wurden die Teilchen entfernt und gründliche mit 0,06 m Natriumphosphat-Lösung, pH 7,0, gewaschen und dann zusätzlich mit entionisiertem Wasser, und ein Teil von ihnen konnte trocknen. Sowohl die nassen als auch die trockenen Teilchen zeigten die gleichen ausgezeichneten Fließeigenschaften wie der ursprüngliche Träger, und es konnte kein Verlust von Enzymaktivität beobachtet werden. Bei den nassen Teilchen betrug die Rückgewinnung der Enzymaktivität jedoch 70%, während sie bei den trockenen Teilchen nur 48% betrug.

Beispiel 13

20 g getrocknete Trägerteilchen, die wie in Beispiel 4 hergestellt worden waren, wurden in einem Labtyp-Wirbelbett fluidisiert. 45,8 g einer 11,0%igen (Gew./Gew.) homogenisierten Zellaufschlämmung (fermentiert bzw. gezüchtet, wie in Beispiel 1 der DK-Anmeldung 5190/79 angegeben, und die Aufschlämmung hergestellt, wie in Beispiel 4 der DK-Anmeldung beschrieben), enthaltend 80,1_E/g thermophile Lactase von Bacillus sp. NRRL B-11 229, wurden bei 30 bis 40°C auf die Trägerteilchen gesprüht, und die überzogenen Teilchen konnten trocknen. Die Einheit der Lactaseaktivität ist definiert als die Menge Lactase, die 1 µmol Lactose/min unter den folgenden Reaktionsbedingungen spaltet: Substratkonzentration=10% Lactose, Temperatur=60°C, pH=6,5 und Reaktionszeit=30 min. Die Ausbeute an Enzymaktivität betrug 79,8%. 10 g überzogene Kügelchen wurden dann in 250 ml einer Lösung von 0,06 m Na₂HPO₄, 1,4 m Na₂SO₄ und 0,1% (Gew./Vol.) Glutaraldehyd bei pH 7,5 behandelt. Nach 1 h Raumtemperatur wurden die Teilchen entfernt und gründlich mit 0,06 m K₂HPO₄ bei pH 7,5 gewaschen. Die Ausbeute an Enzymaktivität in dieser Vernetzungsstufe betrug 17,2%.

Beispiel 14

24 g trockene Trägerteilchen, die entsprechend Beispiel 4 hergestellt worden waren, wurden mit 20,2 g einer Lösung von 39,6% (Gew./Gew.) teilweise gereinigter Amyloglukosidase von A. niger getränkt, die erhalten worden war durch Ultrafiltration des Handelsproduktes AMG 200 L (beschrieben in NOVO-Schrift AMG, B 020 g-GB 2500, Juli 1982), um niedermolekulare Bestandteile zu entfernen bis zu einem Feststoffgehalt von 39,6% (Gew./Gew.), (Aktivität 2610 IAG/g, wobei die Aktivitätseinheit definiert ist in NOVO Analyseforskrift AF 159/2). Dann wurde 1 h Vakuum angelegt. Das so erhaltene Produkt enthielt 25 Gew.-% Enzym-Trockensubstanz mit einer Ausbeute an Enzymaktivität von 77,9%.

20 g Teilchen mit 71,8% Trockensubstanz wurden dann in 1600 ml einer Lösung aus 1% (Gew./Vol.) NaH₂PO₄, 20% (Gew./Vol.) Na₂SO₄ und 0,2% Glutaraldehyd bei pH 4,5 behandelt. Nach 1 h wurden die Teilchen abfiltriert und mit 1%iger NaH₂PO₄-Lösung bei pH 4,5 gewaschen.

Die Ausbeute an Enzymaktivität bei dieser Vernetzungsstufe betrug 55,1%.

Beispiel 15

40 g Trägerteilchen, die wie in Beispiel 4 angegeben hergestellt worden waren und einen Feststoffgehalt von 98,8% besaßen, und 24 g eines im Vakuum behandelten, teilweise gereinigten Konzentrats von Glukoseisomerase von Bacillus coagulans (NRRL 5650), dem 5% Glukose und 8% Natriumsulfat zugesetzt worden waren (Feststoffgehalt 41,8%), wurden vermischt, und die Flüssigkeit konnte die Luft aus den Poren der Teilchen durch Vakuumbehandlung verdrängen. Das Gewicht nach dem Mischen betrug 63,22 g und der Feststoffgehalt 79,2%.

18 g Anteile dieses Mittels (ungefähr 14 g Feststoffe) wurden 1 h bei Raumtemperatur mit 375 ml einer Lösung, enthaltend in allen Fällen 22% Natriumsulfat, 5% Glukose und 1% Natriumphosphat, eingestellt auf pH 7,5, und zusätzlich entweder 0,1 oder 0,2 oder 0,3% Glutaraldehyd, behandelt.

Nach dieser Behandlung wurden die Mittel 5mal mit etwa 150 ml 1%iger Natriumphophatlösung, pH 7,5, gewaschen.

Die Enzymaktivität wurde bestimmt nach AF 189/1 nach Abziehen der Flüssigkeit von den Teilchen. Auch der Feststoffgehalt wurde nach dem Abziehen der Flüssigkeit von den Teilchen bestimmt.

Anteile entsprechend 5 g Trockensubstanz wurden auf den Druckabfall untersucht.

Beispiel 16

In den gleichen Mischer wie in Beispiel 4, d. h. einen Lödige FM 130 D-Mischer wurden 3 kg Cellulosefasern und 13,5 kg Diatomeenerde (Clarcel Celite) gegeben und 15 kg 10%iges (Gew./Vol.) Polyethylenimin (PEI 15 T) bei Raumtemperatur aufgesprüht. Anschließend wurden 3 kg Wasser und schließlich 2 kg 50%ige (Gew./Vol.) Glutaraldehydlösung aufgesprüht. Die Behandlungszeit und Drehgeschwindigkeiten des Mischers und des Messers wurden so gewählt, daß Teilchen der bevorzugten Größe gebildet wurden. Die Teilchen wurden in einem Wirbelbett getrocknet.

Beispiel 17

In den gleichen Mischer wie in Beispiel 4, d. h. einen Lödige FM 130 D-Mischer, wurden 3 kg Cellulosefasern und 12,0 kg Aktivkohle (Pecactif FGV) gegeben und 20,0 kg 10%ige (Gew./Gew.) Gelatinelösung Bloom 200 und schließlich 4,5 kg Wasser aufgesprüht. Die Behandlungszeit und Rotationgeschwindigkeiten des Mischers und des Messers wurden so gewählt, daß Teilchen der bevorzugten Größe gebildet wurden. Die Teilchen wurden in einem Wirbelbett getrocknet.

Die Anwendbarkeit eines immobilisierten Enzymproduktes nach der Erfindung geht aus dem folgenden Anwendungsbeispiel hervor. Ein immobilisiertes Glukoseisomeraseprodukt wurde allgemein wie in Beispiel 12 angegeben hergestellt. Das Produkt enthielt 32,6 Gew.-% teilweise gereinigte Glukoseisomerase, und die Vernetzung wurde wie in Beispiel 12 durchgeführt.

Nach dem Waschen mit 1%iger (Gew./Vol.) Natriumphosphatlösung (pH 7,0) wurden 27,6 g feuchte Teilchen, entsprechend 10 g Feststoffen, in eine Säule mit Wassermantel mit einem Durchmesser von 1,5 cm gegeben. Die Säule wurde auf 65°C gehalten, und ein 45%iger (Gew./Gew.) Glukosesirup, pH 7,8 (eingestellt mit Na₂CO₃), wurde kontinuierlich durch das Enzymbett mit einer Geschwindigkeit hindurchgeleitet, die eine 40- bis 42%ige Umwandlung von Glukose in Fruktose erlaubte. Die Anfangsaktivität betrug 538 IGIC/g Feststoffe (die Aktivität wurde berechnet entsprechend NOVO Analyseforskrift AF 147/6), und die Halbwertzeit der Aktivität betrug 450 h. Der pH-Wert der austretenden Flüssigkeit betrug 7,4 bis 7,5.

Zum Vergleich ist zu erwähnen, daß die verbreitet angewandte handelsübliche immobilisierte Glukoseisomerase Sweetzyme eine Aktivität von 225 bis 300 IGIC/g und eine ähnliche Halbwertzeit der Aktivität besitzt und um mit Sweetzyme einen pH-Wert der austretenden Flüssigkeit von 7,4 bis 7,5 unter den oben angegebenen Bedingungen, d. h. bei 65°C und einem 45%igen (Gew./Gew.) Glukosesirup, zu erreichen, ist ein pH-Wert der eingespeisten Lösung von 8,2 erforderlich.

Claims

1. Granulatförmiges immobilisiertes Enzym, das geeignet ist zur kontinuierlichen Durchführung von enzymatischen Reaktionen im Festbett oder Fließ- bzw. Wirbelbett, umfassend

a) eine kontinuierliche Phase aus einem hydrophilen Bindemittel und
b) eine diskontinuierliche Phase aus einem feinteiligen inerten Füllstoff, wobei das Bindemittel und der Füllstoff in dem Reaktionsmedium der enzymatischen Reaktion unlöslich sind, und
c) ein an dem Bindemittel auf der Oberfläche des Granulats immobilisiertes Enzym.

2. Enzymgranulat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Bindemittel ein Protein ist, das durch Umsetzung mit Glutaraldehyd unlöslich gemacht worden ist und bei dem das Enzym durch Reaktion mit dem Glutaraldehyd an das Bindemittel gebunden ist.

3. Enzymgranulat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die kontinuierliche Phase ein Protein, insbesondere Gelatine, Sojaprotein, Casein, Albumin, Zein, Gluten oder ein Proteinhydrolysat oder ein Polysaccharid, insbesondere Agar, Alginat oder ein anderer Gummi, Mehl, Stärke oder Chitosan oder ein synthetisches Material wie Carboxymethyl-cellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethyl-cellulose, Hydroxypropyl-cellulose, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon oder Natriumsilicat ist.

4. Enzymgranulat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die diskontinuierliche Phase Diatomeenerde, zermahlener Sand, Ziegelstaub, Ton, ein Nylonpulver, ein unlösliches Metalloxid oder Metallsalz, gemahlene Kieselsäure, Aerosil, gemahlene Tonerde, Korund, gemahlenes Glas, gemahlener Flint, gemahlenes Quarz, gemahlener Granit, Aluminiumphosphat, Kaolin, Bentonit, Perlit, Zeolit, Calciumsilicat, mikrozelluläre Filterhilfe, zerstoßenes Magnesiumsilicat, Talkum, Asbest, abgeriebene Hornblende, Titandioxid, Zinkoxid, Polierpulver, gemahlenes Zirkoniumsilicat, Ruß, Aktivkohle, Knochenmehl, Flugasche oder Metallstaub ist.

5. Enzymgranulat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der diskontinuierlichen Phase zwischen etwa 10 und etwa 98 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Trägers, vorzugsweise 50 bis 95 Gew.-% beträgt.

6. Enzymgranulat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchengröße eines einzelnen inerten Teilchens in der diskontinuierlichen Phase, berechnet als Durchmesser einer Kugel mit dem gleichen Volumen, weniger als ¹/₅ des Durchmessers der Trägerteilchen, vorzugsweise weniger als ½₀ des Durchmessers der Trägerteilchen beträgt.

7. Enzymgranulat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Form der Trägerteilchen kugelförmig oder abgerundet ist und der mittlere Durchmesser 0,1 bis 5 mm, vorzugsweise 0,2 bis 2 mm, insbesondere 0,2 bis 1 mm beträgt.

8. Enzymgranulat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Glukoseisomerase, vorzugsweise eine solche von Bacillus coagulans ist.

9. Verfahren zur Herstellung eines Enzymgranulats nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst einen Träger herstellt, indem man a) eine kontinuierliche Phase aus einem wasserlöslichen Bindemittel, das zumindest teilweise in dem wäßrigen Medium gelöst oder dispergiert ist, zusammenbringt mit b) einer diskontinuierlichen Phase aus einer Vielzahl einzelner harter inerter Teilchen, deren Größe klein genug ist, daß sie bei der Formung der Trägers nicht stört und, soweit erforderlich, das Bindemittel in dem Medium, in dem das Enzym angewandt werden soll, unlöslich macht, daß man die Komponenten a) und b) miteinander vermischt und das Gemisch anschließend zu dem teilchenförmigen Träger, vorzugsweise zu Kügelchen, formt und daß man danach den Träger mit einem Enzym zusammenbringt, das auf der Oberfläche des Trägers festgehalten wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man zu der kontinuierlichen Phase vor, während oder nach dem Vermischen mit der diskontinuierlichen Phase ein gelbildendes Mittel zusetzt und anschließend die so erhaltene Masse in ein Geliermedium extrudiert oder eintropft und gegebenenfalls in einer beliebigen Stufe ein Vernetzungsmittel zusetzt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das gelbildende Mittel Gelatine, ein Alginat, Carragen oder Chitosan ist.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das gelbildende Mittel eine Lösung ist, enthaltend Ca⁺⁺, Ba⁺⁺, K⁺, Polyphosphat oder Ferricyanid, oder kaltes Wasser oder ein Strom kalter Luft.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die kontinuierliche Phase in dem für die Enzymreaktion angewandten Mittel unlöslich gemacht wird mit Hilfe eines geeigneten Vernetzungsmittels, vorzugsweise Glutaraldehyd.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger mit einer Lösung des Enzyms und mit einem Vernetzungsmittel behandelt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger als Wirbelbett in einen Turm eingebracht wird und die Lösung des löslichen Enzyms in den Turm eingesprüht wird und die so entstandene Masse aus dem Turm ausgetragen und mit dem Vernetzungsmittel behandelt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger als fluidisierte Masse in den Turm eingebracht und ein Gemisch einer Lösung des löslichen Enzyms mit dem Vernetzungsmittel in den Turm eingesprüht und die so entstandene Masse aus dem Turm ausgetragen wird.