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BREVET D'INVENTION Au nom de : NOVO INDUSTRI A/S Titre : PROCEDE DE PRODUCTION D'UNE PREPARATION D'ENZYME
IMMOBILISEE, PREPARATION D'ENZYME IMMOBILISEE
OBTENUE ET UTILISATION DE CELLE-CI.
Priorité : demande de brevet déposée au Danemark le
6 octobre 1982 sous le nO 4430/82.
Inventeurs : Shmuel Amotz, Susanne Rugh,
Erik Kj r Markussen, Kurt Thomsen.
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PROCEDE DE PRODUCTION D'UNE PREPARATION D'ENZYME
IMMOBILISEE, PREPARATION D'ENZYME IMMOBILISEE OBTENUE ET
UTILISATION DE CELLE-CI.
La présente invention concerne un procédé pour la production d'une préparation d'enzyme immobilisée particulaire qui est constituée par un support sur la surface duquel est fixée l'enzyme. Par surface du support il faut entendre ici la surface externe ainsi que la surface interne dans le cas d'un support poreux. Elle concerne également la préparation d'enzymes immobilisées obtenues ainsi que l'utilisation de celles-ci.
Les champs d'application des enzymes immobilisées et des supports pour l'immobilisation des enzymes croissent rapidement. En général, le support se présente sous la forme de petites particules, éventuellement alourdies, dans lesquelles l'enzyme se trouve enrobée ou à la surface desquelles l'enzyme est attachée ou fixée.
On se référera aux brevets des Etats Unis 4 266 029 et 4 116 771 ainsi qu'au brevet danois 133 380 qui ne sont que trois exemples de supports (sur ou dans lesquels sont fixées les enzymes) de l'état de la technique.
Le support utilisé pour le procédé de la pré-. sente invention appartient à la catégorie de supports à la surface desquels est fixée l'enzyme, par opposition à la catégorie de supports dans lesquels l'enzyme est distribuée à travers le volume entier de celui-ci.
Un support connu typique faisant partie de cette catégorie de supports susmentionnée à la surface desquels est fixée l'enzyme, consiste en une gélatine granuleuse et est décrit dans Derwent 08061 C/5 (J 54156-892).
Cependant, les particules de gélatine pure ne sont pas suffisamment dures pour une utilisation à grande échelle dans les applications à lit fixe dans lesquelles on exige des vitesses d'écoulement très élevées. En outre, les particules de gélatine pure sont relativement onéreuses.
On peut obtenir, suivant le brevet des Etats Unis n 4 266 029, un support analogue appartenant également à cette catégorie qui consiste en un noyau inerte
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enrobé de gélatine. Bien que ce support ait de bonnes caractéristiques d'écoulement, il présente l'inconvénient qui consiste en ce que la forme et les dimensions des particules de support ne peuvent être choisies en fonction des critères spécifiques pour le meilleur fonctionnement possible de la colonne mais sont données par la fraction de sable particulière ou par une autre fraction d'une matière particulaire dense utilisée à titre de matière non traitée. En outre, bien qu'il soit facile de produire ce support à l'échelle du laboratoire il est difficile ou peut-être impossible de fabriquer ce support à l'échelle industrielle.
Un autre support typique connu faisant partie de cette catégorie est décrit dans Advances in Experimental Medicine and Biology, volume 42, pages 191 à 212, Immobilized Biochemicals and Affinity Chromatography. Ce support est constitué par des perles en verre et un agent de couplage de silane. Ces perles présentent des propriétés d'écoulement excellentes et une capacité de chargement relativement élevée. Elles sont cependant très onéreuses et, comme pour tous les supports inorganiques, il faut effectuer des traitements chimiques élaborés utilisant des matières non souhaitables pour les rendre adéquates pour l'immobilisation des enzymes.
Par conséquent, un objet de la présente invention, vise à fournir un procédé pour la production d'une enzyme immobilisée comprenant un support sur la surface duquel est fixée l'enzyme, dans lequel ledit support présente toutes les propriétés avantageuses susmentionnées, c'est-à-dire une dureté suffisante, l'aptitude à être produit à échelle industrielle et au moyen d'un traitement chimique simple, et un bas prix de revient.
Suivant la présente invention, on a, à présent, trouvé un procédé pour la production d'une préparation particulaire d'enzyme immobilisée, comprenant un support à la surface duquel les enzymes sont fixées, dans lequel le support est formé par la combinaison de deux phases, c'est-à-dire a) une phase continue d'un liant soluble
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dans l'eau et au moins partiellement dissous ou dispersé dans un milieu aqueux, et b) une phase discontinue d'une pluralité de particules séparées, dures et inertes, dont les dimensions sont suffisamment faibles pour ne pas interférer avec la formation du support, dans lequel on rend, si nécessaire, le liant insoluble dans le milieu dans lequel l'enzyme sera finalement utilisée, et dans lequel le support est mis en contact avec une enzyme qui est fixée à la surface du support.
Si le milieu dans lequel l'enzyme immobilisée doit ultérieurement être utilisée est un milieu aqueux, il sera nécessaire de rendre le liant, à l'origine soluble dans l'eau, insoluble par un traitement chimique ou physique, par exemple par réticulation ou chauffage. Si le milieu dans lequel l'enzyme immobilisée devra ultérieurement être utilisée est un milieu nonaqueux, le liant, à l'origine soluble dans l'eau, peut être insoluble dans ce milieu non aqueux et ne doit pas, par conséquent, dans ce cas, être rendu insoluble.
Pour être complet, il faut attirer l'attention sur le fait que le support peut contenir d'autres composants en plus des composants indispensables a) et b) indiqués ci-dessus, par exemple des charges et/ou des adjuvants de granulation.
Suivant l'invention, on a trouvé, de manière surprenante, que le procédé suivant la présente invention satisfait le but susmentionné de l'invention. De même, de manière étonnante, on a trouvé que le support maintient une intégrité physique excellente, même pour des proportions très élevées de particules inertes allant jusqu'à 98 % en poids par rapport au poids du support. Ceci est très important étant donné que plus la proportion de particules inertes (allant jusqu'à la limite supérieure susmentionnée) est élevée, plus le support est dur et plus les coûts sont faibles.
Si l'enzyme immobilisée est une lipase et si celle-ci est destinée à transestérifier les lipides dans une solution d'éther de pétrole, on peut utiliser l'albumine, la caséine, la protéine de soja, l'hydroxyéthylcel-
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lulose, l'agar, l'alginate, les alcools de polyvinyle, l'amidon, la méthylcellulose ou la carboxyméthylcellulose à titre de liant, vu que ces matières sont insolubles dans l'éther de pétrole. Dans ce cas, on n'a besoin que d'un lien lâche entre le support et l'enzyme. Si, d'autre part, l'enzyme avec laquelle sera finalement utilisé le support est l'amyloglucosidase et si l'amyloglucosidase est destinée à décomposer des dextrinesen solution aqueuse, il est nécessaire de rendre insoluble le liant, à l'origine soluble dans l'eau.
En général, l'amyloglucosidase est attachée ou fixée à la surface du support par réticulation avec du glutaraldéhyde.
Il faut noter que chaque combinaison de n'importe quelle enzyme avec n'importe laquelle des deux phases de support a) et b) ne convient pas nécessairement. L'homme du métier sait que certaines enzymes peuvent ne pas supporter certains cations qui pourraient avoir été libérés en faible quantité par la phase b) et de même, si l'enzyme immobilisée est destinée à être utilisée dans l'industrie alimentaire, certains constituants de la phase a) peuvent être moins désirables étant donné la fuite de constituants nuisibles vers l'effluent du réacteur enzymatique.
La glucose isomérase immobilisée fixée par échange ionique à un support consistant en cellulose fibreuse échangeuse d'ions incorporée dans un polymère hydrophobe et contenant éventuellement un agent de densification tel que des oxydes de métaux à l'état poudreux est décrite dans la demande de brevet danois n 1592/78 (Standard Brands), correspondant au brevet des Etats-Unis 4.110. 164 ou au brevet belge 865.900. Le support est obtenu en fondant le polymère hydrophobe et en mélangeant la cellulose et l'agent de densification dans le polymère fondu. Ce procédé présente cependant de nombreux inconvénients.
D'une part, le prix de tels polymères hydrophobes est assez élevé et, d'autre part, il est beaucoup plus facile de travailler avec des solutions ou suspensions aqueuses de liants suivant l'invention, qu'avec des
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polymères hydrophobes fondus. De même, le procédé décrit dans la demande de brevet danois n 1592/78 est strictement limité à des enzymes immobilisées sur des résines échangeuses d'ions, c'est-à-dire comportant une couche monomoléculaire d'enzyme tandis que la présente invention convient à tous les procédés de fixation d'enzymes sur le support et à des couches monomoléculaires d'enzymes aussi bien qu'à des couches multimoléculaires d'enzymes.
Par conséquent, dans le cas de la glucose isomérase par exemple, grâce à ce libre choix de l'épaisseur de la couche d'enzyme, il est possible d'obtenir des valeurs très élevées d'activité spécifique suivant la présente invention, tandis que la valeur maximum de l'activité spécifique de la glucose isomérase décrite dans la demande de brevet danois n* 1592/78 est relativement faible et nettement trop basse pour des applications industrielles.
Suivant un mode d'exécution préféré de la présente invention, la combinaison des deux phases consiste en un mélange de la phase continue et de la phase discontinue, après quoi le mélange est ultérieurement mis en forme pour obtenir le support particulaire, de préférence sous forme sphérique. On obtient ainsi de manière peu onéreuse et aisée des particules de support.
Les procédés de l'état de la technique pour la production de sphères de gélatine ou de particules de gélatine arrondies sont assez onéreux et fastidieux. On se réfère ici au brevet danois n 133.380 dans lequel il est dit que de telles particules de gélatine sont produites par addition d'une solution aqueuse de gélatine (et enzyme) à du n-butanol et par séparation des particules obtenues en forme de gouttelettes.
Suivant l'invention on a cependant trouvé que les sphères ou particules rondes d'un mélange de liant et de matière inerte peuvent être obtenues de manière beaucoup moins onéreuse, par exemple au moyen d'un"Marumerizer" (voir par exemple le brevet des Etats-Unis 3.277. 520) ou au moyen d'un dispositif de granulation particulier (voir par exemple le
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brevet des Etats-Unis 4.106. 991). En outre, l'inclusion d'une multitude de petites particules dures procure une dureté très élevée aux particules de support, améliorant ainsi substantiellement leur propriété d'écoulement et les rendant adéquates pour des fonctionnements en colonnes de grande dimension à des vitesses d'écoulement très élevées.
Suivant un mode d'exécution préféré de la présente invention, la mise en forme consiste en un traite-
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ment de mise en forme de sphères effectuée dans un"Marumerizer"suivant le brevet des Etats-Unis n 3. 277. 520.
De cette manière, on peut produire des sphères adéquates pour le fonctionnement en colonne et présentant des propriétés physiques excellentes.
Suivant un mode d'exécution préféré de la présente invention, la mise en forme consiste en un traitement de mise en forme sphérique effectué dans un dispositif de granulation tel que celui qui est décrit dans le brevet des Etats-Unis n 4.106. 991. De cette manière, on peut obtenir des sphères bon marché présentant des propriétés physiques excellentes.
Suivant un mode d'exécution préféré de la présente invention, on ajoute un agent gélifiable à la phase continue avant, pendant ou après le mélange avec la phase discontinue, après quoi la masse ainsi obtenue est extrudée ou formée en gouttes dans un milieu gélifiant, un agent de réticulation pouvant être additionné à chacune de ces étapes. On peut obtenir ainsi des particules présentant des formes très régulières.
Suivant un mode d'exécution préféré de la présente invention, l'agent gélifiable est la gélatine, l'alginate, la mousse d'Irlande ou la chitosane. On peut obtenir ainsi des particules présentant des formes très régulières et une cohésion excellente.
Suivant un mode d'exécution préféré de la présente invention, le milieu gélifiant consiste en une so-
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lution contenant phate ou du ferricyanure ou en de l'eau froide ou en un
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jet d'air froid. On peut obtenir ainsi des particules ayant des formes très régulières et une cohésion excellente.
Suivant un mode d'exécution préféré de la présente invention, la phase continue consiste en une protéine soluble dans l'eau, en particulier la gélatine, la protéine de soja, la caséine, l'albumine, la zéine, le gluten, ou un hydrolysat de protéine ou un polysaccharide, en particulier l'agar, l'alginate ou d'autres gommes, la farine, l'amidon ou la chitosane ou une matière synthétique, la carboxyméthylcellulose, la méthylcellulose, l'éthylcellulose, l'hydroxyéthylcellulose, l'hydroxypropylcellulose, l'alcool de polyvinyle, la polyvinylpyrrolidone ; ou en silicate de sodium. La phase continue peut consister en tout mélange de liants que l'on peut utiliser selon la présente invention, par exemple tout mélange des matières indiquées ci-dessus.
A l'aide de ces liants, il est possible de créer un support présentant des propriétés physiques excellentes même en une proportion très faible par rapport à la phase discontinue.
Dans un mode d'exécution préféré de la présente invention, la phase discontiue consiste en une terre de diatomées, du sable broyé, de la brique pilée, de l'argile, une poudre de nylon, des oxydes métalliques insolubles ou des sels métalliques insolubles, de la silice broyée, de l'Aérosil, de l'alumine broyée, du corindon, du verre broyé, du silex broyé, du quartz broyé, du granit broyé, du phosphate d'aluminium, du kaolin, de la bentonite, de la perlite, des zéolites, du silicate de calcium, des adjuvants de filtration micro-cellulaires, du silicate de magnésium broyé, du talc, de l'asbeste, de la hornblende abrasée, du dioxyde de titane, de l'oxyde stannique, des poudres de polissage, du silicate de zirconium broyé, du noir de carbone, du charbon actif, de la farine d'os, des cendres volantes ou des fines de métal.
La phase discontinue peut consister en un mélange des particules séparées dures et inertes qui peuvent être
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utilisées dans la présente invention, par exemple tout mélange des matières indiquées ci-dessus. Ces matières sont bon marché et permettent d'obtenir un support présentant de bonnes propriétés mécaniques.
Suivant un mode d'exécution préféré de la présente invention, la quantité de phase discontinue est comprise entre environ 10 et environ 98 % en poids, par rapport au poids total du support, de préférence entre 50 et 95 % en poids, par rapport au poids total du support.
De cette manière on obtient une bonne combinaison du support à faible coût et présentant d'excellentes propriétés physiques.
Suivant un mode d'exécution préféré de la présente invention, la dimension linéaire d'une particule inerte de la phase discontinue, calculée en tant que diamètre de la sphère ayant le même volume que la particule inerte, est inférieure à 1/5 du diamètre de la particule de support, de préférence inférieure à 1/20 du diamètre de la particule de support. Avec de telles dimensions de particules inertes, la mise en forme peut être effectuée sans difficulté.
Suivant un mode d'exécution préféré de la présente invention, la phase continue est rendue insoluble par réticulation au moyen d'un agent de réticulation adéquat, de préférence le glutaraldéhyde. De cette manière, l'intégrité mécanique des particules de support est encore améliorée.
Suivant un mode d'exécution préféré de la présente invention, la forme du support est sphérique ou arrondie et le diamètre moyen du support est compris entre 0, 1 et 5 mm, de préférence entre 0,2 et 2 mm, plus particulièrement entre 0,2 et 1 mm. De cette manière on fournit un support présentant un bon compromis entre les propriétés d'écoulement et la surface.
Dans un mode d'exécution préféré de la présente invention, le support est traité avec une solution d'enzyme et avec un agent de réticulation. On obtient ainsi une adhésion excellente entre le support et l'enzyme et,
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par conséquent, une enzyme immobilisée qui présente une stabilité physique particulièrement bonne.
Suivant un mode d'exécution préféré de la présente invention, le support est introduit dans une tour en tant que masse fluidisée et la solution d'enzyme soluble est introduite dans la tour à l'état pulvérisé, après quoi la masse ainsi produite est éliminée de la tour et traitée avec l'agent de réticulation. De cette manière, on peut obtenir l'enzyme immobilisée suivant la présente invention qui présente un taux de chargement très élevé de l'enzyme sur le support.
Suivant un mode d'exécution préféré de la présente invention, on introduit le support à l'état de masse fluidisée dans la tour et on introduit un mélange de la solution d'enzyme soluble et d'agent de réticulation à l'état pulvérisé dans la tour, après quoi la masse ainsi obtenue est retirée de celle-ci. On peut ainsi obtenir une enzyme immobilisée suivant l'invention qui présente un taux de chargement très élevé de l'enzyme sur le support.
En ce qui concerne les modes d'exécution préférés mentionnés dans les deux paragraphes précédents, il faut noter que le support, l'agent de réticulation, l'enzyme et d'autres agents, s'il y en a, peuvent être mélangés en toute séquence arbitraire. De tels autres agents peuvent être, par exemple, des adjuvants de granulation (par exemple des fibres de celluloses ou des particules très petites inertes et dures), des matières solubles destinées à augmenter la porosité (par exemple le NaCl) ou d'autres protéines.
Dans un mode d'exécution préféré de la présente invention, l'enzyme est une glucose isomérase, de préférence une glucose isomérase provenant du Bacillus coagulans. On a trouvé que la glucose isomérase immobilisée ainsi produite peut présenter un rétablissement d'activité excellent et des caractéristiques supérieures en ce qui concerne un fonctionnement en continu en colonne.
La préparation d'enzymes immobilisées suivant
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la présente invention peut être introduite en tant que couche dans une colonne, après quoi on fait passer une solution de substrat de l'enzyme à travers ladite couche à une vitesse permettant à au moins une partie du substrat d'être convertie par l'enzyme.
Les exemples suivants illustrent le procédé de la présente invention. Dans certains exemples on ne décrit que la préparation du support. Pour tous ces exemples il faut noter que le support est traité avec la même solution d'enzyme que celle qui est indiquée à l'exemple 12 et est traitée ultérieurement pour produire une enzyme immobilisée.
Dans la suite on se réfère à divers documents de NOVO. On peut obtenir des copies de toutes ces références chez NOVO Industri A/S, Novo Allé, 2880 Bagsvaerd, Danemark.
Dans certains des exemples, on indique une valeur de perte de charge (résistance physique) pendant le fonctionnement de la colonne. Cette valeur est déterminée suivant AF 166/2 qui est une description des processus de laboratoire de NOVO. Certaines considérations théoriques en rapport avec la détermination de cette perte de charge sont décrites dans Starch/Stârke 31 (1979) NO 1, pages 13 à 16. A titre de comparaison avec des produits commerciaux connus il faut noter que les meilleures valeurs de la perte de charge pour les préparations de glucose isomérase immobilisée SWEETZYME est située aux environs de 100 Pa (10 g/cm2).
Des exemples il apparaît que les pertes de charge pour les préparations d'enzymes immobilisées produites au moyen du procédé suivant l'invention
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o peuvent être faibles telles que 20 Pa (2 et que toutes les valeurs sont considérablement inférieures à 100 Pa (10 g/cm2) ; ce qui démontre clairement l'avantage technique de la présente invention.
Exemple 1 :
On a dispersé 10 g de gélatine Bloom dans 60 ml de H20, on a ajouté 33 g d'alginate de sodium à 6 % poids/volume, on a chauffé le mélange à 60 C pour
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dissoudre la gélatine puis on a ajouté 10 g de Hyflo Celite (terre de diatomées), on a agité le mélange tout entier pendant 10 minutes à 55 C et on l'a pompé à travers une seringue vibrante pour produire des gouttelettes très
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fines qui pouvaient tomber dans une solution à 2 % poids/ volume de CaC12. maintenue à 5 Les particules sphériques ainsi produites sont agitées dans la solution de CaC12 pendant quelques minutes puis retirées de la solution, lavées avec de l'eau désionisée et séchées pendant 2 jours à température ambiante.
Ensuite les particules sont agitées avec ménagement pendant 1 heure dans 200 ml d'une solution à 1 % poids/volume de glutaraldéhyde à pH 8,5, elles sont retirées, lavées dans de l'eau désionisée et de nouveau séchées. De cette manière on obtient des particules sphériques extrêmement dures et cohérentes qui présentent un diamètre d'environ 2 mm et d'excellentes propriétés d'écoulement. La perte de charge était de 20 Pa (2 g/cm2). Les particules ont pu être traitées avec du citrate ou du phosphate pour éliminer le Ça et l'alginate, si on le désirait, sans effet néfaste à l'égard des particules.
Exemple 2 :
Le processus décrit dans l'exemple a été répété, sauf que l'on a utilisé la moitié de la quantité de gélatine, c'est-à-dire 5 g et 2 x la quantité d'Hyflo Celite, c'est-à-dire 20 g, et que l'on n'a pas fait sècher les particules avant qu'elles ne soient traitées avec le glutaraldéhyde. On a ainsi obtenu des particules sensiblement identiques qui présentaient une dureté quelque peu réduite mais qui présentaient toutefois les mêmes propriétés d'écoulement excellentes. La perte de charge était de 30 Pa (3 g/cm2).
Exemple 3 :
On a répété le processus décrit dans l'exemple 2, sauf que l'on a utilisé de la gélatine Bloom 200 et que la quantité de celle-ci a été réduite à 4 g. La concentration de glutaraldéhyde a également été réduite à 0,2 % en poids/volume. De cette manière on a obtenu des
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particules présentant substantiellement les mêmes propriétés.
Exemple 4 :
Dans cet exemple, on a utilisé une installation pilote. Ainsi, on a mélangé 0, 7 kg de fibres de cellulose, type Arbocel BC 200, 2,8 kg de Clarcel Celite (terre de diatomées) et 4 kg d'une solution à 20 % en poids de gélatine Bloom 200, tous à 60 C, dans un mélangeur à soc du type Lödige FM 130 D et on a extrudé la masse épaisse ainsi obtenue dans une extrudeuse équipée d'un tamis à ouverture de 1, 5 mm et on l'a ensuite mise sous forme sphérique dans un Marumerizertel que décrit dans le brevet des Etats-Unis n 3.277. 520. L'extrudeuse était du type à double vis modèle EXDC-100, et le"Marumerizer" utilisé était le modèle Q-400.
Les particules ainsi obtenues ont été séchées dans une tour à lit fluidisé (du type Glatt SG 15) et tamisées et la fraction comprise entre 1, 2 et 2, 0 mm a été récupérée, le résidu étant recyclé. On a ensuite traité un échantillon de 10 g pendant 3 minutes à température ambiante avec 100 ml d'une solution de glutaraldéhyde à 1 % poids/volume réglée à pH 7, 0, on l'a retiré de la solution et on l'a entièrement lavé avec de l'eau désionisée. Même sans séchage, les particules ainsi obtenues étaient extrêmement dures et cohérentes et présentaient des propriétés d'écoulement excellentes. La perte de charge était de 20 Pa (2 g/cm2). Dans cet exemple, la phase discontinue constituait 65 % en poids de la particule.
Exemple 5 :
Dans cet exemple on a utilisé le même"Marume- rizer"que celui qui a été utilisé à l'exemple 4, sauf que l'on n'a pas utilisé d'extrudeuse. En outre, on a augmenté la teneur de la phase discontinue jusqu'à 94 % en poids du poids total du support. Ainsi, on a chargé 1, 5 kg de particules de glaise Skamol ayant une dimension de particules comprise entre 0,7 et 1, 0 mm dans le dispositif de mise en forme sphérique et on a ajouté alternativement 0,4 kg d'Hyflo Celite et 1,15 kg d'une solution
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de gélatine Bloom 80 à 10 % en poids à 60 C de manière, à éviter la formation d'agglomérats. Les particules ainsi obtenues ont été traitées selon l'exemple 4 et on a obtenu des particules très dures présentant des propriétés d'écoulement très bonnes.
La perte de charge était de 50 Pa (5 g/cm).
Exemple 6 :
Dans cet exemple, on a chargé un granulateur du type mélangeur à soc, Lödige FM 50, équipé d'une lame tournant à vitesse élevée tel que décrit dans le brevet des Etats-Unis n 4.106. 991, avec 5, 0 kg de Clarcel Celite et on a pulvérisé 5, 95 kg de gélatine Bloom 200 à 16 % en poids dans celui-ci, le temps de traitement et les vitesses de rotation du mélangeur et de la lame étant choisies de manière telle qu'on obtienne une dimension de particules comprise entre 0, 7 et 1,5 mm. Ces particules ont été traitées comme à l'exemple 4 et on a obtenu des particules de support présentant essentiellement les mêmes propriétés que celles de l'exemple 4. La perte de charge était de 40 Pa (4 g/cm2).
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Exemple 7 o
On a pulvérisé 1 kg de fibres de cellulose, 4 kg de Clarcel Celite et 10 kg de matière recirculée obtenue suivant cet exemple avec 10, 5 kg de gélatine Bloom 200 à 10 % en poids dans un mélangeur à soc du type Lödige FM 130 D et on a obtenu des particules arrondies de différentes dimensions. Pendant toutes les opérations susmentionnées on a maintenu les ingrédients et l'équipement à 55 C. Les particules arrondies ont été séchées dans une tour à lit fluidisé et ont été tamisées et la fraction comprise entre 0,5 et 0, 7 mm comprenant 32 % a été récupérée. Le résidu comprenant des particules plus grossières qui ont été broyées et des fines qui ont été utilisées directement a été recyclé tel que décrit au début de cet exemple.
Exemple 8 :
On a chargé le même mélangeur que celui de l' exemple 4, c'est-à-dire Lödige FM 130 D, avec 3 kg de
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fibres de cellulose, 10, 5 kg de Clarcel Celite et 1, 5 kg d'albumine, à température ambiante et on a pulvérisé avec 15, 2 kg d'eau. Le temps de traitement et les vitesses de rotation du mélangeur et de la lame ont été choisis de manière à obtenir des particules de dimension préférée.
Les particules ont été séchées dans un lit fluidisé et une analyse granulométrique des particules séchées a donné la distribution granulométrique suivante :
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<tb>
<tb> > 1000 <SEP> pm <SEP> 19,7 <SEP> %
<tb> > 850-35, <SEP> 6 <SEP> %
<tb> > 707-58, <SEP> 8 <SEP> %
<tb> > 600-78, <SEP> 2 <SEP> %
<tb> > 500-92, <SEP> 1 <SEP> %
<tb> < 420-1, <SEP> 1 <SEP> % <SEP>
<tb>
Exemple 9 :
On a répété le processus de l'exemple 8 sauf que l'on a remplacé l'albumine par 1,5 kg d'hydrolysat soluble isoélectrique de protéine de soja et que la quantité d'eau était de 14, 8 kg.
L'analyse granulométrique des particules séchées a donné la distribution granulométrique suivante :
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<tb>
<tb> > 1000 <SEP> nm <SEP> 24,2 <SEP> %
<tb> > 850-43, <SEP> 2 <SEP> %
<tb> > 707-66, <SEP> 1 <SEP> %
<tb> > 600-84, <SEP> 4 <SEP> %
<tb> > 500-95, <SEP> 2 <SEP> %
<tb> < 420-1, <SEP> 0 <SEP> %
<tb>
Exemple 10 :
On a chargé le même mélangeur que celui de 1' exemple 6, c'est-à-dire Lodge FM 50, avec 11, 3 kg d' A1203 et 3,0 kg de fibres de cellulose et on a pulvérisé avec 650 g de gélatine Bloom 200 dans 4, 55 kg d'eau.
La température a été maintenue à 55 C. Les particules formées par la rotation du mélangeur et de la lame ont été séchées dans un lit fluidisé. L'analyse granulométrique a donné la distribution granulométrique suivante :
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<tb>
<tb> > 1000 <SEP> pm <SEP> 8,5 <SEP> %
<tb> > 850-16, <SEP> 1 <SEP> %
<tb>
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<tb>
<tb> > 707-31, <SEP> 2 <SEP> %
<tb> > 600-46, <SEP> 2 <SEP> %
<tb> > 500-65, <SEP> 3 <SEP> %
<tb> . <SEP> < 420-15, <SEP> 6 <SEP> %
<tb>
Exemple 11 :
On a chargé le mélangeur Lodge FM 130 D avec 2,1 kg de fibres de cellulose, 8, 4 kg de Clarcel Celite et 4, 5 kg de chlorure de sodium et on a pulvérisé 11, 0 kg de gélatine Bloom 80 à 10% en poids. La température était de 55 C.
Les particules ont été formées et séchées.
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L'analyse granulométrique a donné la distribution granulométrique suivante :
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<tb>
<tb> > 1000 <SEP> nm <SEP> 14, <SEP> 2 <SEP> %
<tb> > 850-23, <SEP> 7 <SEP> %
<tb> > 707-40, <SEP> 1 <SEP> %
<tb> > 600-59, <SEP> 1 <SEP> %
<tb> > 500 <SEP> - <SEP> 79, <SEP> 1 <SEP> %
<tb> < 420-5, <SEP> 8 <SEP> % <SEP>
<tb>
Exemple 12 :
Cet exemple décrit un procédé de fabrication d'une préparation d'enzyme immobilisée suivant la présente invention.
Ainsi on a fluidisé 4,5 kg de particules de support produites suivant l'exemple 4, traitées avec du glutaraldéhyde, lavées et séchées, dans un appareillage pilote à lit fluidisé (du type Glatt WSG 15) et on a pulvérisé 9, 3 kg de solution de glucose isomérase à 19 % en poids partiellement purifiée et obtenue du Bacillus coagulans NRRL 5650 (activité 3240 unités/g de matière sèche, l'unité d'activité étant définie dans NOVO analyseforskrift AF 189/1) sur les particules, entre 50 et 55 C, et on a fait sécher les particules. Le produit ainsi obtenu contenait 28 % en poids de glucose isomérase partiellement purifiée, et présentait un rendement d'activité d'enzyme de 85 %.
On a ensuite traité 20 g de ces particules dans 500 ml d'une solution contenant du NaH2P04. 2H20 0, 06 M, du Na2s04 1, 4 M et 0, 1 % poids/ volume de glutaraldéhyde, réglée à pH 7,0 au moyen de NaOH 1 N. Après 1 heure à température ambiante, on a
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retiré les particules et on les a entièrement lavées avec du phosphate de sodium 0, 06 M à pH 7,0 et ensuite lavées superficiellement avec de l'eau désionisée et on a fait sécher une partie de celles-ci. Les particules humides et mouillées ont présenté les mêmes propriétés d'écoulement que le support d'origine et on n'a pu déterminer aucune perte d'activité. Cependant, dans les particules humides, le rendement d'activité enzymatique était de 70% tandis que dans les particules séches il n'était que de 48 %.
Exemple 13 :
On a fluidisé 20 g de particules support séchées produites suivant l'exemple 4 dans un lit fluidisé du type Lab. On a pulvérisé 45, 8 g de boue cellulaire homogénéisée à 11, 0 % en poids (fermentée comme indiqué dans l'exemple 1 de la demande de brevet danois n 5190/ 79, boue produite comme indiqué dans l'exemple 4 de la demande de brevet danois n 5190/79) contenant 80, 1 U/g de lactase thermophile obtenue du Bacillus sp. NRRL B-11. 229 sur les particules de support, entre 30 et 40 C, et on a fait sécher les particules revêtues.
L'unité d'activité de lactase est définie en tant que la quantité de lactase qui désintègre 1 pmole de lactose/minute dans les conditions de réaction suivantes : concentration du substrat = 10 % de lactose, température = 60 C, pH = 6, 5 et temps de réaction = 30 minutes. Le rendement de l'activité enzymatique était de 79,8 %. On a ensuite traité 10 g de sphères revêtues dans 250 ml d'une solution con-
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tenant du Na2HPO4 0, du NaSO 1, 4 M et 0, 1 % poids/volume de glutaraldéhyde à pH 7, 5. Après 1 heure à température ambiante, on a retiré les particules et on les a entièrement lavées avec du K2HP04 0, 06 M à pH 7, 5. Le rendement de l'activité enzymatique par rapport à l'étape de réticulation était de 17, 2 %.
Exemple 14 :
On a trempé 24 g de particules de support séchées produites selon l'exemple 4 dans 20, 2 g de solution d'une amyloglucosidase à 39,6 % en poids partiellement
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purifiée obtenue à partir de A. niger et produite par ultrafiltration du produit commercial AMG 200 L (décrit dans la brochure de NOVO AMG, B 020 g-GB 2500, juillet 1982) en vue d'éliminer des constituants de poids moléculaire inférieur pour obtenir une teneur en matière sèche de 39,6 % en poids (activité 2610 IAG/g, l'unité d'activité étant définie dans NOVO Analyseforskrift AF 159/2).
On a appliqué le vide pendant 1 heure. Le produit ainsi obtenu contenait 25 % en poids de matière sèche d'enzyme avec un rendement d'activité enzymatique de 77,9 %.
On a ensuite traité 20 g de particules contenant 71,8 % de matière sèche dans 1600 ml d'une solution à 1 % poids/volume de NaH-PO., 20 % poids/volume de Na2s04 et 0,2 % de glutaraldéhyde à pH 4,5. Après 1 heure, on a séparé les particules par filtration et on les a lavées avec du NaHPO. à 1 %, à pH 4,5.
Le rendement d'activité enzymatique par rapport à l'étape de réticulation était de 55, 1 %.
Exemple 15 :
On a mélangé 40 g de particules support préparées suivant l'exemple 4 et présentant une teneu en matière sèche de 98,8 % avec 24 g d'un concentré de glucose isomérase de Bacillus coagulans partiellement purifiée (NRRL 5650) évaporé sous vide et additionné de 5 % de glucose et de 8 % de sulfate de sodium (matière sèche 41,8 %) et on a évacué l'air dans les pores des particules du liquide par un traitement sous vide. Le poids après mélange était de 63,22 g ; la teneur en matière sèche était de 79,2 %.
On a traité des fractions de 18 g de cette préparation ( 14 g de matière sèche), pendant 1 heure, à température ambiante, avec 375 ml d'une solution contenant dans tous les cas 22 % de sulfate de sodium, 5 % de glucose et 1 % de phosphate de sodium, réglée à pH 7,5 et contenant en outre soit 0,1, 0,2 ou 0,3 % de glutaraldéhyde.
Après ce traitement, les préparations ont été lavées cinq fois avec environ 150 ml de phosphate de
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sodium à 1 % à pH 7,5.
L'activité enzymatique a été déterminée suivant AF 189/1 après avoir évacué le liquide des particules.
On a également déterminé la teneur en matière sèche sur les particules égouttées.
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<tb>
<tb>
% <SEP> de <SEP> mat. <SEP> U/g <SEP> hu-U/g <SEP> Rende-Immob. <SEP>
<tb> séches <SEP> mide <SEP> sec <SEP> ment <SEP> % <SEP> rendement%
<tb> Concentré <SEP> d'enzyme <SEP> 41,8 <SEP> 1415 <SEP> 3385
<tb> Concentré <SEP> d'enzyme
<tb> + <SEP> support <SEP> 79,8 <SEP> 463 <SEP> 585 <SEP> 86 <SEP> - <SEP>
<tb> Immob <SEP> avec <SEP> 0, <SEP> 1% <SEP> GA <SEP> 32,5 <SEP> 158 <SEP> 486 <SEP> 72 <SEP> 83
<tb> 0, <SEP> 2%-38, <SEP> 9 <SEP> 141 <SEP> 362 <SEP> 53 <SEP> 62
<tb> 0, <SEP> 3%--117 <SEP> 333 <SEP> 49 <SEP> 57
<tb>
Les fractions équivalentes à 5 g de matière sèche ont subi des essais en vue de déterminer la perte de charge.
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<tb>
<tb>
Glutaraldéhyde <SEP> Perte <SEP> de <SEP> charge
<tb> concentration <SEP> à <SEP> 25 <SEP> heures <SEP> 50 <SEP> heures
<tb> l'immobilisation
<tb> 0, <SEP> 1 <SEP> % <SEP> 3 <SEP> 5
<tb> 0,2 <SEP> % <SEP> 1 <SEP> 3
<tb> 0, <SEP> 3 <SEP> % <SEP> 2 <SEP> 3
<tb>
Exemple 16 :
On a chargé le même mélangeur que celui de l'exemple 4, à savoir le mélangeur Lödige FM 130 D, avec 3 kg de fibre de cellulose et avec 13,5 kg de Clarcel Celite et on a pulvérisé 15 kg de polyéthylènimine PEI 15 T à 10 % poids/volume, de Taihei Sangyo Kaisha Ltd., à température ambiante, ensuite 3,0 kg d'eau et finalement 2 kg de glutaraldéhyde à 50 % poids/volume. Le temps de traitement et les vitesses de rotation du mélangeur ainsi que du hachoir ont été choisis de manière telle que l'on obtienne des particules de dimension préférée.
Les particules ont été séchées dans un lit fluidisé.
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Exemple 17 :
On a chargé le même mélangeur que celui de l'exemple 4, à savoir le mélangeur Lödige FM 130 D, avec
3 kg de fibre de cellulose et avec 12,0 kg de charbon actif Pecactif FGV (de la Firme Peca S. A., Levallois,
Cedex, France) et on a pulvérisé 20,0 kg d'une solution de gélatine Bloom 200 à 10 % poids/volume et finalement
4,5 kg d'eau. Le temps de traitement et les vitesses de rotation du mélangeur ainsi que du hachoir ont été choisis de manière telle que l'on obtienne des particules de dimension préférée. Les particules ont été séchées dans un lit fluidisé.
L'utilité d'un produit d'enzyme immobilisée ob- tenu suivant la présente invention apparaît plus claire- ment dans l'essai d'utilisation suivant. On a obtenu un produit de glucose isomérase immobilisée selon l'exemple
12. Le produit contenait 32,6 % en poids de glucose iso- mérase partiellement purifiée et la réticulation a été effectuée comme à l'exemple 12.
Après lavage avec 1 % en poids/volume de phos- phate de sodium (pH = 7,0) on a chargé 27,6 g de particu- les humides, correspondant à 10 g de matière sèche, dans une colonne enveloppée d'eau ayant un diamètre de 1,5 cm.
La colonne a été maintenue à 65 C et on a pompé en con- 5 tinu un sirop de glucose à 45 % en poids à pH 7,8 (réglé au moyen de Na2C03) à travers le lit d'enzyme à une vitesse qui permet une conversion de 40 à 42 % de glucose en fructose. L'activité initiale était de 538 IGIC/g de préparation de matière sèche (l'activité ayant été calcuD lée suivant NOVO Analyseforskrift AF 147/6) et la demivie de l'activité a été déterminée à 450 heures. Le pH à la sortie était compris entre 7,4 et 7,5.
A titre de comparaison on peut noter que la glucose isomérase immobilisée largement utilisée dans le 5 commerce, Sweetzyme""présente une activité de 225 à 300
IGIC/g et une demi-vie d'activité semblable et que pour
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obtenir un pH à la sortie de 7,4 à 7,5 avec la Sweetzyme, dans les mêmes conditions qu'indiquées ci-dessus, c'est- à-dire 65 C et 45 % en poids de sirop de glucose, il faut régler un pH d'entrée de 8,2.