"Perfectionnements relatifs à des enzymes immobilisées" La présente invention concerne des enzymes immo-
bilisées, leur procédé de préparation et leur utilisation.
Dans certains cas, il est avantageux d'employer une
enzyme immobilisée plutôt qu'une enzyme soluble. Les avantages qu'offre l'emploi d'une enzyme immobilisée comparativement à une enzyme soluble résident dans le fait que l'enzyme immobilisée peut
être réutilisée et ne contamine pas les produits réactionnels, de
sorte qu'elle est remarquablement appropriée pour une utilisation
en continu ou une utilisation répétée. Les inconvénients des
enzymes immobilisées connues sont les suivants : certaines
d'entre elles doivent être préparées par des procédés plutôt
compliqués et, par conséquent, elles sont relativement coûteuses, tandis que d'autres nécessitent une proportion assez importante
de support, ce qui signifie que ces enzymes immobilisée:; connues
ne sont pas très compactes. De même, certaines enzymes immobilisées connues présentent un autre inconvénient du fait que, lorsqu'elles sont chargées dans une colonne, elles manifestent
des propriétés d'écoulement insatisfaisantes .
La préparation enzymatique suivant l'invention comprend une matière appropriée comme catalyseur à usage industriel,
de sorte que cette matière est constituée de corps façonnés d'une structure insoluble dans l'eau comprenant au moins une enzyme
sans aucun additif, à l'exception des impuretés accompagnant normalement les enzymes fabriquées à l'échelle industrielle, un
liant non protéique et éventuellement un agent de renforcement,
les corps façonnés étant largement réticulés au moyen d'un agent de réticulation.
On constate souvent que l'addition d'un liant au système immobilisé améliore fortement sa stabilité mécanique et enzymatique. Comme lianls, on peut employer des substances
solubles à bas poids moléculaire ou à poids moléculaire élevé contenant, de préférence, au moins deux groupes fonctionnas <EMI ID=1.1>
les carbohydrates, les polyamines, les composés polyhydroxy
et analogues.
Les substances protéiques telles que les protéines, les hydrolysats de protéines, les peptones, les peptides et analogues ne sont pas appropriées pour l'objet de la présente invention, étant donné qu'elles sont susceptibles d'être dégradées par des enzymes protéolytiques qui sont pratiquement omniprésentes dans les préparations enzymatiques industrielles et, lorsqu'on les utilise dans les systèmes immobilisés, elles rendent ces derniers non reproductibles et moins stables.
Ces nouvelles préparations enzymatiques suivant l'invention présentent l'avantage d'être très économiques, du
fait qu'elles sont préparées par un procédé très simple.
De plus, la nouvelle préparation enzymatique suivant l'invention ne contient aucun constituant autre que la ou les enzymes, les impuretés que l'on rencontre normalement dans les enzymes fabriquées à l'échelle industrielle, le liant et éventuellement un agent de renforcement. Dès lors, la nouvelle préparation enzymatique suivant l'invention ne contient aucun support qui, dans les enzymes immobilisées connues, réduit la compacité ou l'activité enzymatique maximale possible par unité de poids. C'est pourquoi, on peut préparer une colonne ayant une très haute activité enzymatique par unité de volume. En conséquence, la vitesse réactionnelle du liquide s'écoulant à travers la colonne est très élevée. Enfin, étant donné que les préparations enzymatiques sont façonnées, l'écoulement à travers la colonne est satisfaisant.
La préparation enzymatique suivant l'invention assure d'excellentes caractéristiques d'écoulement à travers une colonne qui en est garnie. De préférence, les particules ont une section transversale arrondie ; par exemple, elles se présentent sous forme de sphères, d'hémisphères, de granules sphériques, de filaments, de pastilles, de réticules, de mousses perméables, de mailles et analogues. Les particules peuvent avoir une forme comportant deux surfaces principales parallèles, par exemple, une pellicule, une bande ou un carré. De plus, la préparation peut avoir une forme irrégulière que l'on obtient, par exemple, en granulant une poudre irrégulière.
Les préparations enzymatiques suivant l'invention peuvent contenir plusieurs enzymes actives différentes. Outre les enzymes simples, on peut également employer les systèmes enzymatiques complexes . Le tableau 1 ci-après donne des exemples d'enzymes que l'on peut employer conformément à la présente invention, ainsi que leur utilisation.
<EMI ID=2.1>
<EMI ID=3.1>
Tableau 1 (suite)
<EMI ID=4.1>
<EMI ID=5.1>
<EMI ID=6.1>
L'agent de réticulation peut être l'un ou l'autre des produits suivants ou leurs mélanges :
<EMI ID=7.1>
L'agent de réticulation peut également comprendre une combinaison de l'un ou l'autre des agents de réticulation précités avec d'autres substances, afin d'augmenter la grosseur de la molécule et/ou accroître le nombre de groupes réactifs de l'agent de réticulation.
La nature de la réticulation est l'un ou l'autre des types connus de liaisons, par exemple, les liaisons covalentes, ioniques, de coordination, d'hydrogène et analogues.
L'enzyme peut être une enzyme à liaison cellulaire
et elle peut exister sous forme de cellules microbiennes, de mycelia , de structures subcellulaires telles que les membranes, les mitochondries, les ribosomes, les noyaux et autres structures naturelles contenant des enzymes. L'enzyme peut également être une enzyme exempte de cellules ou un mélange d'une enzyme à liaison cellulaire et d'une enzyme exempte de cellules.
Une forme de réalisation préférée de l'invention consiste à employer des enzymes exemptes de cellules. En utilisant des enzymes exemptes de cellules, le produit final d'enzymes immobilisées n'est pas dilué par la matière cellulaire inactive du point de vue enzymatique et, pour cette raison, on obtient une enzyme immobilisée d'une très haute activité enzymatique.
Dans une forme de réalisation préférée de la préparation enzymatique suivant l'invention, l'enzyme est choisie parmi le groupe comprenant l'amidase de pénicilline, l'amino-acylase, l'amylo>glucosidase, la lactase, l'invertase, l'oxydase de phénol, l'inulase et l'isomérase de glucose. Toutes ces préparations présentent un intérêt commercial immédiat ou virtuel.
Dans une autre forme de réalisation préférée de la préparation enzymatique suivant l'invention, l'agent de réticulation est le glutaraldéhyde . Cet agent de réticulation est peu coûteux, non toxique, aisément disponible dans le commerce et il donne lieu à la formation d'un produit présentant de bonnes propriétés mécaniques et assurant une bonne récupération de l'activité enzymatique.
Dans une autre iorme de réalisation préférée de la préparation enzymatique suivant l'invention, les corps façonnés
ont une section transversale arrondie. De la sorte, on obtient
un produit présentant des propriétés d'écoulement satisfaisantes.
Dans une autre forme de réalisation préférée de la préparation enzymatique suivant l'invention, les corps façonnés ont une épaisseur ou un diamètre moyen compri.s entre environ
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qui constitue un bon compromis entre une accessibilité suffisante de l'enzyme et de bonnes propriétés d'écoulement.
Dans une autre forme de réalisation préférée de la préparation enzymatique suivant l'invention, cette préparation contient un agent de renforcement choisi parmi le groupe comprenant la terre d'infusoires, la perlite expansée, les celluloses fibreuses et en poudre , la sciure, le feutre, le poil, le sable
et les filaments sythétiques, les tamis ou les réticules formés de polyamides, de polyesters, de polyuréthanes, de polyéthylène, de polypropylène, d'acétate de cellulose et/ou de silicones. De la sorte, on obtient un produit présentant de bonnes propriétés mécaniques.
Dans une autre forme de réalisation préférée de la préparation enzymatique suivant l'invention, le liant est une polyamine. Les polyamines sont économiques et disponibles dans le commerce et les préparations enzymatiques ainsi obtenues possèdent une bonne stabilité mécanique et enzymatique.
Dans une autre forme de réalisation préférée de la préparation enzymatique suivant l'invention, la polyamine est présente en une quantité d'environ 0,01 à 10% en poids, de préférence, entre environ 0, 1 et 5% en poids, calculés sur la base du poids total de la préparation enzymatique sèche. On obtient
<EMI ID=9.1>
tivement faibles en liant.
Dans une autre forme de réalisation préférée de la préparation enzymatique suivant l'invention, le liant est un alginate. Les alginates sont économiques et disponibles dans le commerce, tandis que les préparations enzymatiques ainsi obtenues possèdent une bonne stabilité mécanique et enzymatique. De même, les alginates sont appropriés pour la fabrication de filaments, de fibres, de pellicules et analogues.
Dans une autre forme de réalisation préférée de la préparation enzymatique suivant l'invention, l'alginate est pré-
<EMI ID=10.1>
de préférence, entre environ 10 et 75% en poids, calculé* -\ la base du poids total de la préparation enzymatique sécha .
L'invention concerne également un procédé da production de cette nouvelle préparation enzymatique. Ce procédé
<EMI ID=11.1>
moins une enzyme et les impuretés éventuelles qui accompagnent normalement les enzymes fabriquées à l'échelle industriels,
2) un liant non protéique, 3) un agent de renforcement éventuel.
4) un agent de réticulation et 5) de l'eau et/ou un ou plusieurs solvants organiques de façon qu'il ne se forme qu'une phase liquide, puis transformer le mélange ainsi obtenu en corps façonnés à n'importe quel stade suivant l'introduction de l'enzyme dans le procédé. De la sorte, la préparation est fixée et insolubilisée à la forme désirée .
Afin d'obtenir une réticulation homogène et étendue dans tout le corps façonné, une seule phase liquide est nécessaire. Dans le cas d'un agent de réticulaiion hydrosoluble et lorsque la réticulation est effectuée après la formation des corps façonnés, on constate très souvent que l'on ne peut employer de l'eau seule, étant donné que les corps façonnés seraient alors dissous. Dans ce cas, il est nécessaire d'employer un solvant organique hydrosoluble.
On a constaté qu'en procédant de la sorte, la forme restait intacte, alors que le corps façonné était réticulé. Lorsque l'agent de réticulation est insoluble dans l'eau, on peut employer des solvants organiques hydrophiles ou hydrophobes dans un milieu fondamentalement non aqueux.
De préférence, la réticulation est effectuée aux environs de la température ambiante . Si la température de réticulation est sensiblement inférieure à la température ambiante, la durée de la réticulation sera prolongée excessivement et, si cette température de réticulation est sensiblement supérieure à la température ambiante, les enzymes auront tendance
à être rendues inactives .
Afin d'assurer une réticulation efficace à la température ambiante, la réaction doit durer au moins 2 minutes, de préférence, 10-60 minutes.
Lors du choix du pH du milieu de réticulation, il convient de tenir ' compte de la sensibilité de l'enzyme et de l'efficacité de la réticulation. Normalement, on constate que le pH optimum se si':.le entre environ 2 et 10, en particuler, entre environ 4 et 9. Avec la plupart des enzymes et des agents de réticulation, on constate qu'il est préférable que le pH se rapproche du point neutre. Avec le glutaraldéhyde, on constate que le pH optimum pour le milieu de réticulation se situe entre environ
6 et 7.
Dans le tableau III ci-après, on donnera certains exemples de solvants organiques :
Tableau III
<EMI ID=12.1>
Tableau III (suite)
<EMI ID=13.1>
Dans le procédé décrit ci-dessus suivant l'invention ,
<EMI ID=14.1>
le liant, l'agent de renforcement éventuel, l'agent d� réticulation, ainsi que l'eau et/ou le solvant organique) n'est pas critique et, en règle générale, les ingrédients peuvent être ajoutés dans n'importe quel ordre. L'opération consistant à conférer la forme
<EMI ID=15.1>
pendant ou après le traitement de réticulation, suivant le procédé désiré.
Une forme de réalisation du procédé de préparation de ces corps façonnés consiste à mettre en contact une suspension de l'enzyme dans un milieu contenant un solvant organique faisant office de liquide coagulant, puis réticuler le produit formé avec un agent de réticulation. La mise en contact peut être effectuée simultanément avec la coagulation ou en une étape séparée.
Une forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention consiste à conférer une forme particulaire désirée à une matière contenant : 1) au moins une enzyme et les impuretés éventuelles accompagnant normalement les enzymes fabriquées à
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éventuel, puis traiter la matière enzymatique particulaire ainsi formée dans un milieu de réticulation constitue d'au moins un agent
<EMI ID=17.1>
de façon à ne former qu'une phase liquide, la forme de la ma.
tière particulaire restant intacte au cours de la réticulation.
<EMI ID=18.1>
insoluble ayant des propriétés d'écoulement désirées et ce, d'une manière aisée et peu coûteuse.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, on sèche la matière enzymatique qui a reçu la forme particulaire désirée avant de la réticuler. De la sorte, la réticulation a lieu plus rapidement que de la manière habituelle .
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, on effectue le séchage à une tem-
<EMI ID=19.1>
par une température défavorable.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, on sèche les corps façonnés après le traitement de réticulation. De la sorte, on obtient un produit immobilisé ayant une meilleure stabilité.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, l'enzyme est choisie parmi le
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l'amyloglucosidase, la lactase, l'invertase, l'oxydase de phénol, l'inulase et l'isomérase de glucose. Toutes les préparations obtenues de la sorte présentent un intérêt commercial immédiat ou virtuel.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procède suivant l'invention, l'agent de réticulation est le glutaraldéhyde Cet agent de réticulation est peu coûteux, non toxique, aisément disponible dans le commerce, tandis qu'il donne un produit ayant de bonnes propriétés mécaniques et assurant une bonne récupération de l'activité enzymatique.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, l'enzyme utilisée comme matière de départ est exempte de cellules . En utilisant des enzymes exemptes de cellules, le produit enzymatique final immobilisé n'est pas dilué par la matière cellulaire enzymatiquement inactive et, pour cette raison, on obtient une enzyme immobilisée à très haute activité enzymatique.
Dans une autre forme de réalisation préfé:rée du procédé suivant l'invention, l'enzyme utilisée comme matière de
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priée pour l'extrusion et cette dernière constitue un procédé approprié pour la fabrication à grande échelle de corps façonnés.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, l'enzyme utilisée comme matière de départ se présente sous forme d'une suspension. De la sorte, on peut employer directement, comme matière de départ, le bouillon de fermentation tel quel ou un bouillon de fermentation qui n'est que préalablement traité .
Dans une autre forme de réalisation préférée du
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tière de départ se présentent sous forme d'une solution. De
la sorte, on peut employer directement, comme matière de départ, le bouillon de fermentation tel quel ou un bouillon de fermentation qui n'est qui préalablement traité.
Dans une aatre forme de réalisation préférée da procédé suivant l'invention, la forme désirée conférée à la matière de départ enzymatique est obtenue par extrusion ou granulation Une extrusion ou une granulation est un procédé approprié pour la fabrication à grande échelle de corps façonnés.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, le produit d'extrusion est transformé en sphères. Ce procédé est aisément effectué industriellement
<EMI ID=23.1> Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, la forme désirée conférée à la matière de départ enzymatique est obtenue par égouttement sur
une surface. C'est là un procédé aisé pour la formation de particules arrondies.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, la forme désirée conférée à la matière de départ enzymatique est obtenue en étalant la matière
de départ sous forme d'une couche sur une surface et en procédant à un séchage. C'est là un procédé aisé permettant d'obtenir un produit ayant une haute surface spécifique.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, la couche séchée est réduite en plus petites unités . De la sorte, on obtient une surface spécifique
plus haute encore.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, la forme désirée conférée à la matière de départ enzymatique est obtenue moyennant un séchage par pulvérisation. De la sorte, on peut aisément former industriellement et à grande échelle des particules d'une très haute surface spécifique et présentant de bonnes propriétés d'écoulement.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, le solvant organique éventuel est miscible à l'eau en toutes proportions.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, le solvant organique éventuel Est
un alcool contenant 1 à 4 atomes de carbone.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant la présente invention, le solvant organique éventuel est l'acétone.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, le solvant organique éventuel est un des produits suivants : le tétrahydrofuranne , le diméthylfor-
<EMI ID=24.1>
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, l'agent de réticulation est hydrosoluble et le pourcentage volumétrique du solvant organique
dans le mélange d'eau et de solvant organique se situe entre environ 25 et 95%, de préférence, entre environ 45 et 85%.
En dessous de la quantité minimale de solvant, le ou les corps façonnés peuvent être dissous et, au-delà de la quantité maximale de solvant, la réticulation se déoule lentement et d'une manière inefficace.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, le pourcentage (en poids/volume)
de l'agent de réticulation dans le milieu d'eau et/ou de solvant organique se situe entre environ 0,01 et 50%, de préférence, entre environ 0, 1 et 10%. Ces intervalles s'appliquent, en particulier, dans le cas du glutaraldéhyde . En dessous de
la valeur minimale, la réticulation se déroule trop lentement
et d'une manière inefficace tandis que, au-delà de la valeur maximale, les enzymes ont tendance à être rendues inactives.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, le liant ajouté est une polyamine. Les polyamines sont économiques et disponibles dans le commerce, tandis que la préparation enzymatique ainsi obtenue possède une bonne stabilité mécanique et enzymatique.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, on ajoute la polyamine en une quantité d'environ 0,01 à 10% en poids, de préférence, une quantité comprise entre environ 0, 1 et 5% en poids, calculés sur la base du poids total sec des ingrédients de départ. De la sorte, on obtient des préparations enzymatiques ayant une bonne stabilité mécanique et enzymatique avec de faibles concentrations seulement en liant.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, le liant ajouté est un alginate.
Les alginates sont économiques et disponibles dans le commerce, tandis que les préparations enzymatiques ainsi obtenues possèdent une bonne stabilité mécanique et enzymatique. De plus, les alginates sont appropriés pour la fabrication de filaments, de fibres, de pellicules et analogues.
Dans une autre forme de réalisation préférée du procédé suivant l'invention, on ajoute l'alginate en une quantité comprise entre environ 5 et 95% en poids, de préférence, entre environ 10 et 75% en poids, calculés sur la base du poids total
sec des ingrédients de départ.
L'invention concerne également l'emploi des nouvelles préparations enzymatiques d'une manière continue ou répétée.
Dans une forme de réalisation préférée de l'utilisation suivant l'invention, on emploie la préparation enzymatique comme charge dans une colonne en vue d'une utilisation continue ou répétée. En énonçant très clairement les propriétés avantageuses, les
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approprié s'écoule afin d'effectuer une transformation chimique. Toutefois, les nouvelles préparations enzymatiques peuvent être également utilisées en discontinu. C'est ainsi que les nouvelles préparations enzymatiques peuvent être utilisées dans un lit agité dans tous les sens dans un récipient sans que les particules subissent une forte désintégration.
Dans une autre forme de réalisation préférée concernant l'utilisation suivant l'invention, l'enzyme est l'isomérase de glucose, tandis que la charge de la colonne est une solution de
<EMI ID=26.1>
mercial .
Dans une forme de réalisation préférée relative à l'utilisation suivant l'invention, l'enzyme est l'inulase, tandis que la charge de la colonne est une solution d'inuline. C'est là un procédé intéressant du point de vue commercial.
Dans une forme de réalisation préférée relative à l'utilisation suivant l'invention, l'enzyme est la lactase, tandis que la charge est du lait ou du lait dilué. Plusieurs personnes réagissent mal au lactose mais, lorsqu'il est hydrolysé er. galactose et en glucose conformément à l'utilisation suivant l'invention, le lait est transformé en un ingrédient tolérable pour ces personnes.
Dans une autre forme de réalisation préférée relative à l'utilisation suivant l'invention, l'enzyme est l'amidase de pénicilline, tandis que la charge de la colonne est une solution de pénicilline. C'est là un procédé intéressant du point de vue commercial .
Bien que l'on utilise uniquement le mot "enzyme" dans la présente spécification, on peut employer de la même manière d'autres molécules apparentées biologiquement actives,
<EMI ID=27.1>
par exemple, des inhibiteurs,/des anticorps et des antigènes.
La présente invention sera illustrée ci-après par certains exemples.
Exemple 1
Fibres d'alginates et de polyamines
On verse lentement une suspension de 6% (poids volume) de cellules contenant de l'isomérase de glucose dans 1,5% (poids /volume) d'une solution d'alginate de sodium réglée à un pH de 7,0 dans de l'isopropanol agité vigoureusement en une quantité égale à 10 fois le volume de cette suspension. On laisse sécher les fibres ainsi obtenues pendant une nuit et on en agite 6, 25 g dans 100 ml de polyéthylène-imine à 1% d'un poids moléculaire de 600 et d'un pH de 7,0 pendant 30 minutes , <EMI ID=28.1>
(poids/volume) à un pH de 7,0, on les rince deux fois dans
100 ml d'eau déminéralisée et on les charge dans une colonne
<EMI ID=29.1>
de 7,0 et l'on règle la température à 60[deg.]C.
On enregistre le rendement suivant :
<EMI ID=30.1>
Exemple 2
Polyamines, microsphères
De la manière suivante, on traite 3 portions de 10 g chacune d'une poudre séchée par pulvérisation et contenant une
partiellement
activité d'isomérase de glucose/exempte de cellules :
a) On plonge la poudre dans 100 ml d'un mélange de volumes égaux d'acétone et d'éthylène-diamine à 5% (poids/ volume) que l'on règle à un pH de 7,0, puis on filtre et laisse sécher pendant une nuit. Ensuite, on agite la poudre pendant
20 minutes dans du glutaraldéhyde aqueux à 1% et à un pH de 7,0, <EMI ID=31.1> une colonne munie d'une enveloppe.
b) On procède de la même manière, avec cette exception que l'on effectue le traitement avec de la polyéthylène-imine d'un poids moléculaire de 600 au lieu de diamine. c) On procède de la même manière, avec cette exception que l'on n'effectue pas le traitement préalable avec des amines.
Les volumes des lits dans les colonnes sont les suivants :
<EMI ID=32.1>
A raison de 19 ml/heure, on entame une charge cons-
<EMI ID=33.1>
Transformation, %
<EMI ID=34.1>
<EMI ID=35.1>
Exemple 3
Microsphères, traitement ultérieur avec une diamine
Pendant 20 minutes, on agite 40 g d'une poudre séchée par pulvérisation et contenant une activité d'isomérase de glucose partiellement exempte de cellules dans 200 ml d'un mélange de deux volumes d'acétone et d'un volume de glutaraldéhyde aqueux
<EMI ID=36.1>
60 minutes dans 100 ml d'eau déminéralisée, tandis que l'autre portion, est agitée pendant 60 minutes dans. 100 ml d'éthylènediamine aqueuse à 5% à un pH de 7,0. Ensuite, on rince les
<EMI ID=37.1>
loppes, dans lesquelles on charge ensuite, à raison de 20 ml/ heure, une solution de 50% (poids/volume) de glucose, de 0,1%
<EMI ID=38.1>
On obtient les résultats suivants :
<EMI ID=39.1>
<EMI ID=40.1>
45 ml. A raison de 23 ml/heure, pendant 20 heures, on charge de l'eau déminéralisée dans la colonne, puis on modifie: la charge en une solution de dextrine à 30 % (poids /volume) d'un équivalent de dextrose de 19 et d'un pH de 4,5, puis on règle la température à 60[deg.]C. On analyse la teneur en glucose de l'effluent et l'on . obtient les résultats suivants :
<EMI ID=41.1>
Exemple 5
Carbodiimide comme agent de réticulation dans un milieu non aqueux
On complète 20 g de cellules contenant de l'isomérase de glucose à 100 ml avec de l'eau déminéralisée, on agite pendant
30 minutes, on effectue une centrifugation et on recueille le pro-. duit clair surnageant. On agite 60 ml de ce produit surnageant,
<EMI ID=42.1>
à un pH de 7,0 et on continue à agiter pendant 20 minute_. On élimine le précipité par centrifugation et on divise le produit clair surnageant en deux portions : on mélange une portion pendant 10 minutes avec 3,2 ml de polyéthylène-imine "PEI-6" ("Dow Chcmicals") à 1% (poids/volume) à un pH de 7,0, on l'étalé
<EMI ID=43.1>
N-cyclohexyl-N'-[2-(4-morpholinyl)-éthyl]-carbodiimide, puis on filtre et on agite pendent 20 minutes dans 100 ml d'eau déminéralisée pour obtenir des particules ayant de bonnes propriétés mécaniques et assurant une bonne récupération de l'activité enzymatique.
Exemple 6
Isomérase de glucose exempte de cellules
Pendant 30 minutes, on agite 60 g d'une poudre séchée par pulvérisation et contenant de l'isomérase de glucose partiellement exempte de cellules dans 560 ml d'eau déminéralisée, on la soumet à une centrifugation et on recueille le produit sur-
<EMI ID=44.1>
minutes dans un bain de glace, on ajoute goutte à goutte 25 ml de CoC12.6H20 à 10% et l'on poursuit l'agitation pendant 2 heures. On élimine le précipité par centrifugation et l'on conserve le produit surnageant à 4[deg.]C pendant une nuit, puis on le centrifuge à nouveau, on l'étale sur une surface de formica et on le laisse sécher. On détache la mince pellicule ainsi formée et on la broie pour obtenir de petites paillettes .
Ensuite, on agite 1 g de paillettes pendant 20 minutes dans un mélange de 95 ml d'acétone et de 5 ml de polyéthylèneimine "PEI-6" à 1% et à un pH de 7,0, on filtre, puis on agite
<EMI ID=45.1>
d'eau déminéralisée et de 2,5 ml de glutaraldéhyde à. 20% fraîchement préparé à un pH de 6,9. Ensuite, on filtre les paillettes, on les laisse sécher pendant une nuit, puis on les charge dans une colonne munie d'une enveloppe pour obtenir un lit de 1, 9 ml, après quoi, à raison de 7 ml/heure, on entame une charge cons-
<EMI ID=46.1>
les résultats suivants (volume de lit : 1,9 ml) :
<EMI ID=47.1>
Exemple 7
Terre d'infusoires comme agent de renforcement
On mélange 60 ml d'une solution d'isomérase de glucose exempte de cellules et préparée conformément à l'exemple 6 avec
<EMI ID=48.1>
formica de 600 cm2, on laisse sécher, puis on détache et on broie. Ensuite, on réticule 1 g des particules et on effectue un test de rendement comme décrit à l'exemple 6 ; on obtient une transformation d'environ 18% qui est maintenue pendant 48 heures.
Exemple 8
Cellulose fibreuse comme agent de renforcement
On prépare un produit identique à celui décrit à l'exemple 7, avec cette exception que l'on emploie du "solka-flok" au lieu de "Célite", puis on effectue un test de la même manière et l'on obtient une transformation d'environ 22% que l'on maintient pendant 48 heures .
Exemple 9
Coagulation et réticulation simultanées dans du dioxamie
On mélange 12 ml d'une solution d'isomérase de glucose exempte de cellules et préparée conformément à l'exemple 7, avec cette exception que l'on omet le traitement
<EMI ID=49.1>
pH de 7,0. On agite le précipité de temps à autre pendant
30 minutes , puis continuellement pendant 30 minutes, après quoi on le filtre, on le rince avec de l'eau déminéralisée pour obtenir des particules fibreuses dures qui, lorsqu'on les soumet à un test conformément à l'exemple 7, donnent le rendement suivant (volume de lit : 1,1 ml) :
<EMI ID=50.1>
Exemple 10
Coagulation et réticulation simultanées dans de l'acétone
Pendant 30 minutes, on agite 20 g d'isomérase de glucose partiellement exempte de cellules dans 200 ml d'eau déminéralisée, puis on effectue une centrifugation et on recueille le produit surnageant.
On mélange 20 ml de l'extrait avec 4 ml de polyéthylène-imine "PEI-6" à un pH de 7,0, puis on ajoute goutte à goutte le mélange dans 2 litres d'acétone contenant 10 ml de
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l'agitation et on la poursuit pendant 20 minute . supplémentaires. On filtre les particules ainsi formées, on les rince dans de l'acétone, on les broie dans un mortier, on les agite pendant
20 minutes dans un mélange de 60 ml d'acétone et de 40 ml de glutaraldéhyde à 1,5%, à un pH de 7,0, puis on les filtre, on les agite pendant 20 minutes dans 100 ml d'eau déminéralisée
et on. les soumet à un test conformément à l'exemple 7, avec cette exception que la charge contient, en plus, 0,01% de CoC12.6H20 et du NaHS03 0,003 M, cette charge étant réglée à un pH de 7,0. On obtient les résultats suivants :
<EMI ID=52.1>
Exemple 11
Coagulation et réticulation non simultanées
On obtient les rendements suivants avec des particules d'isomérase de glucose préparées et testées conformément à l'exemple 10, avec cette exception que l'on ajoute l'agent de réticulation après la coagulation :
<EMI ID=53.1>
Un produit préparé de la même manière, mais sans le liant, ne donne qu'une transformation de 2,6%.
Exemple 12
Coagulation et réticulation simultanées d'isomérase de glucose purifiée
Comme décrit à l'exemple 10, on traite 25 ml d'une solution d'isomérase de glucose préparée conformément à l'exemple 7, afin de former des particules donnant le rendement suivant
(volume de lit : 1, 4 ml) :
<EMI ID=54.1>
Un produit préparé de la même manière, mais sans le liant, ne donne qu'une transformation de 2%.
Exemple 13
Coagulation et réticulation non simultanées d'isomérase de glucose purifiée
Conformément à l'exemple 11, on traite 25 ml d'une soluté 'isomérase de glucose préparée conformément à l'exemple 7, pour former des particules donnant le rendement suivant
(volume de lit : 1,0 ml) :
<EMI ID=55.1>
Un produit préparé de la même manière, mais sans le liant, ne présente aucune activité.
Exemple 14
Précipitation et réticulation en deux étapes séparées a) On mélange 10 ml d'une solution d'isomérase de glucose préparée conformément à l'exemple 9, avec 1 ml de polyéthylène-imine à 1% à un pH de 7,0, puis on ajoute goutte à goutte le mélange dans 1 litre d'acétone non agitée, on agite de temps à autre pendant 10 minutes, puis on filtre le précipité, on l'agite pendant 20 minutes dans un mélange de 30 ml d'acétone et de 20 ml de glutaraldéhyde à 1,5%, puis on le filtre, on le plonge pendant 20 minutes dans 100 ml d'acétone, on le filtre
et on en teste l'activité comme décrit à l'exemple 10, avec cette
<EMI ID=56.1>
les résultats suivants (volume de lit : 1, 2 ml) :
<EMI ID=57.1>
b) Produit préparé de la même manière, mais sans le liant.
Exemple 15
Addition du liant après addition de l'agent de réticulation
On agite 2 g d'une poudre séchée par pulvérisation et contenant une activité d'isomérase de glucose dans un mélange de 150 ml d'acétone et de 50 ml de glutaraldéhyde à 1% à un pH
<EMI ID=58.1>
imine "PEI-6" à 0,1% à un pH de 7,0 et l'on poursuit l'agitation pendant 60 minutes supplémentaires.
Ensuite. on filtre les microsphères, on les agite deux fois dans 200 ml d'eau déminéralisée pendant 20 minutes , on les filtre, puis on les laisse sécher. Lorsqu'on en teste l'activité comme décrit h l'exemple 14, ces microsphères donnent une transformation de 37,6% après 20 heures .
Exemple 16
Addition du liant au terme de la réticulation de l'enzyme
Dans les mêmes conditions que celles décrites à l'exemple 15, on obtient une transformation de 31,3% avec un produit conforme à cet exemple, avec cette exception que le
<EMI ID=59.1>
Exemple 17
Addition du liant après élimination de l'agent de réticulation par lavage
Pendant 20 minutes, on agite un produit conforme à l'exemple 15, avec cette exception que l'on filtre tout d'abord
les microsphères réticulées, dans 500 ml d'eau déminéralisée, puis on le filtre et on l'agite pendant 60 minutes dans une solution constituée de 100 ml de polyéthylène -imine "PEI-6" à 0,05% et à un pH de 7,0, ainsi que de 150 ml d'acétone. Dans les mêmes conditions, on obtient une transformation de 37,2%.
Exemple 18
Tétr aminé comme agent liant
Pendant 20 minutes, on agite 2 g d'une poudre séchée par pulvérisation et contenant une activité d'isomérase de glucose dans un mélange de 150 ml d'acétone et de 100 ml de glutaraldéhyde à 1% à un pH de 7,0, puis on la filtre, on l'agite pendant 20 minutes dans 250 ml de triéthylène-tétramine à 0,2% et à un pH de 7,0,
<EMI ID=60.1>
on la filtre, on l'agite deux fois pendant 20 minutes dans 100 ml d'eau déminéralisée, on la filtre, on la laisse sécher, puis on
en teste l'activité comme décrit à l'exemple 14 et on constate
mais sans le liant, donne une transformation de 19,5%.
Exemple 19
Agrégats . Réticulation par pulvérisation
On soumet 200 g d'une pcudre du type décrit à l'exem-
<EMI ID=61.1>
à 2% à un pH de 7,0, on la sèche et on la soumet à une granulation complémentaire en cuvette avec 100 ml de polyéthylène -imine
<EMI ID=62.1>
agglomérées. On sèche ces microsphères et on en agite 23 g pendant 20 minutes dans un mélange de 40 ml d'acétone et de 2C ml de glutaraldéhyde à 20% à un pH de 7,0, on les filtre, on