JPH02291265A - 水―不溶性グルコースイソメラーゼ結晶およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は結晶酵素の架橋結合により形成する新規水一不
溶性グルコースイソメラーゼに関する。

本発明は不溶性、架橋結合グルコースイノメラーゼの製
造方法にも関する。

〔従来の技術および発明が解決しよう．とする課題〕連
続操作反応器で固定化酵素、すなわち固体キャリアに結
合した酵素の使用はますます好ましい技術である。何故
なら酵素のコストおよび最終生成物の精製で節約できる
からである。固定化グルコースイソメラーゼによるグル
コースのフラクトースへの転換は通常このような手順金
利用する方法である。

一般に、酵素は水溶性であり、従って連続方法において
固定化技術全使用することが必要になる。

酵素が水性相に溶解することを防止し、一方その活性金
維持できる方法により固体相に結合させなければならな
い。酵素を吸収させ、共有結合させ、架橋結合させ又は
ミクロカプセル化する各種技術が酵素を固体キャリアと
提携させるために提案された。別法では、酵素を産生ず
る微生物全体全固体相に結合できる。これらの技術のす
ぐれた要約４例えば、Ｍｏｏ　−　Ｙｏｕｎｇ　，　Ｍ
．　（　ａｄ．　）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　　２，　　Ｐｅｒｇａｍｏ
ｎＰｒｅｓｓ，　Ｌｏｎｄｏｎ，　　１　９８５９　ｐ
．　１　９　１　〜２　１　１に提示される。

先行方法では、酵素は別に製造したキャリア材科に結合
する。これ扛そのままで化学的動力学に対し、又は基質
の流動技術に対し有利である。しかし、キャリア材料は
糖産業で使用されるような、特に大規模大量生産方法で
は、大部分の場合触媒として作用する酵素より一層コス
トがかかる。別法では、酵素はゼラチンのような不活性
成分と架橋結合により固定化することができる。いずれ
にしても、先行技術において触媒として作用する酵素框
、各特別の方法で使用する材料の重量および容積の一般
には５チよジ少ない、通例は１〜２憾の画分を形成する
に過ぎない。

技術的に、ダルタルアルデヒドとの架橋結合な例エば、
グルコースイソメラーゼの固定化では非常に重要なもの
であった。既知のように、グルタルアルデヒドは食料品
の加工において酵素の固定化に使用することはＦＤＡＫ
よク承認されている。

適用された他の技術はイオン交換体への結合および固体
キャリアへの吸収を含む。このような適用の例は米国特
許第４．６　９　９，８　８　２号明細書（　Ｋ．Ｖｉ
ｇｕｒｉ　　：　　８ｔａｂｉｌｉｚｅｄ　ｇｌｕｃｏ
ｓｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ　）に見出すことができる。

しかし、この先行技術に使用したキャリアは比較的高価
であシ、この技術な大きな反応器を必要とする。

工業的使用に対する酵素の間定化は必ずしも使用酵素と
連合しないコストを伴なう。これらμ加工装置の建造お
よび工場敷地により生ずるコスト、キャリア材料の取得
（再取得）コスト、失活酵素材科の処分コスト、反応器
を空にし、？Ｒだ丁ことにより（又はキャリアの再生に
よ少）生ずる労務コスト、反応体の緩慢さＫよク生ずる
第二次コスト金含む。永い保有時間の結果として、非一
酵素性の不利な副反応が、特にフラクトースの製造でし
ばしば起こりつる。

科学文献はグルタルアルデヒドによる結晶酵素の架橋結
合の数例を含む。これらの研究で、酵素結晶は基本的研
究目的に対し架橋結合でれた。酵素結晶の構造はしばし
ば非常に弱いので、結晶はＸ一線回折研究で使用する線
ビームに耐えられない。しかし、グルグルアルデヒドκ
よクこれらはしばしばこれらの目的に対し安定化できる
。さらＫ１結晶は安定性および触媒動力学を研究する目
的によジ架橋結合された。結晶の架橋結合が成功した場
合、グルタルアルデヒドのみを使用し、媒体線各特別の
酵素全結晶形で維持する溶液から成った。不溶性結晶は
グルタルアルデヒドおよヒ酵素たん白間の反応により直
接形成するらしい。

ＱｕｉｏｃｈｏおよびＲｉｃｈａｒｄｓ　（　Ｐｒｏｃ
．　Ｎａｔ］．　Ａｃａｄ．８ｃｉ．　（　ＵＳＡ　）
　５　２　（　１　９　６　４　）　Ｉ）−　８　３　
５およびＢ１０ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　５　（　１　９　
６　６　）　ｐ−　４　０　６　２　）がカルボキシペ
プチダーゼの架橋結合にグルタルアルデヒドを使用した
ことが最初のことであった。

Ｂｉ　ｓｈｏｐおよびＲｉｃｈａｒｄｓ　（　Ｊ．　Ｍ
ｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　５　３（１９６８）ｐ．４１５〜
４２１）μ室温で結晶ベータラクトグロプリンと１％グ
ルタルアルデヒド水溶液を架橋結合した。結晶は酵素の
電気的性質全研究するために使用した。ＨａＪｓ　（　
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ．Ｊｏｕｒｎ．　８　（　１　９　
６　８　）　ｐ−５　４　９〜５５５）は１２チのグル
タルアルデヒド濃度を使用して、４チ硝酸塩溶液（−８
）の存在で、リゾチーム結晶を栗橋結合した。

Ｄｙｅｒ　，　ＰｈｉｌｌｉｐｊおよびＴｏｗｎｓｅｎ
ｄ（　Ｔｈｅｒｍｏｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ　８　（
　１　９　７　４　）　ｐ．　４　５　６〜４６４）は
グルタルアルデヒドにより架橋結合した結晶力ルポキシ
ベプチダーゼの熱安定性全研究した。彼らは架橋結合は
安定性の増加に導《こと金発見した。Ｔｕｅｃｈｓｅｎ
およびＯｔｔｅｓｅｎ（　Ｃｈａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅ
ｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　４　２　（　１　９　７　７　
）ｐ．　４　０　７〜４２０）は硫酸ナトリウム溶液中
でグルタルアルデヒドにより架橋結合した結晶サブチリ
シンの動力学性？研究した。低分子基質では、結晶の活
性線高いが、たん自分子又はポリペプチド（結晶中に拡
散することができない）のような高分子基質では些細な
ものであった。

Ｗｏｎｇら（　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃ．　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉ
ｏｎｓ　８　０　（　１　９　７　８　）　１）−　８
　８　６　〜８９ａ）は硫酸アンモニウム溶液中で微生
物起源の酸性グロテアーゼとグルタルアルデヒドを架橋
結合した。架橋結合では、硫酸アンモニウムの存在は技
術的忙不利と見做されていた。

ＭｏｒｏｚｏｖおよびＭｏｒｏｚｏｖａ　（　Ｂｉｏｐ
ｏｌｙｍｅｒｓ　’ｌ　Ｑ（１９８１）ｐ．４５１〜４
６７）は２〜６俤グルタルアルデヒド溶液および室温で
２〜１０日の反応時間を使用して結晶リゾチーム、ヘモ
グロビンおよびミオグロビン全架橋結合した。Ｌｅｅら
（阻ｏｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１　４　
（　１　９　８　６　）　ｐ−２０２〜２１０）は２−
メチル−２，４−ペンタンジオール（２５％）の存在で
アルコールデヒドロゲナーゼの結晶とグルグルアルデヒ
ドを架橋結合した。

グルタルアルデヒドにょク不溶性酵素を製造することは
、特にたん白が比較してほとんどリジンを含まない場合
、しばしば困難であることは知られている。この問題は
酵素中に、架橋結合して不溶形を生成できるアルブメン
のようなたん白を混合することによりしばしば回避でき
る（　Ｇ．　Ｂ．Ｂｒｏｕｎ　，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　＃　４　４　（　１９７６
）ｐ−　２　６　３　）。しかし、このような不活性異
種たん白の添加は、架橋結合すべき酵素が結晶である場
合不可能である。現在まで、グルタルアルデヒドのみに
よシ不溶形に結晶を架橋結合できない場タルアルデヒド
により固定化することは既知である。こうしてイソメラ
ーゼは支持体に架橋結合される。このような方法は工業
的に完全に利用される。グルコースイソメラーゼ結晶を
不溶形に架橋結合する試みは文献に記載されていない。

初めの結晶状態を維持し、一方酵素の酵素活性は非常に
高《残こすような方法でグルコースイソメラーぜ結晶を
架橋結合できることがわかった。

最善の処理は初めの酵素と同じ活性を有する酵素を与え
ることである。本発明κよる生成物は酵素を工業的に使
用する場合、存在できる任意の溶媒に溶解しない。架橋
結合結晶酵素に工業的異性化方法でそのままの状態で異
性化カラムに満たし使用することができる。新規架橋結
合結晶酵素にょシ、以前のものよりはるかに小さ《、一
層効率的なカラムで連続的異性化方法七行なうことがで
きる。本発明によりしばしばカラムの大部分の空間全占
有し、コストの大部分の原因となる不活性材料Ｋ結合し
た酵素よりむしろ、純粋酵素を満たしたカラムを使用で
きることは当業者線認めるであろう。

本発明方法では、グルコースイソメラーゼ結晶にグルタ
ルアルデヒドのようなジアルデヒド、アンモニウム化合
物、アミン又はアミノ酸、好まし《はアンモニ９ム塩又
にリジンのような少な《とも１個のアミノ基金含有する
化合物により架橋結合する。いくつかのアミンおよびア
ミノ酸は使用に適する。グルタルアルデヒドの他忙多数
の他のアルデヒドおよび架橋結合剤として既知の、アミ
ノ基と反応する物質は本方法で使用できることは同様Ｋ
明らかである。

本発明方法により製造した固体結晶酵素の活性に非常に
高いか又は遊離酵素のものと実際に同一である。固体結
晶酵素は連続方法でカラム充填剤としてそのまま使用で
きる。非常に安定で、機械的応力に十分に耐える。

所望する場合、架橋結合結晶は化学物理的方法で、例え
ば球形、シート状形、帯状形などの一層大きいボディｔ
形成するためにさらに結合できる〇こうして得九酵素標
品は各種機械的処理κ耐えることができる。

当業者はここに開示した架橋結合方法は、一般にそのア
ミノ酸組成のために、従来架橋結合に貢献することが分
らなかった任意の結晶酵素の不溶性標品の製造に実際に
使用できること金認めるであろう。

以下に、本発明方法を一層詳細に記載する。

ゼの裏造 硫酸アンモニウム（約１０ｉｌｔ量チ）をグルコースイ
ソメラーゼ溶液（乾燥たん白として測定して１〜１０１
ｊＬ量チのイソメラーゼ）に溶解する。溶液はたえず撹
拌しながら約１〜２℃にゆっくり冷却する。こうして本
質的に完全なイソメラーゼの結晶化が起こる（９５チよ
ク多《）。硫酸アンモニウムの代シに、例えば硫酸マグ
ネシウム又は硫酸ナ｝　ＩＪウムを結晶化剤として使用
できる。使用塩の濃度は広い限度内、例えば５〜２５ｉ
量係内で変化できる。結晶化方法Ｋ必要な時間も広い限
度内、例えば１時間〜数日内で変化する。大結晶の鯛造
には、徐々に冷却することが好まし《、イソメラーゼは
できるだけ精製すべきである。結晶化は米国特許第４，
６　９　９，８　８　２号明細書（　Ｖｉａｕｒｉ　）
に記載される。参考のためここ忙挿入する。

結晶化後、結晶マス扛母液から沈澱法又に遠心分離Ｋよ
り分離する。必要の場合、結晶マスは硫酸アンモニウム
、硫酸マグネシウム又は結晶化に適する他の物質の純粋
溶液により洗滌する。架橋結合扛過剰の遊離母液を含ま
ない、高密度形に沈澱又に遠心分離しだ結晶マスで行な
う。これらの結晶マスの代表的活性に１　［］，０　０
　０　ＧＩＵ　／ｇである。乾物として測定して２０〜
６０重量チの純粋酵素たん白を含有する。酵素結晶に乾
燥する場合、その構造金失なうことを注目すべきである
。

架橋結合 結晶マスは結晶がその中に溶解しないように塩溶液にサ
スペンドする。溶液の酵素結晶濃度な例えば、乾物で２
〜１７ｉｉｊｉ％と広《変化できる。

アンモニウム塩は、塩溶液がアンモニウム、又ハ適当な
アミン、又はリジンのようなアミノ酸を初めＫ含有しな
い場合、塩溶液κ添加する。混合物の一は、例えば苛性
ソーダ溶液ヶ添加することＫよク５〜９、好ましくは６
〜８の値に調整する。

酸度にリン酸塩パツファ、例えば０．０５ＭＩＪン酸ナ
トリウムにより、又はアルカリ浴液（苛性ソーダのよう
な）Ｋよる自動的一調整により調整する。

添加アミン又探アミノ酸の有用な濃度に広い限度内で変
化し、他の成分の濃度による。本発明による生成物は混
合物の最終重量の１〜１５チのアミン又扛アミノ酸濃度
により高収敞で製造した。

その後グルタルアルデヒドを架橋結合反応を開始するた
めに混合切に添加する。グルタルアルデヒド量は湿潤酵
素結晶マス基準で１〜４５重量チの広い限度内で変化ｔ
きる。好ましい量に例えば混合物に含有されるアミン濃
度による。一般に、好ましい濃度は乾燥酵素として計算
して３ｇのイソメラーゼにつき６〜４．５ｇのグルタル
アルデヒドに変化する。反応中、溶液はたえず撹拌する
。

温度は２〜２５°Ｃの範囲である。温度は臨界的である
とは思わないが、低温は有利である。反応は、特に高温
では非常に急速に、数分以内に起こる。

低温における反応時間ａ２ｏ＄”までである。

反応後、不溶性結晶は混合物から沈澱又は遠心分離によ
り分離する。結晶マスは水又は適当な塩溶液Ｋサスペン
ドし、再遠心分離することにより洗滌する。洗滌は結晶
マスが触媒として使用するのに十分に精製されるまで数
回反復する。洗滌に関連して微細粒状沈澱は水により洗
滌することが好ましい。

酵素方法で触謀として使用する場合、得た結晶マス全乾
燥することは得策ではない。湿潤結晶マスは何ら特別の
処置することな《少な《とも６ケ月間その活性を十分に
保有する。

最終生成物の特徴 本発明により製造した架橋結合結晶は外観および大きさ
が初めの原科結晶と同じである。結晶の大きさは臨界的
でにない。１００〜２００マイクロメータ又はそれよク
大きい、１＃Ｉ１までの直径を有する結晶は特に工業的
使用Ｋ適する。

本発明による結晶のもつともＭ要な性質にこれらが水、
塩浴液および塘溶液に溶解しないことである。イソメラ
ーゼ結晶が高温でさえグルコースおよびフラクトースの
濃厚溶液Ｋ溶解しないことは特に重要なことである。工
業的方法では、６０℃の温度および４５重量係の塘濃度
を使用することは慣例的である。架橋結合結晶はこのよ
うな条件下で、そして任意の他の糖濃度および高温（１
００°Ｃまで）で不溶性である。架橋結合結晶の活性は
初めの酵素の活性と同じオーダである。

工業的には、これらの活性が不活性キャリア上に固定し
た酵素の活性より何倍も高いことは有利であり、重要で
ある。

酵素を結晶形で架橋結合すると、結晶中で作用し、結晶
を天然に保有する力により酵素は著しい程度まで安定化
することで一層の利益を得る。

出発物質および最終生成物の特徴化に対し使用する方法 イソメラーゼの活性は乾燥酵素標品１ｇにつき国際的グ
ルコースイソメラーゼユニットとして、ＧＩＵと客記し
て測定ちれた。１ユニット（　ＧＩＵ　）は次の条件下
で１マイクロモル／分の割合でグルコース全フラクトー
スに転換できる酵素量全表わ丁：グルコース濃度２．０
モル／！、−７．０および温度６００Ｃｏ 活性測定に対し、０．１〜１ｇの酵素標品（初めの結晶
マス又は完全に洗滌した架橋結合結晶マス）全上記のよ
うな基質浴液（１００ｒｒＬｔ）中に混合した。適当な
時間後、例えば１０分後に溶液のフラクトース含危ｋ測
定し、活性全計算し上記ユニットで表わした。酵素量お
よび反応時間は、測定結果が反応の初めの割合に関連で
きろように形成フラクトース含ｔを全糖含場の５チより
少ないように選択した。出発物質および生成物の乾物含
量は試料を１０５°Ｃで恒ｉまで乾燥することにより通
例方法により測定した。

異性化方法 結晶架橋結合酵素は通例方法でパッチ異性化方法で使用
するのに適する。その場合使用酵素は反応後、例えば濾
過により分離し、所望の場合再使用できる。

しかし、工業的規模では、連続方法として異性化を行な
うことが好ましい。それによって異性化丁ぺき糖溶液は
酵素カラムを通して流丁ことができる。反応時間および
／又は温度を変えることにより、異性化方法は調整が容
易である。酵素は凍結点から１００°Ｃｔ−超える温度
まで、広い範囲の温度内で活性である。低温では、反応
が遅《、塘（グルコースおよびフラクトース）水和物が
結晶化することが欠点であるが、高畠では酵素およびフ
ラクトース双方の分解がかなり急速に起こることが欠点
である。

連続異性化に代表的には、カラムに１口０〜３００マイ
クロメータの架橋結合酵素結晶七満だ丁ような方法で行
なう。カラムの大きさおよび高さに各特別の場合に必要
な容量に従って変えることができる。小カラムでは遺当
な層の高さは５〜５０ｃＲである。温度も広い限度内で
変えることができる。室温は容易に実現できる。微生物
学的汚染が問題となる場合、少なくとも約６０℃に温度
金上げることによりこれらは排除できる。

方法μ線流速を変えることにより調整は容易である。小
カラムでは、線流速Ｆｓ．２〜３０口／分の範囲である
。新鮮酵素に適する保留時間は１〜２分である。圧力に
大気圧である。圧力ロスμ些細である（５０口の層の高
さにつき＜０．２バール）保留時間はカラムの層の高さ
金変えることにより、および流速ＫよＶ調整する。異性
化反応は温度會上げることにより加速することができる
。

通例の工業的方法では、大部分の場合、糖の４０〜４５
ｑ６がフラクトースである糖溶液を得ることが目的であ
る。酵素の活性はカラムの老化につれて減少する場合、
所望レベルに流速全減少することにより維持する。

次例は本発明を一層厳密に例示する。

例　　１ 米国特許第４，６　９　９．８　８　２号明細書に記載
のように１０％硫酸アンモニウム溶液中で結晶させた８
５０ｇのグルコースイソメラーゼ結晶を秤債し、この結
晶ｖｃＰＨ７．４　（Ｚ）　１　０　０　０　Ｔｎｌ硫
酸塩ｇｌ（０．５Ｍリン酸ナトリウムによ夛緩衝した）
を添加した。

混合物は１０℃に冷却した。形成混合物は結晶の損傷を
軽減するために低速（２００〜４　０　０　ｒｐｍ）を
使用するプロペラ攪拌機によシたえず攪拌した。

２５％グルタルアルデビドの１６〇一試料全混合物に添
加した。１時間後、２０−ｅの純水を混合物中に添加す
ることによシ反応を阻止した。攪拌は即座に終結させ、
結晶は２時間容器の底部に沈降させた。母液はデカント
し、別に結晶は流出しないように注意した。２０ノの純
水を再び結晶マス中に混合し、洗滌水はデカントして除
去した。尚別の水忙よる洗滌を行なった。水によ勺６回
洗滌して得た湿潤イソメラーゼ結晶マスはそのまま異性
化試験活性測定および他の試験に使用した。

こうして製造した架橋結合グルコースイソメラーゼは結
晶状態（顕微鏡観察）であった。結晶は水、各橿塩の稀
薄爵液（２〜９０一範囲）、稀酸（１モル／ｆｆｌ）、
１００°Ｃまでの熱水および熱塩ｍ液、および１００℃
までの濃厚グルコース、フラクトースおよびｍ溶液に不
溶性であった。結晶の外観はすべての上記条件下で無変
化のままであったが、架橋結合しなかつえ結晶イソメラ
ーゼは溶解するか、又は無定形沈澱として沈澱した。架
橋結合イソメラーゼの酵素活性は架橋結合しなかった初
めのイソメラーゼ活性の５２％であった。

すなわち初めのイソメラーゼの活性は４　０，０　０　
０ＧＨＪ　／　ｆ／である場合、架橋結合結晶の活性は
乾燥酵素たん白について計算して相当して２　０，０　
０　０ＧＩＵ　／　Ｉよク高かった。

例　２ 例１０ようＫ％次の反応混合物を２５°Ｃで表遺した： 純粋酵素たん白として計算して１４ｇのイソメラーゼ、 １０．ｆの硫酸アンモニウム、 １．５ｇのグルメルアルデヒド（約８ｍｌの２５％溶液
）、 ０．０　５　Ｍリン酸ナトリウムバツファ（溶液の一７
．４） １　０　０　ｒｎｌの水。

１時間の反応時間後、遊離ｍ液は実験室遠心分離機によ
シ１　０　０　０　ｒｐｍで５分遠心分離することによ
り混合物から除去した。得た結晶マスは２００ｍｌの純
水にサスペントし、上記のように再び遠心分離した。水
による洗滌は上記のようにもう一度反復した。湿潤洗滌
結晶マスを回収し、それ以上の研究に使用した。こうし
て製造した結晶マスの活性は初めの結晶マスの活性の４
９％であった。

例６〜８ 例２と同じ初めの組成を有する反応混合物を１０°Ｃで
例１のように製造した。各種長さの反応時間後、反応を
終結させ、結晶マスを洗滌し、その後各結晶マスの活性
を測定した。結果は次の第工責に示す。

第　　１ 表 例６　　　１０分　　　４５ 例４　　　６０分　　　４６ 例５　　　６０分　　　　４９ 例６　　　９０分　　　　４８ 例７　　　２時間　　　　４０ 例８　　　６時間　　　　４０ 反応は非常に急速Ｋ完了し、活性は反応時間が増加した
場合でもほとんど増加しないＣとが結果からわかる。

例９〜１６ 例１のように、次の初めの組成を有する反応混合物を１
０℃で製造した： １４ｇのグルコースイソメラーゼたん白（結晶形の）、 １０ｇの硫酸アンモニウム、 ９０ｄの０．５Ｍリン酸ナトリウム溶液（第ｆｆ表に示
すように…６．０　、７．０　，　８，０　、又は８．
４）グルタルアルデヒド０．１２、０．５、２．０　、
３．５又は４．１　２　ｇ（第■表に示すように）。

反応時間は１時間であった。各形成結晶マス（結晶マス
の初めの活性基準の％）は第■表に示す。

例　　９　　　　　６．０　　　　０。５　　　　　２
　２例１０　　　６．０　　５．５　　　２４例１１　
　　　　７．０　　　　０．１２　　　　６０例１２　
　　７．０　　２．０　　　６５例１５　　　　　７．
０　　　　４．ｉ−２　　　　５９例１４　　　８．０
　　０．５　　　４１例１５　　　８．０　　５．５　
　　４４例１６　　　８．４　　２．０　　　５９グル
タルアルデヒｒ量はかなク広い限度内で変化でき、それ
にも拘らず高活性を得ることができることが結果から明
らかである。酸度は非常に結果に影響する。好ましい一
値は７．０であるが有用な標品は試験した全一範囲内で
、すなわち一６．０〜８．４で得ることができる。

上記例と同じ試験シリーズを行なった。しかし温度は２
°Ｃで、反応時間は１８時間であった。反応混合物の組
成は次の通りであった： 乾燥たん白として計算して６ｇのイソメラーゼ結晶、 媒体として５．０１の水、 ７．５ｇの塩（硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウムおよ
び／又は硫酸アンモニウム、第１表参照）、７．０　Ｋ
　Ｐｉ−Ｉ　Ｅ整用の苛性ソーダ（２ミリ当量より多く
ない、すなわち８０ｒｎ９）、 ０．１　２　５〜２．５ｇのグルタルアルデヒド（第Ｉ
表参照）。

第　　　　厘　　　　　♂吐 塩　（／ｉ）　　　　　　　，／，，ヤー　活性（ＮＨ
４）２８０４　　ＭｇＳＯ４　　Ｎａ２ＳＯ４　アルデ
ヒド　け）例１７　　　　　７．５　　０．５　　０例
１Ｂ　　　　　　　　　７．５　　２．５　　　０例１
９　　　　　　７．５　　　　　０．１２５　　　０例
２０　　　　　　７．５　　　　　　０．５　　　　０
例２１　　　　　　７．５　　　　　　０．７５　　　
０例２２　　　　　　７．５　　　　　　１．２５　　
　０例２５　　０．４５　　７．０５　　　　　０．７
５　　　２０例２４　　０．９０　　６．６　　　　　
　０．７５　　　１９例２５　　１．８　　５．７　　
　０．７５　　２８例２６　　３．７５　　５．７５　
　　　　０．７５　　　４０例２７　　７．５　　　　
　　　　　０．７５　　　６０架橋結合をアンモニウム
塩を使用せずに行なう場合、不溶性結晶は得られない。

グルタルアルデヒｒＯ高濃度によってさえ得られない。

少量のアンモニウム塩でも不昇性結晶の形成を促進する
。

例２８〜６８ 不溶性イソメラーゼ結晶を次の一般的方法に従って各種
窒素化合物を使用して製造した：乾燥たん白として計算
して６ｇの結晶イソメラーゼ、 ７．５ｇの硫酸マグネシウム、 １０ミリモルの窒素化合物（第ＩＶ表参照）、２．５ｇ
のグルタルアルデヒド（１００％として計算）、 温度２°Ｃ１および 反応時間１８時間。

第　　■ 例２８ 例２９ 例６０ 例５１ 例６２ 例６５ 例６４ 例６５ 例６６ 例５７ 例６８ 窒素化合物 リジン アルギニン とスチジン グルタミン ロイシン インロイシン プロリン メチオニン フエニルアラニン トリプトファン ベタイン 表 址（ｇ）　　　活性（％） １．８３　　　　　　８０ １．７４　　　　　　１７ １．５５　　　　　　２６ １．４６　　　　　　１８ １．３１　　　　　　２１ １．３１　　　　　　１８ １．１５　　　　　　１０ １．４９　　　　　　２７ １．６５　　　　　　１７ ２．０４　　　　　　４４ １．１７　　　　　２５ 多数の異るアミンは架橋結合方法に関し同じ効果を有す
ることが結果からわかる。

不溶性イソメラーゼ結晶を次の一般的教示に従って異る
用量のグルタルアルデヒドおよびリジンによシ製造した
： 乾燥たん白として計算して６ｇの結晶イソメラーゼ、 ７．５ｇの硫酸マグネシウム、 ０．４７〜２．６４　ｇのリゾン（第Ｖ表参照）、苛性
ソーダ溶液により８．０に…調整、０．５〜１．２　５
　ｇのグルタルアルデヒド（１００チ、第Ｖ表参照）。

溶液は１８時間２℃で反応させた。

第　　Ｖ 表 例５９　　　０．５　　　　　０．４７　　　６７例４
０　　　０．５　　　　　０．９４　　　７７例４１　
　　　　０，５　　　　　　　　Ｌ４０　　　　６０例
４２　　　　　０．７５　　　　　　　０．４７　　　
　７２同４６　　　０．７５　　　　　０．９４　　　
８３列４４　　　　　０．７５　　　　　　　１．４０
　　　　９２例４５　　　　　０．７５　　　　　　　
１．８７　　　　８１例４６　　　　　０．７５　　　
　　　　２．６４　　　　７５例４７　　　　　１．２
５　　　　　　　０．４７　　　　６８例４８　　　　
　１．２５　　　　　　　０．９４　　　　７８例４９
　　　　１．２５　　　　　１．４０　　　９０例５０
　　　　　１，２５　　　　　　　１．８７　　　　１
０２９１Ｊ５　１　　　　　１．２５　　　　　　　２
．５４　　　　１００リジンおよびグルタルアルデヒｒ
の用量間の比は不溶性結晶の形成に影響する、すなわち
、最適リジン用量レベルは各グルタルアルデヒド用量レ
ベルで知り得ることが結果からわかる。

例５２〜５７ イソメラーゼ結晶は次の一般的教示に従って硫酸アンモ
ニウムおよびリジン溶液中で架橋結合した： １０％硫酸アンモニウム中の１０ｇのイソメラーゼ結晶
（すなわち、乾物として計算して６．７２ｙの精製イソ
メラーゼたん白、０．６．５ｇの硫酸アンモニウム、お
よび５．６　５　ｇの水）、５ｇの硫酸アンモニウム、 ４５ｇの水、 １．２　５　ｇのグルタルアルデヒド、１００％として
計算、 Ｏ〜６ｇのリジン（第■茂参照）。

すべての反応成分の一は攪拌前に苛性ソーダによＩ）８
．０に調整した。

混合物は６℃で１８時間攪拌した。

例５２ 例５６ 例５４ 例５５ 例５６ 例５７ 第■表 リジン（ｇ） ０．６ ０．６ １．２ １．８ ６．０ リジンは架橋結合の収量に非常κ有利に影響することが
結果からわかる。硫酸アンモニウムは、たとえ硫酸アン
モニウム単独で満足できる結果を得るとしても、りＡ利
用できる場合の結果より大きい効果を有しない。

イソメラーゼおよびリジンの量は一定に保持し、他の成
分は第■表に示すように変動した二乾燥形で計算して６
ｇのグルコースイソメラーゼ、 １ｇのリジン、 ０．０　１　ｇの苛性ソーダ（溶液の−８）。

反応時間は１８時間で、温度は２℃であった。

例５８ 例５９ 例６０ 例６１ 例６２ 例６６ 例６４ 例６５ 例６６ 例６７ 例６８ 例６９ グルタル−　　　ＭｇＳＯ４ アルデヒド＜９＞　　＜Ｉ） ０．５ ０．５ ０．５ ０．５ ０．５ ０．５ １．２５ １．２５ １．２５ １．２５ １．２５ １．２５ ２．１ ２．７ ４．２ ５．６ １０．２ １６．２ ２．１ ２．７ ４．２ ５．６ １０，２ １６．２ 水 ＜ｇ＞ ？１．９ １５．６ ２６．８ ３２．７ ５７．８ ９１．８ １１．９ １５．６ ２６．８ ５２．７ ５７■８ ９１．８ 反応溶液 計（ｇ） １８．５ ２２．５ ６２．５ ４２．５ ７２．５ １１２．５ １９．２５ ２５．２５ ５５．２５ ４３．２５ ７５．２５ １１３．２５ 活性 （％） 反応混合物の濃度は最終結果にほとんど効果を有しない
ことが結果からわかる。反応成分〔酵素、リジン（又は
アミン）およびグルタルアルデヒｒ〕間の重量比は非常
に犬さい効果を有する。

例７０ 水によシ洗滌した１ｇの架橋結合グルコースイソメラー
ゼマス（例５６からのもの、０．４　！ｉ乾物）を−７
．０に調整した１００ｙの４０％グルコース高液中に混
合した。混合物は６０°Ｃでたえず攪拌した。試料は周
期的〈混合物から採取し、試料のフラクトース含量は偏
光計により測定し、グルコース含量はへキソキナーゼに
より酵素的に測定した。溶液のフラクトース含量は６時
間中に溶液の全糖含量（グルコース＋フラクトース＝１
００％）に対し４２％に上昇した。試験後、架橋結合イ
ソメラーゼを混合物から濾過によシ分離し、水で洗滌し
た。回収した結晶マスはその活性および乾燥含債に対し
試験し、活性酵素は全く溶解しないか又は試験で消失し
ないことがわかった。試験は同じ酵素バッチについて数
回反復することができた。

例７１ 例１記載のように裂遺した結晶マスは微粒状沈澱を除去
するために洗滌し、結晶物質は水にサスペンドしデカン
ト（６回）することによシ処理中に微細に圧砕した。平
均粒度１００マイクロメータのこうして得た大結晶画分
は直径２．６　ｎおよび高さ５ｃｊｊ１を有する円筒状
反応器に充填した。次の組成を有するグルコース溶液を
６０°Ｃでポンプによシカラムを通した： ５８２ｇのグルコース１水和物 ５９０ｇの水 ０．５　７　９のＭｇＥ３０，・７Ｈ２００．１　９　
ｇのＮａＨＳＯ３ ｐ［ｌ　６−９　（　Ｉ　Ｍ　ＮａＯＨ　，　１―以下
の消費）。

試験の初めには流速は１１プ／分であった。それによシ
カラムから排出するｍ液のフラクトース含菫は全糖含量
基準で４２％に上った。試験は２００時間継続し、その
後流速は初めの転換（フラクトース含！４２％）を維持
するために９ｍｌｌ分に低減しなければならなかった。

従って酵素の活性はこの期間中初めの値から８１％に低
下した。

結晶マスの減少又はｍ解は試験中観察できなかつだ。

水によシ洗滌した４　５．４　２　ｇの湿潤活性イソメ
ラーゼマス（例６７の方法によシ製造、乾物基準でｉ　
ｏ．ｏ　ｇの酵素）を秤量した。

例７１に記載のように製造した２００ｄのグルコースｍ
ｆｆ．を結晶マス上に注いだ。混合物は６００Ｃで異る
時間振盪し、次に濾紙ディスクを通して混合物を濾過し
た。濾紙上に残る結晶マスは水で注意深く洗滌し、すべ
ての可溶性物質を除去した。

結晶マスは１０５℃でインキュベータ中で乾燥し、秤菅
した。観察によシ次の第Ｖｌ表を得た：第■表 攪拌時間 例７２　　　１０分 例７３　　　　２時間 例７４　　　　４時間 ｆ！ＡＪ７５　　　　　６時間 例７６　　　２１時間 試験後の結晶マスの 乾燥重量　　（ｇ） ９．９ １１．０ １０．９ １０．７ １０．４ 本発明方法により製造した架橋結合結晶イソメラーゼは
通例の工業的操作条件下で基質に峙解しないことが結果
からわかる。

例７７ 架橋結合結晶イソメラーゼ、ＤｇＡＥセルロースに結合
したイソメラーゼおよび初めの遊離可溶性イソメラーゼ
を同じ化学的および物理的条件下に保持することによシ
相互に比較した。各酵素試料は適度の短時間すなわち１
０〜６０時間に測定町能な程度にその活性を失なうよう
に条件を選択した。各酵素標品の５ｇ部分を１　５　０
　ｍｌの０．０　５　Ｍリン酸ナトリウムバツファ（ｐ
Ｈ６．０）中に混合し、これはさらに１．５ミリモル／
　１ＭｇＳＯ，および２ミリモル／−ｅＮａＨＳＯＳを
含有した。混合物は７０゜Ｃで数時間振盪した。試料は
周期的に混合物から採取し、残留イソメラーゼの活性を
試料から測定した。各酵素試料の半減期（すなわち酵素
活性が初めの値のＶ２に低下する時間）を活性減少を基
準κして測定した。結果は次の第■表に示す。

第■表 酵素試料　　　　　　　　　　　　　半減期（時間）初
めの可溶性イソメラーゼ　　　　　　！・２ＤＥＡＥセ
ルロースに結合したイソメラーゼ　　６．６架橋結合結
晶イソメラーゼ　　　　　　　　　１９．０架橋結合結
晶は遊離酵素又は既知方法で固定した酵素よシ実質的に
すぐれた酵素活性を保有することが結果からわかる。

例７８ 架橋結合結晶イソメラーゼおよびＤｉｇセルロースに結
合したイソメラーゼは例７１記載と同様に円筒状力ラム
反応器に充填した。グルコース溶液は連続的にポンプで
カラムを通して送った。グルコース溶液は一を６．０に
調整したことを除いて例７１と同じ組成を有した。カラ
ムの温度は試験中６０°Ｃであった。カラムに含まれる
酵素活性は流速および流れる溶液のフラクトース含量を
基準にして計算した。結果は次の第Ｘ表に示す。

第　Ｘ　　表 架倫結合イソメラーゼ結晶マス　　　　　１２０ＤＥＡ
Ｒセルロースに結合したイソメラーゼ　６６架僑結合結
晶は顕著に酵素活性を保有することが結果からわかる。

架橋結合結晶と先行技術の固定化イソメラーゼのカラム
法における比較 代表的工業的に使用するイソメラーゼの試料および本発
明の架橋結合結晶を垂直の実験室力ラム中に充填した。

結晶の架橋結合は例５１記載のように行なった。円筒状
カラムの内径は２．７１１で、高さは５０Ｃｍであった
。カラムは６　０　’Ｃに温度調節した水ジャケットを
有した。カラムの下端は酵素顆粒をカラムに保持し、糖
溶液を流過させるためにスクリーンを有した。乾物で各
酵素の２０ｇを個々・のカラムに注いだ。例７１の組成
金有するダルコース基質をカラムを通１，２て調整可能
な実験室ポンプによりポンプ輸送した。基質の温度は６
０°ＯＫ調整した。カラムを通して出る生成物をフラク
トースおよびグルコースについて分析した。

基質ｂＩＬ速が同じである場合、各異る酵素標品は異る
フラクトース含鎗を生成することを観察した。

各カラムの流速は各生成物のフラクトース含雷が全糖（
グルコース＋フラクトース）の４５％１じになるまで試
行錯誤によシ個々１に調整した。次表は４５％フラクト
ースを生成するために酵素および相当する流速を表示す
る。

第Ｘ【表 ８１　　架橋結合イソメラーゼ結晶、　　　　　　１０
９８直径９００〜１１００マイクロメータ 市販酵素を含むカラムの流速は本工業的実施で認められ
るきわめて代表的なものを表わす。架橋結合イソメラー
ゼ結晶を含むカラムの流速は実質的に一層高い。工業的
実際では、架橋結合結晶の高活性は本質的に一層小さい
酵素力ラム使用の結果となう、このように投資および加
工コストを節約できる。

ＣＯの市販裏品 （組成物）　ＳＷＥＥ’ｒＺＹＭＥ　Ｔ　，　ＮｏｖＯ
　Ｃｏデ７−ｑ−ク　１９７の市販製品 （４且成屠汐）ＴＡＫＡＳＷＥＥＴ，　　Ｍｉｌｅｓ−
ＫａｌｉＣｈｅｍ１ｅの市販製品 架橋結合イソメラーゼ結晶、直径 １００〜２００マイクロメータ 架債結合イソメラーゼ結晶、 直径５００〜６００マイクロメータ

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）可溶性グルコースイソメラーゼ結晶を架橋結合に
   より水−不溶形に転換することを特徴とする、グルコー
   スイソメラーゼ結晶。
2. （２）１〜１０のｐＨ範囲内で稀酸およびアルカリ性溶
   液に不溶性である、請求項１記載のグルコースイソメラ
   ーゼ。
3. （３）グルコース、フラクトースおよび他の糖の水溶液
   に不溶性である、請求項１又は２記載のグルコースイソ
   メラーゼ。
4. （４）結晶は高温においてさえ糖溶液に不溶性である、
   請求項３記載のグルコースイソメラーゼ。
5. （５）その天然基質、グルコース、フラクトースおよび
   キシロースの異性化を、これらの糖の濃厚溶液において
   さえ触媒する、請求項１記載のグルコースイソメラーゼ
   。
6. （６）結晶は化学的又は物理的に一層大きいボディ、球
   状、シート状、帯状又は同様の組み合せに結合させる、
   請求項１〜５記載のグルコースイソメラーゼ。
7. （７）水−不溶性の、実質的に純粋の、架橋結合結晶グ
   ルコースイソメラーゼを含有することを特徴とする、フ
   ラクトースの連続生産に有用な反応器。
8. （８）水−不溶性架橋結合結晶酵素の製造方法において
   、 （ａ）結晶イソメラーゼサスペンションにジアルデヒド
   を添加し、その場合ジアルデヒドの添加前又は架橋結合
   反応中、アンモニウム塩、アミン又はアミノ酸のような
   少なくとも１個のアミノ基を含有する化合物をそこに添
   加し、そして （ｂ）架橋結合結晶を水又は何か他の液体により洗滌し
   て試薬残留物を除去することを特徴とする、上記水−不
   溶性架橋結合結晶酵素の製造方法。
9. （９）酵素はグルコースイソメラーゼである、請求項８
   記載の方法。
10. （１０）ジアルデヒドはグルタルアルデヒドである、請
    求項８記載の方法。
11. （１１）グルタルアルデヒド量は０．４〜８重量％であ
    る、請求項８又に９記載の方法。
12. （１２）架橋結合結晶イソメラーゼは基質のその異性体
    への転換を触媒するために使用することを特徴とする、
    基質の異性化方法。
13. （１３）基質はグルコース、フラクトース又はキシロー
    スであり、イソメラーゼはグルコースイソメラーゼであ
    る、請求項１２記載の方法。
14. （１４）グルコース含有溶液を水−不溶性架橋結合結晶
    グルコースイソメラーゼを含有する反応器を流過させる
    ことを特徴とする、フラクトースの連続製造方法。