DK169039B1 - I vand uopløselig tværbundet krystallinsk glucoseisomerase og fremgangsmåde til fremstilling deraf samt fremgangsmåder til isomerisering af et subtra t og til kontinuerlig fremstilling af fructose under anvendelse heraf - Google Patents

Description

i DK 169039 B1

Opfindelsen angår en hidtil ukendt i vand uopløselig tværbundet krystallinsk glucoseisomerase og en fremgangsmåde til fremstilling deraf ved tværbinding af det krystallinske vandopløselige enzym.. Opfindelsen angår 5 også en fremgangsmåde til isomerisering af et substrat og en fremgangsmåde til kontinuerlig fremstilling af fructose under anvendelse af den i vand uopløselige tværbundne krystallinske glucoseisomerase.

10 Anvendelsen af immobiliserede enzymer, dvs. enzymer bundet til en fast bærer, i kontinuerligt drevne reaktionsbeholdere er en teknik, som i stigende grad foretrækkes, da den muliggør besparelser på enzymomkostninger, såvel som på oprensning af slutproduktet. Omdannelsen af glu-15 cose til fructose med en immobiliseret glucoseisomerase er en proces, hvor en sådan procedure benyttes.

Enzymer er i almindelighed vandopløselige, hvilket nødvendiggør anvendelse af en immobiliseringsteknik ved en 20 kontinuerlig proces. Enzymet skal være bundet til en fast fase ved en metode, som forhindrer, at det opløses i den vandige fase, medens dets aktivitet bibeholdes. Der er foreslået forskellige teknikker til at forbinde enzymer med faste bærere, hvorved enzymet absorberes, bindes co-25 valent, tværbindes eller mikroindkapsles. Alternativt kan hele den enzymdannende mikroorganisme bindes til en fast fase. En god opsummering af sådanne teknikker præsenteres i, f.eks. Moo-Young, M. (red.) Comprehensive Biotechnology, 2, Pergamon Press, London 1985, p. 191-211.

30

Ved kendte processer bindes enzymet til et separat fremstillet bæremateriale, der i sig selv kan være fordelagtigt for substratets kemiske kinetik eller strømningsforhold. Imidlertid er bærematerialet i de fleste tilfælde 35 dyrere end det enzym, der fungerer som katalysator, især ved massefremstillingsprocesser i stor skala, såsom de processer, der anvendes i sukkerindustrierne. Alternativt DK 169039 B1 2 kan enzymet immobiliseres ved at tværbinde det med en inert komponent såsom gelatine. Enzymet, der i den kendte teknik fungerer som katalysator, udgør under alle omstændigheder kun en brøkdel, almindeligvis under 5%, sædvan-5 ligvis 1 til 2%, af vægten og volumenet af det i hver særlig proces anvendte materiale.

Teknisk har tværbinding med glutaraldehyd været af stor betydning, f.eks. ved immobilisering af glucoseisomerase.

10 Som det vides, er glutaraldehyd godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration til immobilisering af enzymer, der skal anvendes ved fødemiddelprocesser.

Andre teknikker, som har været anvendt, omfatter binding 15 til ionbyttere og absorption til en fast bærer. Et eksempel på en sådan anvendelse kan findes i US patentskrift nr. 4 699 882 (K. Visuri, Stabiliseret glucoseisomerase). Imidlertid er den ved denne kendte teknik anvendte bærer relativt dyr, og teknikken kræver en stor reaktionsbehol-20 der

Immobilisering af enzymer til industriel brug medfører omkostninger, som ikke nødvendigvis er forbundet med det anvendte enzym, de omfatter omkostninger forårsaget af 25 konstruktionen af procesapparaturet og fabrikslokalerne, udgifter til erhvervelse (generhvervelse) af bærestof, udgifter til bortskaffelse af inaktiveret enzymmateriale, arbejdsomkostninger forårsaget af tømning og fyldning af reaktionsbeholdere (eller af regenerering af bæreren), 30 sekundære omkostninger forårsaget af reaktionsbeholdernes langsomhed. Som en konsekvens af lange retentionstider kan ikke-enzymatiske ufordelagtige bireaktioner ofte forekomme, især ved fremstilling af fructose.

35 Den videnskabelige litteratur omfatter flere eksempler på tværbinding af krystallinske enzymer ved hjælp af glutaraldehyd. Ved disse undersøgelser er enzymkrystaller ble- DK 169039 B1 3 vet tværbundet med henblik på basale forskningsformål. Enzymkrystallers struktur er ofte så svag, at krystallerne ikke kan holde til den ved røntgendiffraktionsundersøgelser anvendte stråle. Med glutaraldehyd kan de imidler-5 tid ofte stabiliseres til sådanne formål. Endvidere er krystaller blevet tværbundet med det formål at undersøge stabilitet og katalysekinetik. I tilfælde hvor tværbindingen af krystaller har været velykket, har kun glutaraldehyd været anvendt, og mediet har bestået af en opløs-10 ning, hvori hvert særligt enzym opretholdes på krystallinsk form. Det lader til, at et uopløseligt krystal er blevet dannet direkte ved en reaktion mellem glutaralde-hydet og enzymproteinet. Quiocho og Richards (Proc. Natl. Acad Sci. (USA) 52 (1964) p. 833 og Biochemistry 5 (1966) 15 p. 4062) var de første til at bruge glutaraldehyd ved tværbinding af carboxypeptidaser. Bishop og Richards (J. Mol. Biol. 33 (1968) p. 415-421) har tværbundet krystallinsk Ø-lactoglobulin med en 1% vandig opløsning af glutaraldehyd ved stuetemperatur. Krystallerne blev brugt 20 til at undersøge enzymets elektriske egenskaber. Haas (Biophysic. Journ. 8 (1968) p. 549-555) har tværbundet lysozymkrystaller i nærvær af en 4% natriumnitratopløs-ning (pH 8), under anvendelse af en glutaraldehydkoncen-tration på 12%.

25

Dyer, Phillips og Townsend (Thermochimica Acta 8 (1974) p. 456-464) har undersøgt termostabiliteten af en krystallinsk carboxypeptidase tværbundet med glutaraldehyd.

De har fundet, at tværbinding fører til forhøjet stabi-30 litet. Tuechsen og Ottesen (Carlsberg Res. Commun. 42 (1977) p. 407-420) har undersøgt de kinetiske egenskaber af en krystallinsk subtilisin tværbundet med glutaraldehyd i en natriumsulfatopløsning. Med lavmolekylære substrater var krystallernes aktivitet høj, hvorimod den 35 ikke var signifikant med højmolekylære substrater som proteinmolekyler eller polypeptider (som ikke kan diffundere ind i krystallerne).

DK 169039 B1 4

Wong et al. (Biochem. and Biophysic. Research Communications 80 (1978) p. 886-890) har tværbundet sur protease af mikrobiel oprindelse med glutaraldehyd i en ammonium-sulfatopløsning. Ved tværbindingen ansås tilstedeværelsen 5 af ammoniumsulfat for teknisk ugunstigt.

Morozov og Morozova (Biopolymers 20 (1981) p. 451-467) har tværbundet krystallinsk lysozym, hæmoglobin og myoglobin under anvendelse af 2-6% glutaraldehydopløsninger 10 og en reaktionstid på 2-10 dage ved stuetemperatur. Lee et al. (Biorganic Chemistry 14 (1986) p. 202-210) har tværbundet alkoholdehydrogenasekrystaller med glutaraldehyd i nærvær af 2-methyl-2,4-pentandiol (25%).

15 Det er kendt, at det ofte er svært at danne uopløseligt enzym ved hjælp af glutaraldehyd, især hvis proteinet indeholder relativt lidt lysin. Dette problem omgås ofte ved i enzymet at blande et protein, såsom æggehvide, der kan tværbindes til dannelse af en uopløselig form (G.B.

20 Broun, Methods in Enzymology, 44 (1976) p. 263). Tilsætningen af et sådant inert fremmed protein er imidlertid ikke muligt, når det enzym, der skal tværbindes, er krystallinsk. Indtil nu har der, i tilfælde hvor det ikke er muligt at tværbinde et krystal til uopløselig form ved 25 hjælp af glutaraldehyd alene, ikke været nogen måde at tværbinde på.

Som nævnt ovenfor er det kendt at immobilisere glucose-isomerase med glutaraldehyd. Glucoseisomerase tværbindes 30 derved til et understøttelsesmateriale. Sådanne fremgangsmåder udnyttes fuldt ud i industrien. Forsøg på at tværbinde glucoseisomerasekrystaller til uopløselig form er ikke beskrevet i litteraturen.

35 Man har nu fundet, at det er muligt at tværbinde glucoseisomerasekrystaller på en sådan måde, at den oprindelige krystallinske tilstand opretholdes, medens enzymets DK 169039 Bl 5 enzymatiske aktivitet forbliver meget høj, idet de bedste procedurer giver den samme aktivitet som det originale enzym. Produktet ifølge opfindelsen er ikke opløseligt i nogen opløsningsmidler, som måtte være til stede, når 5 enzymet anvendes teknisk. Tværbundet krystallinsk enzym kan anvendes som sådant til at fylde en isomerisations-kolonne i en teknisk isomerisationsproces. Ved hjælp af det hidtil ukendte tværbundne krystallinske enzym er det muligt at udføre en kontinuerlig isomerisationsproces i 10 kolonner, der er meget mindre og mere effektive end tidligere. Det vil forstås af fagmanden, at den foreliggende opfindelse tillader brug af en kolonne fyldt med rent enzym, frem for enzym bundet til et inert materiale, som ofte optager størstedelen af kolonnens rum, og udgør 15 størstedelen af dens omkostninger.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen tværbindes glucose-isomerasekrystaller ved hjælp af et dialdehyd, såsom glu-taraldehyd, og en forbindelse indeholdende mindst én ami-20 nogruppe, såsom en ammoniumforbindelse, amin eller aminosyre, fortrinsvis et ammoniumsalt eller lysin. Adskillige aminer og aminosyrer er egnede til brugen. Ud over glu-taraldehyd kan mange andre dialdehyder og stoffer, som reagerer med aminogrupper, kendt som tværbindende reagen-25 ser, anvendes ved fremgangsmåden.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af den i vand uopløselige tværbundne krystallinske glucoseisome-rase er særegen ved det i krav 7's kendetegnende del an-30 givne.

Aktiviteten af en i vand uopløselig tværbundet krystallinsk glucoseisomerase fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er meget høj eller praktisk taget den 35 samme som for det fri enzym. Tværbundet krystallinsk glu coseisomerase kan anvendes som sådan som kolonnefyldmate-riale ved en kontinuerlig proces. Den er yderst stabil og DK 169039 B1 6 modstår mekanisk påvirkning godt.

Om ønsket kan tværbundne krystaller yderligere sammenbindes til dannelse af større legemer, f.eks. i sfæriske, 5 arklignende, båndlignende eller lignende former, på kendte kemisk-fysiske måder. Således opnåede enzympræparater kan modstå forskellige mekaniske behandlinger.

I det følgende beskrives fremgangsmåden ifølge opfindel-10 sen mere detaljeret.

Fremstilling af krystallinsk glucoseisomerase anvendt som råt materiale 15 Ammoniumsulfat (ca. 10 vægt-%) opløses i en glucoseiso-meraseopløsning (1-10 vægt-% isomerase bestemt som tørt protein). Opløsningen afkøles langsomt til ca. 1-2 °C under konstant omrøring. Derved sker en i det væsentlige fuldstændig udkrystallisering af isomerasen (over 95%). I 20 stedet for ammoniumsulfat kan for eksempel anvendes magnesiumsulfat eller natriumsulfat som krystallisationsmiddel . Koncentrationen af de anvendte salte kan variere inden for vide grænser, f.eks. fra 5 til 25 vægt-%. Den for krystallisationsprocessen nødvendige tid varierer 25 også inden for vide grænser, f.eks. fra én time til adskillige dage. Ved fremstillingen af store krystaller foretrækkes det at anvende gradvis afkøling, og glucose-isomerasen bør være så ren som muligt. Krystallisationen er beskrevet i US patentskrift nr. 4 699 882 (Visuri).

30

Efter krystallisation adskilles krystalmassen fra moderluden ved sedimentering eller centrifugering. Om nødvendigt vaskes krystalmassen med rene opløsninger af ammoniumsulfat, magnesiumsulfat eller et andet stof egnet til 35 krystallisation. Tværbinding udføres på en krystalmasse, som ikke indeholder nogen fri overskydende moderlud, og som sedimenteres eller centrifugeres til kompakt form. En DK 169039 B1 7 typisk aktivitet af sådan krystalmasse er 10 000 GlU/g.

Den indeholder fra 20 til 30 vægt-% rent enzymprotein bestemt som tørstof. Det skal bemærkes, at enzymkrystaller mister deres struktur, hvis de tørres.

5

Tværbinding

Krystalmasse suspenderes i en saltopløsning, således at krystallerne ikke opløses deri. Koncentrationen af enzym-10 krystallerne i opløsningen kan variere bredt, f.eks. fra 2 til 17 vægt-% på tørstofbasis.

Der sættes ammoniumsalt til opløsningen, dersom saltopløsningen ikke fra begyndelsen indeholder ammonium eller 15 en passende amin eller aminosyre, såsom lysin. Blandingens pH justeres til en værdi mellem 5 og 9, fortrinsvis mellem 6 og 8, ved tilsætning af for eksempel natriumhydroxidopløsning. Surhedsgraden kontrolleres med en phos-phat-puffer, f.eks. 0,05 M natriumphosphat, eller ved 20 automatisk pH-justering med en alkalisk opløsning (såsom natriumhydroxid). Den nyttige koncentration af den tilsatte amin eller aminosyre varierer inden for vide grænser og afhænger af koncentrationen af de andre bestanddele. Produktet ifølge opfindelsen er blevet fremstillet 25 med et højt udbytte med amin- eller aminosyrekoncentra-tioner på 1-15% af blandingens slutvægt.

Glutaraldehyd sættes derefter til blandingen for at starte tværbindingsreaktionen. Mængden af glutaraldehyd kan 30 variere inden for et bredt område, fra 1 til 45 vægt-% beregnet på våd enzymkrystalmasse. Den foretrukne mængde afhænger for eksempel af koncentrationen af den i blandingen indeholdte amin. Almindeligvis varierer den foretrukne koncentration fra 3 til 4,5 g glutaraldehyd 35 pr. 3 g glucoseisomerase beregnet som tørt enzym. Under reaktionen omrøres opløsningen kontinuerligt, temperaturen ligger i området fra 2 til 25 °C. En lav temperatur DK 169039 B1 8 er fordelagtig, skønt temperaturen ikke synes at være kritisk. Reaktionen kan ske meget hurtigt, på få minutter, især ved højere temperaturer. Ved en lav temperatur kan reaktionstiden være op til 20 timer.

5

Efter reaktionen skilles de uopløselige krystaller fra blandingen ved sedimentering eller centrifugering. Krystalmassen vaskes ved suspendering i vand eller en passende saltopløsning og ved gencentrifugering. Vaskningen 10 gentages flere gange, indtil krystalmassen er tilstrækkelig ren til at blive brugt som katalysator. I forbindelse med vaskningen foretrækkes det også at bortskylle finkornet præcipitat.

15 Det er ikke tilrådeligt at tørre den opnåede krystalmasse, hvis den skal bruges som katalysator i en enzymatisk proces. Våd krystalmasse bibeholder sin aktivitet fuldt ud i mindst 6 måneder uden nogen specielle tiltag.

20 Karakterisering af slutproduktet

Tværbundne krystaller fremstillet ifølge opfindelsen ligner de oprindelige råmateriale-krystaller i udseende og størrelse. Størrelsen af krystallerne er ikke kritisk.

25 Krystaller med en diameter på 100 til 200 mn eller derover, op til 1 mm, er særligt egnede til teknisk anvendelse.

Den vigtigste egenskab ved krystallerne ifølge opfindel-30 sen er, at de er uopløselige i vand, saltopløsninger og sukkeropløsninger. Det er især vigtigt, at glucoseisome-rasekrystallerne ikke opløses i koncentrerede opløsninger af glucose og fructose, selv ved høje temperaturer. I industrielle processer er det almindeligt at anvende en 35 temperatur på 60 “C og en sukkerkoncentration på 45 vægt-%. Tværbundne krystaller er uopløselige under sådanne betingelser og ved enhver anden sukkerkoncentration og DK 169039 B1 9 højere temperaturer (op til 100 °C). Aktiviteten af tvær-bundne krystaller er af samme størrelsesorden som for det oprindelige enzym. Teknisk er det en fordel og af vigtighed, at deres aktivitet er mange gange højere end aktivi-5 teten af et enzym immobiliseret på en inert bærer.

Ved at tværbinde et enzym på krystallinsk form opnås en yderligere fordel ved, at enzymet i betydelig grad stabiliseres af kræfter, der virker i krystallet og naturligt 10 holder krystallet sammen.

Metoder anvendt til karakterisering af udgangsmaterialet og slutproduktet 15 Glucoseisomerasens aktivitet blev bestemt som internatio nale glucoseisomerase-enheder, forkortet GIU, pr. 1 g tørret enzympræparat. En enhed (GIU) svarer til en enzymmængde, der kan omdanne glucose til fructose med en hastighed på 1 μΐηοΐ/min under følgende betingelser: glucose-20 koncentration 2,0 mol/liter, pH 7,0 og temperatur 60 °C.

Med henblik på aktivitetsbestemmelse blev 0,1 til 1 g af et enzympræparat (oprindelig krystalmasse eller grundigt vasket tværbundet krystalmasse) blandet ind i en sub-25 stratopløsning (100 ml) således som beskrevet ovenfor. Efter et passende tidsrum, f.eks. 10 min, blev opløsningens fructoseindhold bestemt, og aktiviteten blev beregnet og udtrykt i ovennævnte enheder. Enzymmængde og reaktionstid valgtes således, at den dannede fructose var 30 under 5% af det samlede sukker indhold, således at måleresultatet ville angå begyndelsesreaktionshastigheden. Tørstofindholdet af udgangsmaterialet og produktet blev bestemt ved en konventionel metode ved at tørre prøven ved 105 °C til konstant vægt.

Isomeriseringsproces 35 DK 169039 B1 10

Krystallinsk tværbundet enzym egner sig til brug på en konventionel måde i en batch-isomeriseringsproces, hvorved det brugte enzym fraskilles efter reaktionen, f.eks. ved filtrering, og det kan om ønsket genanvendes.

5 I industriel målestok foretrækkes det imidlertid at udføre isomeriseringen som en kontinuerlig proces, hvorved sukkeropløsningen, der skal isomeriseres, får lov at løbe gennem en enzymkolonne. Ved at variere retentionstiden 10 og/eller temperaturen er isomeriseringsprocessen let at justere. Enzymet er aktivt inden for et vidt temperaturområde, fra frysepunktet op til temperaturer over 100 °C.

Ved lave temperaturer er det en ulempe, at reaktionen er langsom, og sukkerhydraterne (glucose og fructose) kry-15 stalliserer, hvorimod der ved høje temperaturer foregår betydeligt hurtigere nedbrydning af både enzym og fructose.

Kontinuerlig isomerisering udføres typisk på en sådan 20 måde, at kolonnen fyldes med tværbundne enzymkrystaller på 100-300 tun. Størrelsen og højden af kolonnen kan varieres i henhold til den krævede kapacitet i hvert særligt tilfælde. I en lille kolonne er en passende lejehøjde 5-50 cm. Temperaturen kan også varieres inden for vide 25 grænser. Stuetemperatur er let realiserbar. Hvis mikrobiologiske kontamineringer udgør et problem, kan de elimineres ved at hæve temperaturen til mindst ca. 60 °C.

Processen er let at kontrollere ved at variere den line-30 ære gennemløbshastighed. Med en lille søjle ligger den lineære gennemløbshastighed på 2-30 cm/min. En passende retentionstid for frisk enzym er 1-2 min. Trykket er atmosfæretryk. Tryktab er ikke signifikant (<0,2 bar pr. 50 cm lejehøjde). Retentionstiden justeres ved at variere 35 kolonnens lejehøjde og gennemløbshastighed. Isomerisa-tionsreaktionen kan accelereres ved at hæve temperaturen.

DK 169039 B1 11

Ved en konventionel industriel proces er målet i de fleste tilfælde at opnå en sukkeropløsning, hvori 40-45% af sukkeret er fructose. Når enzymets aktivitet nedsættes med ældning af kolonnen, opretholdes det ønskede niveau 5 ved at reducere gennemløbshastigheden.

De følgende eksempler belyser opfindelsen nærmere: EKSEMPEL 1 10 850 g glucoseisomerase-krystalmasse krystalliseret i en 10% ammoniumsulfatopløsning som beskrevet i US patentskrift nr. 4 699 882 blev vejet, og til krystalmassen sattes 1000 ml af en 10% ammoniumsulfatopløsning (pH 7,4, 15 pufret med 0,5 M natriumphosphat). Blandingen blev afkølet til 10 °C. Den herved fremkomne blanding omrørtes konstant med en propelomrører ved lav hastighed (200-400 omdr./min) for at nedsætte beskadigelsen af krystallerne. Blandingen tilsattes en 160 ml portion 25% glutaraldehyd.

20 Efter 1 times forløb blev reaktionen standset ved tilsætning af 20 liter rent vand til blandingen. Omrøringen blev omgående stoppet, og krystalmassen fik lov at bundfælde i karret i 2 timer. Moderluden blev bortdekanteret, idet der udvistes forsigtighed med ikke at skylle kry-25 stallerne væk. Der blev igen blandet 20 liter rent vand i krystalmassen, og vaskevandet blev fjernet ved dekantering. Der blev foretaget endnu en vaskning med vand. Den opnåede våde glucoseisomerasekrystalmasse, der var vasket 3 gange med vand, blev anvendt som den var ved isomerise-30 ringsafprøvninger, aktivitetsbestemmelser og andre forsøg.

Den således fremstillede tværbundne glucoseisomerase var på krystallinsk form (mikroskopisk vurdering). Krystal-35 lerne var uopløselige i vand, fortyndede opløsninger af forskellige salte (inden for en pH-værdi mellem 2 og 9), fortyndede syrer (1 mol/liter), varmt vand og varme salt- DK 169039 B1 12 opløsninger op til 100 °C og koncentrerede glucose-, fructose- og sukkeropløsninger op til 100 °C. Krystallernes udseende forblev uændret under alle de nævnte betingelser, hvorimod krystallinsk glucoseisomerase, som ikke 5 var blevet tværbundet, blev opløst eller præcipiteret som et amorft præcipitat. Den enzymatiske aktivitet af den tværbundne glucoseisomerase var 52% af aktiviteten af den oprindelige glucoseisomerase, som ikke var blevet tværbundet. Det vil sige, at når aktiviteten af den oprinde-10 lige glucoseisomerase var 40 000 GlU/g, var aktiviteten af tværbundne krystaller tilsvarende over 20 000 GlU/g, beregnet på tørret enzymprotein.

EKSEMPEL 2 15

Ved fremgangsmåden ifølge eksempel 1 blev følgende reaktionsblanding fremstillet ved 25 °C: 14 g glucoseisomerase beregnet som rent enzympro-20 tein 10 g ammoniumsulfat 1,5 g glutaraldehyd (ca. 8 ml af en 25% opløsning) 0,05 M natriumphosphatpuffer (opløsningens pH 7,4) 100 ml vand 25

Efter 1 times reaktionstid blev fri opløsning fjernet fra blandingen ved hjælp af en laboratoriecentrifuge ved centrifugering ved 1000 omdr./min i 5 min. Den opnåede krystalmasse blev suspenderet i 200 ml rent vand og centri-30 fugeret igen som beskrevet ovenfor. Vaskning med vand gentoges én gang til som beskrevet ovenfor. Våd, vasket krystalmasse blev indvundet og anvendt ved yderligere undersøgelser. Aktiviteten af den således fremstillede krystalmasse var 49% af den oprindelige krystalmasse.

EKSEMPEL 3-8 35 DK 169039 B1 13

Reaktionsblandinger med den samme begyndelsessammensætning som i eksempel 2 blev ifølge fremgangsmåden fra eksempel 1 fremstillet ved 10 °C. Efter reaktionstider af forskellig længde, blev reaktionen standset, og krystal-5 massen blev vasket, hvorefter aktiviteten af hver krystalmasse blev bestemt. Resultaterne er vist i den efterfølgende tabel I.

TABEL I

10 X )

Reaktionstid Aktivitet

Eksempel 3 10 min 45

Eksempel 4 30 min 46 15 Eksempel 5 60 min 49

Eksempel 6 90 min 48

Eksempel 7 2 h 40

Eksempel 8 3 h 40 X ) 20 % af aktiviteten af den oprindelige krystalmasse.

Det ses af resultaterne, at reaktionen meget hurtigt er afsluttet, og at aktiviteten ikke ændres nævneværdigt ved 25 forhøjet reaktionstid.

EKSEMPEL 9-16

Ved fremgangsmåden ifølge eksempel 1 fremstilledes ved 10 30 °C reaktionsblandinger med den samme begyndelsesammensæt ning; 14 g glucoseisomeraseprotein (på krystallinsk form) 10 g ammoniumsulfat 35 90 ml 0,5 M natriumphosphatopløsning (pH 6,0, 7,0, 8,0 eller 8,4 som vist i tabel II) glutaraldehyd, 0,12, 0,5, 2,0, 3,5 eller 4,12 g DK 169039 B1 14 som vist i tabel 11)

Reaktionstiden var 1 time« Aktiviteten af hver resulterende krystalmasse (% af den oprindelige aktivitet af 5 krystalmassen) er vist i tabel II.

TABEL II

pH Glutaraldehyd (g) Aktivitet (%) 10

Eksempel 9 6,0 0,5 22

Eksempel 10 6,0 3,5 24

Eksempel 11 7,0 0,12 60 15 Eksempel 12 7,0 2,0 65

Eksempel 13 7,0 4,12 59

Eksempel 14 8,0 0,5 41

Eksempel 15 8,0 3,5 44 20 Eksempel 16 8,4 2,0 39

Det fremgår af resultaterne, at man kan variere mængden af glutaraldehyd inden for temmelig vide grænser og stadig opnå høje aktiviteter. Surhedsgraden påvirker i høj 25 grad resultatet, den foretrukne pH-værdi er 7,0, skønt der kan opnås nyttige præparater inden for hele det afprøvede pH-område, dvs. pH 6,0 til 8,4.

EKSEMPEL 17-27 30

Der udførtes en afprøvningsserie i lighed med de foregående eksempler, imidlertid var temperaturen 2 °C, og reaktionstiden 18 timer. Sammensætningen af reaktionsblandingen var følgende: 3 g glucoseisomerasekrystaller beregnet som tørt protein 35 DK 169039 B1 15 50 ml vand som medium 7,5 g salt (natriumsulfat, magnesiumsulfat og/eller ammoniumsulfat (se tabel III) natriumhydroxid til indstilling af pH til 7,0 (ikke 5 over 2 mækv., dvs. 80 mg) 0,125 til 2,5 g glutaraldehyd (se tabel III).

TABEL III

10 _Salt (g)_ Glutar- Aktivi- (NH4)2S04 MgS04 Na2S04 aldehyd tet (%)

Eks. 17 7,5 0,5 0 15 Eks. 18 7,5 2,5 0

Eks. 19 7,5 0,125 0

Eks. 20 7,5 0,5 0

Eks. 21 7,5 0,75 0 20 Eks. 22 7,5 1,25 0

Eks. 23 0,45 7,05 0,75 20

Eks. 24 0,90 6,6 0,75 19

Eks. 25 1,8 5,7 0,75 28 25 Eks. 26 3,75 3,75 0,75 40

Eks. 27 7,5 0,75 60

Det fremgår af resultaterne, at når tværbinding udføres i 30 fravær af et ammoniumsalt, opnås der ikke uopløselige krystaller, selv ikke med en høj glutaraldehydkoncentra-tion. Selv en lille mængde ammoniumsalt fremmer dannelsen af uopløselige krystaller.

35 EKSEMPEL 28-38 16 DK 169039 B1

Uopløselige glucoseisomerasekrystaller blev fremstillet under anvendelse af forskellige nitrogenforbindelser i henhold til følgende almene metode: 5 3 g krystallinsk glucoseisomerase beregnet som tørt protein 7.5 g magnesiumsulfat 10 mmol nitrogenforbindelse (se tabel IV) 2.5 g glutaraldehyd (beregnet som 100%) 10

Temperatur 2 °C, reaktionstid 18 timer.

TABEL IV

15 Nitrogen- Mængde Aktivitet forbindelse (g) (%)

Eksempel 28 lysin 1,83 80

Eksempel 29 arginin 1,74 17 20 Eksempel 30 histidin 1,55 26

Eksempel 31 glutamin 1,46 18

Eksempel 32 leucin 1,31 21

Eksempel 33 isoleucin 1,31 18

Eksempel 34 prolin 1,15 10 25 Eksempel 35 methionin 1,49 27

Eksempel 36 phenylalanin 1,65 17

Eksempel 37 tryptophan 2,04 44

Eksempel 38 betain 1,17 23 30 Det fremgår af resultaterne, at et antal forskellige aminer har en ensartet virkning på tværbindingsprocessen.

35 DK 169039 B1 17 EKSEMPEL 39-51

Uopløselige glucoseisomerasekrystaller blev fremstillet med forskellige doseringer glutaraldehyd og lysin i hen-5 hold til følgende almene forskrift: 3 g krystallinsk glucoseisomerase beregnet som tørt protein 7,5 g magnesiumsulfat 10 0,47 til 2,34 g lysin (se tabel V) 0,5 til 1,25 g glutaraldehyd (100%, se tabel V)

Opløsningen fik lov at reagere i 18 timer ved 2 °C.

15 TABEL V

Glutar- Lysin Aktivitet aldehyd (g) (<?) (%) 20 Eksempel 39 0,5 0,47 67

Eksempel 40 0,5 0,94 77

Eksempel 41 0,5 1,40 60

Eksempel 42 0,75 0,47 72 25 Eksempel 43 0,75 0,94 83

Eksempel 44 0,75 1,40 92

Eksempel 45 0,75 1,87 81

Eksempel 46 0,75 2,34 75 30 Eksempel 47 1,25 0,47 68

Eksempel 48 1,25 0,94 78

Eksempel 49 1,25 1,40 90

Eksempel 50 1,25 1,87 102

Eksempel 51 1,25 2,34 100

Det fremgår af resultaterne, at forholdet mellem lysin-og glutaraldehyddoseringerne indvirker på dannelsen af 35 DK 169039 B1 18 uopløselige krystaller, dvs. der ses et optimalt lysindo-seringsniveau for hvert glutaraldehyddoseringsniveau.

EKSEMPEL 52-57 5

Glucoseisomerasekrystaller blev tværbundet i opløsningerne af ammoniumsulfat og lysin i henhold til følgende almene forskrift: 10 10 g glucoseisomerasekrystaller i 10% ammonium sulfat (dvs. 3,72 g rent glucoseisomerase-protein beregnet som tørstof, 0,63 g ammoniumsulfat og 5,65 g vand) 5 g ammoniumsulfat 15 45 g vand 1,25 g glutaraldehyd beregnet som 100% 0 til 3 g lysin (se tabel VI)

Alle reaktionskomponenternes pH blev justeret til 8,0 ved 20 hjælp af natriumhydroxid før omrøring.

Blandingen blev omrørt ved 3 °C i 18 timer.

TABEL VI 25

Lysin (g) Aktivitet (%)

Eksempel 52 0 40

Eksempel 53 0,3 62 30 Eksempel 54 0,6 66

Eksempel 55 1,2 72

Eksempel 56 1,8 92

Eksempel 57 3,0 96

Det fremgår af resultaterne, at lysin påvirker udbyttet af tværbinding i gunstig retning. Aramoniumsulfat har 35 DK 169039 B1 19 ingen større virkning på resultatet, når lysin er til stede, selv om ammoniumsulfat alene giver et tilfredsstillende resultat.

5 EKSEMPEL 58-69

Glucoseisomerase- og lysinmængderne blev holdt konstante og de andre bestanddele varieret som vist i tabel VII: 10 3 g glucoseisomerase beregnet i tør form 1 g lysin 0,01 g natriumhydroxid (pH 8 i opløsning).

Reaktionstiden var 18 timer og temperaturen 2 °C.

15

TABEL VII

Glutar- MgSO^ Vand Reaktions- Aktivitet aldehyd opløsning 20 (g) (g) (g) total (g) (%)

Eks. 58 0,5 2,1 11,9 18,5 39

Eks. 59 0,5 2,7 15,3 22,5 70

Eks. 60 0,5 4,2 23,8 32,5 70 25 Eks. 61 0,5 5,3 32,7 42,5 73

Eks. 62 0,5 10,2 57,8 72,5 75

Eks. 63 0,5 16,2 91,8 112,5 77

Eks. 64 1,25 2,1 11,9 19,25 86 30 Eks. 65 0,5 2,7 15,3 23,25 99

Eks. 66 0,5 4,2 23,8 33,25 101

Eks. 67 0,5 5,3 32,7 43,25 89

Eks. 68 0,5 10,2 57,8 73,25 83

Eks. 69 0,5 16,2 91,8 113,25 89

Det fremgår af resultaterne, at koncentrationen af reaktionsblandingen har lille virkning på slutresultatet.

35 DK 169039 B1 20 Vægtforholdene mellem reaktionskomponenterne (enzym, ly-sin (eller amin) og glutaraldehyd) har en meget større virkning.

5 EKSEMPEL 70 1 g tværbundet glucoseisomerasemasse (fra eksempel 56, 0,4 g tørstof), som var vasket med vand, blev blandet ind i 100 g af en 40% glucoseopløsning, hvis pH var justeret 10 til 7,0. Blandingen blev omrørt konstant ved 60 °C. Der blev intermittent taget prøver fra blandingen, og prøvernes fructoseindehold blev bestemt ved hjælp af et polari-meter og glucoseindholdet målt enzymatisk ved hjælp af en hexokinase. Opløsningens fructoseindhold steg til 42% af 15 opløsningens totale sukkerindhold (glucose + fructose = 100%) i løbet af 3 timer. Efter afprøvningen blev den tværbundne glucoseisomerase skilt fra blandingen ved filtrering og vasket med vand. Den genvundne krystalmasse blev undersøgt for aktivitet og tørstof, og man fandt, at 20 der ved afprøvningen ikke var opløst eller forsvundet noget aktivt enzym. Afprøvningen kunne gentages flere gange med den samme enzymportion.

EKSEMPEL 71 25

Krystalmasse fremstillet som beskrevet i eksempel 1 blev ved suspendering i vand og dekantering (3 gange) vasket til fjernelse af finkornet præcipitat og krystalmateriale, som var findelt ved knusning under fremgangsmåden, 30 Den på denne måde opnåede store krystalfraktion, middelstørrelse 100 um, blev pakket på en cylindrisk reaktionskolonne med en diameter på 2,6 cm og en højde på 5 cm. Glucoseopløsning med følgende sammensætning blev pumpet gennem kolonnen ved 60 °C: 582 g glucosemonohydrat 590 g vand 35 DK 169039 B1 21 0,37 g MgS04.7H20 0,19 g NaHS03 pH 6,9 (1M NaOH, forbrugt under 1 ml) 5 Ved afprøvningens begyndelse var gennemløbshastigheden 11 ml/min, hvorved fructoseindholdet af den fra kolonnen udtømte opløsning var steget til 42% i forhold til det samlede sukkerindhold. Afprøvningen fortsattes i 200 timer, hvorefter gennemløbshastigheden måtte nedsættes til 10 9 ml/min for at opretholde den oprindelige omdannelse (fructoseindhold 42%). Som følge heraf var enzymets aktivitet under dette tidsrum faldet til 81% af begyndelsesværdien. Der observeredes ingen reduktion eller opløsning af krystalmassen under afprøvningen.

15 EKSEMPEL 72-76

Der blev afvejet 43,42 g våd aktiv glucoseisomerasemasse, som var vasket med vand (fremstillet ved fremgangsmåden 20 ifølge eksempel 67, 10,0 g enzym beregnet på som tør vægt).

200 ml af en glucoseopløsning fremstillet som beskrevet i eksempel 71 blev hældt på krystalmassen. Blandingen blev 25 omrystet ved 60 "C i forskellige tidsrum, og blandingen blev derpå filtreret gennem en filtrerpapirskive. Den på papiret tilbageværende krystalmasse blev vasket omhyggeligt med vand til fjernelse af alt opløseligt materiale. Krystalmassen blev tørret i en inkubator ved 105 °C og 30 vejet. Resultaterne er vist i den følgende tabel VIII:

TABEL VIII

DK 169039 B1 22

Omrørings- Tørvægt af krystalmasse tid efter afprøvning (g) 5

Eksempel 72 10 min 9,9

Eksempel 73 2 h 11,0

Eksempel 74 4 h 10,9

Eksempel 75 6 h 10,7 10 Eksempel 76 21 h 10,4

Det fremgår af resultaterne, at den tværbundne krystallinske glucoseisomerase fremstillet ved fremgangsmåden 15 ifølge opfindelsen ikke opløses i substratet under konventionelle industrielle driftsbetingelser.

EKSEMPEL 77 20 Tværbundet krystallinsk glucoseisomerase, glucoseisomerase bundet til DEAE-cellulose og oprindelig fri, opløselig glucoseisomerase blev sammenlignet med hinanden ved at holde dem under identiske kemiske og fysiske betingelser. Betingelserne valgtes således, at hver enzymprøve mistede 25 sin aktivitet i et måleligt omfang på rimelig kort tid, dvs. på 10-30 timer. En portion på 5 g af hvert enzympræparat blev blandet ind i 150 ml 0,05 M natriumphosphat-puffer (pH 6,0), som yderligere indeholdt 1,5 mmol/liter MgS04 og 2 mmol/liter NaHSOg. Blandingen blev rystet i 30 adskillige timer ved 70 °C. Der blev intermittent taget prøver fra blandingen, og aktiviteten af den tilbageværende glucoseisomerase blev bestemt udfra prøverne. Hver enzymprøves halveringstid (dvs. det tidsrum, det tager aktiviteten at falde til halvdelen af begyndelsesværdien) 35 blev bestemt på basis af nedgangen i aktivitet. Resultaterne er vist i nedenstående tabel IX.

TABEL IX

DK 169039 B1 23

Enzymprøve Halveringstid (h) 5 Oprindelig opløselig glucoseisomerase 2,2

Glucoseisomerase bundet til DEAE-cellulose 3,3

Tværbundet krystallinsk glucoseisomerase 19,0

Det fremgår af resultaterne, at tværbundne krystaller bi-10 beholder deres enzymatiske aktivitet væsentligt bedre end et frit enzym eller et enzym, der er immobiliseret på kendt måde.

EKSEMPEL 78 15

Tværbundet krystallinsk glucoseisomerase og glucoseisomerase bundet til DEAE-cellulose blev pakket i en cylindrisk reaktionskolonne på lignende måde som beskrevet i eksempel 71. Der blev kontinuerligt pumpet glucoseopløs-20 ning gennem kolonnerne. Glucoseopløsningen havde den samme sammensætning som i eksempel 71 med undtagelse af, at PH var justeret til 6,0. Kolonnernes temperatur var 60 °C under afprøvningen. Aktiviteten af enzymet indeholdt i kolonnerne blev beregnet på basis af gennemløbshastighe-25 den og fructoseindholdet af opløsningen, som er løbet igennem. Resultaterne er vist i den følgende tabel X.

TABEL X

30 Pakningsmateriale Aktivitets- i reaktionsbeholderen halveringstid (h)

Tværbundet glucoseisomerase-krystalmasse 120 Glucoseisomerase bundet til DEAE-cellulose 36 35

Det fremgår af resultaterne, at tværbundne krystaller på fremragende vis bibeholder deres enzymatiske aktivitet.

DK 169039 B1 24 EKSEMPEL 79-81

Sammenligning af de i vand uopløselige tværbundne krystaller ifølge opfindelsen og immobiliserede glucoseiso-5 meraser ifølge kendt teknik ved kolonneprocesser.

Prøver af i industrien typisk anvendte glucoseisomeraser og de i vand uopløselige tværbundne krystaller ifølge opfindelsen blev pakket i vertikale laboratoriekolonner.

10 Tværbinding af krystallerne blev udført som beskrevet i eksempel 51. Den indre diameter af de cylindriske kolonner var 2,7 cm og højden 50 cm. Kolonnerne havde en vandkappe, som var sat termostatisk til 60 °C. Den nedre ende af kolonnerne havde et filter for at holde enzymkornene 15 inde i kolonnen og lade sukkeropløsningen løbe igennem.

20 g på tørvægtsbasis af hvert enzym blev hældt på de enkelte kolonner. Glucosesubstrat med sammensætning som i eksempel 71 blev pumpet gennem kolonnerne med en justerbar laboratoriepumpe. Hver kolonne havde en særskilt pum-20 pe. Substratets temperatur blev justeret til 60 °C. Produktet, som kom gennem kolonnen blev prøvet for fructose og glucose. Det konstateredes, at hvert forskelligt enzympræparat frembragte et forskelligt fructoseindhold, når substratets gennemløbshastighed var omtrent den sam-25 me. Hver kolonnes gennemløbshastighed blev justeret indi viduelt ved at prøve sig frem, indtil fructoseindholdet af hvert produkt var 45% af totalt sukker (glucose plus fructose). I den følgende tabel er enzymerne og de tilsvarende gennemløbshastigheder til dannelse af 45% fruc-30 tose angivet.

TABEL XI

DK 169039 B1 25

Substratgennem-

Eksempel Enzym, 20 g tørstof løbshastighed (ml/h) 5

Forb. SPEZYME IGI, kommercielt 179 produkt fra Finnish Sugar Co.

6>

Forb. SWEETZYME T, kommercielt 197 produkt fra NOVO Co., Danmark 10 Forb. TAKASWEET, kommercielt 94 produkt fra Miles-Kali Chemie 79 Tværbundne glucoseisomerasekrystaller 1364 med diameter på 100-200 um 80 Tværbundne glucoseisomerasekrystaller 1121 15 med diameter på 500-600 um 81 Tværbundne glucoseisomerasekrystaller 1098 med diameter på 900-1100 urn

Gennemløbshastighederne for kolonnerne indeholdende de 20 kommercielle enzymer repræsenterer meget typisk det, som ses i nuværende industriel praksis. Gennemløbshastighederne for kolonnerne indeholdende de tværbundne glucoseisomerasekrystaller ifølge opfindelsen var væsentligt højere. I industriel praksis vil den høje aktivitet af 25 tværbundne krystaller resultere i væsentligt mindre enzymkolonner, hvilket vil medføre besparelser på investerings- og bearbejdningsomkostninger.

30

Claims (12)

1. I vand uopløselig tværbundet krystallinsk glucoseiso- 5 merase.

2. Glucoseisomerase ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er uopløselig i fortyndede sure og alkaliske opløsninger inden for pH-området mellem 1 og 10. 10

3. Glucoseisomerase ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er uopløselig i vandige opløsninger af glucose, fructose og andre sukkerarter.

4. Glucoseisomerase ifølge krav 3, kendetegnet ved, at krystallerne selv ved forhøjede temperaturer op til 100 °C er uopløselige i de nævnte sukkeropløsninger.

5. Glucoseisomerase ifølge krav 1, kendeteg- 20 net ved, at den katalyserer isomerisering af sine naturlige substrater, glucose, fructose og xylose, selv i koncentrerede opløsninger af disse sukkerarter.

6. Glucoseisomerase ifølge kravene 1 til 5, kende-25 tegnet ved, at krystallerne kemisk eller fysisk er sammenbundet til dannelse af større legemer i sfæriske, arklignende, båndlignende eller lignende konfigurationer.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af en i vand uopløselig 30 tværbundet krystallinsk glucoseisomerase, kendetegnet ved, at a) der sættes et dialdehyd til en suspension af krystallinsk glucoseisomerase, til hvilken der før tilsætning 35 af dialdehyd eller under tværbindingsreaktionen er sat en forbindelse indeholdende mindst én aminogruppe, såsom ammoniumsalt, amin eller aminosyre, og DK 169039 B1 b) de tværbundne krystaller vaskes med vand eller en anden væske til fjernelse af reagensrester.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet 5 ved, at dialdehydet er glutaraldehyd.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved, at mængden af glutaraldehyd er 0,4-8 vægt-%. 10

10. Fremgangsmåde til isomerisering af et substrat, kendetegnet ved, at den i vand uopløselige tværbundne krystallinske glucoseisomerase ifølge ethvert af kravene 1-6 anvendes til at katalysere omdannelsen af 15 substratet til dets isomer ved temperaturer op til 100 °C.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at substratet er glucose, fructose eller xylose. 20

12. Fremgangsmåde til kontinuerlig fremstilling af fructose, kendetegnet ved, at en glucoseholdig opløsning får lov at løbe gennem en reaktionsbeholder indeholdende den i vand uopløselige, tværbundne krystal- 25 linske glucoseisomerase ifølge ethvert af kravene 1-6.