SU712026A3 - Способ получени иммобилизованного ферментного препарата глюкозоизомеразы - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к микробиол гической промышленности и касаетс  получени  иммобилизованного ферментного препарата глюкозоизомеразы. Известен способ получени  иммобилизованного ферментного препарата глюкозоизомеразы, предусматривающий смешивание культуральной жидкости, содержащей клетки микроорганизмов с раствором глутарового альдегида 1 Одйако известный способ не позвол ет получить водонерастворимый препарат с высокой физической устой чивостью в процессе изомеризации глюкозы. Цель изобретени  - получение вод нерастворимого препарата и повьвдени его физической устойчивости в процессе изомеризации глюкозы. Это достигаетс  тем, что культуральную жидкость перед смешиванием концентрируют до содержани  сухих веществ 3-30 вес.%, в полученном ко центрате разрушают клетки микроорганизмов до содержани  разрушенных клеток в нем 25-100%, при этом глутаровый альдегид используют в количестве 0,01-1,0 вес.ч. на 1 вес.ч. сухого вещества концентрата и смесь выдерживают при температуре окруждю щей среды до образовани  гел  после чего гель гранулируют, полученный препарат обезвоживают, промывают и вновь обезвоживают. Кроме того, используют культуральную жидкость микроорганизмов рода Bacillus, а также культуральную жидкость микроорганизмов Bacillus coagylans . Клетки разрушают путем автолиза или гомогенизации. В концентрат после автолиза ввод т флокул нт и затем после смешивани  с глутаровым ошьдегидом разбавл ют водой и фильтруют . Обезвоживают препарат сушкой или замораживанием.. Способ осуществл ют взаимодействием клеточного концентрата, по крайней мере частично разрушенных клеток микроорганизмов, содержащего от О до 75% неповрежденных клеток и от 3 до 30 вес.% по объему сухого вещества , с 0,01-1,0 вес.ч. глутарового альдегида на 1 вес.ч. сухого вещества концентрата. Таким образом, получают сцепленный твердый продукт, после чего удал ют воду и формируют катализатор изомеризации глюкозы. Удаление воды, которое может производитьс  до различной степени, обычно осуществл ют в две стадии: оР- воживание механическим путем, т.е. путем фильтрации., и осушка конечного формованного продукта. Дл  этого примен ют клеточный концентрат с содержанием сухого вещества от 8 до 20 вес,% по объему, желательно от 10 до 16 вес.% по объему.

Изобретение касаетс  также энзимтически физически устойчивого, водонерастворимого ,катализатора изомеризации глюкозы из клеток микроорганизмов , обладающих способностью катализировать изомэризацию глюкозы Этот катализатор получают взаимодействием клеточного препарата из частично разрушенных клеток, который содержит от О до 75% поврежденных клеток и имеет содержание сухого вещества от 3 до 30 вес.% по объему с 0,01-1,0 вес.ч глутарового альдегида на 1 вес.ч. сухого вещества концентрата. Таким образом,синтезируют сцепленный твердый продукт, после чего обезвоживают и формируют катализатор изомеризации глюкозы.

сцепленный твердый катализатор изомеризации глюкозы можно получить без разбавлени  энзима при введении инородного реагента иммобилизации. Было установлено, что сами клетки содержат более чем достаточное количество азотных (и других) составл ющих , способных реагировать с глутаровым альдегидом с образованием гел Эти азотные вещества первоначально должны быть выделены из клеток микроорганизмов , а затем их можно использовать , мину  стадию очистки.

Выделение азотных веществ, {протеины и нуклеиновые кислоты)- осуществл ют механически или путем автолиза . Выделение не об зательно должно быть полным. Разрушение 25% клеток (75% остаютс  неповрежденными) дает достаточное количество реагентов дл  образовани  сцепленного твердого продукта, который может представл ть собой гель. Сцепленный -продукт реакции обезвоживают и подвергают формованию с образованием частиц размером в 10 мкм.

Особый источник микроорганизмов не  вл етс  об зательным, поскольку катализатор изомеризации глюкозы  вл етс  внутриклеточным продуктом. Многие микроорганизмы могут катализировать изомеризацию глюкозы. ОднакЬ большинство из этих известных микроорганизмов производ т энзим внутриклеточно.

Клетки микроорганизмов можно култивировать любым подход щим способом , в частности наиболее подход щим дл  получени  клеток, обладающих высокой активностью катализировать изомеризацию глюкозы. Клетки соответственно отдел ют от ферменг-ативного бульона фильтрацией, центрифугированием или подробным способо

и получают концентрат, содержащий 3-30 вес.% по объему сухого вещества . Присутствие аутолизированных и разрушенных клеток и даже свободного энзима в клеточном концентрате  вл етс  критическим, что позвол ет примен ть концентрирование микробиологических клеток с помощью больших промышленных установок (самоочистительные отстойные центрифуги). Обычно допускаютс  сравнительно не жесткие услови  эксплуатации, даже автолиз.

Если значительна  часть клеток разрушаетс , автолиз или ему подобное  вление не происходит во врем  выделени  и концентрировани : клетки разрушаютс  так, чтобы концентра содержал не более 75%, желательно менее 60% целых (неповрежденных) клеток. Полное или 100%-ное разрушение клеток  вл етс  оптимальным, так как позвол ет исключить диффузионные проблемы и получить наиболее физически устойчивый продукт.

Реакцию с глутаровым альдегидом провод т в водной суспензии фрагментированных клеток и некоторое количество выделенных клеточных составл ющих , включа  катализатор изомеризации глюкоз, находитс  в растворе . Соответственно разрыв или разрушение клеток должно проводитьс  только после концентрировани  клеток выше их обычного содержани  в ферментативной среде. Это означает , что микроорганизм обычно отдел ют от своей питательной среды, например , центрифугированием, поскольку концентрат бактериальных клеток содержит 3-20% сухого вещества. Затем одновременно с концентрированием или сразу после него провод т необходимое разрушение клеток, например, с помощью автолиза или гомогенизации В промышленных масштабах концентрирование клеток провод т с помощью самоочищающих сепараторов, например, SAMS 15037 или SAMR.

Эти сеп1Ьраторы рекомендуютс  дл  применени  в том случае, если степень разрушени  клеток не  вл етс  критической, потому что используютс  большие физические силы в процессе периодической выгрузки из корзины центрифуги через периферийные отверсти , при этом клетки переход т из области высокого давлени  в корзине в область атмосферного давлени  снаружи.

. %

Степень разрушени  клеток может мен тьс  в зависимости от типа

микроорганизма, что объ сн етс  размером и прочностью клеточных стенок. Дл  Bacillus coagulans было найдено, что степень разрушени  обычно выше 50% при использовании ЙАМБ 15037.

Давление на стенку корзины центрифуги можно вычислить по формуле

.)

где G - плотность сырь  (в данном случаа около 1030 кг/м) , to - скорость вращени  сепаратора;

г - радиус корзины; г, - радиус от центра уровн 

сырь  который в этой уста новке близок нулю.

Было найдено, что давление на периферии корзины в таком сепараторе равно 50-100 кг/см.. Корзина аппарата SAMS 15037 имеет радиус 25 см и обычно вращаетс  со скоростью 5000 об./мин при соответствующем давлении на стенку корзины около 80 кг/см.

Известно, что некоторые микроорганизмы , особенно Bacillus species, чувствителен к автолизу. Найдено дл Bacillus coagulans что, если клеточный концентрат получают с помощью упом нутого самоочищающего сепаратора , выдел етс  большее количество катализатора изомеризации глюкозы, если отстой выдерживать в течение нескольких часов при 10-40°С. Через 3-6 час хранени  обычно более 80% клеток разрушаетс  или лизируетс .

Активность катализатора изомеризации глюкозы суспензии неповрежденных клеток Bacillus coagulans составл ет только 1/3 активности суспензии полностью лизированных клеток , полученных при обработке лизозмом .

Активность (в GINU/r) свежего пительного бульона без лизозима 2,14, с лизозимом через 30 мин при - 3,97, через 60 мин - 6,02.

Лизозим представл ет собой Sigma Grade I с 25000 Sigma ед./мг.

Питательный бульон разбавл ют в 20 раз и в разбавленную суспензию добавл ют 1,5 мг лизозима на 1 мл. Затем образцы анализируют через 30 и 60 мин согласно стандартной методке- дл  неиммобилизированного катализатора изомеризации глюкозы.

Стандартна  методика дл  измерени  полной активности клеточного концентрата включает инкубацию в течение 1 час с лизозимом после разбавлени  в 150-200 раз. Затем определ ют активность образца, не обработанного лизозимом, процент растворимой активности можно вычислить допуска , что активность неповрежденных клеток равна максимально 35%. Например, если активность после обработки отсто  лизозимом равн лась 135 GlNU/r, а без обработки лизозимом 120 GlNU/r, процент растворимого энзима может быть

найден как X по следующему уравнению:

,35+(igO-X)1,35Х 0,

Другим преимуществом высокой степени разрушени  клеток  вл етс  то, J что физическа  стабильность конечного продукта все более и более увеличиваетс  и клетки (и другие суспендированные вещества) лучше расщепл ютс . Дл  обеспечени  оптимальных условий полезно нагнетать;насо0 сом отстой через промьаиленный гомогенизатор .

Известно несколько методов разрушени  клеток, однако только немногие пригодны в промьпипенных масштабах. Обычный и сравнительно дешевый способ размельчени  клеток заключаетс  в использовании шаровой мельницы .

Катализатор изомеризации глюкозы 0 катализирует изомеризацию глюкозы во фруктозу. Образующа с  фруктоза анализируетс  с помощью цистеинкарбазольного метода, примен емого дл  кетоз.

5 Единица измерени  катализатора изомеризации глюкозы (GINU) определ етс  как такое количество энзима , которое катализирует образование 1 мкмол  фруктозы в 1 мин при следующих стандартных услови х:

Температура 65,0с Концентраци 

субстрата 5 % глюкозы Буферна  кон- 0,25 М малеат5 цектраци  ный буферный

раствор рН 6,50

20

Врем  реакции

мин

Оборудование включает магнитную 40 мешалку, вод ные бани (30,0°С и 65,0°С) рН-метр, спектрофотометр, секундомер и ротамиксер.

Используют следующие реагенты. 1. Буферный раствор, рН 6,50 45 (0,25 М малёатный буфер, 0,1 М сульфата магни , 1,0% хлорида кали ).

К малеиновой кислоте (29,0 г) NaOH (19,0 г)., MgSO THjO (24,7 г), KCfc (10,0 г) добавл ют деионизированную воду до 1000 мл.

Когда все реагенты растворены, рН контролируют рН-метром ипоказатель буферного раствора довод т до

6,50 путем добавлени  1 н. NaOH

или 1 н. нее. Добавление NaOH увеличивает осаждение Мд(ОНе.), который вновь раствор етс  при перемешивании . Поэтому NaOH должен добавл тьс  очень медленно.

2, Субстрат глюкозы - содержит 10% глюкозы безводной (100 г), СоСЙ16Н О (475 мг) ,- рН буфера 6,5; цеионизированную воду добавл ют

до 1000 мл. Когда реагенты растворены, рН снова контролируют рН-метром и довод т до 6,50 , как описано вьше. Дл  сохранени  субстрата добавл ют 0,1%-ный хлороформ (1,0 ил) . Субстрат хран т при охлс дении до момента использовани . 3.Хлорна  кислота - приблизите но 0,1 М 70%-ный (10 мл) и деионизировйнна  вода до 1000 мг. 4.Раствор L-цистеин - 2,2% НСЙ 240 мг цистеина сол нокислого (доногидрат ) и деионизированна  вода до 10 мл. Этот раствор приготавливают заново ежедневно. 5.Раствор карбазола - 400 мг 0,4%-ного карбазола и 96%-ный этан до 100 мл. Раствор необходимо хранить приохлаждении. 6.Серна  кислота (80%-на ) - 300 мл деионизированной воды и 775 мл HgSO (96%-ной). Воду охлаждают на лед ной бане и осторожно добавл ют охлажденную серную кислоту. Необходимо использовать безосколочное стекло. 7.Серна  кисдюта - карбазол 100 мл 80%-ной серной кислоты и 0,4%-ный раствор карбазола в 1 мл этанола. Приготовл ют заново кажды день. Нужно хранить в холодильнике до самого момента использовани . 8.Стандарт фруктозы I 20 m Molar (сырьевой раствор) - 360 мг фруктозы и 0,1 М хлорна  кислота до 100 мг. Этот раствор необходимо хранить при охлаждении. 9.Стандарт фруктозы И 1 m Molar - 5,0 мл стандарта фруктозы I и 0,1 М хлорна  кислота до 100 мл Готов т заново каждый день и испол зуют в качестве стандарта при- опре лении фруктозы. Образец дл  опыта разбавл ю буфером до концентрации 0,10 ,8 GlNU/мл. При этом экстинкци  ка 0,2-1,7 при 560 нм. Изомеризацию ведут следующим о разом. Из разбав1ленного образца отбира ют 1 мл пробы дл  опыта и контрол Используют 10X 160 мм пробирки. Включают секундомер и помещают субстрат глюкозы, опытные образцы и образцы контрол  в вод ную бани при 65°с и закрывают стекл нными пробками. Чеоез 10 мин добавл ют 1,0 мл субстрата глюкозы в первый образец и встр хивают. Через 10 мин 10 сек добавл ют 1,0 мл субстрата глюкозы во второ опытный образец и встр хивают. Пр должают добавл ть в следующую про бирку через 10 мин 20.сек и т.д. Через 30 мин добавл ют 10,0 мл 0,1 М хлорной кислоты в первый опы ный образец и удал ют из вод ной бани. Через 30 мин 10 сек добавл ют 10,0 мл 0,1 М хлорной кислоты во второй опытный образец и удал ют из вод ной бани. Повтор ют добавление в третий опытный образец через 30 мин 20 сек и т.д. После удалени  последнего опытного образца продолжают добавление 10,0 мл 0,1 М хлорной кислоты во все образцы контрольного опыта и затем их также вынимают из вод ной бани. В конце добавл ют 1,0 мл субстрата глюкозы во все образцы контрольного опыта. Обеспечивают тщательное встр хивание всех образцов и определ ют фруктозу. Дл  этого из охлажденных и тщательно перемешанных образцов пипеткой отбирают О,5О,мл пробы в 10« 160 мм пробирки. К этим пробиркам , присоедин ют два стандарта фруктозы (/J ) и две пробирки с деионизированной водой. Пробирки с водой используют в качестве эталона при измерении экстинкции. В каждую пробирку добавл ют 100 мл раствора цистеина НС. После встр хивани  помещают все пробирки в вод ную баню (30°с) . Включают секундомер, добавл ют 3,0 мл охлажденного реагента серна  кислота - карбазол к первому эталону и тщательно перемешивают на ротамиксере (примен ют безосколочное стекло). На 30 сек добавл ют 3,0 мл реагента серна  кислота - карбазол ко второму эталону и т.д. С интервалами в 30 сек обрабатывают образцы в следующем пор дке: контрольный, опытные образцы, стандарты фруктозы. На -30 мин калибруют спектрофотометр на 100%-ное пропускание при 560 нм по первому эталону. На 30 мин 30 сек контролируют настройку спектрофотометра по.второму эталону. На31 мин определ ют экстинкцию первого контрольного опыта. Активность вычисл ют по следующей формуле: ( )-iZ-V-f QlW/r, Std-2auj где S -экстинкци  опытного образца; в -экстинкци  контрольного опыта; -количество образца после изомеризации, мл-экстинкци  стандарта фруктозы; -коэффициент; -количество вз того образца , г; -объем, мл; -коэффициент разбавлени . Пример. 1 г энзима раствор  ют в буфере и довод т до 100 мл. От бирают 1,0 мл этого раствора и дово д т до 100 мл с помощью буферного раствора. Анализ провод т, как опи сано выше. Показани  прибора: S 0,365; В 0,128; S-B 0,237; Std 1,162 пып/ -&)-/. 0,237-i2-m-W NU/г 5ld.2btu - 1,16 -го-i Кпеточный концентрат после иммоб лизации и св зывани  в результате реакции с глутаровым альдегидом содержит 0-75% неповрежденных клеток и 3-30 вес.% сухого вещества. Весь выделенный катализатор изомеризации глюкозы в растворимой форме остаетс  в концентрате дл  включени  в энзим. Сухое вещество представл ет собо остаток после сушки при в течение 16 час. Сушка в течение 24 ча при 60°с в вакууме дает альтернатив ное сухое вещество. Количество глутарового альдегида реагирующего с клеточным концентратом , может быть в интервале от 1 до 100% по весу глутарового альдеги да в зависимости от концентрации су хого вещества. Небольшоеколичество глутарового альдегида приводит к по чению продукта, неприемлемого дл  промышленного использовани , а слиш ком большое количество снижает удельную активность конечного энзима. Подход щий интервал соотношени  сухого веса глутарового альдегида и сухого вещества исходного сырь  колеблетс  от 0,01 до 1 (желательно от 0,04 до 0,4 и в особенности от 0,05 до 0,3). Относительное содержа ние используемого глутарового альде гида может мен тьс  в зависимости от типа микроорганизма, даже в зависимости от масштабов промышленного производства конверсии глюкозы ., Хлутаровый альдегид можно добавл ть к клеточному концентрату в виде коммерческого концентрированного (например 25%-ного),раствора глутарового альдегида, смесь тщательно перемешивают дл  получени  дисперсии глутарового альдегида. Реакци  св зывани  и регенераци  продукта могут осуществл тьс  самыми разнообразны1А1 способами. Согласно одной из методик, исход ное вещество представл ет собой либо концентрированный автоматизирова ный ферментативный бульон, либо го могенизированный концентрат. Количество добавл емого глутарового аль дегида и температуру выбирают так. чтобы в течение 1 час смесь превратилась в гель. По другой методике исходное вещество , которое может быть либо автоматизированным концентратом, либо гомогенатом , обрабатывают флоккул нтом перед добавлением глутарового альдегида с целью образовани  агрегатов и усилени  реакции св зывани . Согласно следующей методике, св занную смесь-вымораживают, с целью образовани  неоднородного гел , что ведет к получению более пористого продукта. Что касаетс  исходного продукта, можно использовать любую форму энзима, услови  стадии св зывани  не должны выбиратьс  так, чтобы допустить гелеобразование перед замораживанием. После замораживани  гель плавитс  при температуре выше температуры замерзани . Это позвол ет продолжить реакцию св зывани  и образовать пористый продукт. Гомогенат или автоматизированный концентрат обрабатывают глутаровым альдегидом, а затем смесь выдержи;вают в состо нии поко  при температуре окружающей среды, пока, вс  масса не превратитс  в гель. Пока гель м гок, его гранулируют и иногда промывают . После этого гель осушают, желательно при средней температуре (30-50С) , например, до 88% сухого веществаi Затем продукт промывают и вновь осушают. В результате получают гранулированный высокоактивный продукт. При желании гранул цию катализатора изомеризации глюкозы провод т экструзией. Твердость гранулированного продукта контролируют путем регулировани  исходного количества глутарового альдегида или степенью промывки. При промывке удал ютнепрореагировавший глутаровый альдегид и получают более м гкий продукт. Реакцию продолжают при осушке, продукта и привод т к его отвердеванию. Последнюю стадию промывки провод т -в основном дл  удалени  очень мелких частиц. Сухие частицы продукта обладают исключительной размерной стабильностью и структурной прочностью, сохран   высокую активность природного энзима, присущего микробиологическим клеткам. Катализатор изомеризации глюкозы в виде частиц пригоден дл  многократного использовани  дл  конверсии глюкозы во фруктозу в реакторах периодического действи  или в колонных реакторах. Клеточный концентрат желательно после стадии автолиза обработать флоккул нтом дл  аггломерации клеток и клеточных осколков, а затем подвергнуть взаимодействию с глутаровым альдегидом. Хорошо первоначально добавить глутаровый альдегид и затем сразу же после глутарового альдегида или перед фильтрацией раз рушенного гел  флоккул нт. После об разовани  гел  его промывают и фильтруют, удал   воду, флоккул нт и/или непрореагировавший глутаровый сшьдегид. Дл  фильтрации можно использовать фильтр любого типа. Дл  переноса суспензии на пресс используют насос. Подход щими  вл ю с  МоЬпонасосы, поскольку они обычно не разрушают сырь . На этой стадни содержание сухого вещества в массе гел  повышаетс , например, с 11 до 30%. После этого фильтпрессну лепешку гранулируют и осушают, напри мер, 88% сухого вещества. В рёзульТате получают твердые частицы с высокой активностью энзима. Основным преимуществом флоккул ции клеточног концентрата  вл етс  то, что получа ют более обезвреженный гель, что снижает нагрузку на осушительное оборудование. Подход щими флоккулйн тами  вл ютс  ЕС 25 и Superfloc С 521. Использование физического обезво живани  на стадии фильтровани  заключаетс  в том, что фильтпрессную лепешку с более низким содержанием водылегче подвергать гранул ции, чем гель, который можно только разделить на неправильной формы куски перед осушкой. Фильтпрессн5ю лепешку можно гранулировать на осцил тор ном гранул торе. Другой способ получени  частиц из фильтрпрессной Лепешки состоит 13 экструдировании лепешки через отверсти  необходимого диаметра на плите. Можно использовать любой экструдер с правильными отверсти ми Диаметр отверстий решета экструдера может быть от 200 М до 2 мм или даже больше. При слишком большом диаметре возникают осложнени , св занные с диффузией. С другой стороны , слишком маленький диаметр дает частицы, которые вызывают значитель ные падени  давлени  в крупных колоннах , когда используютс  реакторы с .неподвижным слоем. Последовательность обработки, включающа  стадию замораживани  обработанного глутаровнм альдегидом клеточного концентрата, дает преиму щества в технологии при получении продукта. Замораживание можно проводить как после гелеобразовани , так и . перед ним, сразу же после смешени  концентрата и глутарового альдегида В этом случае реакци  полностью 3dканчиваетс  после плавлени . После промывки водой и удалени  воды получают продукт, имеющий некоторое количество сухого вещества, наприме 30% сухого вещества. После этого продукт осушают, например, до 88% сухого вещества. Замораживание дает пластинчатый или хлопьевидный продукт , который по своей природе  вл етс  упругим,- волокнистым и/или почти пористым. Если сравнивать его с гранулированными продуктами, продукт процесса замораживани  почти не имеет очень маленьких частиц. Еще один вариант процесса включает сушку при температуре ниже 0°С замороженного продукта реакции. Однако така  сушка требует дорогосто щего вакуумного оборудовани  и приводит к сравнительно высокой стоимости процесса. Поскольку любой вариант испарительной осушки требует технологических затрат, обезвоживание, которому способствует замораживание и флоккул ци , имеет некоторые преимущества. Св занный промытый продукт можно подвергнуть прессованию (на фильтре) дл  удалени  первоначального количества воды и получени  продукта с содержанием сухого вещества около 30%. По желанию этот продукт можно использовать дл  изомеризации глюкозы . Однако предпочтительна некотора  осушка и желателен продукт с содержанием сухого вещества 80%. Микроорганизм, который используют согласно изобретению в качестве источника катализатора изомеризации глюкозы,  вл етс  Bacillus coagulaus. Этот микроорганизм легко распадаетс , выдел   как энзим в растворимой форме, так и такие составл ющие, как-протеины и нуклеиновые кислоты. Типичными штаммами  вл ютс  NRRL В-5649 до В-5666 и В-5351. Пример 1. Получение концентрата и иммобилизаци . Культивируют клетки Bacillus штамиа NRRL В-5656, содержание катализатор изомеризации глюкозы. Затем клетки удал ют из ферментативного бульона путем центрифугировани  на West- talia Sams с самоочищгшзщейс  корзиной , рН довод т до 6,3. Анализ показал , что концентрат содержит приблизительно 10 вес.% по объему сухого вещества и около 40% неповрежденных клеток. В 1 кг концентрата добавл ют 38 мл коммерческого 50%-ного глутарового альдегида при перемешивании, тщательно перемешивают глутаровый альдегид и клеточный концентрат. После этого реакционную массу выдерживают при температуре окружающей среды в состо нии поко . Через 1 час происходит гелеобразование реакционной смеси до в зкой массы с консистенцией , напоминающей сырный творог. Массу разрушают умеренным перемешиванием , промывают двум  объемами де ионизированной воды и воду удал ют. Куски гел  перенос т затем на вакуумный осушительный барабан, где приблизительно 1 кг дегидратируют

при до веса около 130 г. В хоце дегидратации м гкие куски гел  превращаютс  в твердый, устойчивый по размеру материал.

Дегидратированные куски дроб т на частицы диаметром менее 1 мм. Выделение энзима измен етс  от заГрузки к загрузке, составл ет при этом первоначальной активнпсти . Однако около 15 вес.% продукта составл ют очень маленькие частицы ( 1-70 мкм).

Пример 2. Иммобилизаци  пр замораживании.

По методике примера 1 приготовл ют 1 кг клеточного отсто  (40% неповрежденных клеток). Затем методику примера 1 повтор ют до стадии получени  смеси глутатового альдегида и клеточного концентрата и гелеобразовани . После этого гель (в том же сосуде) эамооаживают и оставл ют на ночь. На следующий день гел расплавл ют, поднима  температуру до температуры окружающей среды, и получают вод нистую массу. Добавл ют еще воды при перемеишвании, а затем зоду удал ют. Продукт сушат на сушильном барабане до веса около 130 г. Конечный продукт состоит из пористых частиц, имеет хлопьевидную внешность. Активность мен етс  от загрузки к загрузке от 60 до .70%. Однако образование мелких частиц не наблюдаетс .

Пример 3, Иммобилизаци  при флоккул ции.

1550 л питательного бульона ферментации coagufaus (NRRL в 5656), производ щих катализатор изомерации глюкозы, концентоипуют центрифугированием на Westfafia sanis 15037 при 10°С с образованием отсто содержащего около 12 г сухого веса {105°С) на 100 мл концентрата,

11 кг этого концентрата (рН 7,9) выдерживают при 20с в течение 3 час при комнатной температуре и умеренном перемешивании дл  того, чтобы вызвать аутолиз клеток coaguPaus. затем рН доводит до 6,5 разбавленной уксусной кислотой. К отстою, имеющему 73% активности и растворимой форме, добавл ют 330 мл 50%-иого раствора глутарового альдегида и получают концентрацию около 1,5% вес/об, глутарового альдегида в реакционной смеси. Через 1 час частично св занный гель энергично перемешивают после добавлени  20 л дионизированной водьт.

К полученной таким образом суспензии добавл ют 80 мл 30%-ного расвора DrewfPoc КС 25 дл  получ-ени  прозрачного раствора. Суспензию отфильтровывают дл  удалени  как можн большого количества воды. Отжатый осадок cyiMET в вакууме при и

затем этот осушенный осадок превращают в частицы размером менее 300 М.

Активность определ ют путем изомеризации загрузки в присутствии осушенного распылением порошка из концентрата в качестве эталона. Услови : рН 7,0, 65°С, 0,1 г СоЗО. на 1 л и 2,0,-MjfSO 7Н2О на1л, 40% глюкозы вес,/вес. Смесь продувают азотом. Активность иммобилизированноQ го энзима 70% от эталона. После опыта им лoбилизиpoвaнный энзим выдел ют фильтрацией и повторно используют . Это проделывают п ть раз и после п тикратного использовани  не наблюдаетс  значительного понижени 

5 активности.

Вторую порцию аутолизированного клеточного концентрата обрабатывают 20 мл 30%-ного Drewf oc ЕС 25 на 1 кг

0 отсто  с последующей реакцией с 1,4% вес./вес. глутарового альдегида .

Получают тот же продукт, Пример 4. Гомогенат (обра5 зование поперечных св зей).

12 л отсто , полученного по методике примера 3, гомогенизируют дл  того, чтобы получить свободный энзим и другие внутриклеточные протеины

0 путем разрушени  клеток.

При рН около 7,5 клеточный концентрат прокачивают насосом через гомогенизатор Manton

Давление 400 кг/см . Гомогонат, обладающий активностью более 95%

5 в растворимой форме, подвергают взаимодействию с 40 мл/л 50%-ного вес./вес. раствора глутарового альдегида в растворе. После протекани  реакции в течение 1 час при темпера0 туре окружающей среды образовавшийс  гель разрушают механически, разбавл ют 20 л деионизированной воды и дальше следуют методике примера 1. Получают необходимый продукт.

5Пример 5, Добавление флоккул нта к гомогенату после глутарового альдеп да.

12 л отсто , полученного по методике примера 3, гомогенизируют по

0 методике примера 4. Получили 95% активности в растворимой форме. К гомогенату при рН 7,0 и температуре добавл ют 50%-нь1й вес,/вес. раствор глутарового альдегида и поf лучают концентрацию 2,0% вес./вес. глутарового альдегида в растворе. Через 1 час гель разрушают механически , разбавл ют 2 об. воды и рН довод т до 7,5. Добавл ют 150 мл 30%-ного вес./вес. в Dreu.fte ЕС 25

О и получают прозрачную водную суспензию . Смесь фильтруют на рамном фильтрпрессе. Фильтрпрессную лепешку вентилируют сжатым воздухом д.п  удалени  некоторого количества сво5 бодной воды. Провентилированную

фильтрпрессную лепешку экструдируют на осевом экструдере МопогоС из Simon Heesen, снабженном экраном с 0,8 мм отверсти ми. Продукт cyrjar в осуимтеле с псевдосжиженным слоем с воэдутаным водводом при температуре

300 г загружают в снабженную рубашкой колонну объемом 1 л и при i температуре iSO-C и рН 7,2 прокачивают через колонну со скоростью 1 л/ча 40%-ного вес./вес, в раствор глюкозы ) Сонверси  43%, Раствор глюкозы содержит 0,1 г и 2,0 г Mg-5О/ на 1 л.

Пример 6, Полученг;е концентрата из ферментативного бульона и его иммобилизаци .

1000 л бульона ферментации на V/estfa ia Sams № 5ббб, выдел ю цих катализатор изомеризации глюкозы концентрируют центрифугированием при IQ°C coag-(J onstlKKl- i5037 на Ьамоочищающемс  сепараторе и получают отстой, содержащий 12 г сухого 100 мл концентрата и 56% растворимого энзима. 20 л концентрата обрабатывают буферным раствором 20%-ной водной уксусной кислоты с рН 3,5 с понижением рН концентрата до 6,3. Затем добавл ют 800 мл водного раствора 50%-ного глутарового альдегида смесь тщательно переменивают , выдерживают при в течение 45 мин дл  образовани  гел . Полученный гель диспергируют в 20 л ионизированной водаз, фильтруют на фильтрпрессе и фильтрпрессную лепешку продувают сжатым воздухом на фильтрпрессе дл  удалени  избытка воды. Частично Осушенный осадок (11,6 кг) гранулируют на колебательном гранул торе и сушат в сушильной печи при 35®С с образованием 2,3 кг очень твердых частиц, которые сохран юсвои физические свойства даже после перемешивани  в 40%-ном вес./вес сиропе глюкозы при температуре 60 С в течение нескольких дней.

Затем гранулы (размером от 88 до 300 М) перемешивают в течение 20 час при 65°С в водной среде, содержащей 40% вес,/вес. глюкозы, 0,1% вес./об. M S04-7H20 и 0,01 вес./об. при рН 6,6 и получают 63% от активности осушенного распылением порош-i ка концентрата, испытанного в тех же услови х.

Осадок с поперечными св з ми/ полученный по описанной методике из того же отсто , экструдируют на осевом экструдере с размером экрана 0,5 мм и осушают в псевдоожиженном слое с воздушным подводом при , Получают частицы цилиндрической формы с очень небольшим разбросом по размерам.

Некоторое количество этого же клеточного концентрата смеиливают с глутаровым альдегидом при рН 6,3,

получают концентрацию 1,2%, пометают на полки осуиштельной печи циркулирующим воздухом при температуре , Конечный осадок размегчивают в ступке и испытывают как описано выше. Получают 43% от активности эталонного осушенного распылением порошка.

10 л того же клеточного концентрата гомогенизируют с помошью Manfon Caufin . гомогенизатора при 400 атм и получают гомогенат с более чем 95%-ной активностью в растворимой форме.

100 мл гомогената перемесчивают в течение 20 мин с 5 мл 20%-ного вес./вес. раствора глутарового альдегида при рН 6,8, распредел ют на поверхности в виде 1 см сло , сушат при температуре 20°С и размалывают в ступке с образованием 11,6 г частиц . Частицы перемешивают в течение 20 мин в 200 мл деионизированной во и сушат с образованием 9,7 г твердых частиц.

Твердые частицы загружают в снабженную рубашкой колонну, выдерживаемую при температуре 65°С, и через ее пропускают со скоростью 45 мл/ч сырье, состо щее из 40% вес./вес, глюкозы и 0,1% вес./вес. Mg5O/ -7Hg O при рН 7,8. Через 44 час конверси  составл ет 45,2%.

Пример 7i Концентрат, замораживание .

1000 л бульона ферментации Bacillus coagulans, выдел ющих катализатор изомеризации глюкозы, концентрируют центрифупированием при 10°С на Westfalia Sams 15037 сепараторе и получают отстой, содержащий 12 г сухого веса на 100 мл отсто концентрата. Этот отстой аутализируют в течение 8 час при температуре 15®С и рН 7,2. Растворима  активность 84%. 10 л аутолизированного концентрированного отсто  охлаждают до , смешивают тщательно с 300 мл 50%-ного вес./вес. раствора глутарового альдегида, помещают на лолку и понижают температуру до -20®С дл  замораживани . После того , как замораживание окончено, замороженный концентрат расплавл ют при температуре 2Ос и полученную пористую массу диспергируют в 20 л деионизированной воды, фильтруют на корзиночной центрифуге, снабженной грубой фильтрационной тканью, гранулируют на колебательном гранул торе с экраном 7 меш, сушат в осушителе с псевдоожиженным слоем с воздушным подводом при температуре 60°С и получаиот волокнистые, пористые гранулы.

Гранулы (размером от 83 до 300 М) перемешивают в течение 20 час при температуре в водной среде, содержащей 40 вес.% глюкозы, 0,2% вес./об. MgSO; 7Н2О и 0,1 вес.% CoSO 7Н2О при рН 6,6. Получают 79% от активности эталонного осушенного распылением порошка. Гранулы, полученные этим же способом , исключа  стадию осушки, мене твердые, но более упругие. Они про вл ют 81% активности. Пример 8. Различные концен рации энзима. Три порции по 100 МП гомогената примера 6 более чем с 95% растворимого энзима обрабатывают следующим образом: 1.Смешивают с 10 мл 20%-ного вес./вес. глутарового альдегида при рН 6,8. 2.Аналогично 1 , только сначала разбавл ют 100 мл деионизированной воды. 3.Аналогично 1 , только сначала разбавл ют 200 мл деионизированной воды. Все три порции замораживают при температуре -18°С, затем расплавл ю при 20°С, образовавшиес  пористые вещества диспергируют в 300 мл даИонизированной воды, фильтруют, су (иат при 20°с и гранулируют; 5 г каж дого образца испытывают в снабженно рубашкой колонне при 65 С, рН 7,8, скорости 30 мл/час 40%-ного вес./ве раствора глюкозы, содержащего 0,1 вес./об и-0,01 % вес CoSO VHgO, 20 час. Процент конверсии первой порции 46,4, второй - 6,8, третьей - 47,4. Пример 9. Сравнение образцов с различной степенью разрушени клеток. Концентрат (60% разрушенных клеток ) и гомогенат (более 95% разрушенных клеток) готов т по методике примера 6. 200 мл каждого образца смешивают в течение 20 мин с 8 мл 50%-ного вес./вес. раствора глутарового аль дегида, замораживают при температур и расплавл ют при 20с. Полученный пористый продукт отжимают, разрушают, перемешивают в течение 20 мин в 1 л деионизированной воды, ;фильтруют на воронке Бюхнера, прессуют на фильтре, диспергируют в 1 л деионизированной воды, вновь фильтруют, сушат при 20°С и гранулируют; 5 г каждого гранул та испытывают в колоннах по методике примера 6 при скорости подачи сырь 30 мл/час. Через 20 час получены следующие результаты: конверси  концентрата 40%, гомогената - 45,1%. Замер ют жесткость частиц после опыта, частицы концентрата м гкие, а частицы гомогената жесткие. Образец неразрушенных клеток Arthrobacter В 3726 обрабатывают так же, однако иммобилизаци  не уд летворительна , так как не образуетс  устойчивых по форме тел. Пример 10. Сравнение образцов с различной степенью разрушени  клеток. Концентрат а, имеющий 56% разрушенных клеток, был получен по методике примера 6, в имеющий более 95% разрушенных клеток, так же по методике примера 6. 200 мл каждого из них смешивают в течение 20 мин с 8 мл 50%-ного вес./вес. раствора глутарового альдегида , замораживают при температуре , расплавл ют при , полученныйпористый продукт отжимают, разрушают, перемешивают в течение 20 мин в 1 л деионизированной воды, Ьтфильтровывают на воронке Бюхнера, Ьпрессовывают на фильтре, вновь диспергируют в 1 л деионизированной 8оды, отфильтровывают, осушают при 20°С и гранулируют; 5 г каждого гранул та испытывают в колоннах по методике примера 6, использу  40%-ную вес./вес. глюкозу при скорости подачи 30 мл/час. Через 20 час получены следующие результаты: конверси  концентрата - 40,, концентрата - 45,1. Определение жесткости после опыта дало следующие результаты: а - м гйий продукт, в жесткий продукт. Пример 11. Требовани  глутарового альдегида, концентрат и гомогенат. Гранулы готов т из концентрата (55% разрушенных клеток) и из гомогената (96% разрушенных клеток) по методике примера 10, но использу  различные концентрации глутарового альдегида. Затем их перемешивают в течение 20 час в деионизированной воде при , после чего определ ют жесткость по следующей методике: частицы сжимают сильно насколько возможно между двум  пальцами и результаты определ ют по следующей шкапе: 1Полностью склеены 2Склеены в значительной степени 3Склеены только в малой степени 4Нет Склеивани , жесткие 5Очень жесткие 6В высшей степени жесткие Минимальна  жесткость, пригодна  в промышленных масштабах, равна 3 .или 4. В таблице приведены результаты по, определению жесткости гранул.

Claims (7)

1. Формула изобретения

   1. Способ получения иммобилизованного ферментного препарата глюко-

   15 зоизомеразы,предусматривающий смешивание культуральной жидкости,содержа· щей клетки микроорганизмов с раствором глутарового альдегида, отличающийся тем, что, с целью

   20 получения водонерастворимого препара· та и повышения его физической устойчивости в процессе изомеризации глюкозы, культуральную жидкость перед смешиванием концентрируют до содер25 жания сухих веществ 3-30 вес.%, в полученномконцентрате разрушают клетки микроорганизмов до содержания разрушенных клеток в нем 25-100%, при этом глутаровый альдегид исполь30 зуют в количестве 0,01-1,0 вес.ч. на 1 вес.ч. сухого вещества концентрата и смесь выдерживают при температуре окружающей.среды до образования геля, после чего гель гранулируют,

   25 полученный препарат обезвоживают, промывают и вновь обезвоживают.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют культуральную жидкость микроорганизмов рода Bacillus.
3. 3. Способ по пп. 1 и 2, о т л ичающийся тем, что используют культуральную жидкость микроорганизмов Bacillus coagulans.
4. 4-. Способ по п.1, о т л и ч а то45 щ и й с я тем, что разрушают клетки путем автолиза.
5. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что разрушают клетки путем гомогенизации.

   50
6. 6. Способ по пп. 1-4, отличающийся тем, что в концентрат после автолиза вводят флокулянт и затем после смешивания с глутаровым альдегидом разбавляют водой и

   55 фильтруют.
7. 7. Способ по п.1, о т л и ч а тощи й с я тем, что обезвоживание препарата осуществляют путем сушки или замораживания.

   ... Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

   1. Патент Англии № 1376983, кл. С 3 И. опублик. 1971 (прототип).

   Тираж 495 . Подписное

   Филиал ППП !'Патент'г. Ужгород, ул. Проектная, 4