CS231458B1 - Cellular catalysts for biotransformation and method to produce them - Google Patents
Cellular catalysts for biotransformation and method to produce them Download PDFInfo
- Publication number
- CS231458B1 CS231458B1 CS82277A CS27782A CS231458B1 CS 231458 B1 CS231458 B1 CS 231458B1 CS 82277 A CS82277 A CS 82277A CS 27782 A CS27782 A CS 27782A CS 231458 B1 CS231458 B1 CS 231458B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- cells
- cell
- water
- particles
- native
- Prior art date
Links
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 37
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 title claims description 9
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 title claims description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 76
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 48
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 11
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims abstract description 10
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 claims abstract description 10
- 229920013730 reactive polymer Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 128
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 64
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 56
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 50
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 42
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 claims description 34
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 25
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 19
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 14
- -1 aldehydes dicarboxylic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 8
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 7
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 6
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 claims description 6
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 claims description 5
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 claims description 4
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 4
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 claims description 3
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 claims description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 claims description 3
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 claims description 2
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 claims description 2
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 claims description 2
- 229960003133 ergot alkaloid Drugs 0.000 claims description 2
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 claims description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101710157860 Oxydoreductase Proteins 0.000 claims 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 abstract description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 abstract description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 abstract 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 abstract 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 28
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 12
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 12
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 7
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000007444 cell Immobilization Methods 0.000 description 5
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 5
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 5
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 5
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 5
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 4
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 4
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 4
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 4
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 3
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 3
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 3
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000001729 Ammonium fumarate Substances 0.000 description 2
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- STNJBCKSHOAVAJ-UHFFFAOYSA-N Methacrolein Chemical compound CC(=C)C=O STNJBCKSHOAVAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 235000019297 ammonium fumarate Nutrition 0.000 description 2
- CKKXWJDFFQPBQL-SEPHDYHBSA-N azane;(e)-but-2-enedioic acid Chemical compound N.N.OC(=O)\C=C\C(O)=O CKKXWJDFFQPBQL-SEPHDYHBSA-N 0.000 description 2
- 108010041102 azocasein Proteins 0.000 description 2
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000003093 intracellular space Anatomy 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 2
- 229940068065 phytosterols Drugs 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 2
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 1
- 102000015790 Asparaginase Human genes 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 229920002284 Cellulose triacetate Polymers 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- BOWUOGIPSRVRSJ-YFKPBYRVSA-N L-2-aminohexano-6-lactam Chemical compound N[C@H]1CCCCNC1=O BOWUOGIPSRVRSJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010048581 Lysine decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187488 Mycobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- KYJGKOSNTVJPNR-ROLXFIACSA-N N[C@@H]1C(=O)NC(CCC1)N Chemical compound N[C@@H]1C(=O)NC(CCC1)N KYJGKOSNTVJPNR-ROLXFIACSA-N 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000222051 Papiliotrema laurentii Species 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Natural products N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 description 1
- 240000007776 Solanum aviculare Species 0.000 description 1
- 241000187411 Streptomyces phaeochromogenes Species 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 1
- QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N Zirconium Chemical compound [Zr] QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N [(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-diacetyloxy-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-triacetyloxy-6-(acetyloxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-triacetyloxy-2-(acetyloxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](COC(C)=O)O1)OC(C)=O)COC(=O)C)[C@@H]1[C@@H](COC(C)=O)O[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N 0.000 description 1
- LGDAGYXJBDILKZ-UHFFFAOYSA-N [2-methyl-1,1-dioxo-3-(pyridin-2-ylcarbamoyl)-1$l^{6},2-benzothiazin-4-yl] 2,2-dimethylpropanoate Chemical compound CC(C)(C)C(=O)OC=1C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)N(C)C=1C(=O)NC1=CC=CC=N1 LGDAGYXJBDILKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940105657 catalase Drugs 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- QBKFLYWZRMHHRS-UHFFFAOYSA-N chloroform;1,4-dioxane Chemical compound ClC(Cl)Cl.C1COCCO1 QBKFLYWZRMHHRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N glycidyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC1CO1 VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003921 particle size analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000005029 sieve analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005245 sintering Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005496 tempering Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- GPPXJZIENCGNKB-UHFFFAOYSA-N vanadium Chemical compound [V]#[V] GPPXJZIENCGNKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
Landscapes
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Description
Vynález se týká buněčných katalyzátorů pro biotransformace na bázi imobilizovaných prokaryontních a eukaryontních buněk mikroorganismů a rostlinných buněk s různou enzymovou aktivitou a způsobu jejich výroby.The invention relates to cellular catalysts for biotransformation based on immobilized prokaryotic and eukaryotic cells of microorganisms and plant cells with different enzyme activity and a process for their production.
Buněčné biokatalyzátory podle vynálezu jsou využitelné pro průmyslové biotransformace, resp. umožňují vypracovat diskontinuální nebo kontinuální biotechnologie výroby farmaceuticky, potravinářsky či zemědělsky významných produktů či meziproduktů.The cell biocatalysts of the present invention are useful for industrial biotransformation, respectively. they allow the development of discontinuous or continuous biotechnologies for the production of pharmaceutically, food or agriculturally important products or intermediates.
Známé způsoby imobilizace buněk lze obecně charakterizovat jako fyzikální, fyzikálně-chemické nebo chemické, podle toho, zda je vazba buněk s nosičem zprostředkována např. mechanicky při zachycení buněk v gelu, silami van der Waalsovými, polárními interakcemi nebo kovalentní vazbou.Known methods of cell immobilization can generally be characterized as physical, physicochemical, or chemical, depending on whether the binding of the cells to the carrier is mediated, e.g., mechanically by cell capture in the gel, van der Waals, polar interactions or covalent binding.
Běžně se používá různých ve vodě nerozpustných syntetických nebo přírodních organických či anorganických nosičů, které především zlepšují hydrodynamické a sedimentační a tím i separační vlastnosti imobilizovaných buněk a přispívají ke stabilizaci požadované enzymové aktivity. Různé známé způsoby imobilizace buněk, jejich výhody a nevýhody a jejich ekonomické limity shrnují formou přehledných článků např. Vandamme /Chem. Ind., No. 24, 1 072, 1976/, Abbott /In: Advances Appl. Microbiol., ed. D. Perlman, 20, 203, Acad. Press, New York, San Francisco, London, 1976/, Jack a Zajic /Advances Biochem, Eng. 5, 126, 1977/, Durand a Navarro /Proč. Biochem., 13, No. 9, 14, 1978/ a Vojtíšek et al., /Biologické listy, 44, 192, 1979/.Various water-insoluble synthetic or natural organic or inorganic carriers are commonly used, which primarily improve the hydrodynamic and sedimentation and thus separation properties of the immobilized cells and contribute to the stabilization of the desired enzyme activity. Various known methods of cell immobilization, their advantages and disadvantages and their economic limits are summarized in the form of review articles, for example, Vandamme / Chem. Ind. 24, 1072 (1976), Abbott In Advances Appl. Microbiol., Ed. D. Perlman, 20, 203, Acad. Press, New York, San Francisco, London, 1976 /, Jack and Zajic / Advances Biochem, Eng. 5, 126 (1977); Durand and Navarro (Proc.). Biochem. 9, 14 (1978) and Vojtíšek et al., (Biological Sheets, 44, 192, 1979).
Fyzikální způsob imobilizace buněk je popsán např. v čs. patentovém spisu č. 113 908 /agar/, v italském patentovém spisu č. 836 462 /vlákna triacetátu celulózy/, US patentovém spisu Č. 3 791 926 a v SSSR patentovém spisu č. 659 611 /zabudování buněk do sítě vznikajícího polymeru při radikálové kopolymeraci akrylamidu s methylen-bis-akrуlamidem/.The physical method of cell immobilization is described, for example, in MS. No. 113 908 (agar), Italian patent No. 836 462 (cellulose triacetate fibers), US patent No. 3 791 926 and USSR patent No. 659 611 (incorporation of cells into the polymer network of radical formation) copolymerization of acrylamide with methylene-bis-acridolamide).
Chemických způsobů imobilizace buněk v současné době v patentové literatuře reprezentuje mnoho desítek patentových spisů využívajících např. ke kovalentní vazbě buněk různých umělých či přírodních polymerů po jejich předchozí chemické modifikaci a aktivaci různými činidly. Jako nosičů je využívána řada syntetických organických či přírodních materiálů, inertních či chemicky aktivních polymerů např. na bázi methakrylaldehydu, glycidylmethakrylátu, hydroxyalkylmethakrylátu, přírodních polymerů např. celulózy a jejích derivátů, kolagenu, želatiny, anorganických materiálů např. skla a sloučenin titanu, zirkonia, vanadu apod.Chemical methods of cell immobilization currently represent in the patent literature many dozens of patents using, for example, for covalent binding of cells of various artificial or natural polymers after their previous chemical modification and activation by various agents. A variety of synthetic organic or natural materials, inert or chemically active polymers such as methacrylaldehyde, glycidyl methacrylate, hydroxyalkyl methacrylate, natural polymers such as cellulose and its derivatives, collagen, gelatin, inorganic materials such as glass and titanium, zirconium, vanadium, etc.
Nosiče těchto podobných typů, kromě toho, že po zachycení buněk mají preparáty nízkou specifickou aktivitu a částice jsou mechanicky málo odolné vůči otěru, jsou nákladné přípravky, jejichž cena, dostupnost a sama technologie jejich předchozí chemické modifikace a aktivace často velmi agresivními a toxickými činidly, limitují přípravu a tím průmyslové využití imobilizovaných buněk.Carriers of these types, in addition to the low specific activity of the preparations and the particles being mechanically poorly abrasion-resistant after cell capture, are expensive preparations whose cost, availability and technology of their previous chemical modification and activation are often very aggressive and toxic agents, limit the preparation and thus the industrial use of immobilized cells.
Jistým pokrokem ve vývoji technologie vazby buněk в průmyslovým významem je způsob popsaný v čs. autorském osvědčení č. 197 101, jehož princip spočívá ve vazbě nativních produkčních buněk s penicilinácylázovou aktivitou na buněčné nosiče různých druhů organismů, kterými jsou bud celé neporušené a/nebo fyzikálně, chemicky či biochemicky ošetřené buňky či jejich nerozpustné fragmenty, a to chemicky, kovalentní vazbou, použitím polyfunkčních činidel, zejména glutáraldehydu, po jejich předchozí fyzikálně chemické flokulaci, s výhodou flokulanty obsahujícími sloučeniny, které nesou alespoň dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny. U tohoto způsobu imobilizace buněk odpadá ekonomický limit ceny nosiče, neboř používanými nosiči jsou odpadní buňky/ nebo jejich desintegrovaná směs, odpadní buněčná hmota po různých fermentačních výrobách, jejichž cena je převážně zanedbatelná resp. nulová.Some progress in the development of cell binding technology with industrial significance is the method described in MS. No. 197 101, the principle of which is based on the binding of native production cells with penicillin-acylase activity to cell carriers of various species of organisms which are either intact and / or physically, chemically or biochemically treated cells or their insoluble fragments, namely chemically, covalently bonding, using polyfunctional agents, especially glutaraldehyde, after their previous physicochemical flocculation, preferably flocculants containing compounds that carry at least two primary and / or secondary amino groups. In this method of cell immobilization, there is no economic limit to the cost of the carrier, since the carriers used are waste cells / or a disintegrated mixture thereof, waste cell mass after various fermentation processes, the cost of which is largely negligible, respectively. zero.
Další, ještě výhodnější způsob chemické vazby produkčních buněk bez použití nosiče, která je popsána v čs. autorském osvědčení č. 203 607 a univerzálně pro vzájemnou imobilizaci buněk bez použití nosiče prokaryontních a eukaryontních buněk mikroorganismů s různými enzy3 movými aktivitami v čs. autorském osvědčení Č. 209 265. Citovanými postupy se získají velmi stabilní preparáty navzájem kovalentně prokřížených buněk různých mikroorganismů nesoucích požadované enzymové aktivity za tvorby dobře sedimentujících částic, tvořících integrální jednotky.Another, even more preferred method of chemically binding producer cells without the use of a carrier is described in U.S. Pat. No. 203 607 and universally for the mutual immobilization of cells without the use of a carrier of prokaryotic and eukaryotic cells of microorganisms with various enzyme activities in MS. No. 209,265. The present invention provides very stable preparations of covalently cross-linked cells of various microorganisms carrying the desired enzyme activities to form well-settling particles forming integral units.
Postup principiálně spočívá v chemické reakci nativních produkčních buněk ,s bifunkčními sítovacími činidly, zejména glutaraldehydem, čímž dojde ke kovalentnímu prokřížení vnitrobuněčného obsahu individuálních buněk a kovalentní fixaci požadované enzymové aktivity produkčních buněk a odolnosti těchto buněk vůči přirozené či uměle navozené autolýze.In principle, the process consists in the chemical reaction of native production cells with bifunctional crosslinking agents, in particular glutaraldehyde, thereby covalently cross-linking the intracellular content of individual cells and covalently fixing the desired enzymatic activity of the production cells and their resistance to natural or artificially induced autolysis.
V dalším stupni výroby se zesítěné' buňky permeabilizují jednotlivým nebo kombinovaným účinkem fyzikálních, fyzikálně chemických či chemických vlivů, čímž dojde к odstranění difúzní bariéry zesítěných buněk vyplavením maktomolekulárních materiálů tvořících součást povrchových struktur buňky, které nereagovaly s glutaraldehydem, zejména lipidů. V posledním stupni výroby se zesítěné a permeabilizované buňky navzájem kovalentně váží v přítomnosti volného síčovacího činidla, zejména glutaraldehydu, ve směsi s koreagujícími ve vodě rozpustnými látkami obsahujícími nejméně dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny, zejména polyethyleniminem a hexamethylendiaminem, za podmínek favorizujících vzájemný kontakt buněk během reakce, jako je mražení, působení odstředivého pole, 'filtračního tlaku apod.In the next stage of manufacture, the cross-linked cells are permeabilized by the single or combined effect of physical, physicochemical or chemical influences, thereby removing the diffusion barrier of the cross-linked cells by leaching the macromolecular materials forming part of the cell surface structures that did not react with glutaraldehyde, especially lipids. In the final production step, the crosslinked and permeabilized cells are covalently bound to each other in the presence of a free crosslinking agent, especially glutaraldehyde, in admixture with reactive water-soluble substances containing at least two primary and / or secondary amino groups, especially polyethyleneimine and hexamethylenediamine during the reaction such as freezing, centrifugal field, filter pressure and the like.
Z citovaných postupů výroby imobilizovaných buněk se zdá, že výroba buněčných biokatalyzátorů je již vypracována v dostatečně ekonomizované formě. Není tomu však zcela univerzálně, a to zejména proto, že některé enzymy přítomné v buňkách produkčních organismů podléhají rychle irreverzibilní inaktivaci při snadné penetraci molekul nízkomolékulárního agresivního sířovadla, např. glutaraldehydu, do vnitrobuněčného prostoru i při použití jeho velmi nízkých koncentrací, čímž u některých senzitivních enzymů dochází ke značnému poklesu jejich enzymové účinnosti, pravděpodobně kovalentním prokřížením a z toho vyplývají prostorové deformace aktivního místa enzymu, které pochopitelně nemůže být zpětně restaurováno na konformaci původní. Tato skutečnost byla experimentálně pozorována, zéjména u některých produkčních buněk s racemázovými a lyázovými aktivitami.From the cited procedures for the production of immobilized cells, it appears that the production of cellular biocatalysts has already been developed in a sufficiently economized form. However, this is not universally due, in particular, to the fact that some enzymes present in the cells of production organisms are subject to rapid irreversible inactivation by easy penetration of low molecular weight aggressive sulphurizer molecules such as glutaraldehyde into the intracellular space even at very low concentrations. Enzyme activity decreases significantly, probably by covalent cross-linking, resulting in spatial deformation of the active site of the enzyme, which of course cannot be restored to the original conformation. This has been experimentally observed, particularly in some production cells with racemase and lyase activities.
Výše uvedené nedostatky je možno odstranit využitím buněčných katalyzátorů podle vynálezu, sestávajících z celých neporušených, enzymově aktivních, nativních, popř. předem permeabilizovaných buněk, nebo jéjich fragmentů a jejich podbuněčných částic a/nebo ze směsí celých nativních buněk s jejich fragmenty, podbuněčnými částicemi a celým uvolněným obsahem buněk a/nebo z celých, individuálně zesítěných a permeabilizovaných buněk, imobilizovaných chemicky reaktivním polymerem, rozpustným ve vodě, vzniklým reakcí ve vodě rozpustné látky, obsahující nejméně dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny, jako je např. polyethylenimin, hexamethylendiamiň, lyzin a polylyzin s bifunkčními aldehydy dikarboxylových kyselin, jakojje např. glutaraldehyd, popř. dále permeabilizovaných a/nebo mechanicky zpevněných.The above drawbacks can be overcome by utilizing the cellular catalysts of the invention consisting of whole intact, enzymatically active, native, or non-enzymatic enzymes. pre-permeabilized cells, or fragments thereof, and their cellular particles, and / or mixtures of whole native cells with their fragments, cellular particles and all released cell contents, and / or whole, individually cross-linked and permeabilized cells immobilized with a water-soluble chemically reactive polymer formed by the reaction of a water-soluble substance containing at least two primary and / or secondary amino groups such as polyethyleneimine, hexamethylenediamine, lysine and polylysine with bifunctional dicarboxylic acid aldehydes, such as glutaraldehyde and the like. further permeabilized and / or mechanically reinforced.
Jako buněčný materiál mohou tyto katalyzátory obsahovat prokaryontní nebo eukaryontní buňky organismů, zejména grampozitivních, gramnegativních a gramlabilních baktérií, acidoresistentních baktérií, aktinomycet,· kvasinek a dalších mikroskopických hub a vyšších, zejména parazitických hub a rostlinných buněk, popř. jejich fragmenty a podbuněčné částice, nesoucí enzymové aktivity, zejména hydrolázy, isomerázy, lyázy, dekarboxylázy, oxidoreduktázy a jiné aktivity a/nebo částici celé sekvence enzymů logického sledu biochemické dráhy, zejména degradativního metabolismu, glykolýzy, enzymů katalýzujících biotransformace hormonů a produkci alkaloidů, zejména solanových alkaloidů a fytosterolů a námelových alkaloidů.As cellular material, these catalysts may comprise prokaryotic or eukaryotic cells of organisms, in particular gram-positive, gram-negative and gram-labile bacteria, acid-resistant bacteria, actinomycetes, yeasts and other microscopic fungi and higher, especially parasitic fungi and plant cells, respectively. fragments thereof and cellular particles carrying enzymatic activities, in particular hydrolase, isomerase, lyase, decarboxylase, oxidoreductase and other activities and / or a particle of the whole sequence of enzymes of the logical sequence of the biochemical pathway, in particular degradative metabolism, glycolysis; solan alkaloids and phytosterols and ergot alkaloids.
Předmětem vynálezu je dále způsob výroby uvedených katalyzátorů, jehož podstata spočívá v tom, že se výše uváděné buněčné materiály imobilizují uvedením ve styk s ve vodě rozpustným, chemicky reaktivním polymerem, vzniklým reakcí ve vodě rozpustné látky, obsahující nejméně dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny, s výhodou polyethyleniminem a sbifunkčními aldehydy dikarboxylových kyselin, s výhodou s glutaraldehydem, při teplotě v rozmezí 0 až 60 °C ve vodném prostředí, při pH v rozmezí 4,0 až 12,0, přičemž reakce uvedeného bu něčného materiálu s uvedeným polymerem se provádí při teplotě v rozmezí -30 až +50 °C ve vodném prostředí a při pH v rozmezí 5,o až 9,o, popř. za přítomnosti flokulačních činidel, vzniklé buněčné agregáty se po oddělení z reakční směsi promyjí vodou nebo pufrem, načež se popř. permeabilizují a/nebo mechanicky zpevňují.The present invention further provides a process for the production of said catalysts, characterized in that the above-mentioned cellular materials are immobilized by contacting a water-soluble, chemically reactive polymer formed by the reaction of a water-soluble substance containing at least two primary and / or secondary amino groups. , preferably polyethyleneimine and bifunctional aldehydes of dicarboxylic acids, preferably glutaraldehyde, at a temperature in the range of 0 to 60 ° C in an aqueous medium, at a pH in the range of 4.0 to 12.0, wherein the reaction of said cellular material with said polymer is it is carried out at a temperature in the range of -30 to +50 ° C in an aqueous medium and at a pH in the range of 5 to 9, 0 and 10 ° C, respectively. in the presence of flocculants, the resulting cell aggregates are washed with water or buffer after separation from the reaction mixture, and then optionally washed with water or buffer. permeabilize and / or mechanically solidify.
Je výhodné, když se к přípravě ve vodě rozpustného polymeru а к případné předchozí flokulaci buněčného materiálu použije vodný roztok polyethyleniminu s distribucí molekulové hmotnosti 100 000 až 800 000.It is preferred that an aqueous polyethyleneimine solution having a molecular weight distribution of 100,000 to 800,000 is used to prepare the water-soluble polymer and to optionally flocculate the cellular material.
Výhodně se reakce uvedeného buněčného materiálu s uvedeným polymerem provádí při teplotě 0 až 45 °C, při relativní odstředivé síle 1 až 50 000 g, při filtračním tlaku od 0 do 50 000 kPa, při stání či pomalém míchání nebo při přerušovaném míchání a stání reakční směsi.Preferably, the reaction of said cellular material with said polymer is carried out at a temperature of 0 to 45 ° C, at a relative centrifugal force of 1 to 50,000 g, at a filtration pressure of 0 to 50,000 kPa, with stand or slow agitation or with intermittent agitation and mixtures.
* Permeabilizace nativních buněk před imobilizací nebo získaných buněčných agregátů po imobilizaci se může provádět mícháním buněčné suspenze ve vodném prostředí při teplotách od 0 do 70 °C, při hodnotě pH 4,0 až 9,0, v přítomnosti tenzidu a/nebo organického s vodou mísitelného a/nebo nemísitelného rozpouštědla, zejména acetonu, etheru, isopropánolu, petroletheru, butylacetátu, chloroformu dioxanu, dimethylformamidu nebo dimethylsulfoxidu, popř. za současné nebo následné změny iontové síly suspenze přídavkem solí silných kyselin a/nebo zásad.* Permeabilization of native cells before immobilization or obtained cell aggregates after immobilization can be accomplished by stirring the cell suspension in an aqueous environment at temperatures from 0 to 70 ° C, at a pH of 4.0 to 9.0, in the presence of a surfactant and / or organic with water a miscible and / or immiscible solvent, in particular acetone, ether, isopropanol, petroleum ether, butyl acetate, chloroform dioxane, dimethylformamide or dimethylsulfoxide; with simultaneous or subsequent changes in the ionic strength of the suspension by addition of strong acid salts and / or bases.
částice imobilizovaných buněk se popř. dále mechanicky zpevňují částečnou dehydratací působením organických rozpouštědel, s výhodou acetonem, popř. roztoky lepidel v organických rozpouštědlech nebo jejich směsí s vodou, při teplotách +20 až -25 °C, popř. se vzniklé částice odsají a parciálně vysuší za sucha či vlhka, popř. vhodným způsobem postformují.the particles of immobilized cells are, respectively, further mechanically solidifying by partial dehydration by the action of organic solvents, preferably acetone, respectively. solutions of adhesives in organic solvents or mixtures thereof with water, at temperatures of +20 to -25 ° C, resp. the resulting particles are sucked off and dried partially or dry or wet. in a suitable manner.
Výhody způsobu podle vynálezu spočívají v tom, že se za pomoci chemicky reaktivních ve vodě rozpustných polymerů /dále jen RRP/ získají imobilizované buněčné biokatalyzátory s vysokou specifickou aktivitou, dobrými sedimentačními vlastnostmi a vysokým výtěžkem imobilizace, a to i v případech vysoce citlivých enzymových aktivit, které nelze obejít postupy uvedenými v čs. autorských osvědčeních č. 197 101, 203 607 a 209 265, nebo£ na rozdíl od uvedených poetupů využívajících volného nízkomolekulárního síčovadla, RRP připravené postupy podle předmětného vynálezu jsou sice ve vodě rozpuštěné, avšak jejich molekulová hmotnost je již tak veliká, Že nepenetrují do buňky a kovalentní vazba /imobilizace/ se odehrává mezi povrchy buněk a reaktivními aldehydovými skupinami aktivovaného RRP.The advantages of the process according to the invention are that immobilized cellular biocatalysts with high specific activity, good sedimentation properties and high immobilization yield are obtained by means of chemically reactive water-soluble polymers (hereinafter RRP), even in cases of highly sensitive enzyme activities, which cannot be circumvented by the procedures given in MS. No. 197,101, 203,607 and 209,265, or in contrast to the disclosed low-molecular-weight crosslinker techniques, the RRP prepared by the present invention is dissolved in water, but has a molecular weight that is no longer penetrating the cell and covalent bonding (immobilization) occurs between cell surfaces and reactive aldehyde groups of activated RRP.
Vlastní mechanismus tvorby chemicky reaktivních ve vodě rozpustných polymerů, např. za použití polyethyleniminu a bifunkčních sinovacích činidel, zejména glutaraldehydu, si lze představit jednak vnitřním zesítěním frakcí polyethyleniminu za preferenční tvorby barevných Schiffových bází mezi koncovými aldehydickými skupinami glutaraldehydu a primárními či sekundárními aminoskupinami polyethyleniminu /Cín vazba/, což má za následek vzrůst molekulové hmotnosti těchto frakcí při současné chemické aktivaci některých primárních či sekundárních aminoskupin obsažených v rozvětvených a pravděpodobně koncových řetězcích polyethyleniminu, resp. jejich převodem na reaktivní aldehydické skupiny, přičemž vzniklý zesítěný chemicky reaktivní polymer zůstane rozpuštěný ve vodném roztoku, takže rezultující roztok RRP je čirá, průhledná, žlutohnědá až červenohnědá kapalina.The intrinsic mechanism for the formation of chemically reactive water-soluble polymers, eg using polyethyleneimine and bifunctional sintering agents, especially glutaraldehyde, can be imagined by internal cross-linking of polyethyleneimine fractions with preferential formation of colored Schiff bases between terminal aldehyde groups of glutaraldehyde and primary or secondary amino groups of polyethyleneimine resulting in an increase in the molecular weight of these fractions, with simultaneous chemical activation of some of the primary or secondary amino groups contained in the branched and probably terminal chains of the polyethyleneimine, respectively. by converting them to reactive aldehyde groups, the resulting crosslinked chemically reactive polymer remains dissolved in the aqueous solution such that the resulting RRP solution is a clear, transparent, yellow-brown to red-brown liquid.
Postup výroby podle předmětného vynálezu principiálně sestává ze dvou technologických operací. V prvé fázi se připraví chemicky reaktivní ve vodě rozpustný polymer /RRP/ s .výhodou reakcí komerčně dostupných flokulantů, používaných к čištění odpadních vod, obsahující frakci polyethyleniminu, např. Sedipur KA nebo Sedipur CL-930 s bifunkčním síčovadlem, zejména glutaraldehydem, ve vodném prostředí s výhodou za míchání reakční směsi.The manufacturing process of the present invention consists essentially of two technological operations. In a first stage, a chemically reactive water-soluble polymer (RRP) is prepared with the advantage of reacting commercially available flocculants used for wastewater treatment containing a polyethyleneimine fraction, e.g. Sedipur KA or Sedipur CL-930 with a bifunctional crosslinker, especially glutaraldehyde, in aqueous preferably with stirring the reaction mixture.
Rychlost polymerace lze např. sledovat ňa základě změny absorbance přírůstku koncentrací barevných Schiffových bází ve viditelné oblasti spektra /např. při 550 nm/, jejichž kon centrace je závislá především na poměru obou reakčních složek, tj. sífovadla : koreagující sloučenině, reakční době a teplotě. Reakci lze popsat kinetikou prvého řádu. V druhé fázi se do částečné nebo kvantitativně zreagovaného roztoku RRP vmíchají nativní, čerstvé, předem odkultivačního média separované mikrobiální nebo rostlinné buňky nesoucí požadované enzymové aktivity a/nebo zesítěné a‘permeabilizované buňky v těch případech, kdy citlivost klíčového enzymu dovoluje předchozí použití volného roztoku sítovadla, popř. směs celých nativních buněk a desintegrovaných buněkve formě suspenze s buněčným ditritem, a v závislosti na pouíité technice imobilizace, zejména mražený stán^ pozvcdn^o míchání, působení filtračního tlaku, odstředivého pole, vytlačování suspenze či vzniklých částic vhodným zařízením a- následného parciálního sušení částic za sucha či vlhka, lze regulovat velikost, tvar, charakter, porozitu' a specifickou aktivitu buněčných Mobilizovaných materiálů.For example, the polymerization rate can be monitored by varying the absorbance gain of the color Schiff base concentrations in the visible region of the spectrum (e.g. at 550 nm), the concentration of which is mainly dependent on the ratio of the two reactants, i.e. the crosslinker: the reacting compound, the reaction time and the temperature. The reaction can be described by first order kinetics. In a second phase, native, fresh, pre-cultured media separated microbial or plant cells carrying the desired enzyme activities and / or cross-linked and permeabilized cells are mixed into the partial or quantitatively reacted RRP solution, where the sensitivity of the key enzyme permits prior use of the free crosslinker solution or. mixture of whole native cells and disintegrated buněkve slurry with cell ditritem, and depending on a bromine s technique and mobi if tion, especially E on frozen resting place ^ pozvcdn ^ of the spinal cord and the p s with b en A filter pressure centrifugal field, The size, shape, nature, porosity and specific activity of the cellular mobilized materials can be controlled by extruding the suspension or particles formed by a suitable device and then partially drying the particles dry or wet.
Způsob výroby Mobilizovaných buněk podle vynálezu rovněž zahrnuje · postupy vedoucí k permeabilizaci buněk před Mobilizací, popř. permeabilizacivzniklých buněčných agregátů po Mobilizaci, zvláště v těch případech, kdy jako výchozí materiál byly použity celé nativní buňky, popř. kdy bylo použito technik následného ošetření Mobilizovaných částic vedoucích k zvýšení jejich mechanické stability a pevnosti, zejména částečné dehydratace částic ošetřením acetonem či jinými organickými rozpouštědly, popř.a s výhodou roztoky takových komerčních lepidel v organických rozpouštědlech, které . po parciálním zaschnutí vytvoří ochrannou mikrovrstvu ve vodě nerozpustného filmu na povrchučástice, za individuální volby podmínek ošetření, za předpokladu z technologického hlediska nepříliš významné limitace enzymové reakční rychlosti difúzí.The method for producing the Mobilized Cells of the invention also includes processes for permeabilizing the cells prior to mobilization and / or cell mobilization. permeabilization of the resulting cellular aggregates after Mobilization, especially in those cases where whole native cells and / or cells were used as starting material. where the post-treatment techniques of the mobilized particles have been used to increase their mechanical stability and strength, in particular partial dehydration of the particles by treatment with acetone or other organic solvents, and preferably solutions of such commercial adhesives in organic solvents which. upon partial drying, it forms a protective micro-layer of the water-insoluble film on the surface of the particle, under individual treatment conditions, provided that the enzymatic reaction rate of diffusion is not very significant from a technological point of view.
Pro výrobu Mobilizovaných buněk podle vynálezu, lze principiálně použít nejen různé druhy a kmeny proka^yontních a eukaryontních mikrobiálních buněk s různými enzymovými aktivitami, ale i buněk rostlinných, a to jak u mikrobiálních, tak rostlinných buněk bez ohledu na to, zda je požadovaná enzymová aktivita /požadovaný enzym resp. enzymy/ lokalizovaná Ί v periplasmatickém či vnitrobuněčném prostoru /v cytoplasmě buňky/. Stejně tak v dostatečně širokém rozmezí, které je dokumentováno příklady provedení, není zásadně rozhodující kvalita enzymu, resp. typ žádané enzymové katalyzované biochemické reakce.In principle, not only various types and strains of procured and eukaryotic microbial cells with different enzyme activities, but also plant cells, both in microbial and plant cells, regardless of whether the enzyme is desired, can be used to produce the mobilized cells of the invention. activity / desired enzyme resp. enzymes (localized Ί in the periplasmic or intracellular space / in the cytoplasm of a cell). Similarly, the quality of the enzyme and the quality of the enzyme, respectively, is not critical in a sufficiently wide range, as illustrated by the examples. the type of enzyme-catalyzed biochemical reaction desired.
Pro daný typ prokaryontní nebo eukaryontní buňky je v návaznosti na lokalizaci požadovaného enzymu v buňce a na kvalitě enzymu resp. typu enzymově katalyzované biochemické reakce a známém nebo předpokládaném chemickém složení buněčných povrchů /peptidoglykan, lipoprotein,’ lipopolysacharid, chitin, c'hitozan apod./ nutno -specificky volit techniku Mobilizace, např. mražení, stání, míchání apod. a především techniku permeabilizace buněk před a/nebo po vazbě, zvláště slouží-li jako výchozí materiál pro Mobilizací čerstvé, neporušené, nativní, živé buňky.For a given type of prokaryotic or eukaryotic cell, it depends on the localization of the desired enzyme in the cell and the quality of the enzyme, respectively. type of enzyme-catalyzed biochemical reaction and known or predicted chemical composition of cell surfaces (peptidoglycan, lipoprotein, lipopolysaccharide, chitin, c'hitozan etc.) / it is necessary to select the mobilization technique, eg freezing, standing, stirring etc. and especially the cell permeabilization technique before and / or after binding, especially when fresh, intact, native, living cells serve as the starting material for Mobilization.
Vlastní techniky uvedeného způsobu imobilizace podle vynálezu je nutno rovněž volit v závislosti na předpokládané četnosti a dostupnosti reagujících skupin, které jsou součástí buněčného povrchu a jsou tedy určeny druhem a fyziologickým.stavem Mobilizované buněčné populace. V těch případech, kdy se použije buněk, u nichž je známo či předpokládáno, že četnost a dostupnost reagujících skupin buněčného povrchu . je nízká, zejména u rostlinných buněk, lze postup podle vynálezu s výhodou kombinovat předchozí flokulací nativní buněčné suspenze flokulanty obsahujícími sloučeniny, které nesou nejméně dvě· primární a/nebo sekundární aminoskupiny, a takto předem fyzikálně chemicky vytvořené agregáty se po odsátí nebo přímo vmíchají do roztoku RRP, čímž se jednak usnadní předchozí vzájemný kontakt buněk, jednak obohatí povrch buněk skupinami vstupujícími do reakce.The actual techniques of said method of immobilization according to the invention must also be selected depending on the predicted frequency and availability of the reactive groups that are part of the cell surface and are thus determined by the type and physiological status of the mobilized cell population. In those cases where cells are known or suspected to have a frequency and availability of reactive cell surface groups. is low, especially in plant cells, the process according to the invention can advantageously be combined by prior flocculation of the native cell suspension with flocculants containing compounds carrying at least two primary and / or secondary amino groups and thus pre-physically chemically formed aggregates after aspiration or directly mixed into solution of RRP, thereby facilitating prior cell contact with each other and enriching the cell surface with the groups entering the reaction.
Pro výrobuMobilizovaných buněk podle vynálezu lze používat produkčních buněk obsahujících různé enzymy, a to různých druhů a kmenů baktérií, aktinomycet, kvasinek, Mperfektních hub, vyšších parazitických hub a rostlinných buněk. Je^pochopitelně výhodné používat pro Mobilizací buněk mutantních organismů, získaných šlechtěním, selekcí· a nahromadovacími metodami a genetickou manipulací, nebot .získané Mobilizované preparáty pak mají vysokou specifickou aktivitu.Production cells containing various enzymes can be used for the production of the mobilized cells of the invention, namely different types and strains of bacteria, actinomycetes, yeasts, Mperfect fungi, higher parasitic fungi and plant cells. Of course, it is advantageous to use for mobilizing cells of mutant organisms obtained by breeding, selection and accumulation methods and genetic manipulation, as the mobilized preparations obtained have a high specific activity.
Velikost vázaných buněk /částic/ získaných postupem podle vynálezu byla posuzována mikroskopicky /optickým mikroskopem/ s použitím kalibrovaného měrného okuláru. Některé preparáty byly posuzovány rastrovacím elektronovým mikroskopem. Sedimentační vlastnosti byly hodnoceny tak, že 2,5 g vlhké hmoty preparátu bylo suspendováno v celkovém objemu 25 ml demineralizované vody v kalibrovaném odměrném válci a byl sledován čas potřebný ke kvantitativní sedimentaci částic. К analýze velikosti částic bylo‘rovněž použito kovových sít pro sítovou analýzu a vázané buňky byly děleny podle velikosti použitím tří sad těchto sít, přičemž síta měla otvory velikosti od 0,03 až do 2,00 mm.The size of the bound cells (particles) obtained by the method of the invention was assessed microscopically (by optical microscope) using a calibrated measuring eyepiece. Some preparations were scanned by scanning electron microscope. The sedimentation properties were evaluated by suspending 2.5 g of the wet mass of the preparation in a total volume of 25 ml of demineralized water in a calibrated graduated cylinder and monitoring the time required for quantitative sedimentation of the particles. Metal sieves were also used for particle size analysis for sieve analysis and bound cells were sized by using three sets of sieves, with sieves having mesh sizes ranging from 0.03 to 2.00 mm.
Enzymové aktivity imobilizovaných materiálů byly hodnoceny za míchání a temperасе definovaného množství částic vázaných buněk v roztoku substrátu za podmínek měření v oblasti kinetiky nultého řádu enzymové reakce a enzymová aktivita resp. specifická aktivita vyjadřována jako množství vytvořených ^umolů produktu resp. produktů/mg nebo g vlhké hmoty částic, pokud není v příkladech uvedeno jinak. Zachování celé sekvence enzymových reakcí v imobilizovaných buňkách bylo testováno manometricky celkovou produkcí C02 vytvořeného během stanovení ze sacharózy. V případě produkce různých alkaloidů, zejména solanových alkaloidů a fytosterolu, byly tyto látky stanoveny pomocí HPLC chromatografie.Enzyme activities of immobilized materials were evaluated by mixing and tempering a defined amount of bound cell particles in the substrate solution under conditions of measurement in the region of zero order kinetics of the enzyme reaction and enzyme activity respectively. the specific activity expressed as the amount of ^ µmol of product and resp. products / mg or g wet mass of particles unless otherwise indicated in the examples. Retention of the entire sequence of enzyme reactions in immobilized cells was tested manometrically by the total production of CO 2 generated during the sucrose assay. In the case of the production of various alkaloids, in particular brine alkaloids and phytosterol, these were determined by HPLC chromatography.
Získané částice imobilizovaných buněk se po případném mechanickém zpevnění částečnou dehydratací působením organických rozpouštědel, výhodně acetonu, popřípadě roztoky komerčních lepidel v organických rozpouštědlech, po odsátí a parciálním vysušení za sucha či vlhka, mohou vhodným způsobem postformovat, čímž lze regulovat velikost, tvar, charakter, porozitu, specifickou aktivitu a sedimentační vlastnosti imobilizovaných materiálů.The resulting particles of immobilized cells can be deformed in a suitable manner after suctioning and partial dry or wet drying after mechanical consolidation by partial dehydration by the action of organic solvents, preferably acetone or commercial adhesive solutions in organic solvents. porosity, specific activity and sedimentation properties of immobilized materials.
V následujících příkladech provedení se jako látky obsahující alespoň dvě primární a/nebo sekundární aminoakupiny používá komerčních flokulantů typu Sedipur, a to Sedipur CL-930 nebo Sedipur-KA, který obsahuje polyethylenimin o molekulové hmotnosti 200 000 až 300 000 v koncentraci přibližně 30 hmotnostních procent.In the following examples, commercially available Sedipur flocculants, namely Sedipur CL-930 or Sedipur-KA, containing polyethyleneimine having a molecular weight of 200,000 to 300,000 at a concentration of about 30 weight percent are used as substances containing at least two primary and / or secondary aminoacids. .
V dalším je vynález blíže objasněn v příkladech provedení, aniž by se jimi omezoval.In the following, the invention is illustrated in more detail by the examples without limiting them.
Příklady'provedeníExamples
PřikladlHe did
Bylo připraveno 100 ml 1,0% a 100 ml 2,0% /hmotnost/objem/ vodného roztoku Sedipuru CL-930 /BASF, A.G./ v demineralizované vodě. Roztoky byly přelity do 500 ml varných baněk a umístěny na rotační třepací stroj o počtu otáček 260/min. Do těchto roztoků, jejichž pH bylo, 6,1, byl. přidán 25% vodný roztok glutaraldehydu /Merck/ tak, aby jeho koncentrace v reakční směsi činila 0,5 % v případě prvém a*1,0 % /objem/objem/ v případě druhém.100 ml of 1.0% and 100 ml of a 2.0% (w / v) aqueous solution of Sedipur CL-930 (BASF, A.G.) in demineralized water was prepared. The solutions were poured into 500 ml flasks and placed on a rotary shaker at 260 rpm. To these solutions, whose pH was 6.1, was. 25% aqueous solution of glutaraldehyde (Merck) was added so that its concentration in the reaction mixture was 0.5% for the first and * 1.0% (v / v) for the second.
Baňky s reakčními směsmi byly překryty hliníkovou fólií a spuštěno míchání a ve zvolených časových intervalech byla sledována rychlost polymerace spektrófotometricky při 550 nm /Unicam, SP-500, hranaté skleněné kyvety 10 x 10 mm/. Reakce probíhala za nepřetržitého míchání při teplotě 20 °C. Hodnoty absorbancí z jednotlivých vzorků odebíraných v závislosti na čase z reakčních směsí byly měřeny proti demineralizované vodě. Výsledky měření, které indikují přírůstky koncentrací Schiffových bází pro obě reakční směsi, jsou uvedeny v následující tabulce.The flasks with the reaction mixtures were covered with aluminum foil and stirring was started, and the polymerization rate was monitored spectrophotometrically at 550 nm (Unicam, SP-500, square glass cuvettes 10 x 10 mm) at selected time intervals. The reaction was carried out with continuous stirring at 20 ° C. The absorbance values of individual samples taken over time from the reaction mixtures were measured against demineralized water. The results of the measurements, which indicate increments of Schiff base concentrations for both reaction mixtures, are shown in the following table.
/+/ Takto označené a níže uvedené hodnoty absorbancí byly vypočítány z ředění vzorků demineralizovanou vodou, takže značí absolutní hodnoty absorbancí po přepočtu.(+) The absorbance values so indicated and listed below were calculated from the dilution of the samples with demineralized water, so that the absolute values of the absorbances after recalculation are indicated.
Po 24 hodinách reakce vznikly barevné, červenohnědé roztoky, jejichž pH bylo 4,9.After 24 hours of reaction, colored reddish-brown solutions were formed, the pH of which was 4.9.
Dó popsaným způsobem připravených zreagovaných směsí reaktivních rozpustných polymerů /RRP/ bylo vmícháno, intenzívním mícháním, h 25 g vlhké hmoty celých neporušených bakteriálních buněk.Alcaligenes metalcaligenes've formě nepromyté vlhké buněčné pasty, získané odstředěním po kultivaci, s aspartát amoniak lyázovou'aktivitou. Specifická aktivita buněk činila 550 ^unol kys. L-asparagové/min/g vlhké hmoty /37 °0, pH 8^ substrát 1,35 molární roztok fumaranu amonného/. Po vmíchání buněk do každé z . reakčních směsí byly homogenní suspenze přelity na 2 hliníkové misky o průměru 20 cm při výšce vrstvy cca 1,5 cm a uloženy do mrazicího·boxu při teplotě -20 °C po dobu 4 hodin. po této době byly misky z boxu vyjmuty, zmrzlý obsah na miskách ' přelit přibližně 100 ml demineralizované vody a misky ponechány 1 hodinu při teplotě místnosti zvolna · rozmrazit·. Po této době byly vytvořené agregáty přelity do skleněných nádob, v kterých byla předložena demineralizovaná voda v množství 1 litru, zvolna ' promíchány a po jejich kvantitativní sedimentaci stáním byla promývací voda slita a agregáty uvedeným postupem třikrát děkantovány 1 litrem pitné.vody. Poté byly částice vakuově dobře odsáty na fritě přes kalolisovou textilní plachetku a zváženy. Z prvé reakční směsi bylo získáno 16,0 · g vlhké hmoty, z druhé reakční směsi bylo získáno 18,2 g vlhké hmoty imobillzovaných buněk.The reactive soluble polymers (RRP) prepared in the manner described above were mixed, by intensive stirring, with 25 g of wet mass of whole intact bacterial cells. The specific activity was 550 cells to y ^ unol p. L and P aragov s / min / g of humid Ké the HMO / 37 0 p H 8, substrate, and t 1, 3, 5 mole percent solution of ammonium fumarate /. After mixing the cells into each of the cells. reaction mixtures were homogeneous suspension Decant 2 aluminum pan of 20 cm diameter when the layer height of about 1.5 cm and placed in the freezing · ¹H b OXU t e pl at about the -20 DEG C for a period of 4 h and n. p tet d of about bE dishes were characterized boxing exempts y y frozen contents on the plates' poured about 100 ml of deionized water and the plates left for 1 hour at room temperature to thaw slowly · ·. After this time, the formed aggregates were poured into glass containers in which 1 liter of demineralized water was introduced, mixed gently and after their quantitative sedimentation on standing, the wash water was decanted and the aggregates decanted three times with 1 liter of drinking water. The particles were then sucked off well on a frit through a filter cloth and weighed. 16.0 g of wet mass were obtained from the first reaction mixture, and 18.2 g of wet mass of the immobilized cells were obtained from the second reaction mixture.
Dále byla provedena biochemická a další charakterizace obou imobilizovaných materiálů postupy uvedenými v popisu vynálezu a výsledky jsou shrnuty v následující tabulce:Further, biochemical and further characterization of both immobilized materials was performed according to the procedures described in the description of the invention and the results are summarized in the following table:
Příklad 2Example 2
Byl připraven roztok RRP /iniciální koncentrace obou reakČních složek byla 2,0 % Sedipuru CL-930 a 1,0 % glutaraldehydu/ postupem uvedeným v příkladu 1.A RRP solution (initial concentration of both reactants was 2.0% Sedipur CL-930 and 1.0% glutaraldehyde) was prepared as described in Example 1.
Do 100 ml roztoku RRP bylo intenzívně vmícháno 25 g bakteriálních buněk jako v příkladu 1 a dále bylo postupováno stejným způsobem,jak je uvedeno v příkladu 1. Bylo získáno 17,2 g vlhké hmoty dobře odsátých agregátů o specifické aktivitě 512 длпо1 kys. L-asparagové/min/g vlhké hmoty. Získaný materiál byl suspendován v 5o ml 5% roztoku Kanagomu v acetonu předem vychlazeného na -20 °C a po 3minutovém míchání při teplotě místnosti byl materiál ostře vakuově popsaným způsobem odsát a na fritě odsáván po dobu přibližně 15 minut tak, aby došlo к částečnému zaschnutí lepidla na povrchu jednotlivých částic. Po této době byl materiál zvážen /10,5 g/ a suspendován ve 100 ml 1,35 M roztoku fumaranu amonného, pH 8,5 a uložen přes noc při teplotě +8 °C. Poté byl materiál znovu vakuově odsát, na fritě promyt 1 litrem vody a dobře odsátý zvážen /13,0 g/.25 g of bacterial cells as in Example 1 were intensively mixed into 100 ml of RRP solution and the same procedure as in Example 1 was followed. 17.2 g of wet mass of well aspirated aggregates having a specific activity of 512 л о 1 L- was obtained. aspartic / min / g wet mass. The resulting material was suspended in 5 ml of a 5% Kanagom in acetone solution previously cooled to -20 ° C and after stirring at room temperature for 3 minutes, the material was vacuum aspirated sharply as described and sucked off on the frit for approximately 15 minutes to partially dry. adhesives on the surface of individual particles. After this time, the material was weighed (10.5 g) and suspended in 100 ml of a 1.35 M ammonium fumarate solution, pH 8.5 and stored overnight at +8 ° C. The material was then vacuum vacuumed, washed with 1 liter of water on the frit and weighed well (13.0 g).
Specifická aktivita materiálu Činila 180 <umol kys. L-asparagové/min/g vlhké hmoty, materiál byl tvořen pevnými drsnými ohraničenými destičkami s průměrnou distribucí velikosti částic 400 až 600 ^um, а к jeho kvantitativní sedimentaci vedlo 2minutové stání.The specific activity of the material was 180 µmol of L-aspartic acid / min / g of wet mass, the material consisted of solid rough bounded plates with an average particle size distribution of 400 to 600 µm, and its quantitative sedimentation was caused by standing for 2 minutes.
P ř í к 1 a d 3Example 1 a d 3
Byl připraven roztok RRP jak je uvedeno v příkladu 1 a 2 s tím rozdílem, že reakční doba činila 3 hodiny za jinak stejných podmínek.A RRP solution as described in Examples 1 and 2 was prepared except that the reaction time was 3 hours under otherwise identical conditions.
Do 100 ml tohoto roztoku RRP bylo vmícháno 25 g bakteriálních buněk jako v příkladu 1 a 2 a dále bylo v přípravě imobilizováných buněk postupováno stejně jako v příkladu 2, s tím rozdílem, že před ošetřením materiálu roztokem lepidla v acetonu byly agregáty permeabilizovány tříhodinovým mícháním /rotační třepací stroj 260 ot/min., 30 °C/ ve 100 ml 1,0 M vodného roztoku síranu amonného o pH 8,5 obsahujícího 0,1 % tenzidu /Slovafol 909/, po této době byl materiál popsaným způsobem vakuově dobře odsát, promyt 1 litrem vody, znovu odsát, zvážen /16,0 g/ a poté teprve dále ošeUřen, jak je uvedeno v příkladu 2.25 g of bacterial cells as in Examples 1 and 2 were mixed into 100 ml of this RRP solution, and the preparation of immobilized cells was carried out as in Example 2, except that the aggregates were permeabilized by stirring for three hours prior to treatment of the material with acetone adhesive. rotary shaker 260 rpm, 30 ° C / in 100 ml of a 1.0 M aqueous ammonium sulfate solution at pH 8.5 containing 0.1% surfactant (Slovafol 909), after which time the material was well vacuumed as described , washed with 1 liter of water, aspirated again, weighed (16.0 g) and then further treated as described in Example 2.
Bylo získáno 10 g vlhké hmoty imobilizováných buněk, jejichž specifická aktivita činila 250/umol kys. L-asparagové/min/g vlhké hmoty, materiál byl tvořen pevnými, drsnými, ohraničenými destičkami s průměrnou distribucí velikosti částic 300 až 550 ^um а к jeho kvantitativní sedimentaci vedlo 3minutové stání.10 g of wet mass of immobilized cells were obtained, whose specific activity was 250 µmol L-aspartic acid / min / g wet mass, the material consisted of solid, rough, bounded plates with an average particle size distribution of 300 to 550 µm and its quantitative sedimentation was led by standing for 3 minutes.
Příklad 4Example 4
300 g vlhké hmoty čerstvé vlhké pasty nativních celých bakteriálních buněk Escherichia coli, sklizené po kultivaci odstředěním, o specifické aktivitě penicilinacylázy 8,0/umol 6-APK/hod/mg vlhké hmoty buněk /42 °C, pH 7,6, substrát K-sůl benzylpenicilinu/, bylo suspendováno do 1 litru roztoku RRP, vzniklého reakcí 2% Šedipuru КА a 1% glutaraldehydu při 30 °C v průběhu 24hodinové reakce, postupem, který je popsán v příkladu 1, do formy homogenní suspenze, intenzívním mícháním ocelovým vrtulovým míchadlem. Poté byla suspenze rozdělena na přibližně 4 stejné objemové díly /А 320 ml/ a každý díl separátně nalit do igelitových sáčků, otvory sáčků byly několika přehyby zajištěny kovovými svorkami, a sáčky uloženy ve vodorovné poloze po dobu cca 5 hodin do mrazicího boxu při teplotě -20 až -25 °C; síla vrstvy reakční směsi po uložení sáčků ve vodorovné poloze činila cca 1,5 až 2 cm.300 g wet mass of fresh wet paste of native whole bacterial Escherichia coli cells, harvested by centrifugation after cultivation, with specific penicillin acylase activity 8.0 / µmol 6-APK / hr / mg wet cell mass / 42 ° C, pH 7.6, substrate K benzylpenicillin salt] was suspended in 1 liter of RRP solution formed by the reaction of 2% Šedipur КА and 1% glutaraldehyde at 30 ° C during the 24-hour reaction, as described in Example 1, to form a homogeneous suspension by vigorous stirring with a steel propeller. stirrer. The suspension was then divided into approximately 4 equal volumes (A 320 ml) and poured separately into plastic bags, the holes of the bags were secured with metal clamps over several folds, and the bags were placed in the freezer at a temperature of - 20 to -25 ° C; The layer thickness of the reaction mixture after placing the bags in a horizontal position was about 1.5 to 2 cm.
Po této době byly sáčky z mrazicího boxu vyjmuty, zmrzlý obsah v sáčcích mechanicky rozlámán, sáčky rozstřiženy, a jejich obsah vnesen do 10 litrů předložené demineralizované vody 25 °C teplé, umístěné ve skleněné nádobě. Materiál byl v průběhu 1 až 2 hodin mírným přerušovaným mícháním rozmražen a po kvantitativní sedimentaci vytvořených částic byla promývací voda slita a materiál 3krát děkantován 5 litry pitné vody. Poté byly agregáty vakuově na nuči ještě promyty 5 litry pitné vody a znovu dobře odsáty do formy vlhkého koláče.After this time, the bags were removed from the freezer, the frozen contents in the bags were mechanically broken, the bags were cut, and their contents were placed in 10 liters of 25 ° C warm demineralized water placed in a glass container. The material was thawed by gentle intermittent stirring over 1 to 2 hours and after quantitative sedimentation of the formed particles, the wash water was decanted and the material decanted 3 times with 5 liters of drinking water. Thereafter, the aggregates were further washed with 5 liters of drinking water under vacuum and sucked well again into a wet cake.
215 g vlhké hmoty dobře odsátého materiálu bylo za míchání suspendováno v 500 ml předem vychlazené směsi aceton/voda /1 : 1/ na teplotu -15 °C a 3 minuty při teplotě místnosti intenzívně částice ve zředěném acetonu promíchány. Po této době byl materiál vakuově ostře odsát, 5 až 10 minut na nuči ještě prosáván a poté promyt cca 5 litry pitné vody, znovu dobře odsát a suspendován v 1 litru 0,05 M fosfátového pufru pH 7,6 a ponechán botnat přes noc při +8 °C. ф 215 g of wet mass of well aspirated material was suspended with stirring in 500 ml of pre-cooled acetone / water (1: 1) to -15 ° C and vigorously mixed in dilute acetone for 3 minutes at room temperature. After this time, the material was vacuum aspirated, sieved for 5 to 10 minutes and then washed with about 5 liters of drinking water, aspirated well again and suspended in 1 liter of 0.05 M phosphate buffer pH 7.6 and allowed to swell overnight at room temperature. +8 ° C. ф
Celkem bylo získáno 180 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk o specifické aktivitě penicllinacylázy 6,5 ^umol 6-APK/hod/mg vlhké hmoty, materiál byl tvořen ohraničenými destičkami в průměrnou distribucí velikosti částic 150 až 450 /um а к jeho kvantitativní sedimentaci vedlo 5minutové stání.A total of 180 g of wet mass of immobilized cells with specific penicillin acylase activity of 6.5 µmol 6-APK / hr / mg wet mass was obtained, the material consisted of confined platelets with an average particle size distribution of 150 to 450 µm and resulting in a quantitative sedimentation of 5 min. stání.
Příklad 5Example 5
250 g vlhké hmoty zesítěných a permeabilizovaných bakteriálních buněk E. coli s penicilinacylázovou aktivitou /specifická aktivita činila 7,0дипо1 6-APK/hod/mg vlhké hmoty/, přičemž postup síténí a permeabilizace individuálních buněk E. coli je popsán v čs. autorském osvědčení č. 203 607, bylo vmícháno do 1 litru RRP, jehož postup přípravy byl uveden v příkladu 1, s tím rozdílem, že reakční doba tvorby RRP činila 5 hodin. Po rozmíchání buněk v roztoku RRP do formy homogenní suspenze bylo dále ve výrobě imobilizovaných buněk postupováno podle příkladu 4, včetně ošetření materiálu směsí aceton/voda.250 g of wet mass of cross-linked and permeabilized E. coli bacterial cells with penicillin acylase activity / specific activity was 7.0dpi-6-APK / hr / mg wet mass /, the process of sieving and permeabilizing individual E. coli cells is described in MS. No. 203,607, was mixed into 1 liter of RRP, the preparation procedure of which was given in Example 1, except that the reaction time of the formation of RRP was 5 hours. After mixing the cells in the RRP solution to form a homogeneous suspension, the production of immobilized cells was followed according to Example 4, including treatment of the material with an acetone / water mixture.
Bylo získáno celkem 166 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk s penicilinacylázovou aktivitou, jejichž specifická aktivita činila 6,0/umol 6-APK/hod/mg vlhké hmoty, materiál byl tvořen ohraničenými hnědočernými destičkami s průměrnou distribucí velikosti 180 až 400/um а к jeho kvantitativní sedimentaci vedlo 3minutové stání.A total of 166 g of wet mass of immobilized cells with penicillin acylase activity was obtained, the specific activity of which was 6.0 / µmol 6-APK / hr / mg wet mass, the material consisted of bounded brown-black plates with an average size distribution of 180-400 µm and quantitative sedimentation was led by standing for 3 minutes.
PříkladeExample
40,0 g vlhké hmoty čerstvých nativních buněk E. coli s penicilinacylázovou aktivitou jako v příkladu 4, bylo homogenně suspendováno ve 150 ml roztoku RRP rovněž jak je uvedeno v příkladu 4 a směs byla rozplněna do 10 ml polyethylenových kyvet a v závislosti na použité relativní odstředivé síle byla prováděna tvorba částic imobilizovaných buněk. Reakce probíhala při 20 °C po dobu 3 hodin. Po reakci byly preparáty dvakrát dekantovány vodou, vakuově odsáty přes textilní materiál a ošetřeny směsí aceton/voda jako v příkladu 4 a ponechány bobtnat přes noc, rovněž jak je uvedeno v příkladu 4. Poté byly znovu vakuově odsáty, zváženy a dále charakterizovány. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.40.0 g of wet mass of fresh native E. coli cells with penicillin acylase activity as in Example 4 was homogeneously suspended in 150 ml RRP solution as described in Example 4 and the mixture was filled into 10 ml polyethylene cuvettes and depending on the relative centrifugation was performed to form particles of immobilized cells. The reaction was carried out at 20 ° C for 3 hours. After the reaction, the preparations were decanted twice with water, vacuum aspirated through textile material and treated with acetone / water as in Example 4 and allowed to swell overnight as in Example 4. They were then vacuum aspirated, weighed and further characterized. The results are summarized in the following table.
Poznámka i metody hodnocení imobilizovaných preparátů jsou uvedeny v popisu vynálezu.Note and methods for evaluating immobilized preparations are provided in the disclosure.
P ř I k 1 . a a 7 g vlhké hmoty čerstvé nativní pasty buněk Escherichia coli obsahujících enzym beta-galaktosidázu 'bylo intenzívně suspendováno ve 100 ml roztoku RRP připraveného 24hodlnovou reakcí jak je uvedeno v příkladu 1 s tím rozdílem, že iniciální koncentrace obou reakčních složek při·přípravě RRP byla 5 % /hmota/objem/ Sedipuru CL-930 a 2,0 % /objem/objem/ glutaraldehydu· Specifická aktivita čerstvé nativní pasty ' buněk činila 0,42 /unolů glukózy + galaktózy/mln/g vlhké hmoty nativních buněk /37 pH 7^ substrát roztok laktózy^/.Example 1. aa 7 g of wet mass of fresh native Escherichia coli cell paste containing beta-galactosidase enzyme was vigorously suspended in 100 ml of 24-hour RRP solution as described in Example 1 except that the initial concentration of both reactants in RRP preparation was 5 % / w / v / Sedipur CL-930 and 2.0% / v / v / glutaraldehyde · the specific activity of the native fresh paste 'was 0.42 cells / glucose + galactose unolů y / mln / g in H LHKE native mot y b un EK / 3 ^ 7 pH 7 Substrate a solution of l and t to t o zy ^ /.
Homogenní buněčná suspenze byla ponechána reagovat stáním při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Po této době byl vzniklý houbovitý precipitát buněčných agregátů vakuově, v předchozích příkladech popsaným způsobem, odsát a vzniklá hmota byla vpravena ve formě vlhkého koláče do sáčku z kalolisové tkaniny, otvor sáčku přehnut a zajištěn kovovými svorkami, . sáček vložen .. mezi 2 kovové desky ve vodorovné potaze a vystaven filtračnímu tlaku 1,25 . 104 kpa pomocí hydraulického lisu při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Po této době byla tmavá pevná hmota ve formě desky mechanicky rozrušena rozlámáním na menší kousky a tyto vneseny do 100 ml vody předložené v kuchyňském mixéru a při nejnižším nastavení rychlosti otáček s přerušovaným vypínáním a zapínáním desintegrovány na drobnější částice. Po desintegraci a homogenizaci byl materiál třikrát dekantován 0,5 litry vody, vakuově dobře odsát, zvážen /16,2 g/ a vpraven do 100 ml 1 M roztoku NaCl obsahujícího 0,2 % tenžidu:/Slovafol 910/ a 1 % dimethylsulfoxidu, suspenze byla vytemperována . na 40 °C po dobu 3 · hodta při uvedené teplotě nepřetržitě míchána. Po permeabilizaci byly částice 3krát dekantovány 1 litrem pitné vody, vakuově popsaným způsobem dobře odsáty a vneseny do 0,1 M fosfátového pufru pH 7,0 a ponechány bobtnat přes noc. 'The homogeneous cell suspension was allowed to react at room temperature for 2 hours. After this time, the resulting spongy precipitate of cellular aggregates was vacuum aspirated, as described in the previous examples, and the resulting mass was introduced in the form of a wet cake into a filter press bag, the bag opening was folded and secured with metal clamps. .. bag inserted between two metal é des ky in a trued d s account and TX Aven fil tration t he s and the thickness at 1, 2 5th 10 4 kp and using a hydraulic press at room temperature for 2 hours. After this time, the dark solid in the form of a plate was mechanically disrupted by breaking into smaller pieces and these were introduced into 100 ml of water presented in a kitchen mixer and disintegrated into smaller particles at the lowest intermittent on / off speed. After disintegration and homogenization, the material was decanted three times with 0.5 liters of water, sucked off well, weighed (16.2 g) and introduced into 100 ml of a 1 M NaCl solution containing 0.2% of the same: (Slovafol 910) and 1% dimethyl thyl su ox id for LF, and the slurry was rub erována p. at 40 ° C d a b u 3 · Throw at temperatures above e of continuously stirred. After permeabilization, the particles were decanted 3 times with 1 liter of drinking water, aspirated well in a vacuum manner and placed in 0.1 M phosphate buffer pH 7.0 and allowed to swell overnight. '
Po odsátí a promytí imobilizovaných buněk bylo získáno ' celkem 13,2 g vlhké hmoty nepravidelných tmavých amorfních · částic ve formě velmi rychle sedimentujících hrudek, jejichž specifická aktivita činila 0,12<>mol glukózy .+ galaktózy/min/g vlhké hmoty s distribucí velikosti částic 0,5 až 2,6 mm.After aspirating and washing the immobilized cells, a total of 13.2 g of wet mass of irregular dark amorphous particles were obtained in the form of very rapidly sedimenting lumps with a specific activity of 0.12 <> mol glucose + galactose / min / g wet mass with distribution particle sizes of 0.5 to 2.6 mm.
Příklad . 8 g ' vlhké hmoty nativních celých.buněk E. coli s beta-galaktosidázovou aktivitou jako v příkladu 7, bylo vpraveno do 100 ml 0,5 M toztoku NaCl, který obsahoval 0,5 % tenzidu /Slovafol 910/, suspenze byla intenzívním mícháním důkladně homogenizována a poté přelita do 500 ml varné baňky, baňka překryta hliníkovou folií a umístěna na rotační třepací stroj o počtu otáček 260/min. Suspenze nativních buněk byla permeabilizována po dobu 20 minut za nepřetržitého .míchání při . teplotě 30 °C. Poté byly buňky odstředěny /20 000 g/10 mtaut/, supernatant slit a sediment buněčné pasty zvážen.Example. 8 g of wet mass of native whole E. coli cells with beta-galactosidase activity as in Example 7 were introduced into 100 ml of 0.5 M NaCl solution containing 0.5% surfactant (Slovafol 910), the suspension was vigorously stirred thoroughly homogenized and then poured into a 500 ml boiling flask, covered with aluminum foil and placed on a rotary shaker at 260 rpm. Suspensions of native cells were permeabilized for 20 minutes with no pre tr fo th .míc h at th e. te p ture of 30 ° C. Then the cells were centrifuged ňky / 20,000 g / 10 mtaut /, the supernatant discarded and the cell paste pellet weighed.
. g vlhké hmoty'popsaným způsobem ošetřených buněk bylo suspendováno ve 100 ml roztoku RRP, připraveného, jak je .uvedeno v příkladu 2, do formy homogenní suspenze a imobilizace buněk byla provedena mražením reakční směsi postupem uvedeným rovněž v příkladu 2 včetně ošetření vzniklých částic po imobilizaci, s . tím rozdílem, že 17 g vlhké hmoty vzniklých částic bylo suspendováno . v 50 ml čistého acetonu předem vychtazen^o na teplot -2° °c, přičemž ošetření acetonem za intenzivního' míchání trvalo 3 minuty, poté byl materiál rychle a ostře na frltě. vakuově odsán, promyt vodou a ponechán bobtnat přes noc v prostředí 0,1 M fosfátového pufru pH 7,0 při ' teplotó +8 °C.. The wet mass of the treated cells was suspended in 100 ml RRP prepared as described in Example 2 to form a homogeneous suspension and the immobilization of the cells was performed by freezing the reaction mixture as described in Example 2, including treatment of the resulting particles after immobilization. , p. except that 17 g of wet mass formed part i c p was sus end Digital and NO. or in 50 ml of acetone st eh in advance vychtazen ^ o to -2 ° C, eg IR em from the treatment with acetone under vigorous' stirring continued for 3 minutes, then the material is rapidly and sharply to frltě. vacuum-evacuated, washed with water and allowed to swell overnight in 0.1 M phosphate eh O P f u ru p H 7.0 at a 'temperature of + 8 ° C.
Celkem bylo získáno 12,6 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk o specifické aktivitě. beta-galaktosldásy 0,3Θ/unol glukózy + galaktózy/min/g vlhké hmoty, · s průměrnou distribucí velikosti · částic 85 až 400 /im, materiál . byl tvořen destičkami s nepravidelhými·okraji a k · jeho kvantitativní sedimentaci vedlo Sminutové stání.A total of 12.6 g of wet mass of immobilized cells with specific activity was obtained. beta-galactose dase 0.3Θ / unol glucose + galactose / min / g wet matter, · average particle size distribution · 85 to 400 µm, material. was formed by platelets with irregular edges and its quantitative sedimentation was caused by standing for one minute.
Příklad 9Example 9
2,5 kg vlhké hmoty Čerstvých nativních buněk Bacillus megatherium, sklizených před skončením exponenciální fáze růstu, s proteolytickou aktivitou 38 azokaseinových jednotek/g vlhké hmoty /37 °C, pH 7,5, substrát azokasein/ bylo suspendováno v 10 litrech demineralizované vody/ suspenze intenzívním mícháním homogenizována a ochlazena na +5 °C. Poté byla' suspenze desintegrována trojnásobným průchodem štěrbinovým mechanickým desintegrátorem při tlaku 25,1 mPa. Suspenze mezi jednotlivými desintegracemi byla průběžně chlazena tak, aby maximální teplota desintegrované směsi nepřesáhla 35 °C.2.5 kg of wet mass Fresh Bacillus megatherium native cells harvested before the exponential growth phase, with proteolytic activity of 38 azokassein units / g wet mass (37 ° C, pH 7.5, azocasin substrate) were suspended in 10 liters of demineralized water / homogenize the suspension by vigorous stirring and cool to +5 ° C. The suspension was then disintegrated by passing three times through a slotted mechanical disintegrator at a pressure of 25.1 mPa. The suspension between the individual disintegrations was continuously cooled so that the maximum temperature of the disintegrated mixture did not exceed 35 ° C.
К 1 litru desintegrované suspenze nativních buněk, jejíž pH bylo upraveno na hodnotu 7,5 20% roztokem NaOH za nepřetržitého míchání*, byl přidán flokulant, Sedipur KA, v takovém množství, aby jeho aktuální koncentrace v desintegrované suspenzi Činila 0,25 % /objem/objem/. Suspenze byla důkladně promíchána, ponechána stát při teplotě místnosti po dobu přibližně 1 hodiny v klidu až bylo pozorovatelné, že došlo ke kvantitativní flokulaci buněčného detritu.A flocculant, Sedipur KA, was added to 1 liter of the disintegrated native cell suspension, whose pH was adjusted to 7.5 with 20% NaOH with continuous stirring *, in such an amount that its actual concentration in the disintegrated suspension was 0.25% / volume. The suspension was thoroughly mixed, allowed to stand at room temperature for about 1 hour at rest until it was noticeable that quantitative flocculation of cellular detritus occurred.
Po této době bylo к 1 litru suspenze přidáno 2 litry roztoku RRP připraveného 24hodinovou reakcí postupem,jak jé uvedeno v příkladu 1 s tím rozdílem, že iniciální koncentrace obou reakčních složek při přípravě RRP byla 4 % /hmota/objem/ Sedipuru KA a 2 % /objem/objem/ glutaraldehydu. Vmíchání 2 litrů roztoku RRP do 1 litru suspenze buněk po desintegraci bylo provedeno pomalým ručním mícháním pomocí nerezového kopiště tak, aby nebyly narušeny předem vytvořené vyflokulované částice.After this time, 2 liters of the 24-hour RRP solution prepared as described in Example 1 was added to 1 liter of suspension, except that the initial concentration of both reactants in the preparation of RRP was 4% (w / v) Sedipur KA and 2%. / volume / volume / glutaraldehyde. The mixing of 2 liters of RRP solution into 1 liter of cell suspension after disintegration was performed by slow manual agitation using a stainless steel lance so as not to disturb the pre-flocculated particles.
Po 2 hodinách stání byla silně viskozní vyvločkováná a částečně zreagovaná suspenze pomalu promíchána a rozplněna do 10 polyethylenových sáčků po přibližně 0,3 litrech a dále bylo postupováno jako v příkladu 4 s tím rozdílem, že imobilizované částice byly po imobilizaci ošetřeny čistým acetonem předem vychlazeným na -20 °C tříminutovým intenzívním mícháním, poté ostře vakuově odsáty, několikrát dekantovány vodou a vpraveny do 1 litru 0,1 M fosfátového pufru, pH 7,5, kde byly ponechány botnat přes noc při teplotě +8 °C.After standing for 2 hours, the highly viscous flocculated and partially reacted slurry was slowly mixed and filled into 10 polyethylene bags of approximately 0.3 liters and proceeded as in Example 4 except that the immobilized particles were treated with pure acetone pre-chilled after immobilization. -20 ° C with vigorous stirring for three minutes, then vigorously aspirated, decanted several times with water and added to 1 liter of 0.1 M phosphate buffer, pH 7.5, where they were allowed to swell overnight at +8 ° C.
Celkem bylo získáno plavením na sítech, jak je uvedeno v popisu vynálezu, 1,28 kg vlhké hmoty imobilizovaných částic postupným zpracováním výchozí suspenze, přičemž specifická aktivita materiálu činila 3,62 azokaseinových jednotek/g vlhké hmoty s průměrnou distribucí velikosti částic 0,4 až 2,0 mm, přičemž ke kvantitativní sedimentaci částic vedlo 2minutové stání.In total, 1.28 kg wet mass of immobilized particles were obtained by sieving on screens as described in the description by successive processing of the initial suspension, with a specific material activity of 3.62 azo-casein units / g wet mass with an average particle size distribution of 0.4 to 0.4 2.0 mm, with a 2-minute standing for quantitative sedimentation of the particles.
Příklad 10Example 10
Do 100 ml 0,05% vodného roztoku NaCl, jehož pH bylo upraveno na hodnotu 7,0 20% roztokem NaOH, bylo suspendováno 5o g vlhké hmoty čerstvých celých nativních buněk Bacillus megatherium s proteolytickou aktivitou, jak je uvedeno v příkladu 9. Po homogenizaci suspenze bylo pH znovu popsaným způsobem upraveno na hodnotu 7,0, poté byl přidán vaječný lyofilizovaný lysozym tak, aby jeho koncentrace v suspenzi činila 100 ^ug/ml a po 30 minutách stání bylo pH suspenze opatrně roztokem NaOH za míchání nastaveno na hodnotu 8,6 a suspenze zahřáta na 50 °C po dobu několika minut, až došlo к náhlé změně viskozity suspenze а к enzymové lyži buněčných stěn.To 100 ml of a 0.05% aqueous NaCl solution, adjusted to pH 7.0 with 20% NaOH, was suspended 5o g of wet whole fresh Bacillus megatherium whole cells with proteolytic activity as described in Example 9. After homogenization the pH of the suspension was adjusted to 7.0 again as described, then the egg lyophilized lysozyme was added to a concentration of 100 µg / ml in the suspension, and after 30 minutes of standing the pH of the suspension was carefully adjusted to 8 with stirring with NaOH. 6 and the suspension is heated to 50 ° C for a few minutes until a sudden change in viscosity of the suspension and enzyme lysis of the cell walls occurs.
Poté bylo к suspenzi, bez předchozí flokulace, přidáno 100 ml roztoku RRP o koncentraci reakčních složek podle příkladu 9, suspenze intenzívně promíchána a dále při imobilizaci postupováno včetně ošetření částic acetonem po imobilizaci jako v příkladu 8 /mražení reakční směsi/.Thereafter, 100 ml of the reactive concentration RRP solution according to Example 9 was added to the suspension, without prior flocculation, the suspension was vigorously mixed and the immobilization step was followed, including treatment of the particles with acetone after immobilization as in Example 8 (freezing of the reaction mixture).
Bylo získáno 30 g vlhké hmoty imobilizovaných částic, které vykazovaly 2,4 azokaseinových jednotek/g vlhké hmoty s průměrnou distribucí velikosti 0,2 až 1,0 mm, přičemž ke kvantitativní sedimentaci vedlo 3minutové stání.30 g of wet mass of immobilized particles were obtained, which showed 2.4 azo-casein units / g wet mass with an average size distribution of 0.2 to 1.0 mm, with a quantitative sedimentation of 3 minutes standing.
Přikladli >They added>
g vlhké hmoty čerstvé nativní pasty buněk kvasinky Kluyveromyces fragills, obsahující enzym beta-galaktosidázu o specifické aktivitě 0,017 ^imolů glukózy + galaktozy/min/mg vlhké hmoty /37 °C, pH 6,0, substrát laktózy/, bylo suspendováno ve 100 ml 0,1 M fosfátového pufru pH 7,0, který obsahoval 0,1 % tenzidu /Slovafol 910/ a 1 % dimethylsulfoxidu a suspenze byla zahřáta na 40 °C a při této teplotě nepřetržitě míchána po dobu 30 min. Po této době byly permeabilizované buňky odstředěny, 5 000 g/10 minut, supernatant slit a sediment buněčné pasty zvážen.g of wet mass of fresh native cell paste of Kluyveromyces fragills, containing a beta-galactosidase enzyme having a specific activity of 0.017 µm glucose + galactose / min / mg wet mass (37 ° C, pH 6.0, lactose substrate), was suspended in 100 mL 0.1 M phosphate buffer pH 7.0 containing 0.1% surfactant (Slovafol 910) and 1% dimethylsulfoxide and the suspension was heated to 40 ° C and stirred continuously at this temperature for 30 min. After this time, the permeabilized cells were centrifuged at 5,000 g / 10 minutes, the decant supernatant and the cell paste sediment weighed.
g vlhké hmoty popsaným způsobem permeabilizovaných buněk bylo imobilizováno a oěetřeno jako v příkladu 8, s tím rozdílem, že ošetření částic po imobilizaci bylo provedeno 1% roztokem Kanagomu v acetonu za jinak stejných podmínek ošetření a botnání, jak je uvedeno v příkladu 8.g of wet mass in the manner of permeabilized cells described above was immobilized and treated as in Example 8, except that treatment of the particles after immobilization was performed with a 1% Kanagom in acetone solution under otherwise the same treatment and swelling conditions as in Example 8.
Bylo získáno 15 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk o specifické aktivitě 0,02 дцп glukózy + galaktózy/min/mg vlhké hmoty .částic, distribuce velikosti se pohybovala průměrně od 0,2 do 1,5 mm a ke kvantitativní sedimentaci vedlo 2minutové stání při poměrně objemném sedimentu agregátů, které měly vatovitý charakter.15 g of wet mass of immobilized cells with a specific activity of 0.02 δ glucose + galactose / min / mg wet mass of particles were obtained, the size distribution ranged from 0.2 to 1.5 mm on average and resulted in quantitative sedimentation for 2 minutes at relatively voluminous sediment aggregates, which had a cotton wool character.
Příklad 12 g vlhké hmoty čerstvých celých buněk kvasinky Cryptococcus laurentii 8 L-alfa-amino-epsilon-aminokaprolaktam hydrolazovou aktivitou o specifické aktivitě 5,9<ито1й L-lysinu/ /hod/mg vlhké hmoty /37 °C# pH 7,5, substrát vodný roztok L-alfa-amino-epsilon-kaprolaktamu/, bylo intenzívním mícháním suspendováno v 100 ml roztoku RRP připravených jak uvedeno v příkladu 2 a po lhodinovém pomalém míchání byla silně viskózní vatovitá suspenze dále imobilizována technikou mražení jako v příkladu 2, včetně ošetření agregátů po imobilizaci roztokem lepidla v acetonu. Vzniklé odsáté agregáty byly uloženy přes noc botnat ve fosfátovém pufru pH 7,0 při +8 °C.Example 12 g wet mass of fresh whole cells of yeast Cryptococcus laurentii 8 L-alpha-amino-epsilon-aminocaprolactam by hydrolase activity with specific activity of 5,9% L-lysine / h / mg wet mass / 37 ° C # pH 7.5 , the substrate aqueous solution of L-alpha-amino-epsilon-caprolactam) was suspended by vigorous stirring in 100 ml of the RRP solution prepared as described in Example 2 and after stirring for 1 hour the strongly viscous cotton wool slurry was further immobilized by freezing as in Example 2, treatment of aggregates after immobilization with a solution of glue in acetone. The resulting aspirated aggregates were stored overnight in phosphate buffer pH 7.0 at +8 ° C.
Bylo získáno 15 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk o specifické aktivitě 3,2/umolů L-lysinu/hod/mg vlhké hmoty, s průměrnou distribucí velikosti částic v rozsahu 0,125 až 1,5 mm а к jejich kvantitativní sedimentaci vedlo 2minutové stání. Makroskopicky tvořily Částice nepravidelné útvary s nepravidelnými okraji.15 g of wet mass of immobilized cells with a specific activity of 3.2 [mu] moles of L-lysine / hr / mg wet mass were obtained, with an average particle size distribution in the range of 0.125 to 1.5 mm and a 2 minute standing to quantitate sedimentation. Macroscopically, the particles formed irregular shapes with irregular edges.
Příklad 13 g vlhké pasty čerstvých nativních buněk Mycobacterium sp., obsahující епгут dekarboxylázu L-asparagové kyseliny o specifické aktivitě 7,1 j/g vlhké hmoty /1 jednotka enzymové účinnosti je takové množství enzymu, které uvolní 100 /ul C02 z kyseliny L-asparagové za 5 minut při teplotě 30 °C a pH 5,5/, bylo suspendováno ve 100 ml roztoku RRP jako v příkladu 2 do formy homogenní suspenze a dále postupováno technikou mražení reakční směsi, včetně dekantace, promytí a odsátí rovněž jako v příkladu 2. Bylo získáno’ 19,6 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk.Example 13 g wet paste of fresh native Mycobacterium sp. Cells containing L-aspartic acid decarboxylase having a specific activity of 7.1 µg / g wet weight / 1 enzyme activity unit is the amount of enzyme which releases 100 µl of CO 2 from L acid Asparagus in 5 minutes at 30 ° C and pH 5.5) was suspended in 100 ml RRP solution as in Example 2 to form a homogeneous suspension and then followed by freezing the reaction mixture, including decanting, washing and aspiration as in Example 2. 19.6 g of wet mass of immobilized cells were obtained.
Uvedené množství částic bylo suspendováno ve 100 rol 1 M roztoku Nad o pH 6,5, v kterém byl rozpuštěn tenzid /Slovafol 910/ o koncentraci 0,5 %. Do této suspenze byl přidán chloroform o aktuální koncentraci 5 % /objem/objem/ a. suspenze byla za míchání vytemperována na 35 °c a při této teplotě intenzívně míchána po dobu 1 hodiny. Poté byla suspenze zředěna 1 litrem vody, třikrát dekantována 0,5 1 vody a permeabilizované Částice vakóuvě v dřívějších příkladech popsaným způsobem odsáty, po odsátí suspendovány v 50 ml acetonu předem vychlazeného na -25 °č a intenzívně po dobu 3 minut-míchány při teplotě místnosti. Poté byly částice znovu odsáty, na fritě důkladně promyty vodou a suspendovány v 50 ml 0,05 M acetátového о г pufru o pH 6,0 a uloženy přes noc botnat při +8 C.Said amount of particles was suspended in 100 µl of 1 M Na solution at pH 6.5, in which the surfactant (Slovafol 910) at a concentration of 0.5% was dissolved. To this suspension was added chloroform at a current concentration of 5% (v / v) and the suspension was allowed to warm to 35 ° while stirring and vigorously stirred at this temperature for 1 hour. Then the suspension was diluted with 1 liter of water, decanted three times with 0.5 liter of water and the permeabilized vacuum particles in the earlier examples were aspirated as described, suspended in 50 ml of acetone pre-cooled to -25 ° C and vigorously stirred for 3 minutes. rooms. The particles were then aspirated, washed thoroughly with water on the frit and suspended in 50 ml of 0.05 M acetate о г buffer pH 6.0 and stored overnight at +8 ° C.
Bylo získáno 14,2 g/vlhké hmoty imobilizovaných. buněk o specifické aktivitě·4,0 j/g vlhké ‘ hmoty, distribuce velikosti se pohybovala od 75 do 800 <un, makroskopicky posuzováno tvořily· částice amorfní . šedožluté vatovité vložky se špatně smočivým povrchem. Imobilizované · buňky samovolně špatně sedimentovaly, tj. udržovaly se v horní části kapaliny· ve vznosu, avšak daly . se dobře filtrovat a odsávat.14.2 g / wet mass immobilized were obtained. cells with specific activity · 4.0 j / g wet ‘mass, size distribution ranged from 75 to 800 <un, macroscopically assessed formed · particles amorphous. gray-yellow cotton wool pads with poorly wetted surface. The immobilized cells spontaneously badly sedimented, i.e. they were held high in the upper part of the liquid, but gave up. well filtered and aspirated.
Příklad 14 g vlhké pasty . čerstvých nativních buněk Bacterium cadaveris obsahující enzym dekarboxylázu L-lysinu o specifické aktivitě 16,4 j/g vlhké · hmoty /1 jednotka enzymové účinnosti je takové množství enzymu, které uvolní 1°° jil C02 z L-lysinu při teplotě 30 °C a · pH 5,5Д bylo suspendováno ve 100 ml roztoku RRP jako v příkladu 2 do formy homogenní suspenze a dále bylo postupováno technikou mražení, včetně dekantace, · promytí a odsátí rovněž·jak , je uvedeno v příkladu·2. Bylo získáno 24 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk.Example 14 g of wet paste. Fresh native Bacterium cadaveris cells containing the enzyme lysine decarboxylase, L-specific activity of 16.4 J / g · wet weight / 1 unit of enzymatic activity is that amount of the enzymes, the liberated kt er i 1 j °° IL C0 2 from L-lysine at that p lot of 30 ° C · p H 5 5 Д b y lo suspended in 100 ml of RRP as in Example 2 to form a homogeneous suspension and the further procedure was technique of freezing, including decantation, · washing and aspiration also · as , is shown in example · 2. 24 g of wet mass of immobilized cells were obtained.
Uvedené množství odsátých částic bylo suspendováno · ve 100 ml 1 M roztoku NaCl·o pH 6,5, který obsahoval 0,1% tenzid /SloVafol 909/ a suspenze byla 1 hodinu nepřetržitě míchána·při teplotě 37 °C. V da^ím ošetření imobilizovaných a permeabilizovaných buněk bylo pokračováno způsobem uvedeným v příkladu 13.Said amount of exhausted particulate was suspended in 100 ml · 1 · M NaCl, pH 6.5, containing 0.1% surfactant / SloVafol 909 / and the suspension was continuously stirred for 1 hour at te pl · Ote 3 7 ° C. Da .mu.m axis T and MO Creating beat zovanýc H and P ermE bi l i zovanýc HB UNEKO would LO edges c and f s as described in Example thirteenth
Bylo získáno 19,1 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk o specifické aktivitě 11,8 j/g vlhké hmoty, průměrné distribuce velikosti částic · 180 · až 600 /um, mikroskopicky tvořily částice ohraničené destičky, makroskopicky amorfní hnědé částice a k jejich kvantitativní sedimentaci vedlo 3minutové stání. ·19.1 g of wet mass of immobilized cells with a specific activity of 11.8 µg / g wet mass were obtained, average particle size distribution · 180 · 600 / µm, microscopically formed of bounded plate particles, macroscopically amorphous brown particles and led to quantitative sedimentation for 3 minutes stání. ·
Příklad 15 g vlhké pasty čerstvých nativních buněk kvasinky Saccharomyces cerevisiae obsahující enzym invertázu o specifické aktivitě I48 j. na g vlhké hmoty /30 °C, pH 4,7^ substt^ sacharoza/ bylo suspendováno ve 100 ml roztoku RRP jako v příkladu· 2 do formy homogenní suspenze a dále bylo postupováno v imobilizacl technikou mražení včetně dalších operací jak je uvedeno v příkladu 2. Ošetření buněk acetonem bylo provedeno, jako v příkladu 8.Example 15 g wet paste of fresh native cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae containing the enzyme invertase th SR about spec ifi c a l a t i v i I I 48 j. G of LHKE HMO those / 30 ° C, pH 4, 7-substt Sucrose was suspended in 100 ml of RRP solution as in Example 2 to form a homogeneous suspension and then proceeded by freezing immobilization technique including other operations as described in Example 2. Treatment of cells with acetone was performed as in Example 8.
Bylo získáno 12,1 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk o specifické aktivitě 90 j/g vlhké hmoty, průměrné distribuce velikosti částic 0,32 až 2,0 mm, mikroskopicky tvořily částice neohraničené útvary nepravidelné morfologie · s potrhanými kraji, · makroskopicky tvořily světle hnědé až béžové amorfní částice a , k jejich kvantitativní sedimentaci vedlo íminutové stání.12.1 g of wet mass of immobilized cells with a specific activity of 90 J / g of wet mass were obtained, average particle size distribution 0.32 to 2.0 mm, microscopically formed of particles not bounded by irregular morphology · with torn edges, · macroscopically formed light brown to beige amorphous particles and, to their quantitative sedimentation, was caused by standing for 1 minute.
Příklad 16 litr živné .půdy po submersní kultivaci obsahující čerstvou kulturu kvasinek Sacharomyces·coreanus byl odstředěn /Janetzki S-70, 3 000 g/10 minut/ a po slití supernatantu /živné · půdy po fermentaci, která byla uschována/ bylo získáno 28 g vlhké hmoty čerstvých nativních buněk.EXAMPLE 16 liters of submersible broth containing fresh Sacharomyces coreanus yeast culture was centrifuged (Janetzki S-70, 3000 g / 10 minutes) and after the supernatant was decanted (fermentation broth, which was stored), 28 g was obtained wet mass of fresh native cells.
Získané množství čerstvých · kvasinek ve formě buněčné pasty bylo suspendováno.ve 100 ml roztoku RRP, který byl připraven,·jak je · uvedeno v příkladu 2, a·po důkladné·homogenizaci suspenze intenzívním mícháním · byla reakční·směs umístěna na stolní reciproký·laboratorní·třepací stroj o počtu kyvů 50/min a 1 · hodinu takto třepáno při teplotě místnosti. Poté bylo míchání · zastaveno a · suspenze ponechána v klidu po dobu 3 hodin při uvedené teplotě. Po této době · byla silně viskozní houbovitá kaše vytvořených · agregátů přelita do 500 ml polyethylenových kyvet a výše popsaným způsobem odstředěna, supernatant slit a sediment suspendován v demineralizované vodě a třikrát 250 ml vody dekantován-za mírného míchání. Po dekantaci · a kvantitativní sedimentaci agregátů byl materiál vakuově odsát, promyt ještě cca 100 ml vody a zvážen /14 g/. Poté byl materiál suspendován ve 25 п1 ·acetonu předem vychlazeného na -25 °C а 2 minuty intenzívně míchán. Materiál byl ostře na fritě vakuově odsát a promyt cca 1 litrem demineralizované vody, znovu dobře odsát a zvážen /9 g/. Získaná vlhká hmota imobilizovaných buněk byla suspendována do odstředěné supernatantní kapaliny jak 18hora uvedeno /živná půda po fermentaci kvasinek, a ponechána botnat několik hodin při teplotě místnosti/.The amount of fresh yeast cell paste obtained was suspended in 100 ml of RRP solution prepared as described in Example 2 and after thorough homogenization of the suspension by vigorous stirring the reaction mixture was placed on a reciprocating table. laboratory · shaker at 50 rpm and shaken at room temperature for 1 hour. Stirring was then stopped and the suspension was allowed to stand for 3 hours at this temperature. After this time, the highly viscous sponge slurry of the formed aggregates was poured into 500 ml polyethylene cuvettes and centrifuged as described above, the supernatant slurry and sediment suspended in demineralized water and decanted three times with 250 ml water under gentle stirring. · After decanting and sedimentation of aggregates quantitative material was vacuum-aspirated, washed with approximately 100 ml more water and weighed TOWING / 1 4 g /. P that was on a T er ial en sus p s d and n in 1 · 25 п acetone REDE se p hl azeného -2 to 5 ° C for 2 minutes а vigorous stirring. The material was vacuum vacuumed sharply on the frit and washed with about 1 liter of demineralized water, sucked off well again and weighed (9 g). The obtained wet mass of immobilized cells was suspended in the centrifuged supernatant liquid as described above (yeast broth after fermentation of the yeast, and allowed to swell for several hours at room temperature).
Materiál byl znovu vakuově dobře odsát, odváženo 100 mg vlhké hmoty částic do Warburgovy nádobky, přidáno 2 ml odstředěné čiré fermentační kapaliny, jejíž pH bylo 4,6, do raménka Warburgovy nádobky byl napipetován 12,5% roztok sacharózy /0,5 ml/, do jedné z referenčních nádobek byly naplněny nativní neimobilizované buňky /100 ml nativní vlhké pasty/, přidáno ml odstředěné fermentační kapaliny do 2. z referenčních nádobek samotný supernatant /bez buněk/ a do ramének šacharóza, nasazeny manometry a zapnuto třepání při teplotě lázně Warburgova přístroje 30 °C po dobu 15 minut. Poté byly manometry odvzdušněny, z ramének přilit roztok sacharózy a započato vlastní měření vývoje C02.The material was sucked off well again under vacuum, weighed 100 mg of wet mass of the particles into a Warburg flask, added 2 ml of a centrifuged clear fermentation liquid, pH 4.6, and a 12.5% sucrose solution (0.5 ml) was pipetted into the arm of the Warburg flask. , one non-immobilized cell (100 ml native wet paste) was filled into one of the reference vials, ml of the centrifuged fermentation liquid was added to the 2 nd of the reference vials supernatant alone (no cells), and chacharose arms mounted, manometers mounted and agitated at Warburg 30 ° C for 15 minutes. Then the pressure gauges were vented, the sucrose solution was poured from the arms and the actual measurement of CO 2 evolution started.
V prvém kontrolním měření /neimobilizované jednotlivé nativní buňky/ došlo к vývojiIn the first control measurement (non-immobilized single native cells) development occurred
064 <ul CO^/hod., v druhém kontrolním měření /supernatant bez buněk/ nedošlo к vývoji C02, v třetím měření /imobilizované buňky o stejné koncentraci vlhké hmoty jako v prvém kontrolním měření/ došlo к vývoji C02 v množství 165 ,ul C02/hod., což je přibližně 5,4 % původní /neimobilizované/ celkové metabolické aktivity buněk.064 <µl CO 2 / hr, in the second control measurement (cell-free supernatant) no CO 2 evolution, in the third measurement / immobilized cells with the same wet mass concentration as in the first control measurement / CO 2 evolution of 165, µl CO 2 / hr, which is approximately 5.4% of the original (non-immobilized) total cell metabolic activity.
Materiál imobilizovaných kvasinek, posuzováno mikroskopicky, tvořil ohraničené částice nepravidelných tvarů, makroskopicky béžové amorfní částice. К jeho kvantitativní sedimentaci vedlo jednominutové stání, distribuce velikosti částic činila 300 až 900The material of immobilized yeast, assessed microscopically, consisted of bounded particles of irregular shapes, macroscopically beige amorphous particles. Its quantitative sedimentation was led by a one-minute stand, the particle size distribution was 300-900
P ř í к 1 a d 17 g vlhké hmoty čerstvé nativní buněčné pasty baktérie Erwinia aroidea obsahující enzym L-asparagin amidohydrolázu o specifické aktivitě 100 ддто1 kys. L-asparagové/min/g vlhké hmoty /37 °C, pH 5,0, substrát L-asparagin/, bylo suspendováno ve 100 ml roztoku RRP, který byl připraven podle příkladu 7. Poté byla suspenze intenzívním mícháním homogenizována, 30 minut mírné míchána jako v příkladu 16 a poté ponechána 1 hodinu stát při teplotě místnosti. Po této době byla viskózní houbovitá hmota přelita do 500 ml polyethylenových kyvet a odstředěna při 5 0Q0 g/30 minut. Poté byl supernatant slit a na sediment působeno filtračním tlakem, jak je uvedeno v příkladu 7, s tím rozdílem, Že hmota byla krátkodobě, přibližně 5 minut, stlačena pomocí hydraulického lisu /vymačkání kapalné části RRP/ a křehký lomivý materiál byl rozlámán a vpraven do masového strojku se speciální ocelovou vložkou o velikosti pórů 1 mm a přes tuto vložku vytlačen do formy válcovitých granulí, které byly sušeny cca 3 hodiny na vzduchu při teplotě 25 °C, poté třikrát dekantovány vodou á ponechány přes noc botnat v demineralizované vodě.Example 17 g wet mass of fresh native cell paste of Erwinia aroidea containing L-asparagine amidohydrolase enzyme with a specific activity of 100 d-L-aspartic acid / min / g wet mass / 37 ° C, pH 5,0, substrate L-asparagine was suspended in 100 ml of the RRP solution prepared according to Example 7. Thereafter, the suspension was homogenized by vigorous stirring, stirred gently for 30 minutes as in Example 16, and then allowed to stand at room temperature for 1 hour. After this time, the viscous sponge mass was poured into 500 ml polyethylene cuvettes and centrifuged at 50 g / 30 minutes. Thereafter, the supernatant was decanted and the sediment was subjected to filtration pressure as shown in Example 7, except that the mass was compressed for a short time, about 5 minutes, by means of a hydraulic press (squeezing the liquid RRP) and the brittle fracture material was broken and meat extractor with a special steel insert of pore size of 1 mm and extruded through the insert into cylindrical granules, which were dried for about 3 hours in air at 25 ° C, then decanted three times with water and left to swell overnight in demineralized water.
Celkem bylo získáno 8 g granulovaného pevného materiálu imobilizovaných buněk o specifické aktivitě 64 ,umol kys. L-asparagové/g vlhké hmoty o nepravidelné velikosti částic ve tvaru válečků v rozsahu 1 až 3 mm. Materiál sedimentoval kvantitativně během několika desítek sekund.A total of 8 g of granulated solid material of immobilized cells with a specific activity of 64 .mu.mol of L-aspartic acid / g of wet, irregularly-sized, roller-shaped particle size in the range of 1 to 3 mm was obtained. The material sedimented quantitatively within a few tens of seconds.
P ř í к 1 a d 18 g vlhké hmoty čerstvé nativní buněčné pasty Streptomyces phaeochromogenes obsahující enzym glukozoisomerázu o specifické aktivitě 0,21/umol fruktózy/min/g'vlhké hmoty /60 °c, pH 6,85, substrát glukóza/, bylo suspendováno ve 200 ml 0,1 M roztoku NaCl pH 7,0 a suspenze byla krátkodobě zahřáta za nepřetržitého míchání po dobu 10 minut na 70 °c. Poté byla suspenze ochlazena a odstředěna /5 000 g/15 minut/. Supernatant slit á sediment suspendován ve 150 ml roztoku RRP, který byl připraven podle příkladu 7. Poté bylo při imobilizaci postupováno jak je uvedeno v příkladu 17, včetně odstředění, krátkodobého lisování, mletí a sušení s tím rozdílem, že vzniklé postformované granule imobilizovaných buněk byly ošetřeny 50 ml předem vychlazeného acetonu obsahujícího 2% lepidlo /Kanagomu/ na -28 °C po dobu 3 minut.Example 18 g of wet mass of fresh native Streptomyces phaeochromogenes cell paste containing a glucose isomerase enzyme having a specific activity of 0.21 [mu] mol fructose / min / g of wet mass (60 DEG C., pH 6.85, glucose substrate), was suspended in 200 ml of 0.1 M NaCl solution pH 7.0 and the suspension was briefly heated to 70 ° C for 10 minutes with continuous stirring. The suspension was then cooled and centrifuged (5000 g / 15 minutes). The alloys sediment supernatant was suspended in 150 ml of the RRP solution prepared as in Example 7. Thereafter, immobilization was carried out as described in Example 17, including centrifugation, brief pressing, grinding and drying, with the exception that the formed postformed granules of immobilized cells were treated with 50 ml of precooled acetone containing 2% glue (Kanagom) to -28 ° C for 3 minutes.
' / 15 · 231458'/ 15 · 231458
Poté byly granule ostře odsáty a na fritě ještě cca 15 minut odsávány a poté promyty cca 1 litrem 0,0.5 M fosfátového pufru, znovu odsáty a suspendovány v 100 ml tohoto pufru a uloženy při +8 °C přes noc.Then the granules were sharply aspirated and a frit for approx 15 minutes then extracted and washed with about 1 liter of 0,0.5 M phosphate buffer, aspirated and re-suspended in 100 ml of buffer and stored at + 8 ° C, eg overnight.
Celkem bylo získáno 20 g vlhké hmoty granulovaného pevného materiálu imobilizovaných buněk o specifické aktivitě 0,1 (umol fruktózy/g vlhké hmoty o nepravidelné velikosti částic ve tvaru válečků v rozsahu 0,5 až 3,0 mm. Materiál sedimentoval kvantitativně během několika desítek sekund.A total of 20 grams of wet mass of granulated solid material of immobilized cells having a specific activity of 0.1 (umol fructose / g of wet mass of irregularly sized roller-shaped particles ranging from 0.5 to 3.0 mm) was obtained. .
Příklad 19 · g vlhké hmoty čerstvé nativní buněčné pasty Aspergillus niger obsahující enzymy , glukosooxidázu a katalázu o specifické aktivitě 0,1 jumol H2O2/min/mg vlhké hmoty bylo vpraveno do 150 ml roztoku RRP, který byl připravén podle příkladu 7. Poté bylo při imobilizaci.Example 19 · g wet mass of fresh native Aspergillus niger cell paste containing enzymes, glucose oxidase and catalase with a specific activity of 0.1 jumol H2O2 / min / mg wet mass was introduced into 150 ml of RRP solution prepared as in Example 7. Thereafter immobilization.
, postupováno rovněž, jak je uvedeno v příkladu 7 s tím rozdílem, že vzniklé postformované granule byly ponechány sušit při 40 % vlhkosti ' vzduchu /^SO^/ při teplotě místnosti ' po dobuas described in Example 7, except that the resulting postformed granules were allowed to dry at 40% humidity (air (SO 2) at room temperature) for a period of time.
- 24 hodin. Po této době . byly imobilizované buňky přeneseny do demineralizované vody a pone, chány 24 hodin botnat při teplotě +8 °C.- 24 hours. After this time. immobilized cells were transferred into demineralized water and allowed to c n y hook 24 hours b otnat te p ture at 8 ° C.
Celkem bylo získáno 29 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk o specifické aktivitě ' 0,045 rtrnol H2O2/ml vlhké hmoty buněk o nepravidelné velikosti částic ve tvaru válečků v rozsahu 0,5 až 3,0 mm. Materiál sedimentoval kvantitativně během několika desítek sekund.A total of 29 g of wet mass of immobilized cells having a specific activity of 0.045 rtrnol H2O2 / ml wet mass of irregularly sized roller-shaped cells in the range of 0.5 to 3.0 mm was obtained. The material sedimented quantitatively within a few tens of seconds.
Příklad 20 g vlhké hmoty čerstvých promytých rostlinných buněk Solanum aviculare /jednobuněčná kultura/, syntetizujících v hypertonickém prostředí roztoku sacharózy solanové alkaloidy a fytosterol, bylo suspendováno ve 100 ml roztoku RRP, jehož příprava je uvedena v příkladu 2 a homogenní suspenze vzniklá intenzívním mícháním·byla přelita na hliníkovou misku o průměru 15 cm a uložena do mrazic^o boxu po dobu 4 hodin při teplotě -19 °C. Po této době byla zmrzlá reakční směs z boxu vyjmuta a přelita · přibližně 50 ml 0,05 M fosfátového pufru o pH 5,7 obsahujícího 0,75 M KC1 a po 2 hodinách stání při teplotě místnosti byly vzniklé agregáty rostlinných buněk přeneseny do 1 litru výše uvedeného pufru a několikrát tímto pufrem dekantovány, vždy po kvantitativní · sedimentaci částic. Poté byly imobilizované buňky vakuově dobře odsáty, na fritě ještě promyty pufrem a znovu odsáty a zváženy /18 g/.Example 20 g of wet mass of fresh washed Solanum aviculare plant cells (unicellular culture) synthesizing in a hypertonic environment a solution of sucrose saline alkaloids and phytosterol were suspended in 100 ml of RRP solution as shown in Example 2 and homogeneous suspension formed by vigorous stirring. poured on an aluminum dish with a diameter of 15 cm and F ENA stored in a freezing box p ^ o about 4 hours at te pl OTE -1 9 ° C. After the time t s should Ia frozen mixture of the box were removed and poured · about 50 ml of 0.05 M phosphate buffer pH 5.7 containing 0.75 M KC1, and after 2 h at room temperature the resulting aggregates were transferred to the plant cells to 1 liter of the above-mentioned buffer and decanted several times with this buffer, after quantitative sedimentation of the particles. The immobilized cells were then well aspirated under vacuum, washed further with buffer on the frit and aspirated again and weighed (18 g).
Poté· byly částice přeneseny · do 100 ml 8% /hmota/objem/ sterilního vodného roztoku sachar<ozy a suspenze byla mícWna při teplotě 20 °C elektromagnetickým míchadlem po dobu třikrát 24 hodin, přičemž .ve 24hodinových časových intervalech byla sledována v · sacharozovénť roztoku po oddělení agregátů extracelulární produkce solanových alkaloidů·a fytosterolu pos mocí HPLC chromatografie, popsané Hirků et al., /Biotechnol. · Letters, 3, No. 8, 447, 1981/.Then · particles were transferred · 100 ml of 8% / w / v / sterile aqueous solution Sachar <Ozy SUS p Enns was a mícWna EXAMPLE te pl OTE 2 0 C ele to tromagnetickým stirrer l em p o d OBU t three times of 24 hours, with 24 hour intervals .in was monitored · sacharozovénť solution after separation of the extracellular aggregates produce alkaloids solanových · phytosterols power pos HPLC chromatography described Hirka et al. / Biotechnol. · Letters. 8, 447 (1981)].
Bylo zjištěno, že ve 3 opakovaných 24hodinových intervalech zůstává zachována produkce ' uvedených komponent s touže násadou imobilizovaných buněk. Částice byly hodnoceny rastrovacím elektronovým mikroskopem a byla prokázána vzájemná vazba rostlinných buněk.It has been found that the production of said components with the same batch of immobilized cells is maintained at 3 repeated 24-hour intervals. The particles were scanned by scanning electron microscope and the mutual binding of plant cells was demonstrated.
Příklad 21 g vlhké hmoty čerstvých nepromytých rostlinných . buněk jako v příkladu 20, bylo suspendováno ve 100 ml 0,05 M · fosfátového pufru o pH 6,0 obsahujícího 0,75 M KC1. K homogenní suspenzi buněk byl za míchání přidán flokulant, Sedipur KA, v množství 0,5 % /objem/objem/. Po promíchání suspenze byla tato ponechána v klidu stát po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti až došlo k vizuálně pozorovatelnému vyvločkování buněk. Po této době byla suspenze opatrně, aby se neporušily přeformované vločky, přelita na fritu a přes textilní materiál byla .suspenze pomalu, avšak dobře vakuově odsáta. Po odsátí přebytečné kapaliny byl materiál bez promytí vpraven do 100 ml roztoku RRP, jehož příprava je uvedena v příkladu 10, a suspenze homogenizována opatrným a pozvolným mícháním. Po homogenizaci suspenze tato ponechána stát 1 hodinu při teplotě místnosti a dále bylo postupováno při imobilizaci jak je uvedeno v příkladu 20 s tím rozdílem, že teplota během mražení činila -25 °c.Example 21 g of wet mass of fresh unwashed plant. cells as in Example 20 were suspended in 100 ml of 0.05 M phosphate buffer pH 6.0 containing 0.75 M KCl. A 0.5% (v / v) flocculant, Sedipur KA, was added to the homogeneous cell suspension with stirring. After stirring the suspension, the suspension was allowed to stand for 1 hour at room temperature until visually observed flocculation of the cells. After this time, the slurry was carefully poured onto a frit and carefully passed through the textile material to suck the preformed flakes slowly and well sucked off under vacuum. After the excess liquid was aspirated, the material was washed without washing into 100 ml of the RRP solution shown in Example 10, and the suspension was homogenized by gentle and gentle stirring. After homogenizing the suspension, it was allowed to stand for 1 hour at room temperature and further immobilized as described in Example 20 except that the temperature during freezing was -25 ° C.
Po 4hodinovém mražení byl materiál z mrazicího boxu vyjmut a dále postupováno jako v příkladu 20 s tím rozdílem, Že doba rozmrazování při teplotě místnosti trvala 1 hodinu. Bylo získáno 20 g imobilizovaných, promytých a dobře odsátých buněk.After freezing for 4 hours, the material was removed from the freezer and proceeded as in Example 20 except that the defrosting time at room temperature was 1 hour. 20 g of immobilized, washed and well aspirated cells were obtained.
Poté byly částice přeneseny do stejného prostředí jak je uvedeno v příkladu 20 s tím rozdílem, že biosyntéza solanových alkaloidů a fytosterolu probíhala recirkulací roztoku sacharozy vznosným ložem biokatalyzátoru po dobu 5 x 24 hodin, přičemž ve 24hodinových intervalech byla v sacharozovém roztoku sledována produkce solanových alkaloidů a fytosterolu postupem uvedeným v příkladu 20.The particles were then transferred to the same medium as described in Example 20 except that the biosynthesis of the brine alkaloids and phytosterol was recirculated through the buoyant bed of the biocatalyst for 5 x 24 hours, monitoring the production of the brine alkaloids in the sucrose solution at 24 hours. of phytosterol as described in Example 20.
Bylo zjištěno, že v 5 opakovaných 24hodinových intervalech zůstává zachována produkce i produkční rytmus uvedených komponent s touže násadou imobilizovaných buněk.It was found that the production and production rhythm of these components with the same batch of immobilized cells were maintained at 5 repeated 24-hour intervals.
Claims (8)
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS82277A CS231458B1 (en) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | Cellular catalysts for biotransformation and method to produce them |
| AT0002783A AT388933B (en) | 1982-01-14 | 1983-01-05 | METHOD FOR PRODUCING BIOCATALYSTS BY IMMOBILIZING ENZYMATICALLY ACTIVE CELL MATERIAL |
| IN31/CAL/83A IN155662B (en) | 1982-01-14 | 1983-01-07 | |
| YU70/83A YU44732B (en) | 1982-01-14 | 1983-01-13 | Process for producing biotransformation cell catalysts |
| JP58003581A JPS58155092A (en) | 1982-01-14 | 1983-01-14 | Cell catalyst and its manufacturing method |
| DE19833301102 DE3301102A1 (en) | 1982-01-14 | 1983-01-14 | Cellular biocatalysts and the preparation thereof |
| CS257784A CS241730B3 (en) | 1982-01-14 | 1984-04-03 | Stiffening and stabilization method of biocatalyst particles for ferment transformation of beta-lactam antibiotics |
| CS257884A CS249325B3 (en) | 1982-01-14 | 1984-04-03 | Method of biocatalyst's particles hardening and stabilization for saccharose's enzymatic inversion |
| CS463584A CS245584B3 (en) | 1982-01-14 | 1984-06-18 | Immobilized cells' particles hardening and stabilizing method for denitration of waters |
| CS79085A CS251111B3 (en) | 1982-01-14 | 1985-02-05 | Method of biocatalyst's particles consolidation and stabilization for enzyme transformation of 7-beta-(4-carboxybutanamido)-cephaelosporane acid into 7-aminocephaelosporane acid |
| CS306187A CS259997B3 (en) | 1982-01-14 | 1987-04-30 | Solid grained biocatalyst on base of immobilized fungi for phenoxymethylpenicilline conversion into 6-aminopenicillane acid and method of its production |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS82277A CS231458B1 (en) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | Cellular catalysts for biotransformation and method to produce them |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS231458B1 true CS231458B1 (en) | 1984-11-19 |
Family
ID=5334616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS82277A CS231458B1 (en) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | Cellular catalysts for biotransformation and method to produce them |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58155092A (en) |
| AT (1) | AT388933B (en) |
| CS (1) | CS231458B1 (en) |
| DE (1) | DE3301102A1 (en) |
| IN (1) | IN155662B (en) |
| YU (1) | YU44732B (en) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3301992A1 (en) * | 1983-01-21 | 1984-07-26 | Boehringer Ingelheim KG, 6507 Ingelheim | PERMEABILIZED MOLD MUSCLE WITH INTAKE IMMOBILIZED GLUCOSEOXIDASE CATALASE SYSTEM AND ITS PRODUCTION AND APPLICATION |
| US4600692A (en) * | 1983-02-10 | 1986-07-15 | Purification Engineering, Inc. | Immobilized cells for preparing phenylalanine |
| CA1210717A (en) * | 1983-08-10 | 1986-09-02 | Oreste J. Lantero, Jr. | Immobilization of biocatalysts |
| CN1174096C (en) * | 1997-09-09 | 2004-11-03 | 生物化学有限公司 | Spherical particles from microorganisms having enzymatic activity, method for the production thereof and use thereof |
| AT409380B (en) * | 1997-09-09 | 2002-07-25 | Biochemie Gmbh | Process for decreasing esterase activity in a mixture with D-aminoacid oxidase activity or glutarylacylase activity |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5617073B2 (en) * | 1971-10-28 | 1981-04-20 | ||
| GB1444539A (en) * | 1972-09-11 | 1976-08-04 | Novo Industri As | Immobilised enzymes |
| SU659611A1 (en) * | 1977-02-09 | 1979-04-30 | Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова | Method of obtaining l-aspartic acid |
| US4212943A (en) * | 1978-03-27 | 1980-07-15 | Miles Laboratories, Inc. | Production of bacterial cell aggregate |
| DK146942C (en) * | 1978-04-19 | 1984-07-30 | Novo Industri As | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF AN IMMOBILIZED ENZYME PRODUCT |
| US4251632A (en) * | 1978-09-11 | 1981-02-17 | Miles Laboratories, Inc. | Preparation of a bacterial cell aggregate |
-
1982
- 1982-01-14 CS CS82277A patent/CS231458B1/en unknown
-
1983
- 1983-01-05 AT AT0002783A patent/AT388933B/en not_active IP Right Cessation
- 1983-01-07 IN IN31/CAL/83A patent/IN155662B/en unknown
- 1983-01-13 YU YU70/83A patent/YU44732B/en unknown
- 1983-01-14 DE DE19833301102 patent/DE3301102A1/en active Granted
- 1983-01-14 JP JP58003581A patent/JPS58155092A/en active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58155092A (en) | 1983-09-14 |
| DE3301102C2 (en) | 1987-09-17 |
| AT388933B (en) | 1989-09-25 |
| JPH0325159B2 (en) | 1991-04-05 |
| YU44732B (en) | 1991-02-28 |
| DE3301102A1 (en) | 1983-07-21 |
| IN155662B (en) | 1985-02-23 |
| ATA2783A (en) | 1989-02-15 |
| YU7083A (en) | 1985-10-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SU712026A3 (en) | Method of preparing immobilized enzyme glucoisomerase preparate | |
| Kumar et al. | Immobilization of soybean (Glycine max) urease on alginate and chitosan beads showing improved stability: Analytical applications | |
| Homaei | Enzyme immobilization and its application in the food industry | |
| US4543332A (en) | Method for the preparation of spherical microorganism cell aggregates | |
| Sangeetha et al. | Preparation and characterization of cross-linked enzyme aggregates (CLEA) of subtilisin for controlled release applications | |
| AU724492B2 (en) | Polymer-protein composites and methods for their preparation and use | |
| WO1982000660A1 (en) | Immobilization of animal cells | |
| WO1989000195A1 (en) | Process for immobilization of biological material by cross-linking with polyazetidine | |
| KR910002854B1 (en) | Enzyme Fixation Method | |
| Rezakhani et al. | Immobilization of protease in biopolymers (mixture of alginate-chitosan) | |
| Arica et al. | Reversible immobilization of lipase on phenylalanine containing hydrogel membranes | |
| US4276381A (en) | Preparation of immobilized enzymes of microorganisms | |
| CS231458B1 (en) | Cellular catalysts for biotransformation and method to produce them | |
| West | Exopolysaccharide production by entrapped cells of the fungus Aureobasidium pullulans ATCC 201253 | |
| CS203607B1 (en) | Process for preparing bonded cells with activity of penicilinacylase | |
| CS231656B1 (en) | Enzyme catalysts for biotransformation and their processing method | |
| CS209265B1 (en) | Manufacturing process of stable preparates of interbonded cells of procaryonte and eucaryonte microorganisms with enzyme activity | |
| US4013511A (en) | Immobilized enzymes | |
| JPS5974984A (en) | Preparation of immobilized enzyme or microorganism | |
| JPH0383585A (en) | Immobilization of enzyme and microorganism | |
| JP3083554B2 (en) | Bacterial cell wall material with flocculant properties, method for its production | |
| US4757008A (en) | Enzyme immobilization in a macroporous non-ionic resin | |
| JP2000236892A (en) | Polymer compound fine particles and method for producing the same | |
| CS263016B1 (en) | Granular biocatalyst on the base of immobilized enzyme hydrolase of 7 beta-/4-carboxybutanamido-cephalosporic accid for enzyme preparing 7-aminocephalosporic acid and process for preparing thereof | |
| Zhang et al. | Stability of β‐galactosidase immobilized on composite microspheres of artemisia seed gum and chitosan |