CS231458B1 - Cellular catalysts for biotransformation and method to produce them - Google Patents
Cellular catalysts for biotransformation and method to produce them Download PDFInfo
- Publication number
- CS231458B1 CS231458B1 CS82277A CS27782A CS231458B1 CS 231458 B1 CS231458 B1 CS 231458B1 CS 82277 A CS82277 A CS 82277A CS 27782 A CS27782 A CS 27782A CS 231458 B1 CS231458 B1 CS 231458B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- cells
- cell
- water
- particles
- native
- Prior art date
Links
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 title claims abstract description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 37
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 title claims description 9
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 title claims description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 76
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 48
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 11
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims abstract description 10
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 claims abstract description 10
- 229920013730 reactive polymer Polymers 0.000 claims abstract description 6
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 128
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 64
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 56
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 50
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 42
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 claims description 34
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 25
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 19
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 claims description 14
- -1 aldehydes dicarboxylic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 8
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 8
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 7
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 7
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 6
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 6
- 239000008394 flocculating agent Substances 0.000 claims description 6
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 claims description 5
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 claims description 4
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 claims description 4
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 claims description 3
- 108090000489 Carboxy-Lyases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 claims description 3
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 claims description 3
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102000004031 Carboxy-Lyases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 claims description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 claims description 2
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 claims description 2
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 claims description 2
- 229960003133 ergot alkaloid Drugs 0.000 claims description 2
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 claims description 2
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims description 2
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101710157860 Oxydoreductase Proteins 0.000 claims 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 abstract description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 abstract description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 abstract 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 abstract 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 28
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 13
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 12
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 12
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 7
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 6
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000007444 cell Immobilization Methods 0.000 description 5
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 5
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 5
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 5
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 5
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N L-Aspartic acid Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 4
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 4
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 4
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 4
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 3
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 3
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 3
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 3
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000001729 Ammonium fumarate Substances 0.000 description 2
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- STNJBCKSHOAVAJ-UHFFFAOYSA-N Methacrolein Chemical compound CC(=C)C=O STNJBCKSHOAVAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 235000019297 ammonium fumarate Nutrition 0.000 description 2
- CKKXWJDFFQPBQL-SEPHDYHBSA-N azane;(e)-but-2-enedioic acid Chemical compound N.N.OC(=O)\C=C\C(O)=O CKKXWJDFFQPBQL-SEPHDYHBSA-N 0.000 description 2
- 108010041102 azocasein Proteins 0.000 description 2
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000003093 intracellular space Anatomy 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 2
- 229940068065 phytosterols Drugs 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 2
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010024976 Asparaginase Proteins 0.000 description 1
- 102000015790 Asparaginase Human genes 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 229920002284 Cellulose triacetate Polymers 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- BOWUOGIPSRVRSJ-YFKPBYRVSA-N L-2-aminohexano-6-lactam Chemical compound N[C@H]1CCCCNC1=O BOWUOGIPSRVRSJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010048581 Lysine decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187488 Mycobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- KYJGKOSNTVJPNR-ROLXFIACSA-N N[C@@H]1C(=O)NC(CCC1)N Chemical compound N[C@@H]1C(=O)NC(CCC1)N KYJGKOSNTVJPNR-ROLXFIACSA-N 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000222051 Papiliotrema laurentii Species 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Natural products N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 108090001066 Racemases and epimerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004879 Racemases and epimerases Human genes 0.000 description 1
- 240000007776 Solanum aviculare Species 0.000 description 1
- 241000187411 Streptomyces phaeochromogenes Species 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700040099 Xylose isomerases Proteins 0.000 description 1
- QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N Zirconium Chemical compound [Zr] QCWXUUIWCKQGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N [(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-diacetyloxy-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-triacetyloxy-6-(acetyloxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-triacetyloxy-2-(acetyloxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-2-yl]methyl acetate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@@H](COC(C)=O)O1)OC(C)=O)COC(=O)C)[C@@H]1[C@@H](COC(C)=O)O[C@@H](OC(C)=O)[C@H](OC(C)=O)[C@H]1OC(C)=O NNLVGZFZQQXQNW-ADJNRHBOSA-N 0.000 description 1
- LGDAGYXJBDILKZ-UHFFFAOYSA-N [2-methyl-1,1-dioxo-3-(pyridin-2-ylcarbamoyl)-1$l^{6},2-benzothiazin-4-yl] 2,2-dimethylpropanoate Chemical compound CC(C)(C)C(=O)OC=1C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)N(C)C=1C(=O)NC1=CC=CC=N1 LGDAGYXJBDILKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940105657 catalase Drugs 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- QBKFLYWZRMHHRS-UHFFFAOYSA-N chloroform;1,4-dioxane Chemical compound ClC(Cl)Cl.C1COCCO1 QBKFLYWZRMHHRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N glycidyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC1CO1 VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003921 particle size analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000005029 sieve analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005245 sintering Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005496 tempering Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- GPPXJZIENCGNKB-UHFFFAOYSA-N vanadium Chemical compound [V]#[V] GPPXJZIENCGNKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052726 zirconium Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
Landscapes
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
Vynález se týká buněčných katalyzátorů pro biotransformace na bázi imobilizovaných prokaryontních a eukaryontních buněk mikroorganismů a rostlinných buněk s různou enzymovou aktivitou a způsobu jejich výroby.
Buněčné biokatalyzátory podle vynálezu jsou využitelné pro průmyslové biotransformace, resp. umožňují vypracovat diskontinuální nebo kontinuální biotechnologie výroby farmaceuticky, potravinářsky či zemědělsky významných produktů či meziproduktů.
Známé způsoby imobilizace buněk lze obecně charakterizovat jako fyzikální, fyzikálně-chemické nebo chemické, podle toho, zda je vazba buněk s nosičem zprostředkována např. mechanicky při zachycení buněk v gelu, silami van der Waalsovými, polárními interakcemi nebo kovalentní vazbou.
Běžně se používá různých ve vodě nerozpustných syntetických nebo přírodních organických či anorganických nosičů, které především zlepšují hydrodynamické a sedimentační a tím i separační vlastnosti imobilizovaných buněk a přispívají ke stabilizaci požadované enzymové aktivity. Různé známé způsoby imobilizace buněk, jejich výhody a nevýhody a jejich ekonomické limity shrnují formou přehledných článků např. Vandamme /Chem. Ind., No. 24, 1 072, 1976/, Abbott /In: Advances Appl. Microbiol., ed. D. Perlman, 20, 203, Acad. Press, New York, San Francisco, London, 1976/, Jack a Zajic /Advances Biochem, Eng. 5, 126, 1977/, Durand a Navarro /Proč. Biochem., 13, No. 9, 14, 1978/ a Vojtíšek et al., /Biologické listy, 44, 192, 1979/.
Fyzikální způsob imobilizace buněk je popsán např. v čs. patentovém spisu č. 113 908 /agar/, v italském patentovém spisu č. 836 462 /vlákna triacetátu celulózy/, US patentovém spisu Č. 3 791 926 a v SSSR patentovém spisu č. 659 611 /zabudování buněk do sítě vznikajícího polymeru při radikálové kopolymeraci akrylamidu s methylen-bis-akrуlamidem/.
Chemických způsobů imobilizace buněk v současné době v patentové literatuře reprezentuje mnoho desítek patentových spisů využívajících např. ke kovalentní vazbě buněk různých umělých či přírodních polymerů po jejich předchozí chemické modifikaci a aktivaci různými činidly. Jako nosičů je využívána řada syntetických organických či přírodních materiálů, inertních či chemicky aktivních polymerů např. na bázi methakrylaldehydu, glycidylmethakrylátu, hydroxyalkylmethakrylátu, přírodních polymerů např. celulózy a jejích derivátů, kolagenu, želatiny, anorganických materiálů např. skla a sloučenin titanu, zirkonia, vanadu apod.
Nosiče těchto podobných typů, kromě toho, že po zachycení buněk mají preparáty nízkou specifickou aktivitu a částice jsou mechanicky málo odolné vůči otěru, jsou nákladné přípravky, jejichž cena, dostupnost a sama technologie jejich předchozí chemické modifikace a aktivace často velmi agresivními a toxickými činidly, limitují přípravu a tím průmyslové využití imobilizovaných buněk.
Jistým pokrokem ve vývoji technologie vazby buněk в průmyslovým významem je způsob popsaný v čs. autorském osvědčení č. 197 101, jehož princip spočívá ve vazbě nativních produkčních buněk s penicilinácylázovou aktivitou na buněčné nosiče různých druhů organismů, kterými jsou bud celé neporušené a/nebo fyzikálně, chemicky či biochemicky ošetřené buňky či jejich nerozpustné fragmenty, a to chemicky, kovalentní vazbou, použitím polyfunkčních činidel, zejména glutáraldehydu, po jejich předchozí fyzikálně chemické flokulaci, s výhodou flokulanty obsahujícími sloučeniny, které nesou alespoň dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny. U tohoto způsobu imobilizace buněk odpadá ekonomický limit ceny nosiče, neboř používanými nosiči jsou odpadní buňky/ nebo jejich desintegrovaná směs, odpadní buněčná hmota po různých fermentačních výrobách, jejichž cena je převážně zanedbatelná resp. nulová.
Další, ještě výhodnější způsob chemické vazby produkčních buněk bez použití nosiče, která je popsána v čs. autorském osvědčení č. 203 607 a univerzálně pro vzájemnou imobilizaci buněk bez použití nosiče prokaryontních a eukaryontních buněk mikroorganismů s různými enzy3 movými aktivitami v čs. autorském osvědčení Č. 209 265. Citovanými postupy se získají velmi stabilní preparáty navzájem kovalentně prokřížených buněk různých mikroorganismů nesoucích požadované enzymové aktivity za tvorby dobře sedimentujících částic, tvořících integrální jednotky.
Postup principiálně spočívá v chemické reakci nativních produkčních buněk ,s bifunkčními sítovacími činidly, zejména glutaraldehydem, čímž dojde ke kovalentnímu prokřížení vnitrobuněčného obsahu individuálních buněk a kovalentní fixaci požadované enzymové aktivity produkčních buněk a odolnosti těchto buněk vůči přirozené či uměle navozené autolýze.
V dalším stupni výroby se zesítěné' buňky permeabilizují jednotlivým nebo kombinovaným účinkem fyzikálních, fyzikálně chemických či chemických vlivů, čímž dojde к odstranění difúzní bariéry zesítěných buněk vyplavením maktomolekulárních materiálů tvořících součást povrchových struktur buňky, které nereagovaly s glutaraldehydem, zejména lipidů. V posledním stupni výroby se zesítěné a permeabilizované buňky navzájem kovalentně váží v přítomnosti volného síčovacího činidla, zejména glutaraldehydu, ve směsi s koreagujícími ve vodě rozpustnými látkami obsahujícími nejméně dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny, zejména polyethyleniminem a hexamethylendiaminem, za podmínek favorizujících vzájemný kontakt buněk během reakce, jako je mražení, působení odstředivého pole, 'filtračního tlaku apod.
Z citovaných postupů výroby imobilizovaných buněk se zdá, že výroba buněčných biokatalyzátorů je již vypracována v dostatečně ekonomizované formě. Není tomu však zcela univerzálně, a to zejména proto, že některé enzymy přítomné v buňkách produkčních organismů podléhají rychle irreverzibilní inaktivaci při snadné penetraci molekul nízkomolékulárního agresivního sířovadla, např. glutaraldehydu, do vnitrobuněčného prostoru i při použití jeho velmi nízkých koncentrací, čímž u některých senzitivních enzymů dochází ke značnému poklesu jejich enzymové účinnosti, pravděpodobně kovalentním prokřížením a z toho vyplývají prostorové deformace aktivního místa enzymu, které pochopitelně nemůže být zpětně restaurováno na konformaci původní. Tato skutečnost byla experimentálně pozorována, zéjména u některých produkčních buněk s racemázovými a lyázovými aktivitami.
Výše uvedené nedostatky je možno odstranit využitím buněčných katalyzátorů podle vynálezu, sestávajících z celých neporušených, enzymově aktivních, nativních, popř. předem permeabilizovaných buněk, nebo jéjich fragmentů a jejich podbuněčných částic a/nebo ze směsí celých nativních buněk s jejich fragmenty, podbuněčnými částicemi a celým uvolněným obsahem buněk a/nebo z celých, individuálně zesítěných a permeabilizovaných buněk, imobilizovaných chemicky reaktivním polymerem, rozpustným ve vodě, vzniklým reakcí ve vodě rozpustné látky, obsahující nejméně dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny, jako je např. polyethylenimin, hexamethylendiamiň, lyzin a polylyzin s bifunkčními aldehydy dikarboxylových kyselin, jakojje např. glutaraldehyd, popř. dále permeabilizovaných a/nebo mechanicky zpevněných.
Jako buněčný materiál mohou tyto katalyzátory obsahovat prokaryontní nebo eukaryontní buňky organismů, zejména grampozitivních, gramnegativních a gramlabilních baktérií, acidoresistentních baktérií, aktinomycet,· kvasinek a dalších mikroskopických hub a vyšších, zejména parazitických hub a rostlinných buněk, popř. jejich fragmenty a podbuněčné částice, nesoucí enzymové aktivity, zejména hydrolázy, isomerázy, lyázy, dekarboxylázy, oxidoreduktázy a jiné aktivity a/nebo částici celé sekvence enzymů logického sledu biochemické dráhy, zejména degradativního metabolismu, glykolýzy, enzymů katalýzujících biotransformace hormonů a produkci alkaloidů, zejména solanových alkaloidů a fytosterolů a námelových alkaloidů.
Předmětem vynálezu je dále způsob výroby uvedených katalyzátorů, jehož podstata spočívá v tom, že se výše uváděné buněčné materiály imobilizují uvedením ve styk s ve vodě rozpustným, chemicky reaktivním polymerem, vzniklým reakcí ve vodě rozpustné látky, obsahující nejméně dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny, s výhodou polyethyleniminem a sbifunkčními aldehydy dikarboxylových kyselin, s výhodou s glutaraldehydem, při teplotě v rozmezí 0 až 60 °C ve vodném prostředí, při pH v rozmezí 4,0 až 12,0, přičemž reakce uvedeného bu něčného materiálu s uvedeným polymerem se provádí při teplotě v rozmezí -30 až +50 °C ve vodném prostředí a při pH v rozmezí 5,o až 9,o, popř. za přítomnosti flokulačních činidel, vzniklé buněčné agregáty se po oddělení z reakční směsi promyjí vodou nebo pufrem, načež se popř. permeabilizují a/nebo mechanicky zpevňují.
Je výhodné, když se к přípravě ve vodě rozpustného polymeru а к případné předchozí flokulaci buněčného materiálu použije vodný roztok polyethyleniminu s distribucí molekulové hmotnosti 100 000 až 800 000.
Výhodně se reakce uvedeného buněčného materiálu s uvedeným polymerem provádí při teplotě 0 až 45 °C, při relativní odstředivé síle 1 až 50 000 g, při filtračním tlaku od 0 do 50 000 kPa, při stání či pomalém míchání nebo při přerušovaném míchání a stání reakční směsi.
* Permeabilizace nativních buněk před imobilizací nebo získaných buněčných agregátů po imobilizaci se může provádět mícháním buněčné suspenze ve vodném prostředí při teplotách od 0 do 70 °C, při hodnotě pH 4,0 až 9,0, v přítomnosti tenzidu a/nebo organického s vodou mísitelného a/nebo nemísitelného rozpouštědla, zejména acetonu, etheru, isopropánolu, petroletheru, butylacetátu, chloroformu dioxanu, dimethylformamidu nebo dimethylsulfoxidu, popř. za současné nebo následné změny iontové síly suspenze přídavkem solí silných kyselin a/nebo zásad.
částice imobilizovaných buněk se popř. dále mechanicky zpevňují částečnou dehydratací působením organických rozpouštědel, s výhodou acetonem, popř. roztoky lepidel v organických rozpouštědlech nebo jejich směsí s vodou, při teplotách +20 až -25 °C, popř. se vzniklé částice odsají a parciálně vysuší za sucha či vlhka, popř. vhodným způsobem postformují.
Výhody způsobu podle vynálezu spočívají v tom, že se za pomoci chemicky reaktivních ve vodě rozpustných polymerů /dále jen RRP/ získají imobilizované buněčné biokatalyzátory s vysokou specifickou aktivitou, dobrými sedimentačními vlastnostmi a vysokým výtěžkem imobilizace, a to i v případech vysoce citlivých enzymových aktivit, které nelze obejít postupy uvedenými v čs. autorských osvědčeních č. 197 101, 203 607 a 209 265, nebo£ na rozdíl od uvedených poetupů využívajících volného nízkomolekulárního síčovadla, RRP připravené postupy podle předmětného vynálezu jsou sice ve vodě rozpuštěné, avšak jejich molekulová hmotnost je již tak veliká, Že nepenetrují do buňky a kovalentní vazba /imobilizace/ se odehrává mezi povrchy buněk a reaktivními aldehydovými skupinami aktivovaného RRP.
Vlastní mechanismus tvorby chemicky reaktivních ve vodě rozpustných polymerů, např. za použití polyethyleniminu a bifunkčních sinovacích činidel, zejména glutaraldehydu, si lze představit jednak vnitřním zesítěním frakcí polyethyleniminu za preferenční tvorby barevných Schiffových bází mezi koncovými aldehydickými skupinami glutaraldehydu a primárními či sekundárními aminoskupinami polyethyleniminu /Cín vazba/, což má za následek vzrůst molekulové hmotnosti těchto frakcí při současné chemické aktivaci některých primárních či sekundárních aminoskupin obsažených v rozvětvených a pravděpodobně koncových řetězcích polyethyleniminu, resp. jejich převodem na reaktivní aldehydické skupiny, přičemž vzniklý zesítěný chemicky reaktivní polymer zůstane rozpuštěný ve vodném roztoku, takže rezultující roztok RRP je čirá, průhledná, žlutohnědá až červenohnědá kapalina.
Postup výroby podle předmětného vynálezu principiálně sestává ze dvou technologických operací. V prvé fázi se připraví chemicky reaktivní ve vodě rozpustný polymer /RRP/ s .výhodou reakcí komerčně dostupných flokulantů, používaných к čištění odpadních vod, obsahující frakci polyethyleniminu, např. Sedipur KA nebo Sedipur CL-930 s bifunkčním síčovadlem, zejména glutaraldehydem, ve vodném prostředí s výhodou za míchání reakční směsi.
Rychlost polymerace lze např. sledovat ňa základě změny absorbance přírůstku koncentrací barevných Schiffových bází ve viditelné oblasti spektra /např. při 550 nm/, jejichž kon centrace je závislá především na poměru obou reakčních složek, tj. sífovadla : koreagující sloučenině, reakční době a teplotě. Reakci lze popsat kinetikou prvého řádu. V druhé fázi se do částečné nebo kvantitativně zreagovaného roztoku RRP vmíchají nativní, čerstvé, předem odkultivačního média separované mikrobiální nebo rostlinné buňky nesoucí požadované enzymové aktivity a/nebo zesítěné a‘permeabilizované buňky v těch případech, kdy citlivost klíčového enzymu dovoluje předchozí použití volného roztoku sítovadla, popř. směs celých nativních buněk a desintegrovaných buněkve formě suspenze s buněčným ditritem, a v závislosti na pouíité technice imobilizace, zejména mražený stán^ pozvcdn^o míchání, působení filtračního tlaku, odstředivého pole, vytlačování suspenze či vzniklých částic vhodným zařízením a- následného parciálního sušení částic za sucha či vlhka, lze regulovat velikost, tvar, charakter, porozitu' a specifickou aktivitu buněčných Mobilizovaných materiálů.
Způsob výroby Mobilizovaných buněk podle vynálezu rovněž zahrnuje · postupy vedoucí k permeabilizaci buněk před Mobilizací, popř. permeabilizacivzniklých buněčných agregátů po Mobilizaci, zvláště v těch případech, kdy jako výchozí materiál byly použity celé nativní buňky, popř. kdy bylo použito technik následného ošetření Mobilizovaných částic vedoucích k zvýšení jejich mechanické stability a pevnosti, zejména částečné dehydratace částic ošetřením acetonem či jinými organickými rozpouštědly, popř.a s výhodou roztoky takových komerčních lepidel v organických rozpouštědlech, které . po parciálním zaschnutí vytvoří ochrannou mikrovrstvu ve vodě nerozpustného filmu na povrchučástice, za individuální volby podmínek ošetření, za předpokladu z technologického hlediska nepříliš významné limitace enzymové reakční rychlosti difúzí.
Pro výrobu Mobilizovaných buněk podle vynálezu, lze principiálně použít nejen různé druhy a kmeny proka^yontních a eukaryontních mikrobiálních buněk s různými enzymovými aktivitami, ale i buněk rostlinných, a to jak u mikrobiálních, tak rostlinných buněk bez ohledu na to, zda je požadovaná enzymová aktivita /požadovaný enzym resp. enzymy/ lokalizovaná Ί v periplasmatickém či vnitrobuněčném prostoru /v cytoplasmě buňky/. Stejně tak v dostatečně širokém rozmezí, které je dokumentováno příklady provedení, není zásadně rozhodující kvalita enzymu, resp. typ žádané enzymové katalyzované biochemické reakce.
Pro daný typ prokaryontní nebo eukaryontní buňky je v návaznosti na lokalizaci požadovaného enzymu v buňce a na kvalitě enzymu resp. typu enzymově katalyzované biochemické reakce a známém nebo předpokládaném chemickém složení buněčných povrchů /peptidoglykan, lipoprotein,’ lipopolysacharid, chitin, c'hitozan apod./ nutno -specificky volit techniku Mobilizace, např. mražení, stání, míchání apod. a především techniku permeabilizace buněk před a/nebo po vazbě, zvláště slouží-li jako výchozí materiál pro Mobilizací čerstvé, neporušené, nativní, živé buňky.
Vlastní techniky uvedeného způsobu imobilizace podle vynálezu je nutno rovněž volit v závislosti na předpokládané četnosti a dostupnosti reagujících skupin, které jsou součástí buněčného povrchu a jsou tedy určeny druhem a fyziologickým.stavem Mobilizované buněčné populace. V těch případech, kdy se použije buněk, u nichž je známo či předpokládáno, že četnost a dostupnost reagujících skupin buněčného povrchu . je nízká, zejména u rostlinných buněk, lze postup podle vynálezu s výhodou kombinovat předchozí flokulací nativní buněčné suspenze flokulanty obsahujícími sloučeniny, které nesou nejméně dvě· primární a/nebo sekundární aminoskupiny, a takto předem fyzikálně chemicky vytvořené agregáty se po odsátí nebo přímo vmíchají do roztoku RRP, čímž se jednak usnadní předchozí vzájemný kontakt buněk, jednak obohatí povrch buněk skupinami vstupujícími do reakce.
Pro výrobuMobilizovaných buněk podle vynálezu lze používat produkčních buněk obsahujících různé enzymy, a to různých druhů a kmenů baktérií, aktinomycet, kvasinek, Mperfektních hub, vyšších parazitických hub a rostlinných buněk. Je^pochopitelně výhodné používat pro Mobilizací buněk mutantních organismů, získaných šlechtěním, selekcí· a nahromadovacími metodami a genetickou manipulací, nebot .získané Mobilizované preparáty pak mají vysokou specifickou aktivitu.
Velikost vázaných buněk /částic/ získaných postupem podle vynálezu byla posuzována mikroskopicky /optickým mikroskopem/ s použitím kalibrovaného měrného okuláru. Některé preparáty byly posuzovány rastrovacím elektronovým mikroskopem. Sedimentační vlastnosti byly hodnoceny tak, že 2,5 g vlhké hmoty preparátu bylo suspendováno v celkovém objemu 25 ml demineralizované vody v kalibrovaném odměrném válci a byl sledován čas potřebný ke kvantitativní sedimentaci částic. К analýze velikosti částic bylo‘rovněž použito kovových sít pro sítovou analýzu a vázané buňky byly děleny podle velikosti použitím tří sad těchto sít, přičemž síta měla otvory velikosti od 0,03 až do 2,00 mm.
Enzymové aktivity imobilizovaných materiálů byly hodnoceny za míchání a temperасе definovaného množství částic vázaných buněk v roztoku substrátu za podmínek měření v oblasti kinetiky nultého řádu enzymové reakce a enzymová aktivita resp. specifická aktivita vyjadřována jako množství vytvořených ^umolů produktu resp. produktů/mg nebo g vlhké hmoty částic, pokud není v příkladech uvedeno jinak. Zachování celé sekvence enzymových reakcí v imobilizovaných buňkách bylo testováno manometricky celkovou produkcí C02 vytvořeného během stanovení ze sacharózy. V případě produkce různých alkaloidů, zejména solanových alkaloidů a fytosterolu, byly tyto látky stanoveny pomocí HPLC chromatografie.
Získané částice imobilizovaných buněk se po případném mechanickém zpevnění částečnou dehydratací působením organických rozpouštědel, výhodně acetonu, popřípadě roztoky komerčních lepidel v organických rozpouštědlech, po odsátí a parciálním vysušení za sucha či vlhka, mohou vhodným způsobem postformovat, čímž lze regulovat velikost, tvar, charakter, porozitu, specifickou aktivitu a sedimentační vlastnosti imobilizovaných materiálů.
V následujících příkladech provedení se jako látky obsahující alespoň dvě primární a/nebo sekundární aminoakupiny používá komerčních flokulantů typu Sedipur, a to Sedipur CL-930 nebo Sedipur-KA, který obsahuje polyethylenimin o molekulové hmotnosti 200 000 až 300 000 v koncentraci přibližně 30 hmotnostních procent.
V dalším je vynález blíže objasněn v příkladech provedení, aniž by se jimi omezoval.
Příklady'provedení
Přikladl
Bylo připraveno 100 ml 1,0% a 100 ml 2,0% /hmotnost/objem/ vodného roztoku Sedipuru CL-930 /BASF, A.G./ v demineralizované vodě. Roztoky byly přelity do 500 ml varných baněk a umístěny na rotační třepací stroj o počtu otáček 260/min. Do těchto roztoků, jejichž pH bylo, 6,1, byl. přidán 25% vodný roztok glutaraldehydu /Merck/ tak, aby jeho koncentrace v reakční směsi činila 0,5 % v případě prvém a*1,0 % /objem/objem/ v případě druhém.
Baňky s reakčními směsmi byly překryty hliníkovou fólií a spuštěno míchání a ve zvolených časových intervalech byla sledována rychlost polymerace spektrófotometricky při 550 nm /Unicam, SP-500, hranaté skleněné kyvety 10 x 10 mm/. Reakce probíhala za nepřetržitého míchání při teplotě 20 °C. Hodnoty absorbancí z jednotlivých vzorků odebíraných v závislosti na čase z reakčních směsí byly měřeny proti demineralizované vodě. Výsledky měření, které indikují přírůstky koncentrací Schiffových bází pro obě reakční směsi, jsou uvedeny v následující tabulce.
| označení RRP | 1 | ........2 | |
| reakční | směs | 1,0 % Sedipur·+ 0,5 % glutaraldehyd | 2,0 % Sedipur . + 1,0 % gl^a^^eh^ |
| čas | 0 | 0,05 | 0,08 |
| /hod./ | 0,15 | 0,25 | 0,31 |
| 0,30 | 0,36 ’ | 0,75 | |
| 1,0 | 0,54 | · 1,05 /+/ | |
| 2,0 | 0,60 | 1,20 | |
| 3,0 | 0,64 , | < 1,26 | |
| 4,0 | 0,68 | 1,28 | |
| 5,0 | 0,70 /+/ | 1,32 | |
| 6,0 | · 0,72 | . 1,36 | |
| 7,0 | 0,75 | 1,40 | |
| 24,0 | 0,90 | . 1,60 |
/+/ Takto označené a níže uvedené hodnoty absorbancí byly vypočítány z ředění vzorků demineralizovanou vodou, takže značí absolutní hodnoty absorbancí po přepočtu.
Po 24 hodinách reakce vznikly barevné, červenohnědé roztoky, jejichž pH bylo 4,9.
Dó popsaným způsobem připravených zreagovaných směsí reaktivních rozpustných polymerů /RRP/ bylo vmícháno, intenzívním mícháním, h 25 g vlhké hmoty celých neporušených bakteriálních buněk.Alcaligenes metalcaligenes've formě nepromyté vlhké buněčné pasty, získané odstředěním po kultivaci, s aspartát amoniak lyázovou'aktivitou. Specifická aktivita buněk činila 550 ^unol kys. L-asparagové/min/g vlhké hmoty /37 °0, pH 8^ substrát 1,35 molární roztok fumaranu amonného/. Po vmíchání buněk do každé z . reakčních směsí byly homogenní suspenze přelity na 2 hliníkové misky o průměru 20 cm při výšce vrstvy cca 1,5 cm a uloženy do mrazicího·boxu při teplotě -20 °C po dobu 4 hodin. po této době byly misky z boxu vyjmuty, zmrzlý obsah na miskách ' přelit přibližně 100 ml demineralizované vody a misky ponechány 1 hodinu při teplotě místnosti zvolna · rozmrazit·. Po této době byly vytvořené agregáty přelity do skleněných nádob, v kterých byla předložena demineralizovaná voda v množství 1 litru, zvolna ' promíchány a po jejich kvantitativní sedimentaci stáním byla promývací voda slita a agregáty uvedeným postupem třikrát děkantovány 1 litrem pitné.vody. Poté byly částice vakuově dobře odsáty na fritě přes kalolisovou textilní plachetku a zváženy. Z prvé reakční směsi bylo získáno 16,0 · g vlhké hmoty, z druhé reakční směsi bylo získáno 18,2 g vlhké hmoty imobillzovaných buněk.
Dále byla provedena biochemická a další charakterizace obou imobilizovaných materiálů postupy uvedenými v popisu vynálezu a výsledky jsou shrnuty v následující tabulce:
| RRP | .....1........... | . ........ '2 . |
| specií, aktivita | ||
| /cunol k.L-asp./ | ||
| min/g v.hm./ | 420 | 500 |
| distribuce velikosti částic /Xum/ | 100-450 | 300-600 |
| mikroskopický obraz | ohraničené destičky | ohraničené destičky |
| makroskopický obraz | tmavě hnědé částice | tmavě ' hnědé částice |
| sedimentace | kvantitativní za 10’min | kvantitativní za 5 min |
Příklad 2
Byl připraven roztok RRP /iniciální koncentrace obou reakČních složek byla 2,0 % Sedipuru CL-930 a 1,0 % glutaraldehydu/ postupem uvedeným v příkladu 1.
Do 100 ml roztoku RRP bylo intenzívně vmícháno 25 g bakteriálních buněk jako v příkladu 1 a dále bylo postupováno stejným způsobem,jak je uvedeno v příkladu 1. Bylo získáno 17,2 g vlhké hmoty dobře odsátých agregátů o specifické aktivitě 512 длпо1 kys. L-asparagové/min/g vlhké hmoty. Získaný materiál byl suspendován v 5o ml 5% roztoku Kanagomu v acetonu předem vychlazeného na -20 °C a po 3minutovém míchání při teplotě místnosti byl materiál ostře vakuově popsaným způsobem odsát a na fritě odsáván po dobu přibližně 15 minut tak, aby došlo к částečnému zaschnutí lepidla na povrchu jednotlivých částic. Po této době byl materiál zvážen /10,5 g/ a suspendován ve 100 ml 1,35 M roztoku fumaranu amonného, pH 8,5 a uložen přes noc při teplotě +8 °C. Poté byl materiál znovu vakuově odsát, na fritě promyt 1 litrem vody a dobře odsátý zvážen /13,0 g/.
Specifická aktivita materiálu Činila 180 <umol kys. L-asparagové/min/g vlhké hmoty, materiál byl tvořen pevnými drsnými ohraničenými destičkami s průměrnou distribucí velikosti částic 400 až 600 ^um, а к jeho kvantitativní sedimentaci vedlo 2minutové stání.
P ř í к 1 a d 3
Byl připraven roztok RRP jak je uvedeno v příkladu 1 a 2 s tím rozdílem, že reakční doba činila 3 hodiny za jinak stejných podmínek.
Do 100 ml tohoto roztoku RRP bylo vmícháno 25 g bakteriálních buněk jako v příkladu 1 a 2 a dále bylo v přípravě imobilizováných buněk postupováno stejně jako v příkladu 2, s tím rozdílem, že před ošetřením materiálu roztokem lepidla v acetonu byly agregáty permeabilizovány tříhodinovým mícháním /rotační třepací stroj 260 ot/min., 30 °C/ ve 100 ml 1,0 M vodného roztoku síranu amonného o pH 8,5 obsahujícího 0,1 % tenzidu /Slovafol 909/, po této době byl materiál popsaným způsobem vakuově dobře odsát, promyt 1 litrem vody, znovu odsát, zvážen /16,0 g/ a poté teprve dále ošeUřen, jak je uvedeno v příkladu 2.
Bylo získáno 10 g vlhké hmoty imobilizováných buněk, jejichž specifická aktivita činila 250/umol kys. L-asparagové/min/g vlhké hmoty, materiál byl tvořen pevnými, drsnými, ohraničenými destičkami s průměrnou distribucí velikosti částic 300 až 550 ^um а к jeho kvantitativní sedimentaci vedlo 3minutové stání.
Příklad 4
300 g vlhké hmoty čerstvé vlhké pasty nativních celých bakteriálních buněk Escherichia coli, sklizené po kultivaci odstředěním, o specifické aktivitě penicilinacylázy 8,0/umol 6-APK/hod/mg vlhké hmoty buněk /42 °C, pH 7,6, substrát K-sůl benzylpenicilinu/, bylo suspendováno do 1 litru roztoku RRP, vzniklého reakcí 2% Šedipuru КА a 1% glutaraldehydu při 30 °C v průběhu 24hodinové reakce, postupem, který je popsán v příkladu 1, do formy homogenní suspenze, intenzívním mícháním ocelovým vrtulovým míchadlem. Poté byla suspenze rozdělena na přibližně 4 stejné objemové díly /А 320 ml/ a každý díl separátně nalit do igelitových sáčků, otvory sáčků byly několika přehyby zajištěny kovovými svorkami, a sáčky uloženy ve vodorovné poloze po dobu cca 5 hodin do mrazicího boxu při teplotě -20 až -25 °C; síla vrstvy reakční směsi po uložení sáčků ve vodorovné poloze činila cca 1,5 až 2 cm.
Po této době byly sáčky z mrazicího boxu vyjmuty, zmrzlý obsah v sáčcích mechanicky rozlámán, sáčky rozstřiženy, a jejich obsah vnesen do 10 litrů předložené demineralizované vody 25 °C teplé, umístěné ve skleněné nádobě. Materiál byl v průběhu 1 až 2 hodin mírným přerušovaným mícháním rozmražen a po kvantitativní sedimentaci vytvořených částic byla promývací voda slita a materiál 3krát děkantován 5 litry pitné vody. Poté byly agregáty vakuově na nuči ještě promyty 5 litry pitné vody a znovu dobře odsáty do formy vlhkého koláče.
215 g vlhké hmoty dobře odsátého materiálu bylo za míchání suspendováno v 500 ml předem vychlazené směsi aceton/voda /1 : 1/ na teplotu -15 °C a 3 minuty při teplotě místnosti intenzívně částice ve zředěném acetonu promíchány. Po této době byl materiál vakuově ostře odsát, 5 až 10 minut na nuči ještě prosáván a poté promyt cca 5 litry pitné vody, znovu dobře odsát a suspendován v 1 litru 0,05 M fosfátového pufru pH 7,6 a ponechán botnat přes noc při +8 °C. ф
Celkem bylo získáno 180 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk o specifické aktivitě penicllinacylázy 6,5 ^umol 6-APK/hod/mg vlhké hmoty, materiál byl tvořen ohraničenými destičkami в průměrnou distribucí velikosti částic 150 až 450 /um а к jeho kvantitativní sedimentaci vedlo 5minutové stání.
Příklad 5
250 g vlhké hmoty zesítěných a permeabilizovaných bakteriálních buněk E. coli s penicilinacylázovou aktivitou /specifická aktivita činila 7,0дипо1 6-APK/hod/mg vlhké hmoty/, přičemž postup síténí a permeabilizace individuálních buněk E. coli je popsán v čs. autorském osvědčení č. 203 607, bylo vmícháno do 1 litru RRP, jehož postup přípravy byl uveden v příkladu 1, s tím rozdílem, že reakční doba tvorby RRP činila 5 hodin. Po rozmíchání buněk v roztoku RRP do formy homogenní suspenze bylo dále ve výrobě imobilizovaných buněk postupováno podle příkladu 4, včetně ošetření materiálu směsí aceton/voda.
Bylo získáno celkem 166 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk s penicilinacylázovou aktivitou, jejichž specifická aktivita činila 6,0/umol 6-APK/hod/mg vlhké hmoty, materiál byl tvořen ohraničenými hnědočernými destičkami s průměrnou distribucí velikosti 180 až 400/um а к jeho kvantitativní sedimentaci vedlo 3minutové stání.
Příklade
40,0 g vlhké hmoty čerstvých nativních buněk E. coli s penicilinacylázovou aktivitou jako v příkladu 4, bylo homogenně suspendováno ve 150 ml roztoku RRP rovněž jak je uvedeno v příkladu 4 a směs byla rozplněna do 10 ml polyethylenových kyvet a v závislosti na použité relativní odstředivé síle byla prováděna tvorba částic imobilizovaných buněk. Reakce probíhala při 20 °C po dobu 3 hodin. Po reakci byly preparáty dvakrát dekantovány vodou, vakuově odsáty přes textilní materiál a ošetřeny směsí aceton/voda jako v příkladu 4 a ponechány bobtnat přes noc, rovněž jak je uvedeno v příkladu 4. Poté byly znovu vakuově odsáty, zváženy a dále charakterizovány. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce.
| relativní odstředivá síla /g/ | 600 | 1 100 | 4 500 10 200 |
| průměrná distribuce velikosti | |||
| částic /mm/ | 0,2-0,45 | 0,4-0,85 | 0,55-1,2 0,8-2,0 |
| rychlost sedimentace částic /min/1 g/ | 5 | 3 | 1 1 |
| specifická aktivita /fUmol 6-APK/hod/mg v.hm./ | 7,0 | 6,5 | 5 3,1 |
| mikroskopický obraz | neohraničené útvary | s nepravidelnými okraji | |
| makroskopický obraz | hnědé amorfní částice |
Poznámka i metody hodnocení imobilizovaných preparátů jsou uvedeny v popisu vynálezu.
P ř I k 1 . a a 7 g vlhké hmoty čerstvé nativní pasty buněk Escherichia coli obsahujících enzym beta-galaktosidázu 'bylo intenzívně suspendováno ve 100 ml roztoku RRP připraveného 24hodlnovou reakcí jak je uvedeno v příkladu 1 s tím rozdílem, že iniciální koncentrace obou reakčních složek při·přípravě RRP byla 5 % /hmota/objem/ Sedipuru CL-930 a 2,0 % /objem/objem/ glutaraldehydu· Specifická aktivita čerstvé nativní pasty ' buněk činila 0,42 /unolů glukózy + galaktózy/mln/g vlhké hmoty nativních buněk /37 pH 7^ substrát roztok laktózy^/.
Homogenní buněčná suspenze byla ponechána reagovat stáním při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Po této době byl vzniklý houbovitý precipitát buněčných agregátů vakuově, v předchozích příkladech popsaným způsobem, odsát a vzniklá hmota byla vpravena ve formě vlhkého koláče do sáčku z kalolisové tkaniny, otvor sáčku přehnut a zajištěn kovovými svorkami, . sáček vložen .. mezi 2 kovové desky ve vodorovné potaze a vystaven filtračnímu tlaku 1,25 . 104 kpa pomocí hydraulického lisu při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Po této době byla tmavá pevná hmota ve formě desky mechanicky rozrušena rozlámáním na menší kousky a tyto vneseny do 100 ml vody předložené v kuchyňském mixéru a při nejnižším nastavení rychlosti otáček s přerušovaným vypínáním a zapínáním desintegrovány na drobnější částice. Po desintegraci a homogenizaci byl materiál třikrát dekantován 0,5 litry vody, vakuově dobře odsát, zvážen /16,2 g/ a vpraven do 100 ml 1 M roztoku NaCl obsahujícího 0,2 % tenžidu:/Slovafol 910/ a 1 % dimethylsulfoxidu, suspenze byla vytemperována . na 40 °C po dobu 3 · hodta při uvedené teplotě nepřetržitě míchána. Po permeabilizaci byly částice 3krát dekantovány 1 litrem pitné vody, vakuově popsaným způsobem dobře odsáty a vneseny do 0,1 M fosfátového pufru pH 7,0 a ponechány bobtnat přes noc. '
Po odsátí a promytí imobilizovaných buněk bylo získáno ' celkem 13,2 g vlhké hmoty nepravidelných tmavých amorfních · částic ve formě velmi rychle sedimentujících hrudek, jejichž specifická aktivita činila 0,12<>mol glukózy .+ galaktózy/min/g vlhké hmoty s distribucí velikosti částic 0,5 až 2,6 mm.
Příklad . 8 g ' vlhké hmoty nativních celých.buněk E. coli s beta-galaktosidázovou aktivitou jako v příkladu 7, bylo vpraveno do 100 ml 0,5 M toztoku NaCl, který obsahoval 0,5 % tenzidu /Slovafol 910/, suspenze byla intenzívním mícháním důkladně homogenizována a poté přelita do 500 ml varné baňky, baňka překryta hliníkovou folií a umístěna na rotační třepací stroj o počtu otáček 260/min. Suspenze nativních buněk byla permeabilizována po dobu 20 minut za nepřetržitého .míchání při . teplotě 30 °C. Poté byly buňky odstředěny /20 000 g/10 mtaut/, supernatant slit a sediment buněčné pasty zvážen.
. g vlhké hmoty'popsaným způsobem ošetřených buněk bylo suspendováno ve 100 ml roztoku RRP, připraveného, jak je .uvedeno v příkladu 2, do formy homogenní suspenze a imobilizace buněk byla provedena mražením reakční směsi postupem uvedeným rovněž v příkladu 2 včetně ošetření vzniklých částic po imobilizaci, s . tím rozdílem, že 17 g vlhké hmoty vzniklých částic bylo suspendováno . v 50 ml čistého acetonu předem vychtazen^o na teplot -2° °c, přičemž ošetření acetonem za intenzivního' míchání trvalo 3 minuty, poté byl materiál rychle a ostře na frltě. vakuově odsán, promyt vodou a ponechán bobtnat přes noc v prostředí 0,1 M fosfátového pufru pH 7,0 při ' teplotó +8 °C.
Celkem bylo získáno 12,6 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk o specifické aktivitě. beta-galaktosldásy 0,3Θ/unol glukózy + galaktózy/min/g vlhké hmoty, · s průměrnou distribucí velikosti · částic 85 až 400 /im, materiál . byl tvořen destičkami s nepravidelhými·okraji a k · jeho kvantitativní sedimentaci vedlo Sminutové stání.
Příklad 9
2,5 kg vlhké hmoty Čerstvých nativních buněk Bacillus megatherium, sklizených před skončením exponenciální fáze růstu, s proteolytickou aktivitou 38 azokaseinových jednotek/g vlhké hmoty /37 °C, pH 7,5, substrát azokasein/ bylo suspendováno v 10 litrech demineralizované vody/ suspenze intenzívním mícháním homogenizována a ochlazena na +5 °C. Poté byla' suspenze desintegrována trojnásobným průchodem štěrbinovým mechanickým desintegrátorem při tlaku 25,1 mPa. Suspenze mezi jednotlivými desintegracemi byla průběžně chlazena tak, aby maximální teplota desintegrované směsi nepřesáhla 35 °C.
К 1 litru desintegrované suspenze nativních buněk, jejíž pH bylo upraveno na hodnotu 7,5 20% roztokem NaOH za nepřetržitého míchání*, byl přidán flokulant, Sedipur KA, v takovém množství, aby jeho aktuální koncentrace v desintegrované suspenzi Činila 0,25 % /objem/objem/. Suspenze byla důkladně promíchána, ponechána stát při teplotě místnosti po dobu přibližně 1 hodiny v klidu až bylo pozorovatelné, že došlo ke kvantitativní flokulaci buněčného detritu.
Po této době bylo к 1 litru suspenze přidáno 2 litry roztoku RRP připraveného 24hodinovou reakcí postupem,jak jé uvedeno v příkladu 1 s tím rozdílem, že iniciální koncentrace obou reakčních složek při přípravě RRP byla 4 % /hmota/objem/ Sedipuru KA a 2 % /objem/objem/ glutaraldehydu. Vmíchání 2 litrů roztoku RRP do 1 litru suspenze buněk po desintegraci bylo provedeno pomalým ručním mícháním pomocí nerezového kopiště tak, aby nebyly narušeny předem vytvořené vyflokulované částice.
Po 2 hodinách stání byla silně viskozní vyvločkováná a částečně zreagovaná suspenze pomalu promíchána a rozplněna do 10 polyethylenových sáčků po přibližně 0,3 litrech a dále bylo postupováno jako v příkladu 4 s tím rozdílem, že imobilizované částice byly po imobilizaci ošetřeny čistým acetonem předem vychlazeným na -20 °C tříminutovým intenzívním mícháním, poté ostře vakuově odsáty, několikrát dekantovány vodou a vpraveny do 1 litru 0,1 M fosfátového pufru, pH 7,5, kde byly ponechány botnat přes noc při teplotě +8 °C.
Celkem bylo získáno plavením na sítech, jak je uvedeno v popisu vynálezu, 1,28 kg vlhké hmoty imobilizovaných částic postupným zpracováním výchozí suspenze, přičemž specifická aktivita materiálu činila 3,62 azokaseinových jednotek/g vlhké hmoty s průměrnou distribucí velikosti částic 0,4 až 2,0 mm, přičemž ke kvantitativní sedimentaci částic vedlo 2minutové stání.
Příklad 10
Do 100 ml 0,05% vodného roztoku NaCl, jehož pH bylo upraveno na hodnotu 7,0 20% roztokem NaOH, bylo suspendováno 5o g vlhké hmoty čerstvých celých nativních buněk Bacillus megatherium s proteolytickou aktivitou, jak je uvedeno v příkladu 9. Po homogenizaci suspenze bylo pH znovu popsaným způsobem upraveno na hodnotu 7,0, poté byl přidán vaječný lyofilizovaný lysozym tak, aby jeho koncentrace v suspenzi činila 100 ^ug/ml a po 30 minutách stání bylo pH suspenze opatrně roztokem NaOH za míchání nastaveno na hodnotu 8,6 a suspenze zahřáta na 50 °C po dobu několika minut, až došlo к náhlé změně viskozity suspenze а к enzymové lyži buněčných stěn.
Poté bylo к suspenzi, bez předchozí flokulace, přidáno 100 ml roztoku RRP o koncentraci reakčních složek podle příkladu 9, suspenze intenzívně promíchána a dále při imobilizaci postupováno včetně ošetření částic acetonem po imobilizaci jako v příkladu 8 /mražení reakční směsi/.
Bylo získáno 30 g vlhké hmoty imobilizovaných částic, které vykazovaly 2,4 azokaseinových jednotek/g vlhké hmoty s průměrnou distribucí velikosti 0,2 až 1,0 mm, přičemž ke kvantitativní sedimentaci vedlo 3minutové stání.
Přikladli >
g vlhké hmoty čerstvé nativní pasty buněk kvasinky Kluyveromyces fragills, obsahující enzym beta-galaktosidázu o specifické aktivitě 0,017 ^imolů glukózy + galaktozy/min/mg vlhké hmoty /37 °C, pH 6,0, substrát laktózy/, bylo suspendováno ve 100 ml 0,1 M fosfátového pufru pH 7,0, který obsahoval 0,1 % tenzidu /Slovafol 910/ a 1 % dimethylsulfoxidu a suspenze byla zahřáta na 40 °C a při této teplotě nepřetržitě míchána po dobu 30 min. Po této době byly permeabilizované buňky odstředěny, 5 000 g/10 minut, supernatant slit a sediment buněčné pasty zvážen.
g vlhké hmoty popsaným způsobem permeabilizovaných buněk bylo imobilizováno a oěetřeno jako v příkladu 8, s tím rozdílem, že ošetření částic po imobilizaci bylo provedeno 1% roztokem Kanagomu v acetonu za jinak stejných podmínek ošetření a botnání, jak je uvedeno v příkladu 8.
Bylo získáno 15 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk o specifické aktivitě 0,02 дцп glukózy + galaktózy/min/mg vlhké hmoty .částic, distribuce velikosti se pohybovala průměrně od 0,2 do 1,5 mm a ke kvantitativní sedimentaci vedlo 2minutové stání při poměrně objemném sedimentu agregátů, které měly vatovitý charakter.
Příklad 12 g vlhké hmoty čerstvých celých buněk kvasinky Cryptococcus laurentii 8 L-alfa-amino-epsilon-aminokaprolaktam hydrolazovou aktivitou o specifické aktivitě 5,9<ито1й L-lysinu/ /hod/mg vlhké hmoty /37 °C# pH 7,5, substrát vodný roztok L-alfa-amino-epsilon-kaprolaktamu/, bylo intenzívním mícháním suspendováno v 100 ml roztoku RRP připravených jak uvedeno v příkladu 2 a po lhodinovém pomalém míchání byla silně viskózní vatovitá suspenze dále imobilizována technikou mražení jako v příkladu 2, včetně ošetření agregátů po imobilizaci roztokem lepidla v acetonu. Vzniklé odsáté agregáty byly uloženy přes noc botnat ve fosfátovém pufru pH 7,0 při +8 °C.
Bylo získáno 15 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk o specifické aktivitě 3,2/umolů L-lysinu/hod/mg vlhké hmoty, s průměrnou distribucí velikosti částic v rozsahu 0,125 až 1,5 mm а к jejich kvantitativní sedimentaci vedlo 2minutové stání. Makroskopicky tvořily Částice nepravidelné útvary s nepravidelnými okraji.
Příklad 13 g vlhké pasty čerstvých nativních buněk Mycobacterium sp., obsahující епгут dekarboxylázu L-asparagové kyseliny o specifické aktivitě 7,1 j/g vlhké hmoty /1 jednotka enzymové účinnosti je takové množství enzymu, které uvolní 100 /ul C02 z kyseliny L-asparagové za 5 minut při teplotě 30 °C a pH 5,5/, bylo suspendováno ve 100 ml roztoku RRP jako v příkladu 2 do formy homogenní suspenze a dále postupováno technikou mražení reakční směsi, včetně dekantace, promytí a odsátí rovněž jako v příkladu 2. Bylo získáno’ 19,6 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk.
Uvedené množství částic bylo suspendováno ve 100 rol 1 M roztoku Nad o pH 6,5, v kterém byl rozpuštěn tenzid /Slovafol 910/ o koncentraci 0,5 %. Do této suspenze byl přidán chloroform o aktuální koncentraci 5 % /objem/objem/ a. suspenze byla za míchání vytemperována na 35 °c a při této teplotě intenzívně míchána po dobu 1 hodiny. Poté byla suspenze zředěna 1 litrem vody, třikrát dekantována 0,5 1 vody a permeabilizované Částice vakóuvě v dřívějších příkladech popsaným způsobem odsáty, po odsátí suspendovány v 50 ml acetonu předem vychlazeného na -25 °č a intenzívně po dobu 3 minut-míchány při teplotě místnosti. Poté byly částice znovu odsáty, na fritě důkladně promyty vodou a suspendovány v 50 ml 0,05 M acetátového о г pufru o pH 6,0 a uloženy přes noc botnat při +8 C.
Bylo získáno 14,2 g/vlhké hmoty imobilizovaných. buněk o specifické aktivitě·4,0 j/g vlhké ‘ hmoty, distribuce velikosti se pohybovala od 75 do 800 <un, makroskopicky posuzováno tvořily· částice amorfní . šedožluté vatovité vložky se špatně smočivým povrchem. Imobilizované · buňky samovolně špatně sedimentovaly, tj. udržovaly se v horní části kapaliny· ve vznosu, avšak daly . se dobře filtrovat a odsávat.
Příklad 14 g vlhké pasty . čerstvých nativních buněk Bacterium cadaveris obsahující enzym dekarboxylázu L-lysinu o specifické aktivitě 16,4 j/g vlhké · hmoty /1 jednotka enzymové účinnosti je takové množství enzymu, které uvolní 1°° jil C02 z L-lysinu při teplotě 30 °C a · pH 5,5Д bylo suspendováno ve 100 ml roztoku RRP jako v příkladu 2 do formy homogenní suspenze a dále bylo postupováno technikou mražení, včetně dekantace, · promytí a odsátí rovněž·jak , je uvedeno v příkladu·2. Bylo získáno 24 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk.
Uvedené množství odsátých částic bylo suspendováno · ve 100 ml 1 M roztoku NaCl·o pH 6,5, který obsahoval 0,1% tenzid /SloVafol 909/ a suspenze byla 1 hodinu nepřetržitě míchána·při teplotě 37 °C. V da^ím ošetření imobilizovaných a permeabilizovaných buněk bylo pokračováno způsobem uvedeným v příkladu 13.
Bylo získáno 19,1 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk o specifické aktivitě 11,8 j/g vlhké hmoty, průměrné distribuce velikosti částic · 180 · až 600 /um, mikroskopicky tvořily částice ohraničené destičky, makroskopicky amorfní hnědé částice a k jejich kvantitativní sedimentaci vedlo 3minutové stání. ·
Příklad 15 g vlhké pasty čerstvých nativních buněk kvasinky Saccharomyces cerevisiae obsahující enzym invertázu o specifické aktivitě I48 j. na g vlhké hmoty /30 °C, pH 4,7^ substt^ sacharoza/ bylo suspendováno ve 100 ml roztoku RRP jako v příkladu· 2 do formy homogenní suspenze a dále bylo postupováno v imobilizacl technikou mražení včetně dalších operací jak je uvedeno v příkladu 2. Ošetření buněk acetonem bylo provedeno, jako v příkladu 8.
Bylo získáno 12,1 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk o specifické aktivitě 90 j/g vlhké hmoty, průměrné distribuce velikosti částic 0,32 až 2,0 mm, mikroskopicky tvořily částice neohraničené útvary nepravidelné morfologie · s potrhanými kraji, · makroskopicky tvořily světle hnědé až béžové amorfní částice a , k jejich kvantitativní sedimentaci vedlo íminutové stání.
Příklad 16 litr živné .půdy po submersní kultivaci obsahující čerstvou kulturu kvasinek Sacharomyces·coreanus byl odstředěn /Janetzki S-70, 3 000 g/10 minut/ a po slití supernatantu /živné · půdy po fermentaci, která byla uschována/ bylo získáno 28 g vlhké hmoty čerstvých nativních buněk.
Získané množství čerstvých · kvasinek ve formě buněčné pasty bylo suspendováno.ve 100 ml roztoku RRP, který byl připraven,·jak je · uvedeno v příkladu 2, a·po důkladné·homogenizaci suspenze intenzívním mícháním · byla reakční·směs umístěna na stolní reciproký·laboratorní·třepací stroj o počtu kyvů 50/min a 1 · hodinu takto třepáno při teplotě místnosti. Poté bylo míchání · zastaveno a · suspenze ponechána v klidu po dobu 3 hodin při uvedené teplotě. Po této době · byla silně viskozní houbovitá kaše vytvořených · agregátů přelita do 500 ml polyethylenových kyvet a výše popsaným způsobem odstředěna, supernatant slit a sediment suspendován v demineralizované vodě a třikrát 250 ml vody dekantován-za mírného míchání. Po dekantaci · a kvantitativní sedimentaci agregátů byl materiál vakuově odsát, promyt ještě cca 100 ml vody a zvážen /14 g/. Poté byl materiál suspendován ve 25 п1 ·acetonu předem vychlazeného na -25 °C а 2 minuty intenzívně míchán. Materiál byl ostře na fritě vakuově odsát a promyt cca 1 litrem demineralizované vody, znovu dobře odsát a zvážen /9 g/. Získaná vlhká hmota imobilizovaných buněk byla suspendována do odstředěné supernatantní kapaliny jak 18hora uvedeno /živná půda po fermentaci kvasinek, a ponechána botnat několik hodin při teplotě místnosti/.
Materiál byl znovu vakuově dobře odsát, odváženo 100 mg vlhké hmoty částic do Warburgovy nádobky, přidáno 2 ml odstředěné čiré fermentační kapaliny, jejíž pH bylo 4,6, do raménka Warburgovy nádobky byl napipetován 12,5% roztok sacharózy /0,5 ml/, do jedné z referenčních nádobek byly naplněny nativní neimobilizované buňky /100 ml nativní vlhké pasty/, přidáno ml odstředěné fermentační kapaliny do 2. z referenčních nádobek samotný supernatant /bez buněk/ a do ramének šacharóza, nasazeny manometry a zapnuto třepání při teplotě lázně Warburgova přístroje 30 °C po dobu 15 minut. Poté byly manometry odvzdušněny, z ramének přilit roztok sacharózy a započato vlastní měření vývoje C02.
V prvém kontrolním měření /neimobilizované jednotlivé nativní buňky/ došlo к vývoji
064 <ul CO^/hod., v druhém kontrolním měření /supernatant bez buněk/ nedošlo к vývoji C02, v třetím měření /imobilizované buňky o stejné koncentraci vlhké hmoty jako v prvém kontrolním měření/ došlo к vývoji C02 v množství 165 ,ul C02/hod., což je přibližně 5,4 % původní /neimobilizované/ celkové metabolické aktivity buněk.
Materiál imobilizovaných kvasinek, posuzováno mikroskopicky, tvořil ohraničené částice nepravidelných tvarů, makroskopicky béžové amorfní částice. К jeho kvantitativní sedimentaci vedlo jednominutové stání, distribuce velikosti částic činila 300 až 900
P ř í к 1 a d 17 g vlhké hmoty čerstvé nativní buněčné pasty baktérie Erwinia aroidea obsahující enzym L-asparagin amidohydrolázu o specifické aktivitě 100 ддто1 kys. L-asparagové/min/g vlhké hmoty /37 °C, pH 5,0, substrát L-asparagin/, bylo suspendováno ve 100 ml roztoku RRP, který byl připraven podle příkladu 7. Poté byla suspenze intenzívním mícháním homogenizována, 30 minut mírné míchána jako v příkladu 16 a poté ponechána 1 hodinu stát při teplotě místnosti. Po této době byla viskózní houbovitá hmota přelita do 500 ml polyethylenových kyvet a odstředěna při 5 0Q0 g/30 minut. Poté byl supernatant slit a na sediment působeno filtračním tlakem, jak je uvedeno v příkladu 7, s tím rozdílem, Že hmota byla krátkodobě, přibližně 5 minut, stlačena pomocí hydraulického lisu /vymačkání kapalné části RRP/ a křehký lomivý materiál byl rozlámán a vpraven do masového strojku se speciální ocelovou vložkou o velikosti pórů 1 mm a přes tuto vložku vytlačen do formy válcovitých granulí, které byly sušeny cca 3 hodiny na vzduchu při teplotě 25 °C, poté třikrát dekantovány vodou á ponechány přes noc botnat v demineralizované vodě.
Celkem bylo získáno 8 g granulovaného pevného materiálu imobilizovaných buněk o specifické aktivitě 64 ,umol kys. L-asparagové/g vlhké hmoty o nepravidelné velikosti částic ve tvaru válečků v rozsahu 1 až 3 mm. Materiál sedimentoval kvantitativně během několika desítek sekund.
P ř í к 1 a d 18 g vlhké hmoty čerstvé nativní buněčné pasty Streptomyces phaeochromogenes obsahující enzym glukozoisomerázu o specifické aktivitě 0,21/umol fruktózy/min/g'vlhké hmoty /60 °c, pH 6,85, substrát glukóza/, bylo suspendováno ve 200 ml 0,1 M roztoku NaCl pH 7,0 a suspenze byla krátkodobě zahřáta za nepřetržitého míchání po dobu 10 minut na 70 °c. Poté byla suspenze ochlazena a odstředěna /5 000 g/15 minut/. Supernatant slit á sediment suspendován ve 150 ml roztoku RRP, který byl připraven podle příkladu 7. Poté bylo při imobilizaci postupováno jak je uvedeno v příkladu 17, včetně odstředění, krátkodobého lisování, mletí a sušení s tím rozdílem, že vzniklé postformované granule imobilizovaných buněk byly ošetřeny 50 ml předem vychlazeného acetonu obsahujícího 2% lepidlo /Kanagomu/ na -28 °C po dobu 3 minut.
' / 15 · 231458
Poté byly granule ostře odsáty a na fritě ještě cca 15 minut odsávány a poté promyty cca 1 litrem 0,0.5 M fosfátového pufru, znovu odsáty a suspendovány v 100 ml tohoto pufru a uloženy při +8 °C přes noc.
Celkem bylo získáno 20 g vlhké hmoty granulovaného pevného materiálu imobilizovaných buněk o specifické aktivitě 0,1 (umol fruktózy/g vlhké hmoty o nepravidelné velikosti částic ve tvaru válečků v rozsahu 0,5 až 3,0 mm. Materiál sedimentoval kvantitativně během několika desítek sekund.
Příklad 19 · g vlhké hmoty čerstvé nativní buněčné pasty Aspergillus niger obsahující enzymy , glukosooxidázu a katalázu o specifické aktivitě 0,1 jumol H2O2/min/mg vlhké hmoty bylo vpraveno do 150 ml roztoku RRP, který byl připravén podle příkladu 7. Poté bylo při imobilizaci.
, postupováno rovněž, jak je uvedeno v příkladu 7 s tím rozdílem, že vzniklé postformované granule byly ponechány sušit při 40 % vlhkosti ' vzduchu /^SO^/ při teplotě místnosti ' po dobu
- 24 hodin. Po této době . byly imobilizované buňky přeneseny do demineralizované vody a pone, chány 24 hodin botnat při teplotě +8 °C.
Celkem bylo získáno 29 g vlhké hmoty imobilizovaných buněk o specifické aktivitě ' 0,045 rtrnol H2O2/ml vlhké hmoty buněk o nepravidelné velikosti částic ve tvaru válečků v rozsahu 0,5 až 3,0 mm. Materiál sedimentoval kvantitativně během několika desítek sekund.
Příklad 20 g vlhké hmoty čerstvých promytých rostlinných buněk Solanum aviculare /jednobuněčná kultura/, syntetizujících v hypertonickém prostředí roztoku sacharózy solanové alkaloidy a fytosterol, bylo suspendováno ve 100 ml roztoku RRP, jehož příprava je uvedena v příkladu 2 a homogenní suspenze vzniklá intenzívním mícháním·byla přelita na hliníkovou misku o průměru 15 cm a uložena do mrazic^o boxu po dobu 4 hodin při teplotě -19 °C. Po této době byla zmrzlá reakční směs z boxu vyjmuta a přelita · přibližně 50 ml 0,05 M fosfátového pufru o pH 5,7 obsahujícího 0,75 M KC1 a po 2 hodinách stání při teplotě místnosti byly vzniklé agregáty rostlinných buněk přeneseny do 1 litru výše uvedeného pufru a několikrát tímto pufrem dekantovány, vždy po kvantitativní · sedimentaci částic. Poté byly imobilizované buňky vakuově dobře odsáty, na fritě ještě promyty pufrem a znovu odsáty a zváženy /18 g/.
Poté· byly částice přeneseny · do 100 ml 8% /hmota/objem/ sterilního vodného roztoku sachar<ozy a suspenze byla mícWna při teplotě 20 °C elektromagnetickým míchadlem po dobu třikrát 24 hodin, přičemž .ve 24hodinových časových intervalech byla sledována v · sacharozovénť roztoku po oddělení agregátů extracelulární produkce solanových alkaloidů·a fytosterolu pos mocí HPLC chromatografie, popsané Hirků et al., /Biotechnol. · Letters, 3, No. 8, 447, 1981/.
Bylo zjištěno, že ve 3 opakovaných 24hodinových intervalech zůstává zachována produkce ' uvedených komponent s touže násadou imobilizovaných buněk. Částice byly hodnoceny rastrovacím elektronovým mikroskopem a byla prokázána vzájemná vazba rostlinných buněk.
Příklad 21 g vlhké hmoty čerstvých nepromytých rostlinných . buněk jako v příkladu 20, bylo suspendováno ve 100 ml 0,05 M · fosfátového pufru o pH 6,0 obsahujícího 0,75 M KC1. K homogenní suspenzi buněk byl za míchání přidán flokulant, Sedipur KA, v množství 0,5 % /objem/objem/. Po promíchání suspenze byla tato ponechána v klidu stát po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti až došlo k vizuálně pozorovatelnému vyvločkování buněk. Po této době byla suspenze opatrně, aby se neporušily přeformované vločky, přelita na fritu a přes textilní materiál byla .suspenze pomalu, avšak dobře vakuově odsáta. Po odsátí přebytečné kapaliny byl materiál bez promytí vpraven do 100 ml roztoku RRP, jehož příprava je uvedena v příkladu 10, a suspenze homogenizována opatrným a pozvolným mícháním. Po homogenizaci suspenze tato ponechána stát 1 hodinu při teplotě místnosti a dále bylo postupováno při imobilizaci jak je uvedeno v příkladu 20 s tím rozdílem, že teplota během mražení činila -25 °c.
Po 4hodinovém mražení byl materiál z mrazicího boxu vyjmut a dále postupováno jako v příkladu 20 s tím rozdílem, Že doba rozmrazování při teplotě místnosti trvala 1 hodinu. Bylo získáno 20 g imobilizovaných, promytých a dobře odsátých buněk.
Poté byly částice přeneseny do stejného prostředí jak je uvedeno v příkladu 20 s tím rozdílem, že biosyntéza solanových alkaloidů a fytosterolu probíhala recirkulací roztoku sacharozy vznosným ložem biokatalyzátoru po dobu 5 x 24 hodin, přičemž ve 24hodinových intervalech byla v sacharozovém roztoku sledována produkce solanových alkaloidů a fytosterolu postupem uvedeným v příkladu 20.
Bylo zjištěno, že v 5 opakovaných 24hodinových intervalech zůstává zachována produkce i produkční rytmus uvedených komponent s touže násadou imobilizovaných buněk.
Claims (8)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZU1. Buněčné katalyzátory pro biotransformace, sestávající z celých, neporušených, enzymově aktivních, nativních, popřípadě předem permeabilizovaných buněk nebo jejich fragmentů a jejich podbuněčných částic a/nebo ze směsí celých nativních buněk s jejich fragmenty, podbuněčnými částicemi, a celým uvolněným obsahem buněk a/nebo z celých, individuálně zesítěných a permeabilizovaných buněk, imobilizovaných chemicky reaktivním polymerem rozpustným ve vodě, vzniklým reakcí ve vodě rozpustné látky, obsahující nejméně dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny, jako je například polyethylenimin, hexamethylendiamin, lyzin a polylyzin, s bifunkčními aldehydy dikarboxylových kyselin, jako je například glutaraldehyd, popřípadě dále permeabilizovaných a/nebo mechanicky zpevněných.
- 2. Buněčné katalyzátory podle bodu 1, vyznačené tím, že jako uvedený buněčný materiál obsahující prokaryontní nebo eukaryontní buňky organismů, zejména grampozitivních, gramnegativních a gramlabilních baktérií, acidorezistentních baktérií, aktinomycet, kvasinek, a dalších mikroskopických hub a vyšších, zejména parazitických hub a-rostlinných buněk, popřípadě jejich fragmenty a podbuněčné částice, nesoucí enzymové aktivity# zejména hydrolázy, isomerázy, lyázy, dekarboxylázy, oxydoreduktázy a jiné aktivity a/nebo části či celé sekvence enzymů logického sledu biochemické dráhy, zejména degradativního metabolismu, glykolýzy, enzymů katalýzujících biotransformace hormonů a produkci alkaloidů, zejména solanových alkaloidů a fytosterolu a námelových alkaloidů.
- 3. Buněčné katalyzátory podle bodu 1 a 2 vyznačené tím, že uvedený buněčný materiál je imobilizován chemicky reaktivním polymerem rozpustným ve vodě, vzniklým reakcí polyethyleniminu s distribucí jeho molekulové hmotnosti 100 000 až 800 000 s glut^raldehydem.
- 4. Způsob výroby buněčných katalyzátorů pro biotransformace podle bodu 1, vyznačený tím, že se celé, neporušené, enzymově aktivní, nativní, popřípadě předem permeabilizované buňky nebo jejich fragmenty a podbuněčné částice a/nebo směsi celých nativních buněk s jejich fragmenty, podbuněčnými částicemi a celým uvolněným obsahem buněk a/nebo celé, individuálně zesítěné a permeabilizované buňky, imobilizují uvedením ve styk s ve vodě rozpustným, chemicky reaktivním polymerem, vzniklým reakcí ve vodě rozpustné látky obsahující nejméně dvě primární a/nebo sekundární aminoskupiny, s výhodou polyethyleniminu, s bifunkčními aldehydy dikarboxylových kyselin, s výhodou glutaraldehydem, při teplotě v rozmezí O až 60 °C ve vodném prostředí, při pH v rozmezí 4,0 až 12,0, přičemž reakce uvedeného buněčného materiálu s uvedeným polymerem se provádí při teplotě v rozmezí -30 až +50 °C, ve vodném prostředí a při pH v rozmezí 5,0 až 9,0, popřípadě za přítomnosti flokulačních činidel, vzniklé buněčné agregáty se po oddělení z reakční směsi promyjí vodou nebo pufrem, načež se popřípadě permeabilizují a/nebo mechanicky zpevňují.
- 5. Způsob podle bodu 4, vyznačený tím, že se k přípravě ve vodě rozpustného polymeru a k případné předchozí ·flokulaci ' buněčného materiálu použije vodný roztok polyethyleniminu s distribucí molekulové hmotnosti 100 000 až 800 000.
- 6. Způsob podle bodu 4 a 5 vyznačující se tím, že se reakce uvedeného buněčného materiálu s· uvedeným reaktivním polymerem provádí při teplotě 0 až 45 °c, při relativní odstředivé síle 1 až 50 000 g, při filtračním tlaku od 0 do 50 000 kPa, při stání či pomalém míchání nebo při přerušovaném míchání a stání reakční směsi.,
- 7. Způsob podle bodu 4 až 6 vyznačující se tím, že permeabilizace nativních buněk před imobilizací nebo získaných buněčných agregátů po imobilizaci se provádí mícháním buněčné suspenze ve vodném prostředí při teplotách od 0 do 70 °C, při hodnotě pH 4,0 až 9,0, v přítomnosti tenzidu a/nebo organického s vodou mísitelného a/nebo nemísitelného rozpouštědla, t zejména acetonu, etheru, isopropanolu, petroletheru, butylacetátu, chloroformu, dloxanu, * dimethylformamidu nebo dimethylsulfoxidu, popřípadě . za současné nebo následné změny iontové • síly suspenze přídavkem solí silných kyselin a/nebo zásad.
- 8.· Způsob podle bodu 4 a 5, vyznačující se tím, že částice imobilizovaných buněk se popřípadě · dále mechanicky zpevňují·částečnou dehydratací působením organických rozpouštědel, s výhodou acetonem, popřípadě roztoky lepidel v organických rozpouštědlech nebo jejich směsí s vodou, při teplotách +20 až -25 °C, popřípadě se vzniklé částice odsají a parciálně vysuší za sucha či vlhka, popřípadě vhodným způsobem postformují. . ‘
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS82277A CS231458B1 (en) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | Cellular catalysts for biotransformation and method to produce them |
| AT0002783A AT388933B (de) | 1982-01-14 | 1983-01-05 | Verfahren zur herstellung von biokatalysatoren durch immobilisierung von enzymatisch aktivem zellmaterial |
| IN31/CAL/83A IN155662B (cs) | 1982-01-14 | 1983-01-07 | |
| YU70/83A YU44732B (en) | 1982-01-14 | 1983-01-13 | Process for producing biotransformation cell catalysts |
| JP58003581A JPS58155092A (ja) | 1982-01-14 | 1983-01-14 | 細胞触媒及びその製造方法 |
| DE19833301102 DE3301102A1 (de) | 1982-01-14 | 1983-01-14 | Cellulaere biokatalysatoren und ihre herstellung |
| CS257784A CS241730B3 (en) | 1982-01-14 | 1984-04-03 | Stiffening and stabilization method of biocatalyst particles for ferment transformation of beta-lactam antibiotics |
| CS257884A CS249325B3 (cs) | 1982-01-14 | 1984-04-03 | Způsob zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru pro enzymovou inverzi sacharózy |
| CS463584A CS245584B3 (cs) | 1982-01-14 | 1984-06-18 | Způsob zpevňování a stabilizace částic imobilizovaných buněk pro denitrifikaci vod |
| CS79085A CS251111B3 (cs) | 1982-01-14 | 1985-02-05 | Způsob zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru pro enzymovou přeměnu 7-/?-(4-karboxybutanamido)-cefalosporánové kyseliny na 7-aminocefalosporánovou kyselinu |
| CS306187A CS259997B3 (en) | 1982-01-14 | 1987-04-30 | Solid grained biocatalyst on base of immobilized fungi for phenoxymethylpenicilline conversion into 6-aminopenicillane acid and method of its production |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS82277A CS231458B1 (en) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | Cellular catalysts for biotransformation and method to produce them |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS231458B1 true CS231458B1 (en) | 1984-11-19 |
Family
ID=5334616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS82277A CS231458B1 (en) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | Cellular catalysts for biotransformation and method to produce them |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58155092A (cs) |
| AT (1) | AT388933B (cs) |
| CS (1) | CS231458B1 (cs) |
| DE (1) | DE3301102A1 (cs) |
| IN (1) | IN155662B (cs) |
| YU (1) | YU44732B (cs) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3301992A1 (de) * | 1983-01-21 | 1984-07-26 | Boehringer Ingelheim KG, 6507 Ingelheim | Permeabilisiertes schimmelpilzmycel mit intaktem immobilisiertem glucoseoxidase-katalasesystem sowie dessen herstellung und anwendung |
| US4600692A (en) * | 1983-02-10 | 1986-07-15 | Purification Engineering, Inc. | Immobilized cells for preparing phenylalanine |
| CA1210717A (en) * | 1983-08-10 | 1986-09-02 | Oreste J. Lantero, Jr. | Immobilization of biocatalysts |
| AT409380B (de) * | 1997-09-09 | 2002-07-25 | Biochemie Gmbh | Verfahren zur herstellung von biokatalysatoren |
| WO1999013058A2 (en) * | 1997-09-09 | 1999-03-18 | Biochemie Gesellschaft Mbh | Esterase free enzymes |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5617073B2 (cs) * | 1971-10-28 | 1981-04-20 | ||
| GB1444539A (en) * | 1972-09-11 | 1976-08-04 | Novo Industri As | Immobilised enzymes |
| SU659611A1 (ru) * | 1977-02-09 | 1979-04-30 | Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова | Способ получени -аспарагиновой кислоты |
| US4212943A (en) * | 1978-03-27 | 1980-07-15 | Miles Laboratories, Inc. | Production of bacterial cell aggregate |
| DK146942C (da) * | 1978-04-19 | 1984-07-30 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzymprodukt |
| US4251632A (en) * | 1978-09-11 | 1981-02-17 | Miles Laboratories, Inc. | Preparation of a bacterial cell aggregate |
-
1982
- 1982-01-14 CS CS82277A patent/CS231458B1/cs unknown
-
1983
- 1983-01-05 AT AT0002783A patent/AT388933B/de not_active IP Right Cessation
- 1983-01-07 IN IN31/CAL/83A patent/IN155662B/en unknown
- 1983-01-13 YU YU70/83A patent/YU44732B/xx unknown
- 1983-01-14 DE DE19833301102 patent/DE3301102A1/de active Granted
- 1983-01-14 JP JP58003581A patent/JPS58155092A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IN155662B (cs) | 1985-02-23 |
| DE3301102A1 (de) | 1983-07-21 |
| YU7083A (en) | 1985-10-31 |
| AT388933B (de) | 1989-09-25 |
| JPH0325159B2 (cs) | 1991-04-05 |
| ATA2783A (de) | 1989-02-15 |
| JPS58155092A (ja) | 1983-09-14 |
| YU44732B (en) | 1991-02-28 |
| DE3301102C2 (cs) | 1987-09-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SU712026A3 (ru) | Способ получени иммобилизованного ферментного препарата глюкозоизомеразы | |
| Kumar et al. | Immobilization of soybean (Glycine max) urease on alginate and chitosan beads showing improved stability: Analytical applications | |
| Homaei | Enzyme immobilization and its application in the food industry | |
| US4543332A (en) | Method for the preparation of spherical microorganism cell aggregates | |
| AU724492B2 (en) | Polymer-protein composites and methods for their preparation and use | |
| EP0058689A1 (en) | Cell culture medium, improved animal cell culture method, method of producing microparticles and microparticles. | |
| A Chaudhari et al. | Immobilization of proteins in alginate: functional properties and applications | |
| KR910002854B1 (ko) | 효소의 고정방법 | |
| Rezakhani et al. | Immobilization of protease in biopolymers (mixture of alginate-chitosan) | |
| Arica et al. | Reversible immobilization of lipase on phenylalanine containing hydrogel membranes | |
| US4276381A (en) | Preparation of immobilized enzymes of microorganisms | |
| CS231458B1 (en) | Cellular catalysts for biotransformation and method to produce them | |
| US4760024A (en) | Immobilization of enzymes | |
| West | Exopolysaccharide production by entrapped cells of the fungus Aureobasidium pullulans ATCC 201253 | |
| CS203607B1 (en) | Process for preparing bonded cells with activity of penicilinacylase | |
| CS231656B1 (cs) | Enzymové katalyzátory pro biotransformace a způsob jejich výroby | |
| CS209265B1 (cs) | Způsob výroby stabilních preparátů vzájemně vázaných buněk prokaiyontních a eukaryontních mikroorganismů s enzymovou aktivitou. | |
| US4013511A (en) | Immobilized enzymes | |
| JPS5974984A (ja) | 固定化酵素もしくは固定化微生物の製造方法 | |
| JPH0383585A (ja) | 酵素又は微生物の固定化法 | |
| JP3083554B2 (ja) | 凝集剤特性を有する菌の細胞壁物質、その生成のための方法 | |
| US4757008A (en) | Enzyme immobilization in a macroporous non-ionic resin | |
| JP2000236892A (ja) | 高分子化合物微粒子及びその製造方法 | |
| CS263016B1 (cs) | Zrnitý biokatalyzátor na bázi imobilizovaného enzymu hydrolázy 7 -(4-karboxybutanamido), cefalosporánové kyseliny k enzymová výrobě 7-aminooefalosporanové kyseliny a způsob jeho přípravy | |
| Panajotova et al. | Immobilization of lipase produced by Rhizopus arrhizus on chitosan coated polygalacturonic acid beads. |