CS249325B3 - Způsob zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru pro enzymovou inverzi sacharózy - Google Patents
Způsob zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru pro enzymovou inverzi sacharózy Download PDFInfo
- Publication number
- CS249325B3 CS249325B3 CS257884A CS257884A CS249325B3 CS 249325 B3 CS249325 B3 CS 249325B3 CS 257884 A CS257884 A CS 257884A CS 257884 A CS257884 A CS 257884A CS 249325 B3 CS249325 B3 CS 249325B3
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- particles
- biocatalyst
- enzyme
- sucrose
- water
- Prior art date
Links
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 88
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 72
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 72
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 title claims abstract description 35
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 title abstract description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 title abstract description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title description 9
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 title 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 title 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims abstract description 34
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 claims abstract description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 18
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 14
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 13
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 5
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 241000582914 Saccharomyces uvarum Species 0.000 claims description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 2
- 239000012258 stirred mixture Substances 0.000 claims description 2
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 claims description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 19
- 239000000725 suspension Substances 0.000 abstract description 14
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 abstract description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract description 7
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 abstract description 2
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 29
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 19
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 9
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 5
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N ethenylcyclopentane Chemical compound C=CC1CCCC1 BEFDCLMNVWHSGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 239000004334 sorbic acid Substances 0.000 description 4
- 229940075582 sorbic acid Drugs 0.000 description 4
- 235000010199 sorbic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 4
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 3
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 3
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 3
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 3
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 3
- XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N (2R,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 2
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 2
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 2
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 239000007966 viscous suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102100032843 Beta-2-syntrophin Human genes 0.000 description 1
- 108050004003 Beta-2-syntrophin Proteins 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-N 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N D-gluconic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O RGHNJXZEOKUKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 210000000677 aggregate cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 235000019658 bitter taste Nutrition 0.000 description 1
- 238000004061 bleaching Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- JBKVHLHDHHXQEQ-UHFFFAOYSA-N epsilon-caprolactam Chemical compound O=C1CCCCCN1 JBKVHLHDHHXQEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000004186 food analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 229950006191 gluconic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000012208 gluconic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229960004903 invert sugar Drugs 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 235000015122 lemonade Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000005029 sieve analysis Methods 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Řešení se týká způsobu zpevňování a stabilizace
částic biokatalyzátoru pro enzymovou
inverzi sacharózy, připravených podle
autorského osvědčení č. 231458, při kterém
se vodný roztok sacharózy a jejích technických
forem a meziproduktů její výroby
uvádí ve styk s částicemi biokatalyzátoru.
Podstata řešeni spočívá v tom, že do míchané
směsi částic biokatalyzátoru na bázi
kvasinkových buněk obsahujících enzym invertázu,
se po úpravě pH v rozmezí hodnot
6,0 až 8,0 přidá bud vodný roztok glutaraldehydu,
a/nebo vodný roztok technické nebo
čisté bílkoviny živočišného, rostlinného
nebo mikrobiálního původu, s výhodou technická
vaječná bílkovina, a/nebo dezintegrovaná
nebo autolyzovaná suspenze produkčních
buněk obsahujících vedle jiných rozpustných
bílkovin i enzym invertázu, potom se nepřetržitě
míchaná reakční směs ještě popřípadě
došiti dalším přídavkem glutaraldehydu, stabilizované
částice se od reakční kapaliny
oddělí filtrací, suspendují za intenzivního
míchání v ledovém acetonu, filtrací znovu
oddělí a suší po homogenizaci volně na
vzduchu při teplotě místnosti 1 až 24 hodin,
potom se částice suspendují ve studené
vodě, několikrát vodou dekantuji a ponechají
bobtnat ve vodě nebo vQpufru při
teplotách v rozmezí 5 až 20 °C.
Description
Vynález se týká způsobu zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru připraveného podle základního autorského osvědčení č. 231 458 a stabilizace enzymu -D-fruktofuranosidázy (invertázy, EC 3.2.1.26) v těchto částicích, které slouží k enzymové inverzi čisté sacharózy, jejích technických forem a meziproduktů její výroby na směs příslušných monosacharidů, gluózy a fruktózy, resp. glukÓ2afruktózový sirup.
Vzniklé produkty enzymové inverze vytvořené jednorázovým, mnohonásobným opakovaným nebo kontinuálním stykem těchto zpevněných a stabilizovaných částic s vodnými roztoky čisté sacharózy (tzv. rafinády), jejich technických forem např. tzv. afinády (což je surový, od matečných louhů nepromytý cukr), kléru (silně viskózní zahuštěný roztok surového cukru o jeho koncentraci 60 až 70 hmotnostních procent) a meziproduktů její výroby, zejména melasy a těžko cukrové štávy, lze bud použít přímo, např. v potravinářském průmyslu jako glukózafruktózový sirup, který má vyšší stupeň sladivosti než sacharóza, nebo lze izolací a dalším čištěním rozdělit oba monosacharidy a připravit tak čistou, nebo technickou glukózu a fruktózu.
Získané čisté nebo technické monosacharidy lze pak použít v různých odvětvích národního hospodářství např. ve farmaceutickém průmyslu nebo je využít jako substráty pro další enzymové přeměny, např. lze glukózu jako substrátu použít pro enzymovou přeměnu na D-glukonovou kyselinu.
Pro tyto účely se v průmyslové praxi, především v potravinářském a cukrovarnickém průmyslu, v průmyslu výroby cukrovinek, limonád a různých dalších nápojů, používá jednorázová aplikace rozpustného enzymu - invertázy, izolované z různých buněk mikroorganismů. Zdrojem enzymu jsou především kvasinky. V Československu se tento enzym dosud nevyrábí a pro tyto účely, tj. pro účely přípravy tzv. invertního cukru se enzymový preparát dováží ze zahraničí. Sacharózu lze také štěpit neenzymaticky bud fyzikálně chemicky tzv. finskou technologii na iontoměnničích za vysokých teplot za současně izolace obou monosacharidů, nebo chemicky, kyselou hydrolýzou.
Uvedené způsoby mají však své ekonomické a jiné limity. V případě jednorázové aplikace rozpustné invertázy je limitem cena a dovoz enzymového praparátu, v případě fyzikálně chemické technologie je limitem výchozí koncentrace a kvalita sacharózy (35 % hmota/objem roztok), nároky na energii (štěpení na sloupcích iontoměničů při 80 °C), kvalita a cena iontoměničů a jejich regenerace. V případě chemického štěpení sacharózy je limitem vysoká spotřeba minerálních kyselin, koroze aparatury a především špatné organoleptické a vizuální vlastnosti získaného glukózafruktózového sirupu (hořkost a barevnost).
V poslední době se projevují tendence o jednorázovou aplikaci živých nativních buněk pivovarských nebo pekařských kvasinek, obsahujících invertázu, k enzymové inverzi koncentrováných roztoků sacharózy a jejích technických forem, především surového cukru a kléru. Enzymová hydrolýza se provádí jednorázově vmícháním celých živých nebo parciálně autolyzovaných, resp. desintegrovaných buněk kvasinek, do koncentrovaných roztoků cukru za současného míchání a zahřátí na teploty kolem 80 °C.
Limitem této technologie je dovoz kvasničné biomasy z pivovarů, resp. droždáren na místo aplikace, dostupnost biomasy v potřebném množství po celou dobu výroby, její proměnlivá kvalita, zákaly v získaných produktech a konečně sekundární kontaminace kvasničné biomasy pramenící hlavně z převozu, skladování a manipulace.
Vzhledem k proměnlivé kvalitě biomasy, hlavně obsahu enzymu v buňkách, kolísá i stupeň inverze v získaných produktech mezi 60 až 85 %. V nespolední řadě zůstávají ve finálních produktech obsaženy i určité buněčné podíly (bílkoviny, nukleové kyseliny, lipidy), čímž je zvýšeno hygienické riziko.
Jistým pokrokem v oblasti moderních směrů biotechnologie je aplikace zmobilizované invertázy, nebo imobilizovanýoh buněk s invertázovou aktivitou, která na rozdíl od jednorázových aplikací umožňuje využití částic imobilizovaných biokatalyzátorů mnohonásobně opakovaně ve vsádkových míchaných reaktorech nebo kontinuálně v reaktorech se vznosným nebo pevným ložem nebo v míchaných kontinuálních reaktorech, čímž se značně snižují nároky na pracnost, spotřebu energie a kvalita konverzní směsi je vysoká, nebot částice katalyzátorů jsou nerozpustné, snadno separovatelné a nepřecházejí do finálních potravinářských produktů.
V patentové literatuře byly již popsány určité způsoby imobilizace enzymů, mimo jiné i invertázy. Jedná se především o čs. autorské osvědčení č. 214 096, kde je popsáno využití mikroporéznlch částic organických polymerů sorpcí a následné kovalentní vazby enzymů pomocí sorbovaných sítovacích činidel, zejména glutaraldehydu nebo sorpcí roztoků různých enzymů včetně invertázy na částice polymerních sorbentů a následujícího kovalentního zesítění sorbovaných enzymů glutaraldehydem.
V čs. autorském osvědčení č. 209 743 je popsán způsob výroby imobilizovaných enzymů včetně invertázy na mikroporézní organické polymerní sorbenty na bázi poly-6-kaprolaktamu a polykondenzátů melaninu s formaldehydem a močoviny s fornaldehydem, přičemž princip imobilizace enzymů spočívá v předchozí chemické reakci částic těchto syntetických aminopolymerů s volným glutaraldehydem, ze současné chemické aktivace těchto částic, vymytí nadbytku sítovadla a následující kovalentní vazby enzymů prostřednictvím chemicky aktivních aldehydických skupin, za tvorby Schiffových bází mezi enzymovou bílkovinou a částicemi uvedených a popsaným způsobem aktivovaných sorbentů.
Uvedené postupy však vyžaduji izolované technické nebo čisté enzymy, tedy i invertázu, což zvyšuje náklady na výrobu a aplikaci těchto katalyzátorů. Podstatně ekonomičtější postupy imocllizac». jsou ty, které nevyžadují izolovaných enzymů, tedy postupy využívající imobilizovaných buněk s požadovanou enzymovou aktivitou. Fyzikální imobilizaci kvasinek s invertázovou aktivitou popsali např. Toda a Shoda (Biotechnol. Bioeng., 17, 481, 1975) a D' Souza a Nadkarni (Hindustan Antibiotics Bull., 20, 68 1978). V prvém případě se jedná o zabudování buněk do agarových pelet, v druhém případě o zabudování buněk do sítě vznikajícího polymeru kopolymerací akrylamidu s Ν,Ν'-metylendiakrylamidem, za tvorby dobře sedimentujících částic katalyzátorů.
Při opakovaném použití fyzikálně zabudovaných buněk však dochází k vyplavování buněk z částic, a tím k poklesu specifické aktivity a enzymové účinnosti, nebot použité přírodní či syntetické polymery tvoří velmi měkké pelety.
Jistým pokrokem v technologii enzymových transformací je např. postup popsaný v v čs. autorském osvědčení č. (PV 9573-82), který spočívá v chemické aktivaci původně chemicky inertních částic syntetických mikroporézních polymerů čs. provenience, reaktivními ve vodě rozpustnými polymery a následné kovalentní vazby mikrobiálních buněk, rostlinných buněk a enzymů na aktivované částice. V citovaném autorském osvědčení je popsán i způsob imobilizace celých neporušených buněk kvasinek s invertázovou aktivitou a izolované invertázy na částice předem chemicky aktivovaných organických a anorganických ve vodě nerozpustných nosičů.
Tento postup při použití izolovaného enzymu poskytuje velmi dobré výsledky, při imobilizaci celých buněk však výsledné preparáty mají relativně nízkou specifickou aktivitu.
V čs. autorském osvědčení č. 209 265 je popsán způsob výroby vzájemně chemicky vázaných mikrobiálních buněk s různou enzymovou aktivitou, mimo jiné i kvasinek s invertázovou aktivitou. Tento způsob imobilizace je výhodnější ve srovnání s předcházejícím, neboř nevyžaduje žádné ve vodě nerozpustné nosiče. Postup spočívá v kovalentním zasltění individuálních buněk glutaraldehydem, jejich následné permeabilizaci, načež se individuálně zesítěné a permeabilizované buňky s různými enzymovými aktivitami navzájem kovalentně imobilizují za tvorby stabilních buněčných agregátů za specifických podmínek, zejména v odstředivém poli, filtračním tlakem a mražením reakční směsi. Tímto postupem lze získat stabilní pevné agregáty imobilizovaných buněk, avšak technologie výroby vyžaduje speciálních reakčních podmínek, z čehož vyplývají zvýšené nároky na strojní a technologické vybavení provozu.
Ve snaze po odstranění tohoto technologického limitu výroby a využití buněčných katalyzátorů v různých průmyslových odvětvích, byla vypracována podstatně zjednodušená a do značné míry univerzální technologie výroby různých imobilizovaných prokaryontních a eukaryontních buněk, jejichž částice obsahují různé enzymy a jsou použitelné pro různé biotransformace, mimo jiné obsahující i enzym invertázu. Tyto postupy jsou předmětem čs. autorského osvědčení č. 231 458.
Citovaným postupem, který spočívá na vzájemné chemické imobilizaci různých buněk nesoucích různé enzymy pomocí reaktivních ve vodě rozpustných polymerů (dále jen RRP), lze vytvořit částice biokatalyzátorů nejen použitím techniky maražení reakční směsi, ale i pouhým mícháním suspendovaných buněk v reakční směsi za normálních teplot, s výhodou při pokojové teplotě. Vzniklé částice katalyzátorů mají sice vysokou enzymovou aktivitu a dobré sedimentační vlastnosti, jsou však měkké a musí se různým způsobem mechanicky zpevňovat bud použitím lepidel rozpuštěných v organických rozpouštědlech např. acetonu, nebo postformací voluminézních částic do formy granulí nebo válečků a jejich následným sušením.
První způsob zpevňování má za následek vytvoření difúzní bariéry pro substrát a produkty do a z částic snížením jejich porozity (parciálním zalepením pórů částic) , druhý způsob vede k tvorbě velkých částic, řádově 1 až 10 mm, čímž se odstraní počáteční výhoda vysoké specifické aktivity původně vzniklých menších částic (závislost velikosti částice na specifickém povrchu).
Pokud nebyly k výrobě katalyzátorů podle čs. autorského osvědčení č. 231 458 použity jako výchozí materiál zesítěné a permeabilizované buňky, tedy bylo-li použito celých neporušených nativních buněk, získané částice vykazovaly jak během skladování, tak během opakovaného nebo kontinuálního použití nižší stabilitu sledované enzymové aktivity, tedy i aktivity invertázy.
Tato skutečnost je způsobena tím, že RRP v důsledku jeho vysoké molekulové hmotnosti nepenetruje do nativních buněk, což je výhoda pro některé enzymy obsažené v buňkách, které jsou extrémně citlivé k volnému nízkomolekulárnímu sítovadlu, zejména glutaraldehydu. K enzymům, které nejsou extrémně citlivé k jinak poměrně agresivním účinkům bifunkčních sítovacích činidel jako je např. glutaraldehyd, patří i enzym invertáza.
Této skutečnosti bylo již využito v minulosti, při různých způsobech imobilizace enzymu a buněk s touto aktivitou v citovaných autorských osvědčeních a tyto postupy jsou souhrnně uvedeny v recentním článku o imobilizovaných buňkách (Folia Microbiol., 28,
309 až 340, 1983).
Nyní, bylo zjištěno, že v závislosti na způsobu výroby imobilizovaných buněk popsaném v čs. autorském osvědčeni č. 231 458, lze chemickým v kombinaci s mechanickým způsobem zpevňovat a stabilizovat částice biokatalyzátoru s invertázovou aktivitou, přičemž získaný materiál je použitelný k enzymové inverzi sacharózy, jejích technických forem a meziproduktů její výroby v průmyslovém měřítku.
Technologie zpevňování a stabilizace částic podle předmětného vynálezu je jednoduchá, nevyžaduje žádných ve vodě nerozpustných nosičů a především nevyžaduje speciální technologické a strojní zařízení. K výrobě katalyzátoru, zpevňování a stabilizaci částic je třeba pouze míchací kotel a filtrační vakuové zařízení.
i
Výše uváděné nevýhody byly odstraněny vypracováním způsobu zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru, připravených podle autorského osvědčení č. 231 458, pro enzymovou inverzi sacharózy, při které se vodný roztok sacharózy, jejích technických forem a meziproduktů její výroby, uvádí ve styk s částicemi biokatalyzátoru, jehož podstata spočívá v tom, že se do nepřetržitě míchané směsi částic biokatalyzátoru na bázi kvasinkových buněk obsahujících enzym invertázu, výhodně Saccharomyces cerevisiae nebo Saccharomyces uvarum, přidá po úpravě pH na rozmezí 6,0 až 8,0 vodný roztok glutaraldehydu a/nebo vodný roztok nebo suspenze technické nebo čisté bílkoviny živočišného, rostlinného a/nebo mikrobiálního původu, jako je vaječná bílkovina, desintegrované nebo autolyzované mikrobiální buňky, výhodně buňky použitého produkčního mikroorganismu, načež se směs popřípadě došiti dalším přídávkem glutaraldehydu, stabilizované částice se od reakčni kapaliny oddělí filtrací, suspendují za intenzivního míchání v ledovém acetonu, načež se filtrací znovu oddělí a suší po homogenizaci volně na vzduchu při teplotě místnosti po dobu 1 až 24 hodin, poté se suspendují ve studené vodě, několikrát se vodou dekantují a nakonec se nechají botnat ve vodě nebo v pufru při teplotách v rozmezí 5 až 20 °c.
Tímto způsobem získané zpevněné a stabilizované částice biokatalyzátoru se uvedou ve styk s vodnými roztoky sacharózy, jejích technických forem, s výhodou surové sacharózy nebo kléru, a meziproduktů její výroby, nebo matečných louhů, zejména melasy a těžké cukrové štávy, a při pH reakčni směsi 4,0 až 5,0 se provádí diskontinuální opakovaná nebo kontinuální hydrolýza při teplotách 10 až 80 °C, načež se po proběhlé reakci z přefiltrované kapaliny nebo sirupu, oddělené od částic katalyzátoru popřípadě izolují glukóza a fruktóza nebo se oba ve směsi nebo jeden z produktů podrobí účinku jiných enzymů nebo se získaná směs obou monosacharidů použije pro potravinářské či jiné účely.
Částice biokatalyzátoru, ziskané podle předmětného vynálezu, jsou pevné, velmi rychle sedimentujíci útvary nepravidelné velikosti a tvaru s vysokou stabilitou invertázy, což je doloženo v následujících příkladech provedení. Jejich pevnost, dobré sedimentační vlastnosti, snadná a rychlá separovatelnost z reakčni směsi a vysoká specifická aktivita a účinnost enzymové konverze umožňuje jejich mnohonásobné opakované nebo kontinuální využití v běžných typech reaktorů, při vysokých iniciálních koncentracích substrátu.
Jako výchozí enzymově aktivní buněčný materiál byly použity komerční pivovarské nebo pekařské kvasinky. Způsob zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru podle předmětného vynálezu však nevylučuje využití jiných kmenů mikroorganismů obsahujících intracelulární invertázu, popřípadě kmenů kvasinek a jiných mikroorganismů získaných např. selekcí a nahromaSováním či genovou manipulací nebo jiným způsobem šlechtění.
K dělení částic získaného biokatalyzátoru bylo použito kovových sít na sítovou analýzu s velikostí ok 0,8; 0,5 a 0,315 mm, přičemž částice byly děleny plavením na těchto sítech vodou. K vyhodnocení aktivity částic bylo použito jednak enzymatické metody (glukózooxidázový test) pro stanovení reakčni rychlosti přírůstků koncentrace glukózy podle Jérgensena a Andersona (Anal. Biochem., 53, 141-145, 1973) spektrofotometricky. Referenčními metodami byla spektrofotometrická metoda stanovení přírůstku koncentrací redukujících cukrů podle Janíčka (Rukovět potravinářské analýzy, str. 381, 1962, SNTL), při vysokých iniciálních koncentracích sacharózy byla jednak koncentrace substrátu na počátku hodnocena refraktometrícky a vážkově (sušinou), jednak průběh a stupeň enzymové inverze hodnocen polarimetricky.
jednotka enzymové účinnosti invertázy v částicích biokatalyzátoru je takové množství enzymu, které uvolní jeden ^jmol glukózy v jednom mililitru ze jednu minutu za podmínek enzymové reakčni konetiky nultého řádu, při teplotě 30 °C, iniciální koncentraci sacharózy 0,25 M rozpuštěné v Oj 05 M acetátovém pufru o pH 4,6 v míchaném reaktoru. Specifická aktivita částic biokatalyzátoru má rozměr «mol glukózy . min-^ . mg-’'' suché hmoty.
Sedimentační rychlost částic neděleného katalyzátoru a rozdělených frakcí byla určována dobou za jakou sedlmentuje 1 ml dané frakce katalyzátoru; rozměr ml . s-^. Specifický odpor (R) byl vypočítán z doby, za kterou dané množství substrátu, pod daným tlakem, proteče určitým sloupcem částic katalyzátoru, _2
R=p.S/v.d Pa.s.m p - tlak substrátu
S - průřez sloupce v - průtoková rychlost d - výška sloupce
Specifický odpor měřen pro vodu při teplotě místnosti. Velikost částic byla určována jednak optickým mikroskopem a vestavěným měrným okulárem, jednak dělením na sítech.
Porozita částic byla hodnocena nepřímo měřením reakčni rychlosti v závislosti na koncentraci substrátu a také byla zjištována rastrovacím elektronovým mikroskopem.
Částice katalyzátoru byly suspendovány (asi 0,5 kg/1 litr) v 0,05 M acetátovém pufru pH 4,6, obsahujícím 0,1 $ (hmota/objem) kyseliny sorbové a přechovávány v polyetylenových lahvích se šroubovým uzávěrem při teplotě 5-10 °C, Za těchto podmínek uchovávání je katalyzátor stabilní 6 měsíců až 1 rok, přičemž kyselina sorbová brání růstu event. sekundární kontaminace v průběhu dlohodobého skladování. Částice katalyzátoru lze rovněž ošetřit 0,5 až 1,0 % formaldehydem, za účelem jeho sanitace, bez významné ztráty specifické aktivity.
V dalším je vynález blíže objasněn v příkladech provedení, aniž by se jimi omezoval.
Příklady provedeni
Příklad 1
200 g vlhké hmoty kvasinek Saccharomyces uvarum s invertázovou aktivitou bylo suspendováno v 500 ml reaktivního ve vodě rozpustného polymeru, dále jen RRP, získaného 24 h předchozí polymerací 4 % flokulantu obsahujícího polyetylenimin (Sedipur CL-930 BASF,
NSR) a 2 % glutaraldehydu postupem podle čs. autorského osvědčení č. 231 458; pH suspenze bylo upraveno 40 % roztokem NaOH na 7,0a silně viskózní suspenze obsahující voluminézné částice agregovaných buněk byla jednu hodinu nepřetržitě míchána. Poté bylo přidáno 28 ml 25% vodného roztoku glutaraldehydu a intenzívně mícháno opět jednu hodinu.
Po této době bylo za nepřetržitého míchání upraveno pH suspenze na 8,0 a částice odsáty přes textilní materiál (mlynářská silonová plachetka). Dobře odsátý a od přebytečné reakčni směsi vymačkaný materiál byl suspendován v 500 ml čistého acetonu předem vychlazeného na -20 °C. Částice byly pomocí rychloběžného míchadla cca 3 min v ledovém acetonu míchány a poté přes textilní fólii, hrudky homogenizovány a materiál ponechán schnout 24 h volně na vzduchu při teplotě místnosti.
Poté byly větší tvrdé hrudky mechanicky v hmoždíři rozmělněny, suchý materiál homogenizován a suspendován v 1 litru destilované vody. Po cca lhodinovém bobtnání byl materiál 3krát dekantován vždy 1 litrem vody, poté 2krát 1 litrem 0,05 M acetátovým pufrem pH 4,6 a v tomto pufru ponechán bobtnat 24 hodin při teplotě 10 °C. Nabobtnalé částice katalyzátoru byla dobře přes textilní materiál odsáty a zváženy. Bylo získáno 220 g vlhké hmoty zpevněných a stabilizovaných částic biokatalyzátoru o průměrné distribuci velikost 0,76 mm a specifické aktivitě 0,721 umol glukózy . min . mg suché hmoty.
g vlhké hmoty katalyzátoru bylo suspendováno ve 45 ml 1 M roztoku sacharózy (rafináda), rozpuštěné v acetátovém pufru pH 4,6. Suspenze byla umístěna do Dewargovy temperované
Ί nádobky na 30 °C a ve zvolených časových intervalech, v průběhu nepřetržitého míchání suspenze ocelovým vrtulovým míchadlem o počtu otáček 100 . min \ sledován přírůstek koncentrace jednoho nebo obou monosacharidů analytickými postupy popsanými v popisu předmětného vynálezu.
Bylo zjištěno, že enzymová inverze je kvantitativní (100 % teorie, tj. 360,4 mg glukózy a fruktózy . ml ^) za 90 min. Tento postup s touže násadou biokatalyzátoru byl opakován celkem 20krát vždy tak, že po skončení reakce v každém z cyklů (po 90 min) byla po kvantitativní sedimentaci částic vakuově odsáta reakční směs pasteurovou pipetou z z horní části reaktoru a částice opět suspendovány v čerstvé násadě substrátu za jinak stejných podmínek a koncentrace sacharózy. Průměrný stupěň enzymové inverze činil 99,9 % teorie/20 cyklů opakovaného použití téže násady biokatalyzátoru.
200 g vlhké hmoty zpevněných a stabilizovaných částic biokatalyzátoru o průměrné distribuci velikosti 0,76 mm bylo dále fyzikálně a biochemicky charakterizováno postupy uvedenými v popisu předmětného vynálezu, zejména pokud jde o distribuci velikosti částic, specifickou aktivitou jednotlivých velikostních tříd, sedimentační rychlost a specifický odpor částic ve soupci.
Výsledky jsou uvedeny jak následuje.
| Frakce částic | Velikost částic (mm) | Množství vlhké hmoty íg) | Zastoupení jednotí, velikostních tříd <»> |
| A | 0,8 | 103,3 | 51,5 |
| B | 0,8 - 0,5 | 57,5 | 28,8 |
| C | 0,5 - 0,315 | 15,3 | 7,7 |
| D | menší než 0,315 | 23,9 | 12,0 |
| Frakce částic částic | Sedimentační rychlost (s) | Specifický odpor (Pa.s.m 2) | Specifická aktivita (yumol glukózy .mg-3) |
| A | 4,0 | 19,69.105 | 0,161 |
| B | 8,0 | 40,78.105 | 0,473 |
| C | 9,6 | - | 0,565 |
| D | 21,7 | 289.02.105 | 1,524 |
g nedělených Částic katalyzátoru bylo suspendováno ve 100 ml acetátového pufru, v kterém byla rozpuštěna kyselina sorbová o koncentraci 0,1 %? pH pufru bylo 4,6. Za podmíněk skladování uvedených v popisu předmětného vynálezu byla v jednotýdenních časových intervalech sledována specifická aktivita částic. Po 192 dnech nepřetržitého sledování nebyl zaznamenán pokles specifické aktivity částic.
Příklad 2 kg vlhké hmoty nativních buněk Saccharomyces cerevisiae bylo suspendováno v 10 litrech destilované vody pomocí rychloběžného míchadla a suspenze obsahující 0,5 g vlhké hmoty buněk/ml byla vychlazena na 5 °C. Poté byly buňky dezintegrovány čtyřnásobným průchodem štěrbinovým mechanickým dezintegrátorem při maximálním přetlaku 6.10 Pa. Mezi jednotlivými cykly dezintegrace byla suspenze vždy ochlazena na 10 až 15 °C. Stupeň dezintegrace buněk byl sledován jednak mikroskopicky, jednak celkovým množstvím uvolněných bílkovin v supernatantu, odstředěné suspenze.
Postupem podle čs. autorského osvědčení č. 231 458 bylo do dvou 35 litrových nerezových fermentačních tanků předloženo a 15 litrů vody a do každého z fermentorů bylo vmícháno 750 g flokulantu obsahujícím polyetylenimin (Sedipur CL-930) a po jeho rozpuštění přidáno a 825 ml 46 % vodného roztoku glutaraldehydu. Výsledná koncentrace obou rekreačních složek v každém z fermentorů činila 5 % (hmota/objem) Sedipuru a 2,5 % (objem/objem) glutaraldehydu.
Polymerace probíhala 24 hodin za nepřetržitého mícháni při teplotě 20 °C. 10 kg vlhké hmoty celých buněk S. cerevisiae bylo homogenizováno v 10 litrech vody v polyetylenové nádobě pomocí rychloběžného míchadla. Buněčná suspenze byla rozdělena na 2 stejné objemové díly a každý z dílů nalit za zvýšené intenzity míchání do roztoku RRP. Po homogenizaci suspenze bylo upraveno pH z hodnoty 5,2 na 7,5 za intenzivního míchání 40 % roztokem NaOH a mícháno 1 hodinu při počtu otáček 800.min
V 15 litrech dezintegrované suspenze buněk, jejíž příprava byla popsána v prvním odstavci, bylo rozpuštěno 374 g technické vaječné bílkoviny. Celková koncentrace bílkovin v supernatantu po odstředění činila 50 mg.ml 1. Suspenze byla rozdělena na dva stejné objemové díly a každý z nich nalit do míchané suspenze buněk v RRP za současného intenzivního míchání. Po zhoustnutí silně viskozní suspenze byla snížena intenzita míchání a při cca 300 otáčkách.min mícháno 30 minut.
Poté byla intenzita míchání opět zvýšena a do každého v nerezových tancích bylo přidáno 655 ml 46 % vodného roztoku glutaraldehydu. Výsledná koncentrace volného sítovadla činila 1 % (objem/objem). Po intenzivním rozmícháni suspenze bylo míchání přerušeno a reakční směs byla ponechána 30 min v klidu, poté mírně promíchána a za míchání postupně čerpána na rotační vakuový filtr na kterém byla napnuta silonová mlynářská plachetka.
Filtrace částic probíhala za vakua a vlhké a dobře odsáté částice byly krájeny po vrstvách z povrchu plachetky z bubnu rotačního filtru nastaveným nerezovým břitem.
Celkem bylo po filtraci získáno 25,5 kg vlhké hmoty materiálu.
Uvedené množství vlhké hmoty bylo rozděleno na 25 dílů (4 1 kg) a každý díl byl postupně suspendován v 1,5 litru ledového acetonu v 5 litrové nádobě z plastické hmoty pomocí rychloběžného míchadla opatřeného ocelovou vrtulí, cca 3 min intenzivně míchán a poté přes textilní materiál (mlynářská plachetka) vakuově na nuči rychle a ostře odsát a bez promytí ponechán sušit na tácech z plastické hmoty 24 hodin při teplotě místnosti. Popsaným způsobem bylo postupně zpracováno všech 25 hmotnostních dílů materiálu.
Po usušení byl materiál mechanicky homogenizován a zvážen. Bylo získáno 6,045 kg suché hmoty částic. Na sítě byla v suchém stavu oddělena frakce, jejíž částice byly větší než 2 mm (hrudky). Zbylé množství suché hmoty (5,5 kg) bylo suspendováno ve 20 litrech pitné vody v polyetylénové nádobě a několikrát 20 litry vody dekantováno, vždy po kvantitativní sedimentaci materiálu. Materiál ponechán bobtnat přes noc v komorové lednici při teplotě 10 °C.
Po nabobtnání materiál pomocí rychloběžného míchadla intenzívně ve vodě míchán a vždy po kvantitativní sedimentaci částic mnohonásobně promyt pitnou vodou, při slití horni zakalené vrstvy a velmi jemných podílů částic. Dekantace probíhala tak dlouho, dokud po intenzivním míchání nebyl v promývací vodě zákal. Po kvantitativní dekantaci byl materiál vakuově přes mlynářskou plachetku na nuči dobře odsát a zvážen. Získané množství činilo 7,5 kg vlhké hmoty. Toto množství suspendováno v 15 litrech 0,04 M acetátového pufru o pH 4,6, který obsahoval 0,1 % kyseliny sorbové a ponechán do druhého dne při teplotě 10 °C.
Specifická aktivita zpevněných a stabilizovaných částic biokatalyzátoru činila 0,450 0,450 )umol.mg” suché hmoty, průměrná velikost částic činila 0,363 mm. Se získaným katalyzátorem bylo provedeno 20 opakovaných konverzí enzymové inverze 1,5 M roztoku sacharózy (rafináda o koncentraci 51 % hmota/objem, postupem popsaným v příkladu 1 s tím rozdílem,
Že jeden cyklus enzymové inverze s touže násadou katalyzátoru trval 4 hodiny. Za uvedených podmínek činil průměrný stupeň konverze 96,8 % teorie/20 cyklů opakovaného použití zpevněných a stabilizovaných částic. Specifická aktivita katalyzátoru se po jeho 20násobném použití nezměnila.
Příklad 3
Se zpevněnými a stabilizovanými částicemi biokatalyzátoru, jehož způsob přípravy a základní vlastnosti byly popsány v příkladu 2, byla provedena kontinuální enzymová inverze sacharózy (rafináda) třemi způsoby. (A) konverze substrátu v koloně s pevným ložem biokatalyzátoru, (B) konverze substrátu v koloně s míchaným ložem biokatalyzátoru, (C, konverze substrátu v míchaném jednostupňovém kontinuálním reaktoru.
(A) Skleněná kolona o vnitřním průměru 16 mm a délce 20 cm byla naplněna do výšky 19,5 om 20 g částic vlhkého katalyzátoru. 0,5 M roztok sacharózy v acetátovém pufru pH 4,6 byl čerpán na pevné lože katalyzátoru, vertikálně umístěnou kolonou směrem shora dolů, rychlostí 5 ml.h při teplotě místnosti. Po přibližně dvou výměnách objemu kolony (přibližně za 17 hodin nepřetržitého toku) činil průměrný stupeň enzymové inverze na výtoku z kolony 90 % teorie (162 mg.ml redukujících cukrů). Reaktor byl v nepřetržitém chodu 140 hodin při dosažení nezměněného stupně enzymové inverze.
(B) Stejná skleněná kolona byla naplněna 18 g vlhké hmoty katalyzátoru a upevněna v horizontální poloze na reciproký třepací stroj o počtu kyvů 120.m”\ Do jednoho konce kolony byl čerpán 1 M roztok sacharózy v acetátovém pufru pH 4,6 rychlostí 10 ml.h a z druhého konce byla reakční směs jímána za nepřetržitého míchání při teplotě 28 °C.
Kolona byla v kontinuálním chodu 24 hodin při dosažení průměrného stupně teoretické enzymové inverze 98 %.
,C) 45 g vlhké hmoty částic katalyzátoru bylo suspendováno ve 450 ml 1 m roztoku sacharózy v pufru a suspenze pomalu míchána při teplotě místnosti. Po dosaženi ustáleného stavu, po dosažení kvantitativní konverze, byl do míchané nádoby rychlostí 166 ml.h 1 čerpán 1 M roztok sacharózy a stejnou rychlostí, pomocí druhého čerpadla, odsávána reakční směs. Aby nedocházelo k úniku (odsáváni) částic z reaktoru, byl odsávací konec trubice opatřen polyamidovým sítkem a obalen mlynářskou plachetkou. Za uvedených podmínek byl jednostupňový míchaný kontinuální reaktor v chodu 24 hodin připrůměrném dosažení stupně teoretické inverze 88,5 %.
Příklad 4
Zpevněné a stabilizované částice biokatalyzátoru, jejichž způsob přípravy byl popsán v příkladu 2, byly použity k enzymové inverzi tecnických forem sacharózy, zejména surového cukru (afinády) a kléru. Konverze těchto forem sacharózy byly prováděny ve vsádkovém míchaném reaktoru při teplotě 40 °C, pH 4,6 (okyselením vodních roztoků technické sacharózy kyselinou octovou), koncentraci katalyzátoru 15 objemových % (150 g vlhké hmoty částic + 850 ml roztoku resp. sirupu). Jedinou proměnnou veličinou byla počáteční koncentrace sacharózy v jejich různých technických formách. Sušinou a refraktometrioky stanovená počáteční koncentrace cukru v neředěném kléru činila 66 g/100 ml, tj. přibližně 1,9 M roztok sacharózy. Klér byl ředěn okyselenou vodou. Surový cukr rozpuštěn v okyselené vodě. Výsledky jsou shrnuty jak následuje.
Forma sacharózy klér afináda
| konc. sacharózy (hmot. %) | 66 | 56,5 |
| max. dosažený stupeň inverze | 78 | 87,6 |
| (% teorie) | ||
| reakční doba | 4 | 4 |
| <h> |
| 51,4 | 46,3 | 41,3 | 60 | 65 |
| 91,0 | 96,0 | 98,0 | 88,3 | 81,2 |
| 3 | 3 | 3 | 4 | 4 |
Příklad 5
Katalyzátorem, jehož způsob zpevnění a stabilizace byl popsán v příkladu 2, bylo provedeno 10 opakovaných cyklů enzymové inverze něředěného kléru, v kterém koncentrace sacharózy byla 67 hmot. %. Konverze byly provedeny v míchaném vsádkovém reaktoru při teplotě 60 °C a pH 4,6 v Dewarově nádobce způsobem popsaným v příkladu 1. Jediným rozdílem byl způsob manipulace s katalyzátorem. Částice byly po každém ukončeném reakčním cyklu přecezeny přes mlynářskou plachetku a bez promytí dány zpět do reaktoru a přelity opět čerstvou násadou neředěného kléru. pH kléru pro každou opakovanou sádku bylo upraveno kyselinou octovou na hodnotu 4,6. Doba jednoho cyklu činila standardně 4 hodiny.
Za uvedených podmínek činil průměrný stupeň konverze 83,6 % teorie/10 opakovaných cyklů použití téže násady katalyzátoru. Specifická aktivita částic se po jejich lOnásobném použití za uvedených podmínek nezměnila.
Claims (1)
- Způsob zpevňováni a stabilizace částic biokatalyzátoru pro enzymovou inverzi sacharózy, připravených podle autorského osvědčení č. 231 458, při které se vodný roztok sacharózy, jejích technických forem a meziproduktů její výroby uvádí ve styk s částicemi biokatalyzátoru, vyznačený tím, že se do nepřetržitě míchané směsi částic biokatalyzátoru na bázi kvasinkových buněk obsahujících enzym invertázu, výhodně Saccharomyces cerevisiae nebo Saccharomyces uvarum, přidá po úpravě pH na rozmezí 6,0 až 8,0 vodný roztok glutaraldehydu a/nebo vodný roztok nebo suspenze technické nebo čisté bílkoviny živočišného, rostlinného a/nebo mikrobiálního původu, jako je vaječná bílkovina, desintegrované nebo autolyzované buňky, výhodně buňky použitého produkčního mikroorganismu, načež se směs popřípadě došití dalším přídavkem glutaraldehydu, stabilizované částice se od reakční kapaliny oddělí filtrací, suspendují se za intenzivního míchání v ledovém acetonu, filtrací se znovu oddělí a suší se po homogenizaci.volně na vzduchu při teplotě místnosti po dobu 1 až 24 hodin, potom se částice suspendují ve studené vodě, několikrát se vodou dekantuji a nechají se bobtnat ve vodě nebo v pufru při teplotě v rozmezí 5 až 20 °C.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS257884A CS249325B3 (cs) | 1982-01-14 | 1984-04-03 | Způsob zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru pro enzymovou inverzi sacharózy |
| CS173385A CS250262B3 (cs) | 1984-04-03 | 1985-03-12 | Způs»b enzymové výroby glukózafruktózového sirupu ze sacharózy |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS82277A CS231458B1 (en) | 1982-01-14 | 1982-01-14 | Cellular catalysts for biotransformation and method to produce them |
| CS257884A CS249325B3 (cs) | 1982-01-14 | 1984-04-03 | Způsob zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru pro enzymovou inverzi sacharózy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS249325B3 true CS249325B3 (cs) | 1987-03-12 |
Family
ID=25745265
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS257884A CS249325B3 (cs) | 1982-01-14 | 1984-04-03 | Způsob zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru pro enzymovou inverzi sacharózy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS249325B3 (cs) |
-
1984
- 1984-04-03 CS CS257884A patent/CS249325B3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Homaei | Enzyme immobilization and its application in the food industry | |
| Bayramoğlu et al. | Covalent immobilisation of invertase onto a reactive film composed of 2-hydroxyethyl methacrylate and glycidyl methacrylate: properties and application in a continuous flow system | |
| Bashir et al. | Enzyme immobilization and its applications in food processing: A review | |
| Blandino et al. | Immobilization of glucose oxidase within calcium alginate gel capsules | |
| Cheetham et al. | Physical studies on cell immobilization using calcium alginate gels | |
| EP0341503B1 (en) | Cross-linked glucose isomerase | |
| EP0090276A2 (en) | Method for the preparation of spherical microorganism cell aggregates | |
| JPH0797989B2 (ja) | 生物学的に活性なシステム | |
| WO2012112617A2 (en) | Apparatus and process for production of an encapsulated cell product | |
| EP0034609B1 (en) | Immobilized enzyme(s) and microorganism(s) and their production | |
| DK170825B1 (da) | Fremgangsmåde til immobilisering af en enzymproducerende mikroorganisme eller et enzym produceret deraf samt fremstilling af et immobiliseret enzympræparat | |
| Ward | Bioprocessing | |
| Champluvier et al. | Immobilization of β-galactosidase retained in yeast: adhesion of the cells on a support | |
| Budriene et al. | β-Galactosidase from Penicillium canescens. Properties and immobilization | |
| D'Souza et al. | Immobilization of bakers yeast on jute fabric through adhesion using polyethylenimine: application in an annular column reactor for the inversion of sucrose | |
| Iurciuc et al. | Microencapsulation of Baker’s yeast in gellan gum beads used in repeated cycles of glucose fermentation | |
| Güleç et al. | Immobilization of Aspergillus oryzae β-galactosidase on low-pressure plasma-modified cellulose acetate membrane using polyethyleneimine for production of galactooligosaccharide | |
| EP0577162A1 (en) | Immobilized enzyme on a carrier of cross-linked gelatin and active carbon | |
| Mansfeld et al. | Coimmobilization of Yarrowia lipolytica cells and invertase in polyelectrolyte complex microcapsules | |
| CS249325B3 (cs) | Způsob zpevňování a stabilizace částic biokatalyzátoru pro enzymovou inverzi sacharózy | |
| Arslan et al. | The effect of gel composition on the adsorption of invertase on poly (acrylamide/maleic acid) hydrogels | |
| RU2253677C2 (ru) | Иммобилизованный биокатализатор, способ его получения и способ получения молочной кислоты с использованием этого биокатализатора | |
| CS231458B1 (en) | Cellular catalysts for biotransformation and method to produce them | |
| CS203607B1 (en) | Process for preparing bonded cells with activity of penicilinacylase | |
| Dias et al. | Immobilization of yeasts on titanium activated inorganic supports |