DK170825B1 - Fremgangsmåde til immobilisering af en enzymproducerende mikroorganisme eller et enzym produceret deraf samt fremstilling af et immobiliseret enzympræparat - Google Patents

Description

! DK 170825 B1 o

Anvendelsen af enzymer fra mikrobielle celler til gennemførelse af specifikke kemiske omdannelser er velkendt. Ved udførelsen af sådanne omdannelser kan det cellefri enzympræparat, sprængte celler eller hele celler effektivt anvendes 5 som biokatalysator-kilden. De frie enzymer eller celler kan effektivt anvendes ved processer af batch-typen, men er ikke egnede til kontinuerlige operationer i industriel målestok. Eksempelvis kræver økonomisk konkurrencedygtig behandling ved omdannelsen af glucose til fructose, katalyseret af glucose til 10 fructose, katalyseret af glucoseisomerase, eller ved omdannelsen af sucrose til platinose, katalyseret af sucrose-mutase, at substratopløsningen (glucose eller sucrose) ledes over og gennem et fikseret lag af biokatalysatoren under kontinuerlig udvinding af omdannelsesproduktet. Denne behandlingsteknik 15 har ført til en forøget interesse for fremstillingen af forskellige former for immobiliserede biokatalysatorer.

Eksempelvis beskriver Gestrelius i US patentskrift nr. 4.288.552 anvendelsen af polyethylenimin og glutaraldehyd til immobilisering af glutaraldehyd-sensitive enzymer. En 20 forbedring af denne metode er beskrevet i US patentskrift nr. 4.355.105, hvor intracellulære enzymer, der ikke er sensitive overfor glutaraldehyd, immobiliseres ved først at blive bragt i kontakt med glutaraldehyd og derefter indføring af polyethylenimin i reaktionsmediet. I US patentskrift nr.

25 4.167.447 er der beskrevet en metode til immobilisering af enzymer, og denne metode indebærer, at man blander en vandig opløsning af et enzym med chitosan opløst i vand ved en pH-værdi på 3-7 til dannelse af et produkt, der kan fældes ved tilsætning af alkali eller en kilde til sulfat-ioner.

30 Ved en anden udførelsesfonn for den fremgangsmåde, der er beskrevet i det nævnte patentskrift, tværbindes fast chitosan med et polyfunktionelt tværbindingsmiddel, f.eks. et dialdehyd, og bringes derpå i kontakt med en vandig opløsning af et enzym. Muzzarelli beskriver immobiliseringen af enzymer, 35 herunder glucoseisomerase, på chitin og chitosan i Enzyme

Microb. Technol., 1980, Vol. 2, juli 1977. I japansk Kokai- 2 DK 170825 Bl -patent nr. Sho 51 (1976)-128.474 beskrives der en glucoseiso-raerase-immobil i seringsmetode, der omfatter blanding af gluco-seisomerase-producerende bakterier og chitosan med påfølgende behandling med et polyaldehyd. I US patentskrift nr. 4.094.743 5 er der beskrevet en fremgangsmåde, ved hvilken et enzymatisk aktivt produkt, der er uopløseligt i vandigt medium, fremstilles ved behandling af chitosan som en indifferent bærer med et dialdehyd, hvorefter et enzym fikseres til den således behandlede bærer.

10 I US patentskrift nr. 4.543.332 er der beskrevet immobilisering af biokatalysatorer under anvendelse af et polyamin-flokkuleringsmiddel og tværbindingsmiddel med påfølgende sfæronisering af det immobiliserede produkt under anvendelse af et sfæroniseringsapparat bestående af en riflet 15 friktionsplade som rotor anbragt i en cylinder på en sådan måde, at cylinderen udgør en stationær sidevæg for pladen og tillader den at rotere frit. I tysk fremlæggelsesskrift nr. 2.137.042 er der beskrevet en metode til sfæronisering af enzympræparater, især sådanne, der kan anvendes i deter-20 gentindustrien. Det apparatur, der anvendes til denne sfæronisering, minder om det, der er beskrevet i det ovennævnte US patentskrift nr. 4.543.332.

I US patentskrift nr. 4.283.496 er der beskrevet en metode til omdannelse af glucose til fructose, hvilken metode 25 indebærer anvendelse af et enzym produceret af en organisme fra arten Flavobacterium arborescens.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til immobilisering af en enzymproducerende mikroorganisme eller et enzym produceret deraf, og denne fremgangsmåde er ejendom-30 melig ved, at man fremstiller et reaktionsprodukt ved anvendelse af følgende trin: 35 o 3 DK 170825 B1 a) indføring i et vandigt medium indeholdende et enzym eller en masse af bakterieceller, der indeholder et intracellu-lært enzym, af en vandig opløsning af en polyethylenimin med en molekylvægt på mindst ca. 500 dalton og med et indhold af 5 primære aminogrupper på mindst 10 vægtprocent af den polymeres aminogrupper, b) tilsætning af glutaraldehyd og en vandig opløsning af chitosan til det vandige medium til dannelse af et tværbundet reaktionsprodukt og 10 c) fjernelse af det tværbundne reaktionsprodukt fra det vandige medium og tørring deraf til tilvejebringelse af et slutprodukt med biokatalytisk aktivitet.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes til immobilisering af mange intracellulære enzymer, f.eks. gluco-15 seisomerase produceret af B.licheniformis, S.olivaceous og A.missouriensis, samt den sucrose-mutase, der produceres af P.rubrum. Denne fremgangsmåde kan også anvendes til immobilisering af ekstracellulære enzymer. Eksempelvis iagttages der fuldstændig immobilisering af det opløselige enzym ved homo-20 genisering af F.arborescens-celler til et punkt, hvor 40% af deres glucoseisomerase-aktivitet er opløselig.

De celler, der skal immobiliseres, dyrkes typisk i et vandigtnæringsmedium og koncentreres enten ved filtrering eller centrifugering til dannelse af et vandigt medium indehol-25 dende ca. 10 vægtprocent tørstof. De enzymholdige celler, eller det extracellulære enzym i tilfælde af sprængte celler, flokkuleres ved tilsætning af polyethylenimin, chitosan og glutaraldehyd til det vandige medium. Den anvendte polyethylenimin bør have en molekylvægt på mindst ca. 500 dalton, 30 idet den maksimale molekylvægt fortrinsvis er ca. 100.000 dalton. Det foretrukne molekylvægtsområde ligger fra ca.

40.000 til ca. 60.000 dalton. Immobiliseringer, der udføres under anvendelse af lav molekylvægt (under ca. 40.000 dalton) , resulterer i celleaggregering, men den aggregerede celle-35 masse kan ikke let vindes ved filtrering. Den faktiske immobiliseringskemi ville forventes at være den samme som ved udfø- 4 DK 170825 B1 o relse under anvendelse af PEI med høj molekylvægt, De fysiske egenskaber af celleaggregatet synes at være noget anderledes således, at celleaggregatet har tendens til at afbinde filtrerpapiret. En anden almindelig metode til udvinding 5 er centrifugering. Eftersom den aggregerede cellemasse faktisk befinder sig på en uopløselig form, kan celleaggregatet vindes ved centrifugering. Det pakkede celleaggregat kan derpå ekstruderes og formes på den gængse måde til opnåelse af de ønskede immobiliserede enzympartikler. De primære 10 aminogrupper i den polymere bør udgøre mindst ca. 10 vægtprocent af det totale aminogruppeindhold i den polymere, idet den foretrukne mængde er ca. 25 vægtprocent. Polyethyleniminen bringes normalt i vandig opløsning, fortrinsvis i en koncentration på fra 1 til 10 vægtprocent, inden den sættes til det 15 enzymholdige medium. Dette gøres med det formål at opnå passende god blanding af polyethyleniminen med celleblandingen. Mængden af tilsat polyethylenimin vil typisk ligge fra 2 til 22 vægtprocent af det immobiliserede enzympræparat.

Der dannes et tværbundet reaktionsprodukt ved tilsæt-20 ningen af glutaraldehyd og en vandig opløsning af chitosan til mediet. Disse reaktanter kan tilsættes i vilkårlig rækkefølge eller samtidigt. Når der imidlertid Ønskes maksimal hårdhed af de immobiliserede enzympartikler, bør glutaraldehydet tilsættes først. I nogle tilfælde kan glutaraldehyd partielt des-25 aktivere enzymerne, og man vil i så fald tilsætte chitosan først, når der ønskes maksimal aktivitet.

Betegnelsen "chitosan" som anvendt i den foreliggende sammenhæng skal betyde et polyamino-polysaccharid opnået ved N-deacetylering af chitin med stærk alkali og under anvendelse 30 af varme. Chitin er et polysaccharid, hvori den primære gentagne enhed i molekylet er 2-desoxy-2-(acetylaraino)-glucose.

I almindelighed er ca. én ud af hver seks enheder i chitin ikke acetyleret, medens i chitosan i det væsentlige alle de gentagne enheder ikke er acetylerede. Graden af ikke-acetyle-35 ring kan kontrolleres ved hjælp af omfanget af desacetyle- ringsreaktionen. Chitin, der er vidt udbredt i naturen, f.eks.

o 5 DK 170825 B1 i hvirvelløse havdyr, insekter, fungi og gærarter, fremstilles let ved fjernelse af urenhederne fra skaller af krabber, rejer, hummer, krebs og lignende, der i store mængder er tilgængelige fra anlæg til behandling af skaldyr. Mængden af chi-5 tosan, der anvendes, vil typisk ligge fra 0,5 til 22 vægtprocent af det immobillserede enzympræparat, idet en mængde på fra 3,5 til 10 vægtprocent foretrækkes. Chitosanen skal bringes i vandig opløsning inden tilsætningen til det enzymholdige medium, fordi det er normalt uopløseligt i vand.

10 Chitosan er imidlertid opløseligt i fortyndet vandig syre, f.eks. myresyre, eddikesyre, pyrodruesyre, mælkesyre, æblesyre, citronsyre og uorganiske syrer med undtagelse af svovlsyre, hvori der dannes et uopløseligt chitosan-sulfat--kompleks. For at være effektiv ved den her omhandlede immobi-15 liseringsproces skal chitosanen blive en integrerende del af det immobiliserede cellekompleks. Chitosanen bringes derfor i vandig opløsning inden anvendelsen. En opløsning indeholdende fra ca. 0,2 til ca. 1,0 vægtprocent chitosan foretrækkes og fremstilles ved at sætte chitosanen til en 0,5%'s 20 opløsning af eddikesyre. Ved opvarmning af opløsningen til ca. 60°C lettes opløsningen af chitosanen. Efter opvarmning filtreres chitosanopløsningen til fjernelse af uopløselig remanens.

Glutaraldehyd, der anvendes ved denne immobilise-25 ringsproces, udnyttes til at hindre lokale koncentrationsarea ler, der kan inhibere enzymet under tilsætningen af reagenset. Glutaraldehyd anvendes i en mængde fra 4 til 26 vægtprocent af det immobiliserede enzym, idet en mængde på fra 7 til 15 vægtprocent foretrækkes.

30 Biokatalysatoren, polyethylenimin, chitosan og glu taraldehyd kombineres til dannelse af et bioaktivt reaktionsprodukt, der kan fjernes fra reaktionsmediet ved væske-fast-Stof^adskillelsesteknik, tørres, opbrydes i partikler og anvendes til den tilsigtede biokatalytiske omdannelse. Det har 35 imidlertid vist sig, at en mere ønskelig fysisk form for mate rialet kan fås ved tørring af det faste reaktionsprodukt til 6 DK 170825 B1 o dannelse af en fugtig kage indeholdende fra ca. 68 til ca. 76 vægtprocent vand, hvorpå den fugtige kage ekstruderes på den roterende plade i et sfæroniseringsapparatur, der omfatter en riflet friktionsplade som rotor anbragt i en cy-5 linder på en sådan måde, at cylinderen danner en stationær væg for pladen, men tillader den at rotere frit.

Filterkagen ekstruderes gennem en åbning, der omtrentlig har en størrelse svarende til den ønskede diameter for de sfæroniserede partikler, ud på den roterende, riflede plade, 10 hvor den samler sig mod cylindervæggen i en ringformet eller doughnut-lignende form med en tværsnitsgradient. Ekstru-datet opbrydes til at begynde med i korte stykker, ideelt svarende til dets diameter, gennem friktionskraften på den riflede plade og tillige gennem den intergranulære kollision og 15 friktion af den sig bevægende masse. Den karakteristiske anbringelse af materialet er et resultat af centrifugalkraften hidrørende fra den roterende plade og hidrørende fra den tangentielle friktionskraft mellem materialet og den riflede overflade. En glat roterende overflade tillader ikke ekstruda-20 tet at rulle, men blot at glide ud til pladens periferi.

Bevægelsens karakteristika ville være anderledes, og derfor ville den endelige form af materialet ikke blive så ensartet og sfærisk som ønsket, såfremt der blev anvendt en glat plade. Sfæroniseringsapparaturet af den beskrevne type er en kugle-25 -fremstillende maskine, der hurtigt kan omdanne immobili-serede enzymekstrudater til små, kompakte, let håndterbare kugler.

Ekstrudatet bør fortrinsvis have et vandindhold i det ovenfor angivne område. Et for lavt fugtighedsniveau vil 30 resultere i knusning af partiklerne under sfæroniseringspro-cessen, hvilket forårsager dannelsen af partikler i understørrelse. For megen fugtighed giver udtværings- og sammenklumpningsproblemer under sfæroniseringsprocessen, hvilket resulterer i dannelsen af partikler i overstørrelse. Den sfæ-35 roniseringsmaskine, der anvendes i de følgende udførelseseksempler, markedsføres af Fuji Padal Co., Ltd., Osaka, Japan, o 7 DK 170825 B1 under handelsnavnet Marumerizer Q-230. Dette apparat har en rotor med en diameter på 23 cm. Den foretrukne tangentielle hastighed til dannelse af kugler ud fra det ifølge opfindelsen anvendte ekstrudat er 4,5 til 12 meter pr. sekund, idet 5 tangentialhastigheden er defineret som antallet af omdrejninger pr. minut divideret med produktet 60 x TT x diameteren af pladen. Rotationen af pladen med diameter 23 cm vil således andrage fra 500 til 1000 omdrejninger pr. minut til opnåelse af de ønskede sfæroniseringsresultater. Hvis rotations-10 hastigheden er for høj, vil pladen have tendens til at slynge det ekstruderede enzymaggregat mod cylindervæggen, hvorved der vil dannes uønskede partikler, medens en for langsom rotation af pladen ikke vil føre til den ønskede sfæronisering, eftersom der i så fald ikke vil være tilvejebragt et tilstræk-15 keligt moment i den omkringslyngede masse til opnåelse af kollision og friktion som en størrelsesnedsættende og sfæro-niserende kraft. Efter sfæroniseringen tørres celleaggregaterne, typisk i et tørreapparat med fluid bed.

Enzymaktiviteten af de sfæroniserede enzymaggregatpar-20 tikler er groft set ækvivalent med eller højere end aktiviteten af formalede partikler, hvilket indicerer, at sfæronise-ringsproceduren er fordelagtig med hensyn til tilvejebringelse af partikler med en passende biokatalytisk aktivitet. Bortset fra tilvejebringelse af sfæriske partikler, der i sig selv 25 er lettere at håndtere end partikler med uensartet form, udviser de kugler, der fremstilles ved den omhandlede fremgangsmåde, større fysisk sejhed og udstrakt enzymproduktivitet i en reaktionsbeholder .

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres i de 30 følgende udførelseseksempler.

Eksempel 1

Et flydende kulturmedium bestående af 7% majsstøb, 1,4% sødt vallepulver og 0,15% gærekstrakt indstilles på en 35 pH-værdi på 8,3, hvorpå 1000 liter af det resulterende medium anbringes i en 1500 liters fermenteringsbeholder. Medierne DK 170825 B1 8 steriliseres ved 121°C i 60 minutter, podes med F.arborescens--stammen ATCC 4358 og inkuberes ved 30°C i 18 timer. De glucoseisomerase-holdige celler koncentreres derefter fra fermenteringsvæsken ved centrifugering på en Westfalia Model 5 SAMR 5036 centrifuge med en selvrensende skål. Koncentratet anslås at indeholde ca. 10% tørstof. Der foregår praktisk taget ingen celleopbrydning under centrifugeringen. pH-værdien for celleopslæmningen indstilles på 8,0, hvorpå der opvarmes til 70°C og holdes ved 70°C i 15 minutter, hvorefter der af-10 køles til ca. 25°C. Kun lidt om overhovedet nogen glucoseiso-meraseaktivitet inaktiveres under varmebehandlingen. Varmebehandlingen tjener to vigtige formål: 1) den medvirker til udvinding af cellematerialet efter immobilisering og 2) den inaktiverer en co-produceret protease, der er associeret med 15 cellerne.

Til 200 ml varmebehandlet celleopslæmning sættes der under omrøring 1000 ml afioniseret (DI) vand, hvorpå der sættes 40 ml 5%'s (vægt/vol.) PEI (P-600 med molekylvægt 40.000--60.000 dalton fra Cordova Chemical Co.) til den fortyndede 20 celleopslæmning. Efter at PEI er blandet grundigt med opslæmningen, indblandes der grundigt 20 ml 10%'s (vægt/vol.) glutaraldehyd (fremstillet ud fra 25%'s kommerciel glutar-aldehyd) i opslæmningen. Dernæst tilsættes der 200 ml 0,25%'s (vægt/vol.) chitosan-opløsning. pH-værdien efter chitosan-25 -tilsætningen er 7,8, og denne værdi ændres til 8,0 med fortyndet natriumhydroxidopløsning. Under denne immobiliseringsproces varierer pH-værdierne fra 7,0 til 9,0. For den bestemte organisme, der anvendes, vælges der en pH-værdi på 8,0, hovedsageligt fordi flokkuleringsprocessen ved en pH-30 -værdi på under 7,5 ikke synes at være så udtalt, som den er ved en pH-værdi på 8,0. Chitosan-opløsningen fremstilles ved tilblanding af en passende mængde chitosan til dannelse af en 1%'s opløsning i Dl-vand. Derefter tilsættes der iseddikesyre til en slutkoncentration på 0,5%, hvorpå blandingen 35 opvarmes til 60°C, medens den blandes grundigt. Praktisk taget al chitosanen opløses under opvarmningstrinnet. Den varme opløsning fortyndes derpå fire gange med Dl-vand og filtreres 9 DK 170825 Bl derefter gennem Sharkskin-filtrerpapir på en Biichnertragt. Filtratet afkøles til ca. 25°C, og derpå indstilles pH-værdi-en omhyggeligt på 5,0 med 1 N natriumhydroxidopløsning. Efter chitosan-tiIsætningen henstilles opslæmningen i hvilende til-5 stand i 1 time. Derefter opsamles cellemassen på en Biichnertragt, og cellekagen ekstruderes gennem en 1,0 mm dyseåbning. Efter yderligere afvanding af det ekstruderede materiale ved tørring ved 60°C formales det til partikler, der passerer gennem en 30 mesh-sigte, men tilbageholdes på en 40 mesh-sig-10 te, og disse partiklers glucoseisomeraseaktivitet og partikelse jhed bestemmes derpå.

Glucoseisomerase-aktiviteten i partiklerne bestemmes ved anbringelse af 0,1 g af enzymet i en 250 ml Erlenmeyerkol-be og tilsætning af 50 ml substrat (2 M glucose, 20 mM 15 MgS04-7 H20, 0,5 mM CoCl21 6 H20 og 20 mM HEPES (N-2-hydroxy- ethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsyre)-puffer, indstilles på en pH-værdi på 8,0). De tørrede partikler får lov at hydra-tisere i ca. 1 time ved stuetemperatur. Til tiden nul anbringes kolben i et vandbad med en temperatur på 60°C. Kolben om-20 rystes ved hjælp af et rystevandbad med en hastighed, der tilvejebringer partikelbevægelse. Efter 10 minutter og efter 70 minutter udtages der en 0,1 ml prøve fra bestemmelsesblandingen og sættes til 4,0 ml 0,1 M HClO^. Den dannede mængde fructose bestemmes ved cystein-H2S04-metoden (jfr. Dische, 25 z., J. Biological Chemistry, Col. 181, p. 379, 1949) ved inkubering af 0,05 ml prøve med 0,5 ml 5%'s cystein og 4,5 ml 75%'s H2S04 ved 37°C i 30 minutter og aflæsning af absorbansen ved 412 nm. 1 enhed immobiliseret glucoseisomera-se-aktivitet (IGIU) er den mængde enzym, som producerer 30 1 mikromol fructose pr. minut.

Partikel-sejheden bestemmes ved måling af det arbejde, der kræves til at komprimere 20-40 mesh-partikler hydratiseret i 2 M glucose ved en pH-værdi på 8,0 under anvendelse af en Instron Universal Tester model 1102. En fuldstændig beskrivel-35 se af denne metode findes i US patentskrift nr. 4.543.332. Partikel-sejheden angives i enheder af kg-inches.

10 DK 170825 B1 o

Behandling af 200 ml celleopslæmning ved den ovenfor beskrevne immobiliseringsproces resulterer i 21,1 g tørret materiale med en aktivitet på 421 IGIU pr. g og en partikel--sejhed på 3,9 kg-inches.

5

Eksempel 2-5

Forskellige mængder PEI sættes til den varmebehandlede celleopslæmning fra eksempel 1 inden tilsætning af glutaralde-hyd og chitosan. Efter tilsætning af reagenserne til immobi-10 lisering opsamles cellemassen, ekstruderes og tørres som beskrevet i eksempel 1. Den følgende tabel I viser partikelintegriteten og -aktiviteten ved forskellige koncentrationer af PEI. Partikelintegritet og udbytte af immobiliseret enzym ses at blive forbedret med stigende niveauer af PEI.

15

Tabel I

Immobiliseret enzym_

Parti-

Reagenser kelsej- 20 (g/1 celleopslæmning) hedK Aktivitet

Eksempel PEI GA Chit._(%) (IGIU/g) g/1 2 10,0 20,0 2,5 180 486 101 3 15,0 20,0 2,5 281 401 108 25 4 20,0 20,0 2,5 394 475 112 5 25,0 20,0 2,5 299 619 128 1

Partikel-sejhed som en procent af partikel-sejheden ifølge eksempel 1.

30

Eksempel 6-24

Forskellige mængder glutaraldehyd sættes til celleopslæmningen efter PEI-tilsætningen som beskrevet i eksempel 1. Indflydelsen på aktivitet og partikelintegritet ved de to 35 PEI-niveauer fremgår af tabel II. Partikel-sejheden ses at blive forøget, når glutaraldehydmængden forøges. Aktivitets- n DK 170825 B1 o udbyttet ses at stå i omvendt forhold til glutaraldehydmæng- den. Tabet i tilsyneladende aktivitet kan være et resultat af den kemiske reaktion mellem glutaraldehydet og enzymet på en sådan måde, at enzymet inaktiveres, eller glutaraldehydet 5 kan reagere.ed cellulære bestanddele, der kan resultere i forøgelse af massetransportresistensen af substratet og produkter fra enzymreaktionen. Resultaterne i tabel II viser også, at der fås mere masse af immobiliseret enzym ved de højere PEI-niveauer.

10

Tabel II

Immobiliseret enzym Parti-

Reagenser kelsej- 15 Eksem- (g/1 celleqpslaaming). hed K Aktivitet pel PEI GA Chit. (%) (IGIU/g) g/1 6 10,0 5,0 2,5 104 438 104 7 10,0 10,0 2,5 100 421 105 8 10,0 20,0 2,5 162 403 109 2o 9 10,0 30,0 2,5 208 270 115 10 20,0 10,0 2,5 152 409 114 11 20,0 20,0 2,5 216 367 123 12 20,0 30,0 2,5 241 336 135 25 13 10,0 5,0 2,5 94 690 108 14 10,0 10,0 2,5 125 502 105 15 20,0 5,0 2,5 129 705 111 30 16 20,0 7,5 2,5 130 650 116 17 20,0 10,0 2,5 162 592 128 18 20,0 20,0 2,5 244 436 123 19 10,0 5,0 2,5 132 458 103 35 20 10,0 7,5 2,5 148 495 105 21 10,0 10,0 2,5 196 410 104 o 12 DK 170825 B1

Tabel II

Immobillseret enzym 5

Parti-

Reagenser kelsej-

Eksem- (g/1 celleopslaanning) hed* Aktivitet

Pel PEI_GA Chit._(%) (IGIU/q) q/1 22 20,0 5,0 2,5 182 487 102 10 23 20,0 7,5 2,5 213 384 114 24 20,0 10,0 2,5 258 383 117 h Se tabel I 15 Eksempel 25-30

Der udføres immobiliseringer, ved hvilke chitosan-mæng-den varieres. Den i eksempel 1 angivne procedure følges under anvendelse af to forskellige niveauer af PEI og glutaraldehyd. Virkningen på aktivitet og partikel-sejhed er vist i tabel III. 2o Forøgelse af niveauet af chitosan forbedrer aktiviteten og partikel-sejheden ved de to PEI-niveauer. Ved det højere glu-taraldehyd-niveau forbedres partikel-sejheden, medens aktiviteten ikke forbedres ved det højere chitosan-niveau. Forskellige niveauer af chitosan ved et tredie niveau for PEI anven-25 des også ved immobiliseringsprocessen (eksempel 28-30). Resultaterne, der fremgår af tabel III, viser, at ved over det optimale niveau for chitosan formindskes enzymudbyttet.

30 35 13 DK 170825 B1 o

Tabel III

Immobiliseret enzym Parti-

Reagenser kelsej- 5 Eksem- (g/1 celleppslaanning) hed* Aktivitet pel PEI_GA Chit._(%) (IGIU/g) q/1 7 10,0 10,0 2,5 100 421 105 25 10,0 10,0 7,5 142 492 112 10 8 10,0 20,0 2,5 162 403 109 26 10,0 20,0 7,5 182 389 110 10 20,0 10,0 2,5 152 409 114 27 20,0 10,0 7,5 147 480 120 15 28 2,5 10,0 6,3 70 529 100 29 2,5 10,0 12,5 73 576 105 30 2,5 10,0 25,0 104 425 117 20 x Se tabel I Eksempel 31-35 PEI-prøver med forskellig molekylvægt anvendes ved immobiliseringsprocessen som beskrevet i eksempel 1. Resulta- 25 terne er angivet i tabel IV, der viser, at PEI med den høje molekylvægt fungerer bedst. Den immobilisering, hvor der anvendes PEI-prøver med de lavere molekylvægte, bevirker fremkomsten af en type flokkuleret cellemasse, der ikke kan fjernes ved den sædvanlige form for filtrering. Det er muligt, 30 at der ved ændring af niveauerne af PEI og/eller glutaraldehyd og/eller chitosan kan opnås en egnet flokkulant.

35 0 n DK 170825 B1

Tabel IV

Iimcbiliseret enzym 5 Parti- PEI Reagenser kelsej-

Eksem- mol- (g/i celleqpslanning) hedxi* Aktivitet pel vægt PEI GA Chit (%) (IGIU/g) g/1 311 usikker 8,1 4,0 2,0 14 601 88 10 32 P-12 8,1 4,0 2,0 kunne ikke filtreres 33 P-18 8,1 4,0 2,0 34 P-150 8,1 4,0 2,0 " " " 35 P-600 8,1 4,0 2,0 67 828 101 XPEI fra Kodak som 50% faste stoffer 15 ^Se tabel I Eksempel 36-40

Den rækkefølge, i hvilken glutaraldehyd og chitosan 2o tilsættes ifølge eksempel 1, byttes om. Tabel V viser den iagttagne aktivitet og partikel-sejhed ved ombytning af rækkefølgen af tilsætningen af glutaraldehyd og chitosan ved forskellige PEI-niveauer. Der fås en højere immobiliseret enzymaktivitet, når glutaraldehydet tilsættes til sidst, omend par-25 tikel-sejheden formindskes noget.

30 35 is DK 170825 B1 o

Tabel V

Immobiliseret enzym

5 Reagenser ^aftiT

Eksem- <9/1 celleopslemning) h®aIe3~ aktivitet Pel 1 2_3 _(%) (IGIU/gl g/1 PEI ga Chit 36 10,0 7,5 2,5 143 670 119

10 pEI Chit GA

37 10,0 2,5 7,5 157 639 128 PEI GA Chit 38 15,0 7,5 2,5 185 587 125 PEI chit Ga 39 15,0 2,5 7,5 163 638 134 15 PEI ga Chit 24 20,0 10,0 2,5 258 383 117

PEI Chit GA

40 20,0 2,5 10,0 216 652 113 1

Se tabel I

20

Eksempel 41

Varmebehandlet celleopslæmning, der er fremstillet som beskrevet i eksempel 1, fortyndes med to rumfang vand.

Til celleopslæmningen sættes der 15 g PEI, 2,5 g chitosan 25 og 7,5 g glutaraldehyd pr. liter ufortyndet celleopslæmning under anvendelse af fremgangsmåden ifølge eksempel 1. Cellemassen opsamles og afvandes til ca. 75% fugtighed i en ca.

30,5 cm's kurvecentrifuge. Fermenteringer udføres under så identiske betingelser som muligt, men celler isoleret fra 30 forskellige fermenteringer er ikke fuldstændigt identiske for så vidt angår teksturen af den immobiliserede masse. Det foretrukne fugtighedsniveau til dannelse af de sfæriske partikler vil derfor, afhængigt af den pågældende batch, variere noget mellem 71 og 75% fugtighed. Cellekagen ekstruderes 35 gennem en 1,0 mm dyse ud på den roterende plade i en sfæronise-ringsmaskine, der omfatter en riflet friktionsplade som rotor o 16 DK 170825 B1 anbragt i en cylinder på en sådan måde, at cylinderen danner en stationær væg for pladen, men giver denne frihed til at kunne rotere. Den riflede plade har en diameter på 23 cm og er riflet med en konfiguration på 2 mm afstand og 1 mm 5 højde. Pladen bringes til at rotere med en hastighed på 600 o/min.til tilvejebringelse af en tangentialhastighed på 7,2 meter pr. sekund i et tidsrum på ca. 2 minutter, hvorpå det sfæroniserede ekstrudat udtømmes fra maskinen gennem en åbning ved hjælp af centrifugalkraft. De sfæroni-10 serede partikler tørres derefter i en fluid bed-tørrer (Aero-matic AG, model nr. 1) med en indgangslufttemperatur på ca. 68°C. Ved at gå frem på denne måde fås der 108 g tørret materiale pr. liter celleopslæmning. Dette præparat af immo-biliseret glucoseisomerase bestemmes at have en aktivitet på 15 437 IGIU pr. gram med 20/40 mesh-partikelstørrelse og en par- tikel-sejhed på 442 (i forhold til 100 i eksempel 1). En portion på 10 g (30/40-mesh) af dette immobiliserede enzym hydratiseres i 40% (vægt/vægt) DS (dry solids)-glucose ved en pH-værdi på 8,0 indeholdende 4,1 mM magnesium og 250 dpm 20 SO2 ved 25°C i 1 time. Den hydratiserede enzymopslæmning anbringes derpå i et vandbad med en temperatur på 60°C i ca. 2 timer og overføres derefter til en 100 x 1,5 cm søjle med glaskappe. Inden tilsætningen af enzympartiklerne til søjlen anbringes der en lille prop af glasuld på bundpladen, 25 hvorpå der tilsættes 5 ml 20/40 mesh-aluminiumoxidpartikler. Søjlens temperatur holdes ved 60°C. Glucose-fødematerialet perkoleres dernæst ned gennem laget med en strømningshastighed til opretholdelse af en fructose-omdannelse på 42-44%. Tabel VI illustrerer aktiviteten med hensyn til tiden samt 30 produktiviteten som gram DS af 42% fructose pr. gram enzym. Aktivitetsnedsættelsesprofilen indikerer, at der kræves ca. 58 dage til at nå halveringstidspunktet. På dette tidspunkt er der produceret ca. 5060 gram DS (42% fructose) pr.

gram immobiliseret enzym.

35 o 17 DK 170825 B1

Tabel VI

Stabilitet og produktivitet af immobiliseret F. arborescens ved 60°C under anvendelse af 40% DS (vægt/vægt) glucose indeholdende 4,1 mM Mg og 250 dpm SO2 ved pH= 8/0 ved 25°C (se yder-5 ligere detaljer i eks. 41)

Tid Relativ Produktivitet , (dage) Aktivitet (g DS)(g enz.)~ 0,9 100 104 10 4,9 93 554 10.0 94 1126 14.8 86 1632 20.0 82 2138 25.0 80 2617 15 30,1 75 3077 34.9 69 3472 40.0 65 3871 44.9 62 4234 49.9 57 4581 20 55,0 54 4905 59.9 47 5184 64.9 42 5430 69.9 36 5646 74.9 30 5824 25 79,8 24 5967 84.9 21 6092 87.9 18 6159

Eksempel 42 30 Dette eksempel viser, at ekstracellulært enzym kan im- mobiliseres ved den her omhandlede fikseringsproces. Cellevæske af F.arborescens centrifugeres på den sædvanlige måde. Celleopslæmningen fortyndes med DI-vand til 34% efter rumfang af kulturvæsken. Den fortyndede celleopslæmning homogeniseres 35 i en Manton-Gaulin-homogenisator ved 8.000 til 10.000 psi.

Cellematerialet ledes gennem homogenisatoren tre gange. Gra- o is DK 170825 B1 den af solubilisering af enzymet ved homogenisering fremgår af den følgende tabel.

Tabel VII

5 Opløselig aktivitet

Materiale % af total_

Celleopslæmning 2 1. homogenat 31 2. homogenat 52 10 3. homogenat 58

Fikseringsfiltrat 4

Det cellemateriale, der er homogeniseret tre gange, immobiliseres derpå på følgende måde. 10 liter homogeniseret 15 celleopslæmning indstilles på en pH-værdi på 8,0 og inkuberes derefter ved 70°C i 15 minutter og afkøles til ca. 25°C. Tværbinding etableres ved tilsætning af 1038 ml 5%'s PEI (P-600, Cordova), efterfulgt af 3460 ml 0,25%'s chitosan, og idet der til sidst tilsættes 347 ml 10%'s glutaraldehyd.

20 Celleblandingens pH-værdi indstilles derpå på 8,0. Ved tilsætningen af glutaraldehydet sker der en fuldstændig celleaggregering som bedømt ved hjælp af den klare ovenstående væske. Det aggregerede cellemateriale opsamles i en 12% kurvecentrifuge. Cellekagen ekstruderes derpå og formes til sfæ-25 riske partikler ved den i eksempel 41 beskrevne fremgangsmåde.

Den glucoseisomerase-aktivitet, der bliver tilbage i filtratvæsken, viser sig at være kun 4% af den totale aktivitet, jfr. tabel VII. Dette resultat indikerer, at praktisk taget al den opløselige aktivitet immobiliseres. Re-30 sultaterne af immobiliseringen fremgår af den følgende tabel.

35 19 DK 170825 B1 o

Tabel VIII

5 Immobiliseret enzym

Eksem- Behand- Sejhed pel ling PEI Chit GA IGIU/1 g/1 (%)x 42 Homogenl- 29,6 ' 4,9 19,8 476 139 382 seret 10 x Se tabel I Eksempel 43

En kulturvæske af Streptomyces olivaceous indeholdende glucoseisomerase immobiliseres på følgende måde: der anven-15 des kulturvæske fra S.olivaceous-fermentering til immobiliseringen. Væksten af S-olivaceous består hovedsageligt af mycelium, medens væksten i tilfælde af F.arborescens mere er af den cellulære type. 2 liter kulturvæske indstilles på en pH-værdi på 9,0, hvorpå der tilsættes 20 ml 10%'s PEI 20 (P-600, Cordova), hvorved der fremkommer en lille mængde flokkulering. Dernæst tilsættes der 30 ml 10%,s glutaralde-hyd, hvilket ikke forårsager nogen åbenbar forøgelse af flok-kuleringen. Derefter tilsættes der 1,5 liter 0,25%'s chitosan, hvorved der forårsages fuldstændig aggregering af myceliet.

25 immobil!serede cellemateriale opsamles ved filtrering og ekstruderes som i eksempel 1. Resultaterne er sammenfattet i den følgende tabel.

30 35 o 20 DK 170825 B1

Tabel IX

Reagens Immobiliseret enzym g/liter kulturvæske 5 Parti-

Eksem- kelsej- pel PEI GA Chit hed (%) IGIU/g g/liter 43 1,0 1,5 1,9 257 260 10,0 10 x Se tabel I Eksempel 44

Immobilisering af glucoseisomerase fra Bacillus 15 licheniformis-mutant.

I det følgende illustreres den immobiliseringsproces, ved hvilken reagenserne tilsættes i rækkefølgen chitosan-glu-taraldehyd-PEI. Væksten af B. licheniformis er mere lig vask-sten af F.arborescens, dvs. cellulær uden mycelium. Til 1 li-20 ter kulturvæske, der er indstillet på en pH-værdi på 7,0, sættes der 20 ml 10%’s glutaraldehyd. Celleblandingen fortyndes med 2 rumfang vand, og derpå tilsættes derpå 25 ml 5%'s PEI (Kodak, molekylvægtsområde usikkert), hvilket bevirker, at cellerne aggregerer. Den immobiliserede cellemasse opsam-25 les ved filtrering og behandles yderligere som beskrevet i eksempel 1. Resultaterne af immobiliseringsprocessen er samlet i den følgende tabel.

Tabel X

30 Reagens g/liter kulturvæske ____.. .

’ Immobiliseret enzym

Eksem- pel Chit GA PEI IGIU/gX g/liter 44 0,06 1,0 1,25 96,7 13,4

xMålt ved 70°C

35 o 2i DK 170825 B1

Eksempel 45

Immobilisering af glucoseisomerase fra B.licheniformis. Dette eksempel illustrerer immobiliseringsprocessen ved tilsætning af reagenserne i rækkefølgen GA-Chit-PEI. Til 5 1 liter kulturvæske, der er indstillet på en pH-værdi på 7,5, sættes der 250 ml 1%'s glutaraldehyd, medens pH-værdien holdes ved 7,5. Derpå sættes der 1 liter 0,2%'s chitosan til kulturvæsken, efterfulgt af tilsætning af 38,4 ml 5%'s PEI (Kodak, molekylvægtsområde usikkert). Celleaggregatet opsam-10 les ved filtrering og behandles yderligere som i eksempel 1. Fikseringsprocessens resultater er sammenfattet i den følgende tabel.

15 Tabel XI

Reagens g/liter kulturvæske

Immobiliseret enzym 20 Eksem- - pel GA Chit PEI IGIU/gx g/liter 45 2,5 2,0 1,9 99 15,1 * Målt ved 70°C 25

Et yderligere eksempel på immobiliseringen af glucoseisomerase produceret af B.licheniformis.

Ifølge dette eksempel indstilles 4 liter B.licheni-formis-kulturvæske på en pH-værdi på 7,5 og inkuberes derpå 30 ved 70°C i 15 minutter. Efter afkøling til ca. 25°C tilsættes der dernæst 2 liter 0,2%'s chitosan. Celleblandingens pH-værdi indstilles derefter på 9,0 inden tilsætning af 100 ml 10%'s glutaraldehyd. Der tilsættes derpå 80 ml 5%'s PEI. Under tilsætningen af glutaraldehyd og PEI holdes blandingens 35 pH-værdi ved 9,0. Den aggregerede cellemasse opsamles ved filtrering og ekstruderes og tørres som i eksempel 1. Resultaterne af fikseringsprocessen fremgår af den følgende tabel.

o 22 DK 170825 B1

Tabel XII

Reagenser g/liter kulturvæske

Immobiliseret enzym_ 5 Eksem- pel Chit GA PEI IGIU/g* g/liter Sejhed1* 46 1,0 2,5 1,0 142 113 500

1Q * Målt ved 70°C xx Se tabel I

15 20 25 35

Claims (17)

23 DK 170825 B1 Patentkrav.

1. Fremgangsmåde til immobilisering af en enzymproducerende mikroorganisme eller et enzym produceret deraf, 5 kendetegnet ved, at man fremstiller et reaktionsprodukt ved anvendelse af følgende trin: a) indføring i et vandigt medium indeholdende et enzym eller en masse af bakterieceller, der indeholder et intra-cellulært enzym, af en vandig opløsning af en polyethylenimin 10 (PEI) med en molekylvægt på mindst ca. 500 dalton og med et indhold af primære aminogrupper på mindst 10 vægtprocent af den polymeres aminogrupper, b) tilsætning af glutaraldehyd og en vandig opløsning af chitosan til det vandige medium til dannelse af et tværbun- 15 det reaktionsprodukt og c) fjernelse af det tværbundne reaktionsprodukt fra det vandige medium og tørring deraf til tilvejebringelse af et slutprodukt med biokatalytisk aktivitet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 20 ved, at der anvendes en biokatalysator i form af en masse af enzymproducerende bakterieceller.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at molekylvægtsområdet er fra 40.000 til 60.000 dalton.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 25 ved, at polyethyleniminen bringes i vandig opløsning i en koncentration på fra 1 til 10 vægtprocent, inden den indføres i det vandige medium.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes en mængde PEI på fra 2 til 22 vægtpro- 30 cent af den immobiliserede cellemasse.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes en mængde chitosan på fra 0,5 til 22 vægtprocent af det immobiliserede enzympræparat.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet 35 ved, at der anvendes en chitosanmængde på fra 3,5 til 10%. o

24 DK 170825 Bl

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der anvendes en mængde glutaraldehyd på fra 4 til 26 vægtprocent af det immobiliserede enzympræparat.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet 5 ved, at der anvendes en mængde glutaraldehyd på fra 7 til 15%.

10. Immobiliseret biokatalytisk præparat fremstillet ved fremgangsmåden ifølge krav 1.

11. Fremgangsmåde til fremstilling af et immobiliseret enzympræparat, kendetegnet ved, at den omfatter 10 følgende trin: a) indføring i et vandigt medium, der indeholder en masse af levende celler, der producerer enzym, af en vandig opløsning indeholdende fra 1 til 10 vægtprocent polyethylen-imin med en molekylvægt i området fra 40.000 til 60.000 15 dalton og et indhold af primære aminogrupper på mindst 10 vægtprocent af den polymeres aminogrupper, i tilstrækkelig mængde til at tilvejebringe PEI i en mængde på fra 2 til 22 vægtprocent af de immobiliserede enzympræparater, b) tilsætning af glutaraldehyd i en mængde på fra 7 til 20 15 vægtprocent af det immobiliserede enzympræparat og en vandig opløsning af chitosan i en mængde tilstrækkelig til at tilvejebringe chitosan i en mængde på fra 3,5 til 10 vægtprocent af det immobiliserede enzympræparat, til det vandige medium til dannelse af et tværbundet reaktionsprodukt og 25 c) fjernelse af det tværbundne reaktionsprodukt fra det vandige medium og tørring deraf til tilvejebringelse af et slutprodukt med biokatalytisk aktivitet.

12. Fremgangsmåde til fremstilling af et sfærisk, immobiliseret enzympræparat, kendetegnet ved, at 30 den omfatter følgende trin: a) indføring i et vandigt medium, der indeholder et enzym eller en masse af bakterieceller indeholdende et intracellu-lært enzym, af en vandig opløsning af polyethylenimin (PEI) med en molekylvægt på mindst ca. 500 dalton og med et indhold 35 af primære aminogrupper på mindst 10 vægtprocent af den polymeres aminogrupper. 0 DK 170825 B1 b) tilsætning af glutaraldehyd i en mængde på fra 4 til 26% af det immobiliserede enzympræparat og en vandig opløsning af chitosan i en mængde tilstrækkelig til tilvejebringelse af chitosan i en mængde fra 0,5 til 22 vægtprocent 5 af det immobiliserede enzympræparat, til dannelse af et tværbundet reaktionsprodukt, c) fjernelse af det tværbundne reaktionsprodukt fra det vandige medium og partiel tørring deraf til dannelse af en fugtig kage og 10 d) ekstrudering af den fugtige kage gennem en åbning ud på den roterende plade af et sfæroniseringsorgan, der omfatter en riflet friktionsplade som rotor anbragt i en cylinder således, at cylinderen tilvejebringer en stationær væg for pladen, medens den tillader den at rotere frit til dannel-15 se af det ønskede produkt.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at der anvendes en fugtig kage indeholdende fra 68 til 76 vægtprocent vand.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendeteg-20 net ved, at pladen roteres med en hastighed, der er tilstrækkelig til at tilvejebringe en tangentialhastighed på fra 4,5 til 12 meter pr. sekund.

15. Fremgangsmåde til fremstilling af et sfærisk, immobiliseret enzympræparat, kendetegnet ved, 25 at den omfatter følgende trin: a) indføring i et vandig medium, der indeholder en masse af levende celler, der producerer enzym, af en vandig opløsning indeholdende fra 1 til 10 vægtprocent polyethyleni-min med en molekylvægt i området fra 40.000 til 60.000 dalton 30 og med et indhold af primære aminogrupper på mindst 10 vægtprocent af den polymeres aminogrupper, i tilstrækkelig mængde til tilvejebringelse af PEI i en mængde fra 2 til 22 vægtprocent af det immobiliserede enzympræparat, b) tilsætning af glutaraldehyd i en mængde fra 7 til 35 15 vægtprocent af det immobiliserede enzympræparat og en van dig opløsning af chitosan i en mængde tilstrækkelig til at o

26 DK 170825 B1 tilvejebringe chitosan i en mængde fra 3,5 til 10 vægtprocent af det immobiliserede enzympræparat, til det vandige medium til dannelse af et tværbundet reaktionsprodukt, c) fjernelse af det tværbundne reaktionsprodukt og 5 partiel tørring deraf til dannelse af en fugtig kage indeholdende fra ca. 68 til ca. 76 vægtprocent vand og d) ekstrudering af den fugtige kage gennem en åbning ud på pladen af et sfæroniseringsorgan, der omfatter en riflet friktionsplade som rotor anbragt i en cylinder såle- 10 des, at cylinderen tilvejebringer en stationær væg for pladen, medens den tillader den at rotere, idet pladen roteres med en hastighed tilstrækkelig til tilvejebringelse af en tangentialhastighed på fra 4,5 til 12 meter pr. sekund under ekstruderingstrinnet og i et tidsrum, der er tilstrække-15 ligt til dannelse af det ønskede produkt.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, kendetegnet ved, at der anvendes enzymproducerende celler af en stamme af F.arborescens, der er i stand til at producere glucoseisomera-se.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at der anvendes stammen med deponeringsbetegnelsen ATCC 4358. 25 30 35