DK148776B - Fremgangsmaade til fremstilling af palatinose ved hjaelp af immobiliseret alfa-glykosyl-transferase - Google Patents

Description

148770 i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af palatinose ud fra sakkarose under anvendelse af immobiliseret a-glukosyl-transferase.

Palatinose er et reducerende disakkarid og det er fastslået at palatinose er en naturlig komponent i honning og sukkerrørssaft. Dets sødhed er ca. det halve af sakkaroses.

Palatinoses molekylstruktur er 6-0-a-D-glukopyranosyl-D-fruktose, hvor glukose er bundet til fruktose i 1,6-stil-lingen. Palatinose betegnes også isomaltulose.

Ifølge den kendte teknik, jfr. de tyske fremlæggelses-skrifter nr. 1.049.800 og 2.217.628, fremstiller man a-glukosyl-transferase, som danner palatinose ud fra sakkarose, ved at dyrke en bestemt bakterietype, dvs. Protaminobacter rubrum,

Serratis plymuthica osv., i nærværelse af sakkarose. Da enzymet er tilsluttet bakteriernes celler kan en masse af bakteriernes celler i sig selv anvendes som et enzympræparat.

Til fremstilling af palatinose ud fra sakkarose sættes således en masse af celler som indeholder a-glukosyl-transfe-rase til en vandig opløsning af sakkarose i en koncentration på 20-30% og reaktionen udføres ved omrøring af blandingen mens blandingen reguleres ved en temperatur på 20-30°C og en pH på ca. 7. Reaktionstiden afhænger af enzymmængden, reaktionstemperaturen osv., men da den tilbageværende mængde af sakkarose i reaktionsblandingen sædvanligvis bliver meget lav ca. 20 timer efter tilsætning af cellerne defineres dette punkt som afslutningen af reaktionen, og derefter fjernes cellerne fra reaktionsblandingen for at give en vandig transparent opløsning af palatinose, som renses ved hjælp af ion-bytterharpiks osv., og derefter koncentreres under nedsat tryk til krystallisering af palatinose.

Ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde fjernes cellerne sædvanligvis fra reaktionsblandingen ved en centrifugeringsseparation, men eftersom forskellen i vægtfylde mellem cellerne og reaktionsblandingen er lille og da også størrelsen af cellerne er meget lille er separationseffekten meget ringe og der kræves således meget store installationer til at gennemføre fremgangsmåden, hvilket giver et stort problem når metoden skal gennemføres industrielt.

148776 2

Som resultatet af forskellige undersøgelser ud fra den betragtning, at den bedste måde til løsning af dette problem er at anvende immobiliseret α-glukosyl-transferase, har opfinderne fundet en nyttig fremgangsmåde til immobilisering af enzymet og har færdigbearbejdet fremgangsmåden til fremstilling af palatinose ved hjælp af den immobiliserede a-glukosyl-transferase.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er derfor ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

Ved de undersøgelser, der ligger til grund for opfindelsen, forsøgtes α-glukosyl-transferasen først blot indesluttet i en kalciumalginatgel. Som bekendt kan denne metode praktiseres ganske enkelt ved at man fremstiller en vandig opløsning af en blanding af et enzym og natriumalginat og ved dråbevis at sætte en vandig kalciumkloridopløsning til opløsningen under anvendelse af et middel til at gelatinere blandingen til et granulat, fx en injektor. Selv om kalciumalginatet har den ulempe at det opløses efterhånden ved en pH større end 5,8, har gelen deraf høj fysisk styrke og kan derfor let anvendes enten i en reaktionsbeholder af en type med fast leje eller i en reaktionsbeholder af typen med et fluidiseret leje.

Celler med en o-glukosyl-transferase-aktivitet vundet ved podning af Serratia plymuthica NCIB nr. 8285 i et vandigt medium indeholdende 5% sakkarose, 3% majsstøbevand, 0,3% di-natriumhydrogenfosfat og 0,2% natriumklorid og indstillet til en start-pH på 7, og dyrkning under aerobe betingelser og opsamlet ved centrifugal separation, suspenderedes således i en vandig 2%s natriumalginatopløsning af ca. 40 rum-fangs% af den dyrkede gæringsvæske og suspensionen sattes dråbevis til en vandig 0,1N kalciumkloridopløsning under anvendelse af en injektor efterfulgt af omrøring i 2 timer, hvorefter det således dannede granulat udvandtes ved filtrering og vaskedes tilstrækkeligt med vand. De ovennævnte trin blev alle gennemført ved temperaturer under 25°C således at α-glukosyl-transferasen ikke inaktiveredes.

Når det således vundne granulat sattes til en 30 vægt%s sakkaroseopløsning og når man lod blandingen stå ved 25°C og 148776 3 blandingens reducerende evne måltes efterhånden som tiden gik, blev det fastslået at den reducerende evne stiger gradvist. Også ved yderligere analyse under anvendelse af højhastighedsvæskekromatografi blev det bevist at forøgelsen af den reducerende evne skyldtes dannelsen af palatinose.

Dvs. at α-glukosyl-transferase under alle omstændigheder kunne granuleres ved kalciumalginatgel-indeslutningsmetoden.

Når imidlertid reaktionsblandingen filtreredes efter at næsten al sakkarose var omdannet til palatinose for at udvinde granulatet og granulatet var tilstrækkeligt vasket med vand, og det atter blev sat til en 30 vægt%s sakkaroseopløsning og fik lov at stå ved 25°C var stigningshastigheden for den reducerende evne nedsat til under 1/10 af den oprindelige hastighed ved den første reaktion. Dette menes forårsaget af opløsning af enzymet til reaktionsblandingen.

Det vil sige enzymet vil blive tilbøjeligt til at blive frigjort fra cellerne af en eller anden grund og kalciumalginat-gelens gitternet vil ikke være så fint at det tilbageholder enzymproteinet.

Det har således vist sig at skønt a-glukosyl-transfe-rase kan granuleres ved kalciumalginatgel-indeslutningsmetoden, så kan α-glukosyl-transferase ikke immobiliseres.

Det blev derpå undersøgt om tværbinding med glutaralde-hyd ville være hensigtsmæssig.

Til vandige glutaraldehydopløsninger på hver 100 ml med koncentrationer på henholdsvis 0%, 0,025%, 0,0 5.%,

0,1% og 0,5% sattes der 30 g granulat af enzymet indesluttet i kalciumalginatgelen fremstillet under samme betingelser som beskrevet ovenfor,og efter behandling af blandingen i 30 minutter ved 25°C udvandtes granulaterne ved filtrering og vaskedes med vand i hvert tilfælde. De således vundne granulater sattes til 100 g 33,3 vægt%s sakkaroseopløsning og reaktionsblandingen inkuberedes i 20-23 timer ved 25°C. Efter at reaktionen var tilendebragt udvandtes granulatet ved filtrering og vaskedes tilstrækkeligt med vand,og der tilsattes atter 100 g 33,3 vægt% sakkaroseopløsning for at udføre en anden reaktion. På denne måde gennemførtes en række reaktioner. Ved begyndelsen af hver reaktion indstilledes pH

4 U8776 til 6,5-7,0, men pH nedsattes til 5,0-5,5 på 2 timer og til 4,3-4,8 på 20 timer. Ved hver reaktion opsamledes en lille mængde (2-5 g) af reaktionsblandingens overstående væske ved tidspunktet 2 timer efter reaktionens start, faststofindholdet måltes ved hjælp af et refraktometer og reducerende sukker måltes ved en Shaffer-Somogyi-mikrometode og derefter bestemtes omdannelseshastigheden for sakkarose ud fra disse værdier.

Forsøgets resultater er vist i tabel 1. Ud fra resultaterne vil det forstås at den mest passende koncentration af en glutaraldehydopløsning er 0,1% ved forsøget, og når opløsningens koncentration er 0,025% eller 0,05% er enzymet utilstrækkeligt immobiliseret således at aktiviteten hurtig nedsættes, mens enzymet inaktiveres kraftigt under immobiliseringsbehandlingen når koncentrationen er 0,5%. Da imidlertid faldet i aktiviteten også sker hurtig under anvendelse af 0,1%s glutaraldehydopløsning, der gav det bedste resul-tet ved det ovenfor beskrevne forsøg, viste det sig at det immobiliserede enzym ikke kunne vindes med høj produktivitet ved glutaraldehydbehandlingen alene.

148776 5 υι £ ΰ> to η| s Τ31 3 tfl Η Η ι-· ο • S IQ l-s < Η· m

(D 3 S

__SU ua - r+ 3

Di iQ ua H

ooooo Η H 0 fD CD

' ' ' ' —' o, 3 3 H »

Ul H O O dffDrtO · 3

un ro ^ ir 3 · H

un ·< 3 r+

Dj I 3 3

Hi ri fl)

__H

H Hi

u> ^ σι · O

Ό Η OJ UB (O H

n ·% ·.*»> lQ

C7i O O ^ VO P iQ

3 H

ua 3 __rt 3

to H

H fc 3 3

Ul U IB M CO I-1 *«« ^ *· ·>* > ^ Qj

O H ^ σι ^ &1 (D

3 3“ iQ *< cn Dj --JD O' ω Λ1 3 H tii ω lo · X S' oo oo o o 3 3 - - - - ua M 3

OiOn-OH 3 O Di i-3 3 3 H 3 i£| (D H- tr 0 3 3 --g ua h >t* Dj 3

H UO Μ H · 3 3 H

σι NB to σι I 3 3 ·»·..·» lQ 3 H ~J O C 3 3 < 3 1-“ H-

ua 3 H

__3 ^ m 3 U1 ua H- H to Η · H 3 O UB 00 ΟΙ I 3 U5 ^ ^ ^ ^ ^ Qj un ,n> to uo 3 >3 3 --> 3° ua & — 3 3 σι 3 n

M to H · Hi IC

O Ul NB CO | ft 3 ' - ' ' ua 3 w oo σι rf=> 3 H 0 3 3 ua to cn

H

--t+ 3 c H· r+ to · 3 r+ UB to UB I I 3 3 ' ua h rt- |N U1 NB 3 3 3 ua Hi oo 3 to · H· ~j o σι i i Ω *· ·% tQ j-»· un o σι 3 3 3 3 ua i 148776 6

Polyætylenimin har den egenskab at den geleres ved omsætning med glutaraldehyd, men da denne gel har ringe fysisk styrke er det ikke hensigtsmæssigt at anvende polyætylenimin alene til immobilisering af et enzym. Det har nu vist sig at når polyætylenimin geleres ved behandling med glutaraldehyd efter at det er trængt ind i ovennævnte kalcium-alginatgel, dannes der en gel med en høj enzymtilbageholdelsesevne og med høj fysisk styrke idet der sker en indbyrdes kompensering for manglerne ved de to geltyper og den foreliggende opfindelse er udformet på grundlag af denne erkendelse som nærmere forklaret nedenfor.

Granulater af enzymet indesluttet i en kalciumalginat-gel fremstilledes på den samme måde som beskrevet ovenfor og der blev for hvert forsøg benyttet 30 g af granulatet til fremstilling af immobiliseret enzym. Desuden foretrækkes det at granulatets størrelse er på 0,5-5 mm, navnlig 1-3 mm i diameter.

Da en polyætyleniminopløsning har en kraftig alkalisk evne og opløser kalciumalginat,neutraliseredes opløsningen til pH 5,0-5,8 med saltsyre før anvendelse. Mængden af polyætyleniminopløsningen var 30 g og koncentrationen var den dobbelte af den i forvejen bestemte koncentration af den opløsning som skulle trænge ind i gelen. Med andre ord, opløsninger af polyætylenimin med koncentrationer på 1%, 2% og 3% benyttedes til indføring af koncentrationer på henholdsvis 0,5%, 1% og 1,5% i gelen. Efter neddypning af granulatet i polyætyleniminopløsningen i ca. 10 minutter udvandtes granulatet ved sugefiltrering og sattes uden at det blev vasket med vand til 100 ml af en glutaraldehydopløsning med en bestemt koncentration og behandledes deri i 30 minutter. Derefter udvandtes granulatet ved filtrering, vaskedes tilstrækkeligt med vand, anvendtes gentagne gange til reaktionen som i det ovenfor beskrevne forsøg og forandringerne i sakkaroseomdannelseshastigheden i løbet af 2 timer undersøgtes. Det blev faststlået af ca. 80-90% i afhængighed af temperaturbetingelserne af den omdannede sakkarose blev omdannet til pa-latinose.

148776 7

Resultaterne fra det ovenfor beskrevne forsøg med virkningen af samtidig anvendelse af polyætylenimin er vist i tabel 2. Som et sammenligningseksempel på tilfældet uden anvendelse af polyætylenimin er resultaterne fra prøve nr. 5 i tabel 1 også vist i tabel 2. Da polyætyleniminen kombineredes med glutaraldehyd krævedes der en forholdsvis stor mængde glu-taraldehyd.

Ved prøve .nr. 10 blev der ikke opnået tilstrækkelig immobiliseringsvirkning ved at anvende 0,1% glutaraldehyd og i tilfælde af prøve nr. 9 var immobiliseringsgraden stadig utilstrækkelig selv ved anvendelse af 0,2% glutaraldehyd.

I prøve nr. 7 absorberedes 1% polyætylenimin i gelen og gelen behandledes med 0,5% glutaraldehyd, og i dette tilfælde var den indledende aktivitet høj og stabil. I prøve nr. 8 var den absorberede mængde polyætylenimin 1,5% af gelen og koncentrationen af glutaraldehyd var 1%, og i dette tilfælde var den indledende aktivitet en smule lav men stabiliteten var meget høj. De optimale betingelser har således vist sig at være at polyætyleniminkoncentrationen skal være i området fra 0,5-1,5% baseret på gelmængden og koncentrationen af glutaraldehydopløsningen skal være i området fra 0,5-1,0%.

Hvis koncentrationen af polyætylenimin er højere end det ovenfor angivne område vil modstanden mod diffusion af sakkarose og reaktionsproduktet stige i uønsket omfang og hvis koncentrationen ligger under det nævnte område bliver stabiliteten til immobilisering for ringe.

Imidlertid er mængdeforholdet, mellem polyætylenimin og glutaraldehyd vigtig og det har vist sig at gode resultater opnås når mængden af glutaraldehyd er i området fra 1,5 gange til 5 gange mængden af polyætylenimin.

For prøve nr. 7 var mængden af polyætylenimin i gelen i området fra 0,15 til 0,3 g mens den anvendte mængde af glutaraldehyd var 0,5 g og for prøve nr. 8 var mængden af polyætylenimin 0,23-0,45 g mens den anvendte mængde glutaraldehyd var 1,0 g.

148776 8 ,— ρ ~ 5-¾- s» ^ Μ > ο ω 03 -J m υι H Η (—1 0 ^ Sl Οι h

.... < Π) W

CD 3" S

W Η- W___ ^ «Q

0 3 0 _ & 03 3 Η- 3 HHHI-'OO — CTH * li 030 ,,,,, > CD 3 Π) m Ο CD oouioui -^r+3 cn

3 O 3 X H· 0 C

& H ft 3 O' H

Η ® H -Q H- <+

Pi co ¢) fD H PJ

rt 3 i+ 1-1 t-1' {+

μ. μ. μ. CD 01 (D

030 OOHOOO — CDCD ti 3 iQ 3 , , , ' td ii CD · (D H NO O U1 Ul y, ~ F· ^ 3 3 X 3 P°

iQ

pj pj cn <

Hi Hi I H- Φ Ό 2Γ H 0 ----s

Cl- . ΕΠ' ^ H 3

pi aj j* ω h no H · iQ

H r+ Η σι H ** H >J CD

pj v< ,,,,,,ιΩ 3 μ* Η Οι U >t> 09 Ο Οι pi CL CD 3 <ί

(D 3 IQ CD

3“ ----& ^ 3 w Ο, η· ω js. η ω (-· Η · Pi Ο 3 uioooo-'jui 3 Ό ,,·»,·,,νί5 ι-3

Η Η* ϋοω^νίοΐΐ to CD PJ

® 3 Ρι 3 O'

cn iQ uQ Pi CD

3 (D —-----W CD H

μ- I—i (jJ PJ M

3 (D oo co Η d Η1 H · H CD no

iQ 3 «> on oo O 00 . 0 CD

. ,,,·,*,, iq cn (D M Ui Ο Η H Ui Ol CD pj

Hi 3 Q Hi (+ ^3..

w--Oj Ό H jo. pj 0

NO oo H NO Η H · 3 H

3 No d CO lO <] <31 3 ·< fD , , , , , , iQ CD ffi CL to U> H CO U> Η P) H (+

a 3 cn >C

J< iQ CD H

>0--cn CD

3 Cn iQ 3 μ. p W Η Μ Η H » H H· 3 υι oo oo σι σι o p) 3 iQ ,,,,,,ιβ 0, p- ¢. ji ω sj σι in 0J 3 p) 3-

Hi iQ cw> cn ......- -w» jy iQ σ> 3 φ H NO p1 NO μ' H · CD 3

H UJJi'JCnOlO Hi (D

φ ,,,,,,vQ 1+ 3

3 'jiocn-Jibwp) CD

3 H 3

μ. iQ (D

--NO Q,

Ό ~J

0 μ· NO H NO H · (+ iQ

H μ· NO σι σι NO ID Η· H

.(< ,,,,,,lQ 3 0 fM NO (J1 W O U> >P> p> CD (+

(+ 3 H PI

•c iq η

H--I

CD Μ H NO H 00 3 ιοοσι^Νο-Ί.: 1 ,,,,,, NO O ife U1 O U1 iQ P> 3 _IQ__ 148776 9

Virkningen af at anvende polyætylenimin sammen med glutaraldehyd fremgår allerede tydeligt af de i tabel 2 viste resultater, men til yderligere opklaring af virkningen bestemtes antallet af anvendelser indtil aktiviteten er nedsat til det halve samt antallet indtil aktiviteten er nedsat med 75% ud fra resultaterne i tabel 1 og 2,og endelig beregnedes som sammenligningsværdi produktiviteten indtil aktiviteten er nedsat til 75% på følgende måde:

Reaktionen antages at ske i overensstemmelse med hastighedsligningen (1) for en reaktion af første orden: K = - 1/t log (1 - x) (1) hvor K: reaktionshastighedskonstant t: reaktionstid x: omdannelsesgrad for sakkarose.

Når man i ligningen (1) tager i betragtning at K er proportional med den tilsyneladende enzymaktivitet i reaktionssystemet og t er konstant, er den tilsyneladende enzymaktivitet proportional med -log (1 - x) og idet den indledende værdi af - log (1 - x) for prøve nr. 1 defineres som 100 som en standard beregnedes den specifikke aktivitet for hver prøve for hver anvendelse. Ved at antage at reduktionsgraden for aktiviteten af hvert enzym er konstant afprikkedes aktiviteten på semilogaritmisk papir med anvendelsesnummeret ud af abscisseaksen og den specifikke aktivitet ud af ordinataksen, der søgtes en regression og man udledte deraf antallet af anvendelser indtil aktiviteten blev 50% af den maksimale aktivitet og 25% af den maksimale aktivitet. Idet den maksimale aktivitet ofte fremkommer efter den anden gang er antallet af anvendelser indtil aktiviteten bliver 25% af den maksimale aktivitet ikke altid det dobbelte af antallet af anvendelser indtil aktiviteten bliver 50% af den maksimale aktivitet. Produktiviteten vistes ved summen af værdien af den specifikke aktivitet for hver anvendelse. Resultaterne er opstillet i tabel 3.

148776 ίο

Tabel 3

Sammenligning af anvendelige antal og produktivitet.

Prøve Immobiliserings- Antal anvendelige Produktivitet nr. betingelse _gange__

(A)x (B)x 50X 25X 25X

1 0 0 1 1 100 2 0 0,025 2 4 189 3 0 0,05 3 5 222 4 0 0,1 6 10 327 5 0 0,5 8 13 125 6 0,5 0,5 11 19 225 7 1,0 0,5 19 36 746 8 1,5 1,0 36 70 749 9 1,0 0,2 7 12 360 10 _ 1,0 0,1 3 6 197 (A) : polyætylenimin (¾) (B) : glutaraldehyd (%) (50%): op til 50% aktivitet (25%): op til 25% aktivitet.

Resultaterne i tabel 3 viser tydeligt at immobiliseringsbehandlingen under de ovenfor beskrevne optimale betingelser i høj grad forbedrer produktiviteten.

Fremgangsmåden udøves ifølge opfindelsen fortrinsvis ved at man recirkulerer en sakkaroseopløsning til en kolonne pakket med den ved den ovenfor beskrevne metode vundne immo-biliserede α-glukosyl-transferase fra en lagertank ved hjælp af en pumpe, idet man regulerer pH i lagertanken eller pH i den recirkulerende opløsning i rørledningerne.

148776 11

Som beskrevet ovenfor opløses kalciumalginat efter hånden i en opløsning med en pH over 5,8 og derfor må reaktionen gennemføres ved en pH under 5,8. Hvis fx reaktionsblandingens pH neutraliseres til 7,0 nedsættes pH hurtigt og stabiliseres når pH bliver under 5,8.

Tegningen viser en kurve for pH's indflydelse på enzymaktiviteten målt under anvendelse af en 30 vægt%s sakkaroseopløsning opløst i en 0,02 M eddikesyre/kalcium-acetat-pufferopløsning. På tegningen refererer den fuldt optrukne linie (A) til det immobiliserede enzym og den stiplede linie (B) gælder for et frit cellulært enzym. Det aktive pH-område forskydes til den sure side i sammenligning med det frie cellulære enzym, men det er klart at pH under reaktionen fortrinsvis holdes så høj som muligt i et område som ikke nedsætter gelens stabilitet. Derfor holdes reaktionsblandingens pH ved 5,0-5,8, fortrinsvis ved ca. 5,5.

Herefter skal temperaturens indflydelse forklares.

Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen immobiliserede enzym neddyppedes i en 30 vægt%s sakkaroseopløsning opløst i en 0,02M eddikesyre/kalciumacetat-pufferopløsning ved pH 5,5 og holdtes i 30 minutter ved en bestemt temperatur hvorefter det immobiliserede enzym udvandtes ved filtrering og vaskedes tilstrækkeligt med vand. Det immobiliserede enzym bragtes derefter til at reagere i en sakkaroseopløsning med samme sammensætning som ovenfor i 2 timer ved 30°C hvorefter den tilbageværende aktivitet deraf måltes; der fremkom ikke nogen reduktion af aktiviteten ved 30°C, men der blev iagttaget en tydelig reduktion af aktiviteten ved temperaturer over 35°C. Ligesom i tilfælde af anvendelsen af det frigjorte cellulære enzym er det derfor nødvendigt at anvende temperaturer under 30°C.

Når man i praksis anvender enzymet ved denne opfindelse kan der naturligvis benyttes et reaktionsbad med et omrøringssystem, men for i så høj grad som muligt at undgå ødelæggelse af granulatet er det bedre at benytte en kolonne pakket med granulatet, og det foretrækkes således at anvende en kolonne af typen med fast leje. Tryktabet i kolonnen er meget lille 148776 12 og der kan anvendes en betydelig høj lineær hastighed.

Hvis tilbageholdelsestiden i kolonnen forlænges nedsættes pH hvorved enzymets tilsyneladende aktivitet nedsættes, og der anvendes derfor et recirkulationssystem med en forkortet tilbageholdelsestid og pH i recirkulationssystemet uden for kolonnen reguleres til ca. 5,5. Dette betragtes som værende det mest egnede middel til anvendelse af enzymet ifølge opfindelsen. Partikler eller granulat af immobiliseret enzym af en forholdsvis stor mængde sammenlignet med den mængde af en opløsning som skal behandles pakkes i en kolonne og den opløsning der skal behandles passeres én gang gennem kolonnen, hvorved størstedelen af sakkarosen kan omdannes til palatinose. Når mere end 98¾ af sakkarosen er omdannet til det ønskede produkt standses reaktionen og en transparent væske vundet gennem et simpelt filter kan sendes direkte til det efterfølgende trin. Der er således ingen problemer som tilfældet er ved anvendelsen af det frie cellulære enzym.

Dette indebærer desuden at den indledende sakkarosekoncentration i reaktionsblandingen kan forøges i forhold til hvad tilfældet er ved anvendelse af konventionelle frigjorte celler inden for et tilladeligt område som afgrænses af palatinose, dvs. produktets, opløselighed. Da palatinose opløses i vand af ca. 1,5 gange vægten deraf ved 30°C kan den indledende sakkarosekoncentration være ca. 40 vægt%. Således kan man i stort omfang reducere de nødvendige omkostninger til koncentrering af væsken i et krystallisationstrin.

Til at vinde det immobiliserede enzym med højere aktivitet end den der haves i de ovenfor beskrevne eksempler ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan den mængde enzym som indfanges eller omsluttes af kalciumalginatdelen forøges, hvilket meget let kan opnås.

Udførelsesformer for opfindelsen skal nu beskrives mere detaljeret og i praksis ved hjælp af følgende eksempler.

Eksempel 1 I en 30 liters gæringskrukke anbragtes 15 liter af et kulturmedium med pH 7 indeholdende 5% sakkarose, 3% majsstøbe- 148776 13 vand, 0,3% dinatriumhydrogenfosfat og 0,2% natriumklorid efterfulgt af sterilisation og efter podning med Serratia ply-muthica NCIB nr. 8285 gennemførtes gæring ved en temperatur på 28°C i 16 timer med en beluftningshastighed på 7,5 1/min. og en omrøringshastighed på 400 omdr. pr. minut til tilvejebringelse af et dyrket materiale med en høj a-glukosyl-trans-ferase-aktivitet, som fraskiltes ved centrifugalseperation til tilvejebringelse af 2,5 1 af en opslæmning af celler indeholdende enzymet.

Den således vundne celleopslæmning blandedes omhyggeligt med 2,5 1 af en vandig opløsning af 4% natriumalginat, blandingen anbragtes i en cylindrisk extruder forsynet med en matrice med et antal porer på 0,6 mm i diameter ved hovedenden, og blandingen extruderedes nedad gennem matricen ved påføring af lufttryk. Under extruderen anbragtes et 20 liters kar indeholdende 10 1 af en vandig 0,15 M kalciumkloridopløs-ning og under omrøring af opløsningen med en omrører sattes til opløsningen de væskedråber af blandingen som faldt gennem matricen. Extruderingen var afsluttet efter 10 minutter og derefter omrørtes kalciumkloridopløsningen i to timer for at styrke de fysiske egenskaber ved det i opløsningen blandede granulat. Derefter udvandtes granulatet ved filtrering og vaskedes omhyggeligt med vand. Vægten af det vundne granulat var 4 kg.

Efter fortynding af 270 g 30%s polyætylenimin med ca.

3 liter vand neutraliseredes den vundne opløsning til pH 5,5 med fortyndet saltsyre hvorpå den samlede mængde deraf indstilledes til 4 kg. Hele mængden af det ovenfor beskrevne granulat sattes til opløsningen og efter langsom omrøring udvandtes granulatet ved filtrering. Det blev fastslået ved analyse af faststofindholdet i den tilbageværende opløsning at ca. 20 g polyætylenimin var trængt ind i granulatet. Derpå fremstilledes 10 1 0,5%s glutaraldehydopløsning indeholdende 50 g glutaraldehyd, hvilket var 2,5 gange den beregnede mængde polyætylenimin i granulatet; granulatet indeholdende polyætylenimin tilsattes opløsningen og efter mild omrøring i 30 minutter udvandtes granulatet ved filtrering og vaskedes i tilstrækkeligt omfang med vand.

1-48776 14

De ovennævnte trin gennemførtes alle ved ca. 25°C«

Den vundne mængde af immobiliseret glykosyltransferase var 3,3 kg og enzymet pakkedes i en 5 1 kolonne.

I 9 kg vand opløstes 6 kg fint granuleret sukker og efter indstilling af opløsningens temperatur til 25°C recirkuleredes opløsningen gennem kolonnen ved at tilføre opløsningen til kolonnen med en hastighed på 50 liter/time ved hjælp af en pumpe og ved at returnere opløsningen fra det nedre udløb af kolonnen til det oprindelige kar. Da opløsningens pH under recirkulationen gradvist reduceredes indstilledes opløsningens pH til ca. 5,5 ved hjælp af en vandig natriumhydroxydopløsning under anvendelse af en automatisk pH-regulator.

Da recirkulationen havde fortsat i 22 timer var over 98% af sakkarosen nedbrudt til dannelse af palatinose.

Derpå udtømtes sukkeropløsningen og en anden reaktion startedes under anvendelse af en frisk sukkeropløsning. Mængden af sakkaroseopløsning var den samme indtil den tredie reaktion, men derefter nedsattes mængden af sakkaroseopløsningen gradvist i overensstemmelse med reduktion af aktiviteten.

Det tog 25 dage før behandlingsmængden af sakkarose pr. dag var nedsat til det halve. Under denne periode udgjorde den behandlede mængde sakkarose 110 kg. Da forsøget blev yderligere gentaget tog det 48 dage før aktiviteten blev 1/4 af den oprindelige aktivitet og den behandlede mængde sakkarose var på 160 kg.

Eksempel 2

Der fremstilledes en 6%s natriumalginatopløsning og 1,25 liter af opløsningen blandedes med 2,5 liter af en celleopslæmning fremstillet som i eksempel 1: Ved neddrypning af blandingen gennem en extruder som beskrevet i eksempel 1 i en 8 liters 0,15 M kalciumkloridopløsning vandtes der 3 kg granulat.

3 liter 2,5%s polyætyleniminopløsning indstilledes til pH 5,5 og det vundne granulat neddyppédes i denne opløsning i 10 minutter hvorved 30 g polyætylenimin trængte ind i granulatet. Granulatet behandledes derefter i 30 minutter med 9 liter l%s glutaraldehydopløsning indeholdende 90 g glutaral- 148776 15 dehyd hvilket var 3 gange mængden af polyætylenimin og derefter opsamledes granulatet ved filtrering og vaskedes med vand hvorved der vandtes 2,5 kg immobiliseret a-glukosyl-transferase.

Det immobiliserede enzym pakkedes i en kolonne og anvendtes som beskrevet i eksempel 1. I dette tilfælde var den mængde sakkarose som behandledes på én dag 5 kg ved betyndelsen, men selv efter 25 dage beholdt kolonnen en behandlingskapacitet på 3,0 kg/dag. Den mængde sakkarose som var behandlet i løbet af 25 dage var på 93 kg og det tog ca.

50 dage før aktiviteten blev 1/4 af den oprindelige aktivitet.

Den behandlede mængde sakkarose var 185 kg.

Eksempel 3

Protaminobacter rubrum CBS 57477 dyrkedes under anvendelse af et dyrkningsmedium indeholdende 5% sakkarose, 3% majsstøbevand, 0,5% gærekstrakt, 0,3% dinatriumhydrogenfos-fat og 0,2% natriumklorid i 20 timer ved et begyndelses-pH på 7,0 ved en temperatur på 28°C og med en beluftningshastig-hed på 1/4 rumfang pr. rumfang pr. minut og med en omrøringshastighed på 300 omdr. pr. min. til tilvejebringelse af 15 liter dyrket materiale.

Det dyrkede materiale underkastedes centrifugalseparation til tilvejebringelse af 3 liter celleopslæmning, som blandedes omhyggeligt med 1,5 liter 4%s natriumalginatopløs-ning, blandingen dryppedes ind i en kalciumkloridopløsning som beskrevet i eksempel 1 til dannelse af et granulat og granulatet vaskedes med vand. Efter indtrængning af polyætylenimin i granulatet i samme mængde som i eksempel 1, behandledes det med en glutaraldehydopløsning i samme mængde som i eksempel 1 til tilvejebringelse af 2,6 kg fikseret a-glukosyl-transfera- se, som pakkedes i en 5 liter kolonne.

En opløsning af sakkarose opløst i 0,01 M eddikesyre/ kalciumacetat-opløsning ved en koncentration på 30 vægt% førtes gennem kolonnen ved en temperatur på 25°C og med en strømningshastighed på 2,5 liter/time. Mængden af sakkarose i den analyserede effluent var 0,5%, hvilket viste at størstedelen af sakkarosen omdannedes til palatinose i kolonnen. Da kolon- 148776 16 nen benyttedes i 30 dage under de samme betingelser som beskrevet ovenfor var indholdet af sakkarose- i effluenterne inden for området fra 0,5 til 1,5%. Mængden af sakkarose behandlet på 30 dage var 540 kg.

Eksempel 4 I en 200 ml kolonne pakkedes 100 g immobiliseret α-glukosyl-transferase vundet som beskrevet i eksempel 3, 2 liter 30 vægt%s sakkaroseopløsning førtes gennem kolonnen med en hastighed på 500 ml/time og recirkuleredes som beskrevet i eksempel 1. Der anbragtes en automatisk pH-regulator 1 karret med sakkaroseopløsningen og pH indstilledes til 5,5 + 0,1 under anvendelse af en mættet kalciumhydroxydopløsning. Reaktionssystemets temperatur holdtes på 25°C. Da sakkarosekoncentrationen i reaktionsblandingen var nedsat til under 0,5% efter 20 timer fornyedes sakkaroseopløsningen og reaktionen startedes igen. Således gennemførtes reaktionen i 20 timer på en sådan måde at der ikke blev iagttaget nogen bemærkelsesværdig forandring i enzymaktiviteten i kolonnen.

Eksempel 5

Uden brug af en kolonne som i eksempel 4 sattes 100 g af det immobiliserede enzym som beskrevet i eksempel 4 til 2 liter af en sakkaroseopløsning og da reaktionen havde fortsat i 20 timer under omrøring medens pH indstilledes til 5,5 og temperaturen til 25°C blev sakkarosekoncentrationen 0,3%.

Enzymet udvandtes ved filtrering og benyttedes i en efterfølgende reaktion. På denne måde anvendtes enzymet 20 gange, men der kunne ikke iagttages nogen mærkbar forandring i enzymaktiviteten .