JPH01202294A - グルコースの増収法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は、グルコアミラーゼによる澱粉糖化において、
グルコースを増収する方法に関するものである。

（従来技術） グルコースは、現在、澱粉をα−アミラーゼで液化し、
次いで、グルコアミラーゼで糖化することにより製造さ
れている。

グルコアミラーゼは、澱粉のα−１，４−グルコシド結
合とα−１，６−グルコシド結合の両結合を加水分解す
ることができるので、希薄な澱粉溶液の場合は、はぼ完
全にグルコースに分解することができる。しかし、工業
的規模では、３０〜３５％の高濃度の澱粉の下で糖化が
行われるため、グルコアミラーゼ自体のもつ、適合成作
用などにより、生成したグルコースの重合化がおこり、
このため、グルコースの収量は、通常、９３〜９５％程
度である。そして、残りはマルトース、イソマルトース
、パノース、その他の、より高分子のオリゴ糖として残
存する。従って、これら残存するオリゴ糖を分解してグ
ルコースを増収することは、グルコース製造における長
年の念願であった。

（発明が解決しようとする問題点） グルコアミラーゼによる、澱粉糖化において、α−１，
６−グルコシド結合分解能をもつプルラナーゼを存在さ
せて澱粉を糖化すると、糖化反応が促進され、かつ、グ
ルコースが０．５〜２％増収できることが知られている
（特公昭５４−２９５７０゜５７−３９．５７−１７４
０８９他）。また、ある種のα−アミラーゼによっても
グルコースを増収することができる（特公昭６ｌ−１９
４９８）。プルラナーゼはプルランの他、アミロペクチ
ンまたはその派生物中のα−１，６−グルコシド結合を
分解する酵素であり、プルランから最終的にマルトトリ
オースを生成する。しかし、プルラナーゼには逆合成作
用のあることが知られており、例えば、マルトトリオー
スからは六糖（Ｇ６）などを生成する。このため、プル
ラナーゼをグルコアミラーゼによる澱粉糖化に併用した
場合、グルコースの増収が認められる反面、プルラナー
ゼの持つ逆合成作用により、グルコアミラーゼによって
分解され難いオリゴ糖も生成するという問題があった。

（問題点を解決するための手段） 本発明者は、グルコアミラーゼを用いて、澱粉を糖化す
るに際し、グルコースの増収に有効な新規酵素の探索を
行ってきた結果、土壌中より分離した細菌の生産する酵
素がグルコースの増収に極めて顕著な効果を示すことを
認めた。この酵素はマルトース以上のマルトオリゴ糖に
作用して、分子量のより小さいマルトオリゴ糖と、分子
量のより分子の大きい種々のマルトオリゴ糖を生成する
、分解と転移を同時に行う糖転移酵素の一種であること
を認めた。例えば、本酵素を澱粉に作用させたとき、マ
ルトースを主成分とする種々のマルトオリゴ糖を生成す
るが、マルトトリオース（Ｇ３）に作用させたときは、
マルトース（Ｇ２）、マルトテトラオース（Ｇ４）、マ
ルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ６
）など、一連のマルトオリゴ糖を生成する。　しかし、
グルコースは少ない。

第１図は、本酵素を１％のマルトトリオースに作用させ
て得られる生成糖のうち、マルトヘプタオース（Ｇ７）
までの組成量を示す液体クロマトグラムであるが、更に
、高分子量のマルトオリゴ糖も生成された。よく似た作
用をする酵素として、４−α−Ｄ−グルカノトランスフ
ェラーゼ（ＥＣ２，４，１，２５）が知られており、本
酵素もα−４−Ｄ−グルカノトランスフェラーゼに分類
される酵素と考えられる。しかしながら、このような糖
転移酵素がグルコアミラーゼによる澱粉糖化において、
グルコースの増収に効果があるということは、これまで
全く知られておらず、本発明によりはじめて開示される
ものである。本発明はこの知見に基づいてなされたもの
である。

（構　成） ・本発明は、澱粉またはその派生物をグルコアミラーゼ
で糖化して、グルコースを製造するに方法において、α
−１，４−グルコシド結合で移転する糖転移酵素を存在
させることを特徴とするグルコースの増収方法に関する
ものである。

以下に、本発明を、バシルス属菌に見いだした糖転移酵
素を例として具体的に説明する。

（発明の効果） 第１表は、３０％濃度のデキストリンを、ｐＨ４，５、
温度６０℃で、市販アスペルギルス・ニ酵素および市販
バシルス属プルラナーゼの効果を示している。

第　　１　　表 糖成分　　対照　プルラナーゼ　本発明酵素Ｇ　ｌ　　
　９５．２（％）　　９７．２（％’）　　　　９７．
１（％）Ｇ２　　　１．７　　　１．７　　　　　２．
２０３　　痕跡　　　０．３　　　　　０．２Ｇ４〜　
３．０　　　０．８　　　　　０．５表から明らかなよ
うに、グルコアミラーゼ単独では、９５．２％のグルコ
ースしか得られなかったが、本発明の酵素を存在させた
ときは、９７．１％の収量でグルコースが得られた。こ
の収量は、プルラナーゼを用いた場合の収量（９７，２
％）とほぼ同じあった。しかし、本発明の酵素の場合、
三糖類（Ｇ２）はプルラナーゼの場合よりも少し多いが
、三糖類（Ｇ３）以上のオリゴ糖はプルラナーゼの場合
よりも少ないという特徴が見られた。

糖液°の濾過性が悪くなり、また濁りを生ずる原因にも
なるので、高分子のオリゴ糖はできるだけ少ないことが
望ましい。従って、本発明の酵素はグルコースの増収と
いう効果のほかに、分子量の大きいオリゴ糖の少ない糖
液が得られるという利点がある。

第２図はグルコアミラーゼ単独および本発明の酵素を併
用したときの液化澱粉糖化の時間経過をしめしているが
、図から明らかなように、本酵素が存在すると糖化が促
進されるという効果も認められた。このことは、グルコ
アミラーゼの使用量を節減できるということを意味して
いる。グルコアミラーゼによる澱粉糖化において、本発
明の酵素が果たす役割は、次ぎのように理解することが
できる。すなわち、グルコアミラーゼの基質に対する親
和性（反応性）は、グルコースの重合度により大きく影
響されることが知られており、分子量の小さい基質より
も、大きい基質に対して親和性が大きい。グルコアミラ
ーゼによる澱粉糖化の種々の重合度のオリゴ糖が生成さ
れるが、本発明の酵素は、分解と転移作用を通じて、グ
ルコアミラーゼの分解し易い基質を供給することにより
、分解率が向上し、グルコースが増収できるものと考え
られる。したがって、このような転移作用を持つ酵素は
、本発明で例示した酵素と同様にグルコースの増収を達
成することができる。しかし、このような転移作用のな
い、例えば、バシルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス・リケニフォルミス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）やア
スペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏ
ｒｙｚａｅ）などのα−アミラーゼを用いても、グルコ
ースの増収効果は認められなかった。

一方、プルラナーゼによる糖化反応の促進は、グルコア
ミラーゼの弱い分岐結合（α−１，６−グルコシド結合
）切断能を補うことにあると考えられているので、本発
明の酵素とはグルコースの増収機構が異なっている。し
たがって、両者の澱粉糖化物の糖組成は、当然、異なる
と考えること生産する糖転移酵素を例として、具体的に
説明する。

本酵素は、以下に示す酵素的性質を持っている。

１）作用 可溶性澱粉、アミロース、アミロペクチンなどに作用さ
せると、主としてマルトースを生成するが、この他、マ
ルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオ
ース、マルトヘキサオースなど、一連のマルトオリゴ糖
を生成する。しかし、グルコースの生成は少ない。また
、マルトトリオース以上のマルトオリゴ糖に作用させる
と、マルトース以上の一連のマルトオリゴ糖を生成する
が、グルコースの生成は少ない。

第１図に、本酵素を１％のマルトトリオースに作用させ
て得られる生成糖のうち、マルトヘプタオース（Ｇ７）
までの糖組成量を示したが、より高分子量のオリゴ糖も
生成された。また、マルトテトラオース以上のマルトオ
リゴ糖に作用させたとき用により、基質分子から、分子
量のより小さいマルトオリゴ糖と分子量のより大きいマ
ルトオリゴ糖を生成するという、いわゆる基質分子の再
配分を行う糖転移酵素である。よく似た作用をする酵素
として、４−α−Ｄ−グルカノトランスフェラーゼ（Ｅ
Ｃ２，４，１，２５）が知られており、本発明の酵素も
この酵素に分類される酵素と考えられる。この酵素の場
合、マルトトリオースを基質としたとき、グルコースが
生成する（活性測定法として利用されている（赤堀四部
他編、酵素ハンドブック、第２７２ページ、朝食書店）
）。しかし、本発明の酵素の場合、第１図から明らかな
ように、グルコースの生成は少ない。そして、反応初期
に、主として、マルトースとマルトテトラオースが生成
する。このことは、本酵素による糖転移がグルコシル単
位で多くおこることを示している。本酵素はマルトース
に対しても僅かに作用してマルトースよりも分子量の大
きい種々のマルルトテトラオース（Ｇ４）、次いで、マ
ルトトリオース（Ｇ３）とマルトース（Ｇ２）、転移物
として、マルトヘキサオース（Ｇ６）、マルトヘプタオ
ース（Ｇ７）、マルトオクタオース（（Ｇ８）などが生
成することから、本酵素はマルトシルや、マルトトリオ
シル基単位でも転移すると考えられる。また、高分子の
可溶性澱粉に作用して、主としてマルトースを生成する
こと、プルランなどにも作用して還元力を増加すること
などから、水も受容体となると考えられる。

２）作用ｐＨおよび最適作用ｐＨ ｐＨ約３〜約９の広い範囲で作用し、最適作用ｐＨは５
付近に認められたく第３図、１％可溶性澱粉、Ｏ，１Ｍ
酢酸緩衝液または燐酸緩衝液、ｌＸ　１０−”Ｍ塩化カ
ルシウムの下で、５０℃で、１時間反応）。

３）作用温度範囲および最適作用温度 ６０℃に認められた（第４図、１％可溶性澱粉、２．５
ｘｌＯ−”Ｍ酢酸緩衝液（ｐ　Ｈ５）の下で、３０分間
反応）。

４）熱安定性 酵素水溶液を５０．５５．６０℃で、それぞれ１０分間
加熱処理してのち、残存活性を測定した。

その結果、それぞれ、約０％、約３０％、約８０％失活
した。５０℃では、３０分間加熱しても、殆ど失活が認
められなかった。

５）ｐＨ安定性 ｐ　Ｈ約４，５〜約７で安定であった（５Ｘ１０−”Ｍ
酢酸緩衝液またはトリス緩衝液の下で、室温で３時間放
置後、残存活性を測定）。

６）安定剤および賦活剤 カルシウムおよび鉄イオンの存在は酵素を安定化スる。

またカルシウムイオンは酵素活性を増加する。

７）阻害剤 本酵素は１ｘｌＯ−”Ｍの銅、水銀、銀イオンにより強
く阻′害゛さ゛れる。

８）分子量 セファデックスＧ−２００を泪いたゲルろ適法により測
定した分子量は約５０万であった。

９）精製方法 本酵素は、培養上澄に硫酸アンモニウムを７０％飽和に
なるように加え、生成する沈澱区分を遠心分離により集
め、透析、濃縮後、セファデックスＧ−２００カラムク
ロマトグラフイー、同カラムによる再クロマトグラフィ
ーにより、均一まで生成することができる。

１０）力価測定法 ｌＸｌ０−’Ｍ塩化カルシウムを含むＯ，１Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨ５，０）に溶解した２％可溶性澱粉（またはプ
ルラン）溶液０．５　ｍｌに、適量の酵素を加え、蒸溜
水で全量１　　ｍｌとし、６０℃で反応させる。この条
件で、１分間に１ＩＭのグルコースに相当する還元力を
生成する酵素量をＩＡ単位（プルランを基質とするとき
ＩＰ単位）とする。精製酵素の場合、Ｐ単位／へ単位は
、約１／Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｏ＋ｅｇａｔｅｒｉｕｍ　
）は、下記の菌学的性質を持っている。

１）形態：　桿菌、　運動性あり ２）芽胞：　胞子嚢；非膨出、胞子；楕円形、位置；中
立〜亜端立 ３）ダラム染色二　十 ４）カタラーゼ：　＋ ５）ｖ−ｐ反応：　　−１Ｉ）Ｈ５，０６）嫌気下での
生育二　− ７）！粉分解：　＋ ８）ゼラチン液化：　＋ ９）卵黄反応：　− １０）グルコースより酸生産：　＋ １１）グルコースよりガス生産二　− １２）ｐＨ５，７での生育：　＋ １３）５０℃での生育二　− １４）クエン酸塩の利用：　十 １５）５％ＮａＣ１存在下での生育：　＋ｏｒ　Ｄｅｔ
ｅｒｏ＋１ｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙの
８版（ＴｈｅＷｉｌｌｉａｍ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ　Ｃ
ｏ、、１９７４）を参照し、本図をバシルス・メガテリ
ウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａＬｅｒｉｕｍ）と同
定した。本図は工業技術院微生物工業技術研究所ににＦ
ＥＲＭ　ＢＰ−１６７２として寄託されている。

本図を用いて、本発明の酵素を生産するには、ペプトン
、肉エキ支、酵母エキス、コーン・ステイープ・リカー
のような有機窒素源、尿素、塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、鱗酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸
カリウムのような無機窒素化合物、炭素源としては、可
溶性澱粉、デキストリン、砂糖、マルトース、グルコー
スなどが使用される。この他、少量のリン酸塩、マグネ
シウム塩、カルシウム塩などを添加した培地を、ｐＨ５
〜８に調整し、通常、３０℃で１〜４日間、好気的に培
養される。酵素は、殆ど菌体外に生産されるので、培養
後、濾過または遠心分離により除菌し、上澄液を濃縮す
るか、硫酸ナトリウム、ツブロバノール、アセトンのよ
うな有Ｒ溶剤を加えて、酵素を沈澱させ回収する。

本菌株は本発明の酵素以外に、マルトース生成アミラー
ゼを生産する。この酵素は、グルコースの増収効果は持
たず、本酵素活性の測定に妨害となるので、培養液また
は粗酵素の場合は、プルランを基質に用いると、本発明
の酵素量を正確に測定することができる。

本発明の酵素をグルコアミラーゼと併用して、澱粉を糖
化する反応は、通常、液化澱粉濃度３０〜３５（Ｗ／Ｖ
）％、ｐＨ４〜５、温度５５〜６０′Ｃで、２〜４日間
行われる。

（ン≠Ｔ−子、巳） ポリペプトン２％、可溶性澱粉２％、１［、ＨＰｏ。

０．３％、Ｍｇ５Ｏ＋・７Ｈ，００，１％からなる培地
（ｐＨ５）３００ｍｌを２リツトル容三角フラスユ 培養後、遠心分離した上澄液について、酵素の生成量を
測定した結果は、培地ｍｌ当たり１．５Ｐ単位であった
。

該培養上澄に、硫酸アンモニウムを７０％飽和になるよ
うに加え、生成した沈澱を遠心分離により集め蒸溜水に
溶解し、蒸溜水に対し透析したち＼ のを以下の糖化実験に使用した。

実施例２ 基質として市販デキストリン（日本資料（株）製、ＮＳ
Ｄ　　ＤＥ約１３）、グルコアミラーゼは日本フィン・
シュガー（株）から販売されているアスペルギルス・ニ
ガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）起源プルリ
ティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｕｌｕｌｉ
ｔｉｃｕｓ）起源のものを使用した。反応液の組成を、
第２表に示す。

第　　２　　表 試　基質　糖化酵素　プルラナーゼ本酵素料　（ｇ）（
％対置形）（単位／ｇ）　　（Ｐ単位／ｇ）１３．３０
．１　　　　０　　　　　０２　３．３　　０．１　　
　　０．２５　　　　０３　３．３　　０．１　　　　
０　　　　　０．２５それぞれ、全ｆｉ　ｌ　Ｏｍ　Ｉ
とし、ｐＨ４，５，６０℃で、６５および７２時間糖化
した（本酵素使用の試料３においては、ＣａＣＬをｌＸ
ｌ０−２Ｍ量添加した）。糖化液の糖組成は高速液体ク
ロマトグラフ法により定量した。得られた結果を第３表
に示す。

第　　３　（災（ばｊ 糖化時間（時）　　　　６５　　　　　　７２試　　　
料　　　　　　１２３１２３ Ｇ＋（％）　　　　９５．１９６，７９６．６　９５．
２９７．２９７．ＩＯ２（％’）　　　　１，７　１，
８　２．１　１．７　１．７　２．２６３（％）　　　
痕跡　０．４０．３　痕跡０．３　０．２Ｇ４以上（％
）　　３．２　１．１　１．Ｑ　　３．０　　Ｇ、８　
０．５表から明らかなように、本酵素を使用した場合、
無添加の場合に比べ、グルコースの収量が約２％増加し
た。そして、この増加はプルラナーゼを用いた場合とほ
ぼ同じであった。また、本酵素を用いた場合、プルラナ
ーゼ使用の場合に比べ、三糖類は少し多いが、五糖類以
上のものは少なかった。

実施例３ トウモロコシ澱粉を、細菌α−アミラーゼで液化した液
化澱粉（ＤＥ約１３）を固形分として３ｇ１グルコアミ
ラーゼを固形分光たり０．１％５、およびこれに実施例
１で調製した酵素０．７５Ｐ単位、ＣａＣＩｔ　Ｉ　Ｘ
　１０−’Ｍ添加したものを、ツレぞれ、ｐＨ４，５，
６０℃で反応させた。経時的示す。図がら明らかなよう
に、本酵素が存在させたときは、存在させなかった場合
に比べ、糖化反応が促進された。また、グルコースも高
い収量で得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は、バシルス・メガテリウムの糖転移酵素を１％
マルトトリオースに作用させたときの生成物の糖組成を
示している。 第２図は、グルコアミラーゼによる液化澱粉糖化ニおけ
る、バシルス・メガテリウムの糖転移酵素の影響を示し
ている。 第３図は、バシルス・メガテリウムの転移酵素の最適作
用ｐＨを示している。 第４図は、バシルス・メガテリウムの転移酵素の最適作
用温度を示している。 特許出願人　工業技術院長　　　飯塚　幸三溶出時間（
分） 反応時間（時） ｐＨ 温　　　度（”Ｃ）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）澱粉またはその派生物をグルコアミラーゼで糖化
   してグルコースを製造する方法において、α−１．４−
   グルコシド結合で移転する糖転移酵素を存在させること
   を特徴とするグルコースの増収方法。
2. （２）第１項記載において、糖転移酵素が４−α−Ｄ−
   グルカノトランスフェラーゼ能を有する酵素であるグル
   コースの増収法。
3. （３）第１および２項記載において、糖転移酵素の給源
   がバシルス属であるグルコースの増収法。