DE3133123C2

DE3133123C2 - Unbeweglich gemachte α-Glukosyltransferase, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie Verwendung zur Herstellung von Palatinose

Info

Publication number: DE3133123C2
Application number: DE3133123A
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Yamato Kanagawa Nakajima; Junichi Yokohama Kanagawa Shimizu; Kazumasa Ayase Kanagawa Suzuki
Original assignee: Mitsui Sugar Co Ltd
Current assignee: Mitsui DM Sugar Co Ltd
Priority date: 1980-08-21
Filing date: 1981-08-21
Publication date: 1983-10-20
Also published as: GB2082591A; DE3133123A1; NL186019B; NL8103911A; DK148776B; IT8103506A0; DK148776C; NL186019C; JPS5836959B2; US4386158A; JPS5739794A; GB2082591B; IT1146531B; DK370081A

Abstract

Palatinose wird aus Saccharose unter Verwendung einer unbeweglich gemachten α-Glukosyltransferase hergestellt, die gewonnen wird, indem man ganze Zellen von α-Glukosyltransferase enthaltenden Bakterien durch Einschluß der Zellen in ein Calciumalginat-Gel granuliert, Polyäthylenimin in das Granulat eindringen läßt und das Granulat mit Glutaraldehyd-Lösung behandelt. Das unbeweglich gemachte Enzym kann leicht von der Produktlösung für einen wiederholten Einsatz abgetrennt werden und ist daher für eine Palatinoseherstellung mit hoher Produktivität geeignet. Die Effektivität der Palatinoseproduktion wird gesteigert, indem das unbeweglich gemachte Enzym in eine Säule gepackt und eine Saccharoselösung mit hoher Geschwindigkeit durch die Säule geleitet wird.

Description

Die Erfindung betrifft unbeweglich gemachte λ-GIukosyltransferase, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie die Verwendung zur Herstellung von Palatinose (vergleiche hierzu die Patentansprüche 1 bis 3).

Palatinose ist ein reduzierendes Disaccarid, das als natürlicher Bestandteil in Honig und Zuckerrohrsaft vorkommt. Die Süßkraft von Palatinose ist ungefähr halb so groß wie die von Sacharose.

Die Molekularstruktur von Palatinose ist ο-Ο-λ-D-Glukopyranosyl-D-fructose, in welcher die Glukose in 1,6-StelIung an Fructose gebunden ist. Palatinose wird auch als Isomaltulose bezeichnet.

Bei einem Verfahren zur Herstellung von Palatinose wird das Enzym in Form von lebenden oder toten Zellen von Protaminobacter rubrum einer wäßrigen Lösung von Saccharose zugegeben, um Saccharose in Palatinose zu überführen, wonach das Enzym aus der Lösung in der in dem deutschen Patent 10 49 800 beschriebenen Weise entfernt wird, hierbei wird das Enzym durch Zentrifugation abgetrennt.

Beim gegenwärtigen Entwicklungsstand wird λ-GIukosyltransferase, die Palatinose aus Saccharose bildet, durch Kultivieren einer bestimmten Bakterienart, insbesondere Protaminobacter rubrum, Serratis plymuthica usw., in Gegenwart von Saccharose hergestellt Da das Enzym mit den Bakterienzellen verbunden ist, kann eine Zellmasse dieser Bakterien als Enzympräparat verwendet werden.

Bei der Herstellung von Palatinose aus Saccharose wird üblicherweise eine Zellmasse, die Λ-Glukosyltransferase enthält, einer wäßrigen Lösung von Saccharose mit einer Konzentration von 20 bis 30% zugegeben, und die Reaktion wird unter Rühren der Mischung durchgeführt, welche währenddessen auf einer Temperatur von 20 bis 30° C und auf einem pH von etwa 7 gehalten wird. Die Reaktionsdauer hängt von der Menge des Enzyms, der Reaktionstemperatur usw. ab. Da aber die Restmenge an Saccharose in der Reaktionsmischung üblicherweise innerhalb von etwa 20 Stunden nach Zugabe der Zellen sehr gering wird, wird dieser Zeitpunkt als Reaktionsende angesehen. Danach werden die Zellen aus der Reaktionsmischung entfernt, und man erhält eine wäßrige transparente Lösung von Pabtinose, welche mit HiI-

I in CaI ei !«alginat eingeschlossene fe von Ionenaustauscherharzen u.dgl. gereinigt und dann unter vermindertem Druck konzentriert wird, um Palatinose zu kristallisieren.

Bei der obigen Verfahrenr-weise werden die Zellen aus der Reaktionsmischung üblicherweise durch Zentrifugieren abgetrennt, da aber die Differenz in der spezifischen Dichte zwischen den Zellen und der Reaktionsmischung klein ist und auch die Zellgröße sehr klein ist, ist der Wirkungsgrad der Abtrennung sehr schlecht und daher sind für die Durchführung des Verfahrens sehr große Einrichtungen erforderlich, was bei der industriellen Durchführung des Verfahrens mit erheblichen Problemen verbunden ist

Erfindungsgemäß wird dieses Problem dadurch ge-

löst daß eine unbeweglich gemachte Λ-Glukosyltransferase geschaffen wurde und diese für die Herstellung von Palatinose verwendet wird. Zu diesem Zwecke wurde ein geeignetes Verfahren zum Unbeweglichmachen des Enzyms entwickelt.

Die unbeweglich gemachte Λ-Glukosyltransferase ist dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterienzellen, die Λ-Glukosyltransferase enthalten, durch Einschluß in ein Calciumalginat-Gel granuliert, das Granulat in eine auf einen pH von 5,0 bis 5,9 eingestellte Polyäthylen-

imin-Lösung taucht, bis die Polyäthyleniminkonzentration im Gel 0,5 bis 1,5% beträgt, und dann das Granulat mit einer Glutaraldehydlösung behandelt, die die 1,5 bis fünffache Menge, bezogen auf das im Gel befindliche Polyäthylenimin, an Glutaraldehyd enthält. Das Verfahren zur Herstellung der unbeweglich gemachten λ-GIukosyltransferase besteht darin, daß man die obengenannten Maßnahmen in der angegebenen Reihenfolge durchführt. Dadurch wird eine leicht handhabbare käfigartige Gitterstruktur erhalten, die die Λ-Glukosyl-

transferase mit hoher Aktivität in wirksamer Weise einschließt, für Saccharose und Palatinose aber durchgängig ist.

Aus der DE-OS 29 15 135 ist es zwar bekannt, gegen Glutaraldehyd empfindliche intrazelluläre Enzyme mit Hilfe von Polyäthylenimin und Glutaraldehyd unbeweglich zu machen, e sehr feinttilig an. In der DE-OS 23 45 186 ist ein ähnl ches Verfahren beschrieben, bei dem Alginat als Binde verwendet wird. Aus diesen Druckschriften läßt sich jedoch der spezielle Aufbau des erfindungsgemäßen «- Glukosyltransferase-Granulats mit seinen besonderen Eigenschaften nicht herleiten.

Gemäß der Erfindung ist eine Einschlußmethode mit Calciumalginat-Gel als erste Stufe vorgesehen. Diese Methode kann in an sich bekannter Weise sehr einfach durchgeführt werden, indem eine wäßrige Lösung einer Mischung eines Enzyms und Natriumalginat hergestellt und die Lösung tropfenweise in eine wäßrige Calciumchlorid-Lösung zugegeben wird, beispielsweise unter Verwendung eines Injektors, um die Mischung zu einem körnigen Material zu gelatinieren. Obwohl Calciumalginat den Nachteil hat, daß es sich bei pH-Werten über 5,8 allmählich auflöst, besitzt sein Gel eine hohe physikalische Festigkeit und kann daher i.i einfacher Weise sowohl in Festbettreaktoren als auch in Wirbelbett-Reaktoren eingesetzt werden.

Zellen mit A-Glukosyltransferase-Aktivität werden durch Inokulieren von Serratia plymuthica NCIB No. 8285 in ein wäßriges Medium, das 5% Saccharose, 3% Maisquellwasser, 0,3% Dinatriumhydrogenphosphat und 0,2% Natriumchlorid enthält und auf einen Anfangs-pH von 7 eingestellt wurde, und durch aerobes Kultivieren und Sammeln durch Zentrifugalab-

scheidung gewonnen. Die Zellen werden vorzugsweise in einer wäßrigen 2prozentigen Natriumalginat-Lösung von ungefähr 40 Volumenprozent der kultivisrten Brühe suspendiert, wonach die Suspension tropfenweise einer wäßrigen 0,1 N Calciumchlorid-Lösung unter Ver-Wendung eines Injektors zugegeben wird, gefolgt von einem zweistündigen Rühren. Die gebildeten Körnchen werden durch Filtration abgetrennt und mit Wasser ausreichend gewaschen. Die obigen Verfahrensschritte werden alle bei Temperaturen unterhalb 25° C durchgeführt, damit die «-Glukosyltransferase nicht inaktiviert

Werden die so erhaltenen Körnchen einer 30%igen Saccharose-Lösung (Gewicht pro Gewicht) zugegeben und läßt man die Mischung bei 25°C stehen und mißt ihre Reduktionskraft in Abhängigkeit vom Zeitablauf, dann kann bestätigt werden, daß die Reduktionskraft allmählich zunimmt Auch bei der weiteren Analyse unter Anwendung einer Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie wurde nachgewiesen, daß der Anstieg der Reduktionskraft durch die Bildung von Palatinose verursacht wird. Dies bedeutet, daß Λ-Glukosyltransferase durch die Calciumalginat-Gel-Einschlußmethode in beliebigem Maße granuliert werden kann.

Wenn jedoch die Reaktionsmischung, nachdem im wesentlichen alle Saccharose in Palatinose umgewandelt ist, filtriert wird, um die Granulatkörner zurückzugewinnen, und die Granulatkörner ausreichend mit Wasser gewaschen und dann erneut einer 30%igen Saccharose-Lösung (Gewicht pro Gewicht) zugegeben und to bei 25°C stehengelassen werden, dann vermindert sich die Steigerungsrate der Reduktionskraft im Unterschied zur ersten Reaktion auf weniger als 1/10 der anfänglichen Rate. Es wird angenommen, daß dies auf eine Auflösung des Enzyms in die Reaktionsmischung zurückzuführen ist. Dies bedeutet, daß das Enzym auf Grund irgendwelcher Ursachen in die Lage versetzt

^wird, sich aus den Zellen zu befreien, und auf der ande-Seite die Maschen des Calciumalginat-Gel-Gitters

,nicht ausreichend fein sind, das Enzym-Protein zurück-

45

50

Es wurde somit gefunden, daß, obwohl eine Granulierung von Λ-Glukosyltransferase mit der Calciumalginat-Gel-Einschlußmethode möglich ist, die Λ-Glukosyltransferase doch nicht unbeweglich gemacht werden kann.

Es wurde daraufhin in Betracht gezogen, daß bei Einwirkung von als Vernetzungsmittel zum Unbeweglichmachen von Enzymen weit verwendeten Glutaraldehyd auf das durch das oben beschriebene Verfahren erhaltene Granulat komplizierte Vernetzungsverbindungen mit den vom Gel eingefangenen Zellen gebildet werden und auf diese Weise Λ-Glukosyltransferase widerstandsfähig gegen eine Freisetzung wird. Deshalb wurde eine Glutaraldehyd-Behandlung näher untersucht

Zu je 100 ml von wäßrigen Glutaraldehyd-Lösungen mit Konzentrationen von 0%, 0,025%, 0,05%, 0,1% und 0,5% wurden 30 g des auf oben beschriebene Weise hergestellten Granulats aus in Calciumalginat-Gel eingeschlossenem Enzym gegeben, und nach einer Behandlung der Mischung bei 25" C während 30 Minuten wurde das Granulat jeweils durch Filtration abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Dem so erhaitenen Granulat wurden jeweils 100 g einer 333%igen Saccharose-Lösung (Gewicht pro Gewicht) zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde bei 25° C während 20 bis 23 Stunden inkubiert Nach Abschluß der Reaktion wurden die Granulate durch Filtration abgetrennt, ausreichend mit Wasser gewaschen und erneut zu 100 g einer 33,3%igen Saccharose-Lösung (Gewicht pro Gewicht) zugegeben, um eine zweite Reaktion durchzuführen. Auf diese Weise wurde eine Reihe von Reaktionen ausgeführt Zu Beginn einer jeden Reaktion wurde der pH-Wert auf 6,5 bis 7,0 eingestellt. Er verminderte sich jedoch auf 5,0 bis 5,5 innerhalb von 20 Stunden. Bei jeder Reaktion wurde eine geringe Menge (2 bis 5 g) des Überstandes der Reaktionsmischung zum Zeitpunkt von zwei Stunden nach Reaktionsbeginn als Probe entnommen, wobei der Feststoffgehalt durch ein Refraktometer und reduzierender Zucker durch eine Shaffer-Somogyi-Mikromethode gemessen wurden und dann der Umwandlungsgrad von Saccharose aus diesen Werten bestimmt wurde.

Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Aus diesen Ergebnissen kann entnommen werden, daß die geeigneteste Konzentration der Glutaraldehyd-Lösung im Versuch bei 0,1% liegt. Wenn die Konzentration der Lösung 0,025 oder 0,05% beträgt, dann wird das Enzym unzureichend unbeweglich gemacht und die Aktivität schnell vermindert. Wenn dagegen die Konzentration 0,5% beträgt, dann wird das Enzym in hohem Maße durch die Behandlung zum Unbeweglichmacher inaktiviert. Da jedoch der Aktivitätsverlust auch bei Verwendung einer 0,l°/oigen Glutaraldehyd-Lösung, welche die besten Ergebnisse in dem oben beschriebenen Versuch ergab, noch groß genug ist, wurde festgestellt, daß ein unbeweglich gemachtes Enzym mit Hilfe der Glutaraldehyd-Methode nicht in der gewünschten Weise erhalten werden kann.

Tabelle 1

Versuchsergebnisse der Auswirkung einer Glutaraldehyd-Behandlung von in Calciumalginat-Gel eingeschlossenem Enzym

Proben

Glutaraldehydkonzentration

Saccharose-Umwandlungsrate (%) in 2 Stunden

einmal zweimal dreimal viermal fünfmal sechsmal siebenmal achtmal

1	0	62,9	8,4	0	—	—	—	—	—
2	0,025	49,4	52,6	30,1	16,7	6,3	3,4	—	_
3	0,05	43,0	49,9	38,7	2.?0	18,2	12,6	9,2	6,6
4	0,1	31,0	43,1	38,4	32,7	29,4	25,8	22,5	20,0
5	0.5	7,6	15,0	14,5	16,1	10,5	10,3	9,4	7,5

Polyäthylenimin hat die Eigenschaft, auf Grund einer Reaktion mit Glutaraldehyd geliert 'zu werden, da das Gel jedoch eine geringe physikalische Festigkeit besitzt, ist Polyäthylenimin für sich allein ungeeignet für die Herstellung von unbeweglich gemachtem Enzym. Es wurde jedoch gefunden, daß ein Gel mit hoher Rückhaltefähigkeit für das Enzym und hoher physikalischer Festigkeit geschaffen wird, wenn Polyäthylenimin mit Glutaraldehyd behandelt wird, nachdem es in das Calciumalginat-Gel eingedrungen ist. Auf diese Weise werden die Nachteile der zwei Gelarten gegeneinander aufgehoben und das der Erfindung zugrunde liegende Probleme gelöst.

Ausführungen und Einzelheiten der Erfindung werden nachfolgend auch unter Bezugnahme auf Vergleichsbeispiele beschrieben.

Granulate von in Calciumalginat-Gel eingeschlossenem Enzym wurden auf dieselbe Weise wie oben beschrieben hergestellt, und es wurden jeweils 30 g des Granulats zur Herstellung von unbeweglich gemachtem Enzym verwendet. Zusätzlich ist es bevorzugt, wenn die Teilchengröße im Durchmesser im Bereich von 0,5 bis 5 mm, noch besser im Bereich von 1 bis 3 mm liegt.

Da eine Polyäthylenimin-Lösung stark alkalisch ist und Calciumalginat aufzulösen vermag, wird die Lösung vor ihrer Verwendung zweckmäßigerweise mit Salzsäure auf einen pH von 5,0 bis 5,8 neutralisiert. Die Menge an Polyäthylenimin-Lösung lag bei 30 g und die Konzentration war doppelt so hoch wie die vorbestimmte Konzentration der Lösung, die eindringen soll. Es wurden, mit anderen Worten, Polyäthylenimin-Lösungen mit Konzentrationen von 1%, 2% und 3% verwendet, um sie in das Gel mit Konzentrationen von 0,5%, 1% bzw. 1,5% eindringen zu lassen. Nach dem Eintauchen des Granulats in die Polyäthylenimin-Lösung für eine Zeitdauer von 10 Minuten wurde das Granulat durch Saugfiltration gewonnen und, ohne es mit Wasser zu waschen, zu 100 ml einer Glutaraldehydlösung bestimmter Konzentration gegeben und darin während 30 Minuten behandelt. Danach wurde das Granulat durch Filtration gewonnen, ausreichend mit Wasser gewaschen und wiederholt für die Reaktion wie in dem oben beschriebenen Experiment eingesetzt wobei die Änderungen der Saccharose-Umwandlungsrate während zwei Stunden vei folgt wurden. Es wurde bestätigt, daß entsprechend der Temperaturbedingung ca. 80 bis 90% der umgewandelten Saccharose in Palatinose umgewandelt worden war.

Die Ergebnisse des obengenannten Versuches über

die Wirkung der Verwendung von Polyäthylenimin sind

in Tabelle 2 aufgeführt. Als ein Vergleichsbeispiel für

den Fall, bei dem ohne Polyäthylenimin gearbeitet wird,

sind die Daten von Beispiel Nr. 5 der Tabelle 1 auch in

Tabelle 2 wiedergegeben. Da sich Polyäthylenimin mit

Glutaraldehyd verband, war eine relativ große Menge

an Glutaraldehyd erforderlich.

Wie sich im Falle von Probe Nr. 10 ergibt, wird ein

ausreichender Unbeweglichkeitseffekt nicht erhalten, wenn 0,1% Glutaraldehyd verwendet werden, und aus Probe Nr. 9 ergibt sich, daß das Ausmaß der Immobilisierung immer noch nicht genügend ist, wenn Konzentrationen von 0,2% Glutaraldehyd verwendet werden.

Bei Probe Nr. 7 wurde !% Polyäthylenirnin im Gel absobiert und das Gel wurde mit 0,5% Glutaraldehyd behandelt. In diesem Falle war die Anfangsaktivität hoch und stabil. Bei Probe Nr. 8 lag die absobierte Menge an Polyäthylenimin bei 1,5% des Gels, und die Kon-

zentration des Glutaraldehyds lag bei 1%. In diesem Falle war die Anfangsaktivität etwas niedrig aber die Stabilität sehr groß. Wenn man berücksichtigt, daß die angenommene Höhe der Konzentration von Polyäthylenimin in dem Gel mit einer beträchtlichen Unge-

nauigkeit behaftet ist, dann können die Bedingungen als optimal angesehen werden, wenn die Konzentration an Polyäthylenimin, bezogen auf die im Gel vorhandene Menge, im Bereich von 0,5 bis 1,5% liegt und die Konzentration der Glutaraldehyd-Lösung im Bereich von

0,5 bis 1,0%. Wenn die Konzentration von Polyäthylenimin höher ist als der obengenannte Bereich, dann wird der Diffusionswiderstand für Saccharose und für das Reaktionsprodukt unerwünscht hoch, und wenn die Konzentration niedriger liegt als der vorgenannte Be-

rieh, dann wird die Stabilität der Immobilisierung schlecht.

Das quantitative Verhältnis von Polyäthylenimin und Glutaraldehyd ist ebenfalls von Bedeutung, und es wurde gefunden, daß die Menge an Glutaraldehyd in einem

Bereich liegen muß, der 1,5- bis 5mal so groß ist wie die Menge an Poiyäthylenimin.

Im Falle der Probe Nr. 7 liegt die Menge an Polyäthylenimin im Gel in einem Bereich von 0,15 bis 0,3 g, während die Menge an verwendetem Glutaraldehyd

0,5 g beträgt. Im Falle der Probe Nr. 8 lag die PoIyäthylenimin-Menge bei 0,23 — 0,45 g, wogegen die Menge an Glutaraldehyd 1,0 g betrug.

Tabelle 2

Versuchsergebnisse über die wirkung der Verwendung von Polyäthylenimin zusammen mit Glutaraldehyd

Proben- Versuchsbedingung
Nr. (A) (B)

Saccharose-Umwandlungsrate (%) in 2 Stunden
einmal zweimal dreimal viermal fünfmal

rechsmal siebenmal achtmal

5	0	0,5	7,6	15,0	14,5	16,1	10,5	103	9,4	7,5
6	0,5	0,5	11,0	17,7	18,1	17,3	16,6	15,4	12,3	12,0
7	1,0	0,5	24,8	30,4	30,1	29,8	26,7	26,7	26,0	24,5
S	15	Ί.0	11,4	18,3	18,0	18,1	18,3	17,6	16,3	16,4
9	1,0	0,2	36,3	40,0	35,5	333	28,4	24,9	22,5	20,0
10	1,0	0,1	4U	35,4	34,2	22,3	15,4	13,7	11,2	9,2

(A): Die Konzentration von Polyäthylenimin im Gel nach dem Eintauchen des Gels in die Polyäthyleniminlösung. (B): Die Konzentration der Glutaraldehyd-Lösung.

Die Wirkung der gemeinsamen Verwendung von Polyäthylenimin zusammen mit Glutaraldehyd ist aus den in Tabelle 2 aufgeführten Daten eindeutig ersichtlich. Zur weiteren Klärung des Effekts wurde die Anzahl der Einsätze, bis die Aktivität auf die Hälfte vermindert ist, und die Anzahl, bis die Aktivität um 75% vermindert ist, aus den Daten der Tabellen 1 und 2 sowie aus Vergleichswerten der Produktivität, bis die Aktivität um 75% vermindert ist, wie folgt berechnet:

Es wird angenommen, daß die Reaktion entsprechend der Geschwindigkeitsgleichung (1) einer Reaktion erster Ordnung abläuft:

K l/rlog(l - x)

wobei

K die Reaktionsgeschwindigkeitskonstante
t die Reaktionszeit

χ die Umwandlungsrate von Saccharose bedeuten.

Wenn man davon ausgeht, daß in der Gleichung (1) K in Proportion zu der offensichtlichen Enzymaktivität in dem Reaktionssystem steht und t konstant ist, dann ist die offensichtliche Enzymaktivität in Proportion zu log (1 —χ), und daher ist der Anfangswert von — log {\-x) von Probe Nr. 1 als 100 als Standard definiert, und es wurde dann die spezifische Aktivität einer jeden Probe, bezogen auf jeden Einsatz, berechnet. In der Annahme, daß die Verminderungsrate der Aktivität eines jeden Enzyms als konstant anzusehen ist, wurde die Aktivität in ein scmilogarithmisches Diagramm eingetragen, dessen Abszisse die Nummer des Einsatzes und dessen Ordinate die spezifische Aktivität angaben, wobei nach einer Regression gesucht wurde und die Zahl der Einsätze, bis die Aktivität 50% der maximalen Aktivität und 25% der maximalen Aktivität betrug, abgeleitet wurden. Da die maximale Aktivität häufig nach dem zweiten Mal auftrat, ist die Anzahl der Einsätze, bis die Aktivität 25% der maximalen Aktivität wird, nicht immer das Doppelte der Einsatzzahl, bis die Aktivität 50% der maximalen Aktivität beträgt. Die Produktivität ergibt sich aus der Summe der Werte der spezifischen Aktivität für jeden Einsatz. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt.

Tabelle 3

Vergleich der Einsatzzahlen und Produktivität

Proben-	Versuchsbedingung	(B)	Zahl der	25	Produk
Nr.	(A)			1	tivität
			brauchbaren	4
		0	Einsätze	5	25
1	0	0,025	50	10	100
2	0	0,05	1	13	189
3	0	0,1	2	19	222
4	0	0,5	3	36	327
5	0	0,5	6	70	125
6	0,5	0,5	8	12	225
7	1,0	1,0	11	6	746
8	1,5	0,2	19		749
9	1,0	0,1	36		360
10	1,0	Polyäthylenimin (%)	7		197
(A):	Glutaraldehyd (%)	3
(B):	bis zu 50% Aktivität
(50%):	bis zu 25% Aktivität
(25%):

Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen deutlich, daß die Unbeweglichkeitsbehandlung unter den oben beschriebenen Optimalbedingungen die Produktivität ganz erheblich verbessert.

Bei einer weiteren Anwendungsform des erfindungsgemäßen Produkts zur Herstellung von Palatinose wird in einem Recycling-System eine Saccharose-Lösung aus einem Vorratstank mit Hilfe einer Pumpe einer Säule zugeführt, welche mit nach der obengenannten Methode unbeweglich gemachter ar-Glukosyltransferase bepackt ist. Die Reaktionsmischung wird vom Auslaß der Säule in den Vorratstank zurückgeführt, und der pH-Wert im Vorratstank und der pH-Wert der Recycling-Lösung in den Rohrleitungen werden eingestellt.

im nachfolgenden werden die Eigenschaften der unbeweglich gemachten Λ-Glukosyltransferase, wie sie nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird, beschrieben.
Wie oben erwähnt, löst sich Calciumalginat in einer Lösung nur mit einem pH-Wert oberhalb 5,8 allmählich auf und daher soll die Reaktion bei einem pH-Wert unterhalb 5,8 durchgeführt werden. Wenn der pH-Wert der Reaktionsmischung beispielsweise auf 7,0 neutralisiert wird, dann vermindert sich der pH-Wert schnell und wird stabilisiert, wenn er unter 5,8 kommt.

In der Zeichnung zeigt ein Diagramm die pH-Charakteristik der Enzymaktivität, die unter Verwendung einer 30%igen Saccharose (Gewicht pro Gewicht) gemessen wurde, gelöst in einer 0,02 M Essigsäure/Calciumacetatpuffer-Lösung. In der Figur bedeutet die durchgezogene Linie (A) das unbeweglich gemachte Enzym und die gestrichelte Linie (B) ein freigesetztes Zellenzym. Der aktive pH-Bereich ist im Vergleich zum freigesetzten Zellenzym in Richtung auf die saure Seite verschoben, es ist jedoch eindeutig, daß der pH-Wert während der Reaktion vorzugsweise innerhalb eines Bereichs, der die Stabilität des Gels nicht vermindert, so hoch wie möglich gehalten wird. Deshalb wird der pH-Wert der Reaktionsmischung in der Regel 5,0 bis 5,8, vorzugsweise auf etwa 5,5, gehalten.

Im nachfolgenden wird der Einfluß der Temperatur erläutert. Das erfindungsgemäße unbeweglich gemachte Enzym wurde in eine 30%ige Saccharose (Gewicht pro Gewicht), welche in einer 0,02 M Essigsäure/Calciumacetat-Pufferlösung bei pH 5,5 aufgelöst war, eingetaucht und 30 Minuten lang bei einer definierten Temperatur gehalten, wonach das unbewegliche Enzym durch Filtration abgetrennt und mit Wasser ausreichend gewaschen wurde. Danach wurde das unbewegliche Enzym mit einer Saccharose-Lösung der selben Zusammensetzung wie oben während zwei Stunden bei 3CrC gehalten, wonach seine verbliebene Aktivität gemessen wurde. Eine Verminderung der Aktivität findet bei 30° noch nicht statt, jedoch bereits bei Temperaturen zwisehen 30 und 35° C. Deshalb wird die Umwandlung von Saccharose in Palatinose wie im Falle der Verwendung des freigesetzten Zellenzyms zweckmäßigerweise bei Temperaturen unterhalb 30⁰C durchgeführt

Für die Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms kann ein Reaktionsgefäß mit einem Rührer verwendet werden, zur Verhinderung einer Zerstörung bzw. eines Abriebs des Granulats ist es jedoch günstiger, eine mit dem Granulat bepackte Säule, vorzugsweise eine Säule vom Festbett-Typ zu verwenden. Der Druckverlust in der Säule ist sehr gering, und es kann eine recht hohe lineare Geschwindigkeit angewendet werden.

Wenn die Verweildauer in der Säule verlängert ist, dann vermindert eine pH-Verringerung die offensichtli-

ehe Aktivität des Enzyms, weshalb ein Recycling-System mit einer verkürzten Verweildauer bevorzugt angewendet wird und der pH-Wert im Recycling-System außerhalb der Säule auf ca. 5,5 eingestellt wird. Ein solches Vorgehen wird als besonders geeignete Maßnahme im Zusammenhang mit der Verwendung des Enzyms nach der Erfindung erachtet. Auch wird zweckmäßiger fc"; weise im Vergleich zu der Menge der zu behandelnden

Lösung eine große Menge an unbeweglichen Enzympartikeln bzw. Granulatkörnern in eine Säule gepackt. Wird die zu behandelnde Lösung einmal durch die Säule geleitet, dann kann der größere Teil der Saccharose in Palatinose umgewandelt werden. Wenn mehr als 98% der Saccharose in die Folgeprodukte umgewandelt sind, dann wird die Reaktion abgebrochen. Eine transparente Flüssigkeit kann durch ein einfaches Filter bzw. Sieb erhalten und direkt in die nachfolgende Stufe weitergeführt werden. Es bestehen also keinerlei Probleme wie im Falle der Verwendung von freigesetzem zellulärem Enzym.

Außerdem wird es durch die Erfindung ermöglicht, daß die anfängliche Saccharose-Konzentration in der Reaktionsmischung im Vergleilch zur Verwendung herkömmlicher freigesetzter Zellen innerhalb eines von der Löslichkeit der Palatinose als Reaktionsprodukt zügelassenen Bereichs erhöht werden kann. Da Palatinose in der etwa l,5fachen Gewichtsmenge Wasser bei 30°C aufgelöst wird, kann die anfängliche Saccharose-Konzentration bei ungefähr 40% (Gewicht pro Gewicht) liegen.

Die Kosten für die Konzentrierung der Flüssigkeit in einer Kristallisationsstufe können auf diese Weise erheblich gesenkt werden.

Wenn ferner eine höhere Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms als diejenige, die in den obigen Beispielen erläutert ist, erhalten werden soll, dann kann die im Calciumalginat-Gel eingeschlossene Enzymmenge erhöht werden, was leicht erreicht werden kann.

Weitere Ausführungsformen und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den Ansprüchen.

Beispiel 1

In ein 301 Fermeni>rgefäß werden 151 eines Kulturmediums mit einem pH 7 gegeben, das 5% Saccharose, 3% Maisquellwasser, 0,3% Dinatriumhydrogensulfat und 0,2% Natriumchlorid enthält Nach Sterilisieren und nach Inokulieren von Serratia plymuthica NCIB Nr. 8285 wird die Fermentation bei einer einer Tempiratur von 28° C während 16 Stunden mit einem Belüitungsgrad von 7,5 i/min und einer Rührgesehwindigkcii von 400 U. p. M. durchgeführt, um ein Kulturmaterial mit einer hohen Aktivität an «-Glukosyltransferase zu erhalten. Dieses wurde durch Zentrifugalabscheidung abgetrennt und man erhielt 2,5 1 einer das Enzym enthaltenden Zellaufschlämmung.

Die so erhaltene Zellaufschlämmung bzw. -suspension wurde mit 2,5 1 einer wäßrigen Lösung von 4% Natriumalginat gut durchgemischt, und die Mischung wurde in einen zylindrischen Extruder gegeben, der mit einer Form mit einer Vielzahl von Poren mit einem Durchmesser von 0,6 mm am Kopfende ausgerüstet ist. Die Mischung wurde nach unten durch die Form durch Anlegen eines Drucks extrudiert. Unterhalb des Extruders befand sich ein 201-Gefäß, das 101 einer wäßrigen 0,15 M Calciumchlorid-Lösung enthielt Unter Rühren dieser Lösung mit einem Rührer wurden der Lösung die aus der Form fallenden Flüssigkeitstropfen der Mischung zugegeben. Die Extrusion war nach 10 Minuten beendet Die Calciumchlorid-Lösung wurde 2 Stunden lang gerührt, um die physikalischen Eigenschaften der gebildeten Körnchen in der Lösung zu festigen. Danach wurde das erhaltene Granulat durch Filtration gewonnen und mit Wasser gewaschen. Das Gewicht des erhaltenen Granulats betrug 5 kg.

Nach Verdünnen von 270 g 30%igem Polyäthylenimin mit ca. 3 1 Wasser wurde die dabei erhaltene Lösung mit verdünnter Salzsäure auf einen pH von 5,5 eingestellt und danach die Gesamtmenge der Flüssigkeit auf 4 kg eingestellt. Die gesamte Menge des oben beschriebenen Granulats wurde der Lösung zugegeben, und nach langsamem Rühren wurde das Granulat durch Filtration wiedergewonnen. Durch Feststoffanalyse der zurückbleibenden Lösung wurde berechnet, daß ca. 20 g Polyäthylenimin in die Granulatkörnchen eingedrungen war. Dementsprechend wurden 101 einer 0,5%igen GIutaraldehydlösung, die 50 g Glutaraldehyd enthielt, hergestellt, was dem 2,5fachen der berechneten Menge entspricht. Das Polyäthylenimin enthaltende Granulat wurde der Lösung zugegeben und nach schwachem Rühren während 30 Minuten wurde das Granulat durch Filtration wiedergewonnen und mit Wasser ausreichend gewaschen. Die obigen Verfahrensschritte wurden durchweg bei einer Temperatur von ca. 25° C durchgeführt.

Die Menge an auf diese Weise erhaltener unbeweglich gemachter Glukosyltransferase betrug 3,3 kg. Das Enzym wurde in eine 5 1-Säule gepackt.

In 9 kg Wasser wurden 6 kg feingranulierter Zucker aufgelöst, wonach die Temperatur der Lösung auf 25°C eingestellt wurde. Die Lösung wurde durch die Säule umgewälzt, indem die Lösung der Säule mit einer Geschwindigkeit von 50 1 pro Stunde mit Hilfe einer Pumpe zugeführt und die Lösung vom unteren Auslaß der Säule in das ursprüngliche Gefäß rückgeführt wurde. Da der pH-Wert der Lösung während des Recyclings allmählich verringert wurde, wurde er mit einer wäßrigen Natriumhydroxid-Lösung unter Verwendung eines automatischen pH-Reglers auf etwa 5,5 eingestellt. Nach einer Umwälzdauer von 21 Stunden waren mehr als 98% der Saccharose unter Bildung von Palatinose umgesetzt

Die Zuckerlösung wurde entnommen, und es wurde eine zweite Reaktion unter Verwendung einer frischen Zuckerlösung begonnen. Die Menge an Saccharose- Lösung war bis zur dritten Reaktion die gleiche, wonach jedoch die Menge an Zuckerlösung entsprechend der Verminderung der Aktivität allmählich verkleinert wurde. Es dauerte 25 Tage, bis die pro Tag zu behandelnde Menge an Saccharose auf die Hälfte verminderi war. Während dieser Zeitdauer betrug die Gesamtmenge an behandelter Saccharose 110 kg. Bei Fortführung des Versuches dauerte es 48 Tage, bis die Aktivität 1 /4 der ursprünglichen Aktivität betrugt, und die behandelte Saccharose-Menge lag bei 160 kg.

Beispiel 2

Es wurde eine 6%ige Natriumalginat-Lösung hergestellt, und 1,25 1 der Lösung wurden mit 2,5 1 einer wie in Beispiel 1 hergestellten Zellaufschlämmung vermischt. Dann wurde die Mischung, wie in Beispiel 1 beschrieben, tropfenweise durch einen Extruder in 8 1 einer 0,15 M Calciumchlorid-Lösung eingebracht, wobei 3 kg Granulat erhalten wurden.

Nach Einstellen des pH-Wertes von 31 einer

2,5°/o!gen Polyäthylenimin-Lösung auf 5,5 wurde das Granulat während 10 Minuten in diese Lösung getaucht, wobei 30 g Polyäthylenimin in die Granulatkörner eindrangen. Das Granulat wurde daraufhin während 30 Minuten mit 91 einer l°/oigen Glutaraldehyd-Lösung behandelt, die 90 g Glutaraldehyd enthielt, was der dreifachen Menge an Polyäthyienimin entspricht Das Granulat wurde dann durch Filtration wiedergewonnen und mit Wasser gewaschen, wobei 2,5 kg unbeweglich gemachte Λ-Glukosyltransferase erhalten wurden.

Das unbeweglich gemachte Enzym wurde in eine Säule gepackt und wie in Beispiel 1 verwendet In diesem Falle betrug die in einem Tag behandelte Saccharose-Menge 5 kg zu Beginn der Behandlung, und nach 25 Tagen hatte die Säule noch eine Arbeitskapazität von 3 kg pro Tag. Die während 25 Tagen behandelte Saccharose-Menge betrug 95 kg, und es dauerte ca. 50 Tage, bis die Aktivität bei 1/4 der Anfangsaktivität lag. Die Menge an behandelter Saccharose betrug 185 kg.

Beispiel 3

Serratia plymuthica NClB Nr. 8285 wurde unter Verwendung eines Kulturmediums, das 5% Saccharose, 3% Maisquellwasser, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% Dinatriumhydrogenphosphat und 0,2% Natriumchlorid enthielt, während 20 Stunden bei einem Anfangs-pH von 7,0, einer Temperatur von 28⁰C, einer Belüftungsrate von 1/4 Vol/Vol χ min und einer Rührgeschwindigkeit von 300 U. p. M. kultiviert, wobei 15 1 Kulturmaterial erhalten wurden. Das kultivierte Material wurde einer Zentrifugalabtrennung unterworfen, um 3 1 Zellaufschlämmung zu bilden, welche mit 1,5 1 einer 4%igen Natriumalginat-Lösung gut vermischt wurden. Die Mischung wurde wie in Beispiel 1 zur Bildung eines Granulats in eine Calcii'mchlorid-Lösung eingetropft, und das erhaltene Granulat mit Wasser gewaschen. Nach Eindringen von Polyäthylenimin in die Granulatkörner wurde das Granulat mit einer Glutaraldehyd-Lösung behandelt, um 2,6 kg fixierte Λ-Glukosyltransferase zu bilden, welche in eine 51 Säule gepackt wurden.

Eine Lösung von Saccharose, aufgelöst in einer 0,01 M Essigsäure/Calciumacetat-Lösung, wurde in einer Konzentration von 30% (Gewicht pro Gewicht) bei

einer Temperatur von 25° C und einer Fließgeschwindigkeit von 2,5 1 pro Stunde durch die Säule geleitet Der Anteil an Saccharose im Ausfluß wurde zu 0,5% bestimmt, was zeigt, daß der größte Teil der Saccharose in der Säule in Palatinose umgewandelt worden war. Wurde die Säule 30 Tage lang unter denselben Bedingungen wie oben eingesetzt, dann lag der Saccharosegehalt im Ausfluß im Bereich von 0,5 bis 1,5%. Die innerhalb von 30 Tagen behandelte Saccharose-Menge lag bei 540 kg.

Beispiel 4

100 g der unbeweglich gemachten Λ-Glukosyltransferase, die wie in Beispiel 3 erhalten wurde, wurden in eine 200 ml Säule gepackt Durch diese Säule wurden 21 einer 30%igen Saccharose-Lösung (Gewicht pro Gewicht) mit einer Geschwindigkeit von 500 ml pro Stunde hindurchgeleitet und wie in Beispiel 1 umgewälzt Ein automatischer pH-Regler wurde mit dem Gefäß für die Saccharose-Lösung verbunden und der pH-Wert auf 5,5 ±0,1 unter Anwendung einer gesättigten Calciumhydroxid-Lösung eingestellt Die Temperatur des Reaktionssystems wurde auf 25° C gehalten. Da die Konzentration an Saccharose ι der Reaktionsmischung nach 20 Stunden unter 0,5% lag, wurde die Saccharose-Lösung erneuert und die Reaktion von neuem begonnen. Auf diese Weise wurde die Reaktion 20mal durchgeführt, ohne daß eine merkliche Änderung in bezug auf die Enzymaktivität der Säule beobachtet wurde.

Beispiel 5

Ohne Verwendung der in Beispiel 4 genannten Säule wurden 100 g des unbeweglich gemachten Enzyms wie in Beispiel 4 zu 2 I einer Saccharose-Lösung gegeben. Nach einer Reaktionsdauer von 20 Stunden unter Rühren und Einstellen des pH-Wertes auf 5,5 und unter Einhaltung einer Temperatur von 25°C lag die Saccharose-Konzentration bei 0,3%. Das Enzym wurde durch Filtration wiedergewonnen und für die nachfolgende Reaktion eingesetzt. Nach 20maligem Einsetzen des Enzyms wurde keine merkliche Veränderung der Enzymaktivität beobachtet.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1 Unbeweglich gemachtep-Glukosyltransferase, dadurch erhältlich, daß man Bakterienzellen, die x-Glukosyltransferase enthalten, durch Einschluß in ein Calciumalginat-Gel granuliert, das Granulat in eine auf einen pH von 5,0 bis 5,9 eingestellte PoIyäthylenimin-Lösung taucht, bis die Polyäthylenimin-Konzentration im Gel 0,5 bis 1,5% beträgt, und dann das Granulat mit einer Glutaraldehyd-Lösung behandelt, die die 1,5- bis fünffache Menge, bezogen auf das im Gel befindliche Polyäthylenimin, an GIutaraldehyd enthält
2. Verfahren zur Herstellung der Λ-Glukosyltransferase gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die im Anspruch 1 genannten Maßnahmen in der angegebenen Reihenfolge durchführt
3. Verwendung der unbeweglich gemachten x-Glukosyltransferase gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Palatinose aus Saccharose.