CH653704A5

CH653704A5 - Unbeweglich gemachtes enzym, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung.

Info

Publication number: CH653704A5
Application number: CH10350/79A
Authority: CH
Inventors: Johannes Muetgeert; Petrus Philippus Hermann Otto; Frans Adrianus Flippo
Original assignee: Tno
Priority date: 1978-11-20
Filing date: 1979-11-20
Publication date: 1986-01-15
Also published as: DK148981B; SE7909548L; IE792218L; GB2036032A; DE2946642A1; IT1126348B; DE2946642C2; FR2441658A1; LU81917A1; IE48660B1; NL7908326A; GB2036032B; BE880123A; DK148981C; IT7927440A0; DK492179A; US4418147A; JPS55102390A; FR2441658B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein unbeweglich gemachtes Enzym, also ein immobilisiertes Enzym, ein Verfahren zur Herstellung des unbeweglich gemachten Enzyms sowie die Verwendung des erfindungsgemässen, unbeweglich gemachten Enzyms zur Durchführung einer enzymatischen Reaktion.

Es ist bekannt, Enzyme mit einem Träger zu vereinigen oder zu kombinieren, wobei der Träger in dem Medium, in welchem das Enzym verwendet werden muss, unlöslich ist. Das Ziel des Unbeweglichmachens eines Enzyms, d.h. der sogenannten Enzymimmobilisierung, besteht darin, ein Enzymprodukt zu erhalten, das leicht von dem Reaktionsmedium abgetrennt werden kann und dann als biochemischer Katalysator wieder verwendet werden kann. Verschiedene chemische Methoden und physikalische Methoden sind bekannt, um ein Enzym auf einem unlöslichen Träger zu fixieren. Beispielsweise kann das Enzym an einen Träger mit Hilfe von kovalenten chemischen Bindungen gebunden sein. In diesem Falle enthält der Träger aktive Gruppen, welche getrennt eingeführt werden können, wobei diese aktiven Gruppen mit einer mehreren aktiven Gruppen des Enzyms reagieren. Aktivierte Polysacharide, synthetische Polymere und aktivierte anorganische Träger wurden als derartige aktive Trägermaterialien vorgeschlagen.

Es ist auch bekannt, dass ein Enzym an einen Träger mit Hilfe eines bifunktionellen Vernetzungsmittels gekuppelt werden kann. Beispielsweise ist Glutaraldehyd als derartiges Vernetzungsmittel bekannt.

Als Beispiele für physikalische Methoden zur Fixierung eines Enzyms auf einem Träger kann die Fixierung auf einem Ionenaustauscherharz, die Einkapselung in Mikrokapseln, der Einschluss in Fasern aus synthetischen Polymermaterialien und der Einschluss, bzw. die Okklusion in natürliche oder synthetische Gele genannt werden.

Wenn unbeweglich gemachte Enzyme zur Herstellung eines essbaren Produktes verwendet werden, dann sind Methoden zum Unbeweglichmachen, bei welchem ein chemisches Vernetzungsmittel und/oder synthetische Polymere verwendet werden, nicht sehr erwünscht, weil so wohl das chemische Vernetzungsmittel als auch die Chemikalien, die zur Herstellung von synthetischen Polymeren verwendet werden, unter Umständen nicht vollkommen harmlos sein können.

Ziel der vorliegenden Erfindung war es, ein unbeweglich gemachtes Enzym zur Verfügung zu stellen, bei dem die Bestandteile für Menschen und Tiere harmlos sind.

Es wurde bereits vorgeschlagen, ein Enzym unbeweglich zu machen, indem man es in ein Stärkegel einschliesst. Dieser Vorschlag wurde in der USA-Patentschrift Nr. 3 223 593 beschrieben. Zu diesem Zwecke wird ein klares, viskoses Sol hergestellt, indem man 3,25 g einer speziellen Stärke (Con-naughtstärke) und 25 ml destilliertes Wasser erhitzt. Das gekühlte Sol wird mit einer Lösung von Pferdeserumcholin-esterase vermischt, und dann lässt man die ganze Mischung gelieren. Gemäss einer Veröffentlichung in Anal. Chem. 37 (1965), Seiten 1378-1381 hat dieses Gel nur eine geringe mechanische Festigkeit, und in dieser Veröffentlichung wird vorgeschlagen, das Gel in einem Bauschen aus Polyurethanschaum mit offenen Poren aufzunehmen. Auch die Fixierung des Enzyms an dem Gel lässt viele Wünsche offen, weil etwa 14°/o des Enzyms leicht ausgewaschen werden.

Nach der USA-Patentschrift Nr. 4 106 987 wird Glucose-isomerase, die an mikroben Zellen fixiert ist, in einer natürlichen wasserunlöslichen gelbildenden Substanz unbeweglich gemacht. Als eine der verwendbaren gelbildenden Substanzen ist Stärke genannt.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass auch zellfreie Enzyme hervorragend gut in einem Stärkegel unbeweglich gemacht werden können. Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein unbeweglich gemachtes Enzym

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bereit zu stellen, welches geformte Strukturen eines trockenen Stärkegels umfasst, in welchem ein oder mehrere zellfreie Enzyme eingeschlossen, also okkludiert sind.

Vorzugsweise liegt das erfindungsgemässe, unbeweglich gemachte Enzym in einer teilchenförmigen Form vor. Das Produkt besitzt eine überraschend gute hohe mechanische Festigkeit. Der Enzymgehalt kann auf irgendeinen gewünschten Wert eingestellt werden, vorausgesetzt, dass das Stärkegel das Enzym zurückhalten kann. Im allgemeinen ist die Menge an Enzym, welches in dem Stärkegel aufgenommen werden und von dem Stärkegel zurückgehalten werden kann, höchstens 15 Gew.-% bezogen auf das Gewicht der Stärke.

Ein weiterer Gegenstand der vorligenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines unbeweglich gemachten Enzyms, bei dem ein oder mehrere Enzyme in einem Stärkegel aufgenommen werden. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man ein Zumindestens teilweise geliertes Stärkesol, welches einen Stärkegehalt von 20-60 Gew.-% aufweist, mit dem Enzym oder mehreren Enzymen vermischt, die Mischung gelieren lässt und das Gel in die Form von getrockneten geformten Strukturen bringt.

Bei der praktischen Durchführung wird zuerst ein Stärkesol hergestellt, indem man Stärke mit Wasser bei einer hohen Temperatur verknetet. Dann wird das Sol auf eine Temperatur abgekühlt, bei welcher das Enzym oder die Enzyme, die zugegeben werden sollen, sich nicht zersetzten, und sodann wird das Sol, welches zumindestens teilweise geliert sein kann, sofort mit dem Enzym oder den Enzymen vermischt. Danach lässt man die erhaltene Mischung gelieren. Wünschenswerterweise wird die Vermischung des Enzyms oder der Enzyme bei der höchstmöglichen Temperatur durchgeführt, um eine zu zeitige Gelierung der Mischung zu verhindern.

Eine sehr vorteilhafte Arbeitsweise, nach der die in Gelform vorliegende Enzym enthaltende Mischung in die getrockneten, geformten Strukturen übergeführt werden kann, besteht darin, dass man die Mischung zu Strängen extrudiert, diese Stränge trocknet und dann die Stränge zu Stückchen zerkleinert. Auf diese Weise wird ein aus Teilchen aufgebautes Produkt erzeugt, welches eine hohe mechanische Festigkeit besitzt. Diese Eigenschaft wird aufrechterhalten, wenn das Produkt mit einer wässrigen Flüssigkeit in Berührung kommt.

Das Trocknen kann an der Luft erfolgen oder unter vermindertem Druck, und zwar bei erhöhten Temperaturen, die jedoch nicht so hoch liegen dürfen, dass eine Desaktivierung des Enzyms stattfindet. Im allgemeinen kann das Trocknen sicher bei allen Temperaturen ausgeführt werden, die unterhalb von 30 °C liegen.

Obwohl jede natürlich vorkommende Stärke, wie zum Beispiel Getreidestärke, beispielsweise Maisstärke, Weizenstärke oder Roggenstärke, Tapioka, Maniokstärke (Kassavamehl), Reisstärke, Kartoffelstärke oder Buchweizenstärke, oder auf Stärken Von Leguminosen als Stärke in den erfin-dungsgemässen unbeweglich gemachten Enzymen eingesetzt werden können, so können auch reine Stärkefraktionen, die aus diesen Stärken isoliert werden, wie zum Beispiel Amylopektin, d.h. die verzweigte Fraktion, verwendet werden. Es ist auch möglich, Stärkederivate zu verwenden, die es ermöglichen, ein Sol herzustellen, welches einen Feststoffgehalt von 20-60 Gew.-% aufweist, wobei dieses Sol bei der maximalen Temperatur, bei welcher es mit dem Enzym vermischt werden kann, d.h. einer Temperatur unterhalb der Zersetzungstemperatur des Enzyms, nicht vollständig in kurzer Zeit geliert. Vorzugsweise ist die verwendete Stärke Kartoffelstärke, Amylopektin, das aus der Kartoffelstärke gewonnen wurde, also der verzweigte Anteil der Kartoffelstärke, oder Getreidestärke, insbesondere Maisstärke.

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Die vorliegende Erfindung kann eingesetzt werden, um verschiedene Enzyme unbeweglich zu machen, wie zum Beispiel Laktase', Invertase, Katalase, Glucose-oxydase, Phosphorglucose-oxydase, Aminocylase, Orthophosphor-säure-monoester-phosphorhydrolase und ähnliche. Sehr gute Ergebnisse wurden dabei mit Laktase, Katalase, Glucose-oxy-dase und einer Kombination von Katalase und Glucose-oxydase erzielt.

Ausserdem wurde überraschenderweise herausgefunden, dass das erfindungsgemäss in ein Stärkegel eingeschlossene Enzym sehr leicht gereinigt werden kann, indem man das unbeweglich gemachte Enzym mit Wasser oder einer Salzlösung extrahiert, beispielsweise einer Pufferlösung. Zu diesem Zwecke können die Granulate des unbeweglich gemachten Enzymes in einer Extraktionsflüssigkeit suspediert werden, und die Suspension kann leicht gerührt werden. Man kann das unbeweglich gemachte Enzym dann absaugen, und falls notwendig kann das Verfahren mehrere Male wiederholt werden. Als Extraktionsflüssigkeit ist ein 0,02 molarer Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,0 speziell gut geeignet. Es scheint, dass durch Verwendung dieses Extraktionsverfahrens eine grosse Menge des ursprünglichen Stickstoffgehaltes, der in dem unbeweglich gemachten Enzym anwesend ist, entfernt werden kann, ohne dass eine Verminderung der Enzymaktivität auftritt. Im Fall von Laktase konnte sogar 75% des ursprünglichen Stickstoffgehaltes so entfernt werden. Dies war der Fall bei einem käuflich erhältlichen Enzympräparat, das aus Saccharomyces lactis erhalten wurde.

Die Möglichkeit der Reinigung des Enzympräparates auf einfachem Wege ist besonders wichtig, weil es zur Herstellung der erfindungsgemässen unbeweglich gemachten Enzyme so möglich ist, ziemlich unreine Enzyme als Ausgangsmaterial einzusetzen, welche wesentlich billiger erhältlich sind als gereinigte Enzyme.

Die erfindungsgemässen unbeweglich gemachten Enzyme sind hervorragend gut geeignet, um enzymatische Reaktionen durchzuführen, und deshalb stellt die Verwendung der erfindungsgemässen unbeweglich gemachten Enzyme zur Durchführung enzymatischer Reaktionen einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung dar.

Eine wichtige Verwendung eines der erfindungsgemässen unbeweglich gemachten Enzyme, nämlich von unbeweglich gemachter Laktase, ist die Behandlung von Milch, die einen normalen oder verminderten Fettgehalt hat, oder von Molke, um die darin anwesende Laktose in eine Mischung von Glucose und Galactose umzuwandeln. Insbesondere im Fall der Herstellung von Produkten, die von Menschen oder Tieren konsumiert werden sollen, ist es unerwünscht, das Enzym in löslicher Form zuzusetzen, weil in diesem zuletzt genannten Fall dann das Enzym in dem Produkt zurückbleibt. Wie bereits oben angedeutet wurde, wurden bisher chemische, im allgemeinen toxische Hilfssubstanzen oft für die Arbeitsverfahren zur Unbeweglichmachung eines Enzyms benötigt, und als Beispiele für derartige Hilfssubstanzen seien bifunktionelle Reagenzien, wie zum Beispiel Dialdehyde, Carbodi-imide, und Epoxyde genannt, beispielsweise die Verbindungen die in der USA-Patentschrift Nr. 3 838 007 beschrieben sind. Andererseits blieben in denjenigen Fällen, wo Enzympräparate physikalisch oder chemisch in Gele eingeschlossen wurden, beispielsweise Polyacrylamidgel [s. Biotechnical and Bio-Engineering 15,795-402 (1973)] durch ein in situ erfolgende Polymerische Verunreinigungen durch die Reste der chemischen Katalysatoren zurück, die zur Durchführung der Polymerisation benötigt wurden, wie zum Beispiel radikalische Initiatoren und andere niedrig-molekulare und ebenfalls toxische Reaktionsbeschleuniger. Die erfindungsgemässen unbeweglich gemachten Laktaseprodukte besitzen nicht derartige Nachteile, weil diese Produkte ausschliesslich aus

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harmlosen Ausgangsstoffen erzeugt wurden.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemässen unbeweglich gemachten, also immobilisierten Laktase ist derjenige, dass die Wirksamkeit dieser Laktase bei ihrer Verwendung kaum absinkt. Das Enzym ist nicht nur zu sehr stark an der Stärke fixiert, sondern auch die Hydrolyse von Laktose kann in solcher Weise durchgeführt werden, dass das unbeweglich gemachte Enzym nicht durch eine Verstopfung der Poren durch die Abscheidung von Milchproteinen oder anderen Milchbestandteilen auf den Trägerteilchen geschädigt wird. Dieser zuletzt genannte Nachteil tritt bei den bisher bekannten unbeweglich gemachten Enzymen auf, und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung in «Chemical Week», 14. November 1977, Seiten 37-38 hingewiesen. Es zeigte sich, dass die Teilchen abgerieben werden können,

ohne dass sie zerfallen. Auf diese Weise wird die Oberfläche der Teilchen gereinigt, und ein zusätzlicher Fusionswiderstand, der möglicherweise durch Verunreinigung hervorgerufen wird, wird vermieden. So kann ein sehr langsames Abriebverfahren durchgeführt werden, indem man den Inhalt eines Reaktionsgefässes rührt, welches die Mischung aus Enzymkatalysatorpartikeln und dem zu behandelnden Substrat, beispielsweise eine Laktose enthaltende Flüssigkeit, enthält, oder dieser sehr leichte Abrieb kann auch erreicht werden, indem man die Enzymkatalysatorteilchen in einem Fliessbett, d.h. einem fluidisierten Zustand hält, indem man einen Flüssigkeitsstrom nach aufwärts richtet. Indem man die Energie genau einstellt, die durch einen derartigen Rührvorgang, bzw. durch das Fliessbett auf die Teilchen ausgeübt wird, kann das gewünschte Ausmass der Abtriebgeschwindigkeit leicht eingestellt werden, und dementsprechend kann eine Abscheidung von Milchproteinen oder anderen verunreinigenden Niederschlägen wirksam verhindert werden.

Invertase oder ß-Fructosidase ist ein Enzym, das von bestimmten Stämmen von Saccharomyces cerevisiae gebildet werden kann. Dieses Enzym kann verwendet werden, um Fructose aus Saccharose und/oder Maltose herzustellen. Es zeigte sich, dass in der erfindungsgemässen unbeweglich gemachten Form Invertase auch sehr stark an das Stärkegel fixiert ist. Die Invertaseaktivität vermindert sich nicht, nachdem man das Material in einem Puffer eines pH-Wertes von 5,2 in einem Kühlschrank während 40 Tagen gelagert hat. Auch das unbeweglich gemachte Enzym kann verwendet werden, um eine Saccharoseinversion bei einer höheren Temperatur, beispielsweise bei 40 °C, durchzuführen, ohne dass dadurch die Aktivität nachteilig beeinflusst wird. Bei dieser höheren Temperatur läuft die Inversionsreaktion bedeutend schneller ab. Wenn ein unreines Enzym zur Herstellung des unbeweglich gemachten Enzyms verwendet wurde, dann ist es möglich, einen wesentlichen Teil der Verunreinigungen auszuwaschen, ohne dass die Invertaseaktivität vermindert wird.

Katalase kann aus der Leber von Kühen isoliert werden, und sie kann zur Entfernung von Wasserstoffperoxid, das als Desinfektionsmittel eingesetzt wird, herangezogen werden. Wasserstoffperoxid zu Desinfektionszwecken kann gebildet werden, indem man eine erfindungsgemässe unbeweglich gemachte Glucose-oxydase verwendet, und danach kann dann die zurückbleibende Menge an Wasserstoffperoxid entfernt werden, indem man eine erfindungsgemässe unbeweglich gemachte Katalase einsetzt. Sowohl Katalase als auch Glucose-oxydase sind sehr stark an das Stärkegel fixiert.

Ein sehr wichtiges Anwendungsgebiet der erfindungsgemässen Enzyme liegt in der Entfernung von Sauerstoff aus Glucose enthaltenden Flüssigkeiten, wie zum Beispiel Bier und anderen Getränken. Die Anwesenheit von Sauerstoff in Bier ist unerwünscht, weil er zu einer ungünstigen Veränderung des Geschmackes führen kann. Zur Entfernung von Sauerstoff aus Glucose enthaltenden Getränken kann ein Katalase und Glucose-oxydase enthaltendes unbeweglich gemachtes erfindungsgemässes Enzym mit Vorteil eingesetzt werden. Es ist auch möglich, Gluconsäure aus Glucose mit einem Katalysator herzustellen, der diese Enzyme enthält, indem man Sauerstoff einführt.

Die Erfindung sei nun anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Es werden 80 g an luftgetrockneter nativer Kartoffelstärke mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 17 Gew.-% und 100 g eines 0,02 molaren Kaliumphosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,0 in einem doppelwandigen Trog eines aus rostfreiem Stahl aufgebauten Werner-Pfleiderer-Laboratoriumskneter eingebracht, der mit einer sigma-förmigen Knetvorrichtung ausgestattet ist. Unter kontinuierlichem Kneten werden die in den Kneter eingebrachten Materialien auf 96 °C erhitzt, indem man als Erhitzungsmittel siedendes Wasser in die Doppelwand des doppelwandigen Troges einbringt. Bei dieser Temperatur wird das Kneten während 1 Stunde fortgesetzt. Dann wird die Mischung in einem Zeitraum von etwa 30 Minuten auf 27 °C abgekühlt und anschliessend eine Lösung von 3,5 g eines Laktasepräparates in 16,5 g eines 0,02 molaren Kaliumphosphatpuffers eines pH-Wertes von 7,0 zugesetzt. Das Lak-tasepräparat wurde aus Saccharomyces lactis erhalten. Die gesamte Mischung wird bei Zimmertemperatur während 1 Stunde geknetet, und dann wird der Inhalt des Kneters in ein Glasgefäss gegeben, welches geschlossen ist, und man lagert während etwa 16 Stunden bei einer Temperatur von 4 °C.

Am nächsten Tag werden mit Hilfe eines Extruders aus rostfreiem Stahl, der mit einer Platte ausgestattet ist, welche Löcher von 1,0 mm Durchmesser aufweist, Stränge bei einer Temperatur von 20 °C extrudiert. Anschliessend werden die so extrudierten Stränge während 6 Stunden bei einer Temperatur von 25-28° C in einem Trockenofen getrocknet, bei dem die Luft zirkuliert, um ein Produkt mit einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 13 Gew.-% zu erhalten. Dann wird kurzzeitig unter Verwendung einer Schlagmühle gemahlen, und nach dem Sieben erhält man ein Granulat, das aus zylindrischen Teilen aufgebaut ist, welche einen Durchmesser von 0,9 mm und eine Länge von 0,4 bis 1,2 mm besitzen. Diese Granulate weisen eine leicht braune Färbung und einen schimmligen Geruch auf.

Beispiel 2

In der gleichen Weise wie dies in Beispiel 1 beschrieben wurde, stellte man eine Mischung aus 110 g an luftgetrocknetem Amylopektin, das einen Feuchtigkeitsgehalt von etwa 11 Gew.-% aufwies, und 110 g eines 0,02 molaren Kaliumphosphatpuffers her und knetete während 60 Minuten bei 85-90 °C. Nachdem man auf 30° abgekühlt hatte, wurde eine Lösung von 5,0 g eines luftgetrockneten Laktasepräparates in 25,0 g eines 0,02 molaren Phosphatpuffers eines pH-Wertes von 7,0 zugesetzt. Das Laktasepräparat wurde von Saccharomyces lactis erhalten und besass einen Feuchtigkeitsgehalt von etwa 11 Gew.-°/o. Dann wurde die Mischung während 1 Stunde bei 25 °C geknetet, und man Hess sie dann 16 Stunden lang bei 4 °C stehen.

Das Extrudieren, die Trocknung, das Zermahlen und das Sieben wurde in der gleichen Weise durchgeführt wie in Beispiel 1, und es wurde ein gleichartiges Granulat erhalten.

Beispiel 3

In der gleichen Weise wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist, wurden 97 g an luftgetrockneter Kartoffelstärke, die einen Feuchtigkeitsgehalt von 17,2 Gew.-% besass, und 78 g eines 0,02 molaren Phosphatpuffers eines pH-Wertes von 7,0 unter Erhitzen geknetet. Sobald eine Temperatur von 96 °C erreicht

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war, wurde der Knetvorgang während einer weiteren Stunde bei dieser Temperatur von 96 °C fortgesetzt. Dann kühlte man in einem Zeitraum von etwa 30 Minuten auf 28 °C und setzte dann eine Lösung von 4,0 g an luftgetrockneter Laktase in 25,0 g eines 0,02 molaren Kaliumphosphatpuffers eines pH-Wertes von 7 zu dem im Trog befindlichen Material zu. Die luftgetrocknete Laktase wurde von Saccharomyces lactis erhalten, und sie besass einen Feuchtigkeitsgehalt von etwa 8,5 Gew.-%. Dann wurde die Mischung während 1 Stunde bei 28-22 °C geknetet und anschliessend lagerte man sie in einem verschlossenenm Glasgefäss während 16 Stunden bei einer Temperatur von 4 °C.

Die Extrusion, das Trocknen, das Mahlen und das Sieben wurden in der gleichen Weise durchgeführt wie in Beispiel 1 und man erhielt dabei ähnliches Granulat wie in Beispiel 1.

Beispiel 4

Reinigung des nach dem Verfahren gemäss Beispiel 2 hergestellten Enzymkatalysators.

In einem geschlossenen Glasreaktionsgefäss, das mit einem Rührer ausgestattet ist, wurden 100 g der Enzymgranulate, die nach dem Verfahren gemäss Beispiel 2 hergestellt wurden, und 800 g eines 0,02 molaren Kaliumphosphatpuffers in doppelt destilliertem Wasser eines pH-Wertes von 7 bewegt, indem man während 7 Stunden langsam rührte. Dann wurde der Rührvorgang unterbrochen und das darüber stehende Material abgesaugt und anschliessend die beschriebene Behandlung zweimal unter Verwendung von frischen Anteilen an je 800 g der Waschflüssigkeit wiederholt. Die so erhaltenen Granulate waren mit dem gepufferten Wasser gesättigt, und sie sind direkt geeignet, um eine hydrolytische Spaltung von Laktose in wässrigen Systemen durchzuführen. In gequollendem Zustand und auch im trockenen Zustand ist dieses Material ein farbloses geschmackloses und geruchloses Produkt.

Es zeigte sich, dass in diesem trockenen Zustand, d.h. bei dem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 11-13%, das Produkt mindestens drei Monate lang unverändert bleibt, wenn es bei einer Temperatur von etwa 4° C gelagert wird. Während dieser Lagerungszeit bleibt die spezifische Aktivität identisch mit dem anfänglichen Wert des frisch hergestellten Präparates.

Beispiel 5

Hydrolyse von Laktose unter Verwendung der vorgewaschenen, gequollenen Enzymkatalysator-Granulate des Beispiels 4

Als Substrat wurde eine Lösung von chemisch reinem Laktosemonohydrat in 0,02 molarem Kaliumphosphatpuffer in doppelt destilliertem Wasser, der einen pH-Wert von 7,0 aufwies und der ausserdem 2,0 mMol an Magnesiumsulfat pro Liter enthielt, verwendet. Diese Substratlösung enthielt 5,28 g Laktose pro 100 ml Lösung, wobei der Laktosegehalt als wasserfreies Produkt berechnet wurde.

In einen Glasreaktionsbehälter mit Rührer gibt man die folgenden Materialien:

1800 g der Substratflüssigkeit 300 g der gequollenden Katalysatorgranulate

Die 300 g der gequollenden Katalysatorgranulate enthielten nur 100 g des luftgetrockneten Katalysatormateriales, in welchem 5,0 g an luftgetrocknetem Enzympräparat unbeweglich gemacht worden waren.

Die Laktosekonzentration nahm auf 4,75 g wasserfreie Laktose pro 100 ml durch die Zugabe des Katalysators ab. Während man kontinuierlich, aber massig rasch rührte, wird die Abnahme des Laktosegehaltes mit der verstreichenden Zeit bei 25 °C beobachtet, indem man eine automatische oxi-dometrische Analyse durchführt.

Eine Anzahl von Ergebnissen, die während einer Gesamtreaktionszeit von 60 Minuten festgestellt wurden, sind summarisch in der folgenden Tabelle A zusammengestellt.

Tabelle A

5 Hydrolyse von Laktose in Wasser, unter dem Einfluss von ß-Galactosidase, also Laktase, in einem Amylopektingel

Zeit die nach der Zugabe des Enzyms verstrichen ist

Umgewandelte Laktose in %, bezogen auf die ursprünglich anwesende Laktose

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Nach einer Hydrolysezeit von 1 Stunde wurde ein Laktosegehalt erreicht, der ausreichend tief ist dass eine Anwendung im Molkereibetrieb möglich ist. Die Katalysatormasse 2o wurde aus der Substratflüssigkeit entfernt, indem man abfiltrierte, und der Katalysator wurde 2mal mit je 100 ml Anteilen eines doppelt destillierten Wassers, das mit einer Kaliumphosphatlösung auf einen pH-Wert von 7 gepuffert war, gewaschen, und nachdem man das letzte Waschwasser 25 absaugte, wurde das unbeweglich gemachte Enzympräparat wieder mit 1800 g einer frischen Laktoselösung vermischt.

Dieses Arbeitsverfahren wurde 20mal wiederholt, und es zeigte sich, dass die Hydrolyseergebnisse der Tabelle A praktisch unverändert bleiben, selbst nach der zwanzigsten Wie-30 derholung dieses Vorganges.

Nachdem die zwanzigste Wiederholung der Hydrolyse von Laktose stattgefunden hatte, wurde der Katalysator gewaschen und getrocknet, bis ein konstantes Gewicht erreicht war. Ein Gewichtsverlust von 6%, bezogen auf das 35 anfängliche Gewicht des Katalysators, hatte stattgefunden, und zwar aufgrund eines mechanischen Abriebes und/oder einer geringfügigen Auflösung.

Beispiel 6

4o Wie dies in Beispiel 5 beschrieben ist, wurden Hydrolysetests durchgeführt, indem man die Enzymgranulate verwendete, die gemäss Beispiel 1 erhalten wurden. 2,0 g an luftgetrockneten Enzymgranulaten des Beispiels I pro 40 g einer 4,75prozentigen wässrigen Laktoselösung eines pH-Wertes 45 von 7 wurden verwendet, und die Temperatur wurde auf 25,0 °C gehalten.

Nach jedem Versuch wurde die Katalysastormasse abfiltriert, der Katalysator in der gleichen Art gewaschen wie in Beispiel 5 und dann für den nächsten Versuch erneut verwen-5o det. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle B zusammengestellt.

Tabelle B

Ausmass der Hydrolyse 55 Versuch % umgewandelte Laktose % umgewandelte Laktose Nr. nach 10 Minuten nach 30 Minuten

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Nach dem zehnten Versuch wurden die Enzymgranulate abgetrennt und wieder mit 40,0 g der 4,75prozentigen Laktoselösung zusammengebracht. Man liess diese gesamte Mischung 12 x 24 Stunden stehen. Nach dieser Zeit zeigte es sich, dass die Enzymgranulate die gleiche Aktivität hatten wie die Werte, die beim zehnten Versuch erzielt wurden.

Beispiel 7

Wie dies in Beispiel 5 beschrieben ist, wurden Hydrolysetests ausgeführt, indem man die gemäss Beispiel 3 hergestellten Enzymgranulate verwendete. 4,0 g der luftgetrockneten Enzymgranulate, die nach dem Verfahren gemäss Beispiel 3 erhalten wurden, suspendierte man unter mässig raschem Rühren in 80,0 g einer 4,75prozentigen Lösung von Laktose in 0,02 molarem Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,0.

Nach einer Behandlungszeit von 10,30 und 60 Minuten bei einer Temperatur von 25 °C wurde die Menge an umgewandelter Laktose mit Hilfe einer automatischen oxidometri-schen Analyse bestimmt. Das Ausmass der Umsetzung oder Hydrolyse wurde als Prozentsatz der umgewandelten Laktose ausgedrückt. Nach einer Berührungszeit von 1 Stunde wurde die Substratflüssigkeit durch Dekantieren von den Enzymgranulaten abgetrennt.

Dann wurden die Enzymgranulate zweimal während etwa 15 Minuten mit Anteilen von 70 g eines 0,02 molaren Kaliumphosphatpuffers eines pH-Wertes von 7,0 gewaschen, und dann suspendierte man das Granulat wieder in einer frischen Laktoselösung. Anschliessend wurden die gleichen Messungen nochmals ausgeführt.

Während 5 aufeinanderfolgenden Tagen wurde vier Messserien pro Tag ausgeführt. Die dabei erzielten Resultate sind in der folgenden Tabelle C zusammengestellt.

Tabelle C

Hydrolyse von Laktose in Wasser, unter dem Einfluss der in der Kartoffelstärke unbeweglich gemachten Laktase

Reaktionszeit Ausmass der Umwandlung in % der ursprünglich in Minuten anwesenden Laktose nach der n-ten Wiederholung des Versuches n = 0 n = 3 n = 6 n=10 n=15 n=19

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28,5

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26,0

25,5

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64,0

62,0

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74,0

83,0

86,0

82,0

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Nach der zwanzigsten Messung wurde der Katalysator mit dem Puffer gewaschen, bis ein konstantes Gewicht erhalten wurde, und durch Wägung wurde bestimmt, dass etwa 4,2% des ursprünglichen Gewichtes der Granulate aufgrund des Abriebes verlorengegangen waren.

Beispiel 8

Hydrolyse von Laktose in sterilisierter Magermilch bei 25 °C

Das Substrat war Milch, die bei hohen Temperaturen sterilisiert worden war aus Belgien mit der Markenbezeichnung «Lilac». Der Laktosegehalt dieser Milch betrug 4,8 g pro 100 ml.

Die Testvorrichtung und das Testverfahren sowie auch die angewandte Analyse waren vollständig identisch mit demjenigen, was in Beispiel 5 beschrieben ist. In diesem Beispiel wurde eine Reihe von wiederholten Messungen mit dem gleichen anfänglichen Enzympräparat ausgeführt. Insgesamt wurden 20 Hydrolysen durchgeführt. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle D zusammengefasst.

Tabelle D

Hydrolyse von Laktose in Magermilch bei 25 °C unter dem Einfluss von ß-Galactosidase, die in einem Amylopektingel okkludiert ist

Reaktionszeit Ausmass der Umwandlung der Laktose in % der in Minuten ursprünglich anwesenden Laktose nach der n-ten Wiederholung n = 0 n=l n=4 n = 8 n=12 n = 20

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16,3

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40,0

42,0

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56,0

56,8

56,0

53,0

49,0

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76,0

75,7

72,0

71,2

64,0

Beispiel 9

Herstellung einer unbeweglich gemachten Invertase

Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden eine Mischung aus 40,0 g an lufttrockenem Amylopektin mit einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 13 Gew.-% und aus etwa 50 ml eines 0,02 molaren Kaliumphosphatpuffers eines pH-Wertes von 5,2 während 1 Stunde bei 90 °C geknetet, und dann kühlte man auf etwa 40 °C ab. Anschliessend wurde eine Lösung von 0,8 g Invertase in etwa 9 ml Wasser zugegeben. Dann wurde weiter auf 52 °C gekühlt und die Mischung während 1 Stunde geknetet und dann in einem Kühlschrank bei etwa 5 °C während 16 Stunden gelagert.

Diese Mischung wurde in der gleichen Weise extrudiert, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist, mit Ausnahme dessen, dass jetzt zur Extrusion eine Platte verwendet wurde, die Löcher eines Durchmessers von 0,5 mm aufwies. Das extru-dierte Produkt wurde in einem Ofen unter Luftzirkulation getrocknet und dann gemahlen und gesiebt, wobei man eine Fraktion erhielt, welche die gewünschte Teilchengrösse von etwa 0,3 bis 0,6 mm aufwies.

Beispiel 10

Gemäss dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren wurde die Invertaseaktivität der unbeweglich gemachten Invertase, die nach dem Beispiel 9 hergestellt wurde, bestimmt. Die Menge an Glucose und Fructose, die gebildet wurde, wurde bestimmt, indem man eine automatische oxidometrische Anallyse durchführte. Die Bestimmung wurde mehrere Male wiederholt. Zwischen den Messungen wurden die Enzympräparate bei 5 °C in einem 0,02 molaren Kaliumphosphatpuffer bei einem pH-Wert von 5,2 gelagert. Eine Reihe von Tests wurde bei 25 °C und bei 40 °C durchgeführt. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle E zusammengestellt.

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30

35

40

45

50

55

60

65

7

653 704

Tabelle E

Inversion von Saccharose unter Verwendung des gemäss

Beispiel 9 hergestellten Enzympräparates und eines Substrates, welches 5,4 Gew.-% Saccharose in einem 0,02 molaren Phosphatpuffer eines pH-Wertes von 5,2 enthielt.

Das Gewichtsverhältnis von Enzympräparat zu Substrat betrug 1:80

Lagerungs- Ausmass der Umwandlung von Saccharose in % der zeit vor der ursprünglich anwesenden Saccharose Messung in Tagen

Umwandlung bei 25 °C Umwandlung bei 40 °C nach nach nach nach

10 Min. 30 Min. 10 Min. 20 Min.

50 mg des Enzymproduktes, das nach dem obigen Arbeitsschritt A) erhalten wurde, wurden während 15 Minuten mit 2,0 ml eines 0,7 molaren Kaliumphosphatpuffers eines pH-Wertes von 7,1 geschüttelt. Nach dem Dekantieren wurde 5 die klare Waschflüssigkeit abgegossen, und die Katalaseakti-vität in dieser Flüssigkeit wurde bestimmt, indem man die Waschflüssigkeit mit einer 0,04prozentigen Wasserstoffperoxidlösung bei 25 °C reagieren Hess und die Bildung des Sauerstoffes mit einer Sauerstoffelektrode bestimmte. Dieses Ver-io fahren wurde 15mal ausgeführt, indem man immer die gleiche Probe von 50 mg der unbeweglich gemachten Katalase verwendete. Nach 6 Waschvorgängen war ein Gesamtverlust von 35,3 Einheiten der Aktivität festzustellen, d.h. nur 0,7% der ursprünglich anwesenden Katalaseaktivität wurden verloren. Die Verluste nach dem sechsten Waschvorgang waren vernachlässigbar.

Vi

27,0

62,0

45,0

75,0

Vi

30,0

62,0

50,0

80,0

%

28,0

-

50,0

75,0

1

26,0

59,0

47,0

72,0

2

25,5

60,0

-

40

28,0

61,0

-

Aus diesen Tests sieht man, dass die unbeweglich gemachte Invertase ihre Aktivität beibehält, selbst nach verlängerter Verwendung, und dass sie auch bei einer höheren Temperatur, nämlich bei 40 °C verwendet werden kann.

Beispiel 11

A) Herstellung einer unbeweglich gemachten Katalase

In einem Laboratoriumsmodell eines Werner-Pfleiderer-Kneters wurden miteinander die folgenden Materialien zusammengebracht :

80 g an lufttrockenem Amylopektin 90 g eines 0,05 molaren Kaliumphosphatpuffers eines pH-Wertes von 5,6.

Die Materialien wurden .miteinander während 1 Stunde Anschliessend wurde auf 26 °C abgekühlt und zu der homogenen Masse wurden 30 g einer Lösung gegeben, die erhalten wurde indem man 2,5 g Katalse in 27,5 g einer 0,5 molaren Kaliumphosphatpufferlösung eines pH-Wertes von 5,6 auflöste oder dispergierte. Die verwendete Katalase war Sigma Ciò mit einer Aktivität von 3400 Sigmaeinheiten.

Nach dem Zugeben der Katalase knetete man 1 Stunde weiter. Nach dieser Zeit wurde das Präparat in einem geschlossenen Gefäss während 16 Stunden bei 5 °C gelagert, und dann extrudierte man zu Strängen mit einem Durchmesser von 0,5 mm. Das extrudierte Material wurde getrocknet und durch Mahlen zerkleinert, wobei man ein Granulat erhielt, das aus zylindrischen Teilchen aufgebaut war, die einen Durchmesser von 0,45 mm und eine Länge von 0,3 bis 0,6 mm besassen. Das luftgetrocknete Produkt enthielt etwa 100 Einheiten Katalaseaktivität pro mg.

B) Bestimmung des Verlustes an Aktivität durch Waschen

Die Bestimmung des Enzymverlustes erfolgte mit Hilfe der elektrochemischen Messung des Sauerstoffes, der durch die Reaktion der verwendeten Waschflüssigkeit mit einer 0,4prozentigen wässrigen Wasserstoffperoxidlösung freigesetzt wurde.

Beispiel 12

25 A) Herstellung von unbeweglich gemachter Katalase/Glu-cose-oxydase

In einem Laboratoriumsmodell eines Werner-Pfleiderer-Kneters wurden 79 g an lufttrockenem Amylopektin und 100 g einer 0,01 molaren Phosphatpufferlösung eines pH-3o Wertes von 5,6 zusammengebracht, und man knetete die Materialien 1 Stunde lang bie 90 °C.

Anschliessend wurde auf 3°C gekühlt, und man gab zu der homogenen Masse 21 g einer Lösung zu, die erhalten wurde, indem man mit 20 g eines 0,01 molaren Phosphatpuf-35 fers eines pH-Wertes von 5,6 0,100 g einer Glucoseoxydase und 1,00 g einer Katalselösung vermischte, bzw. darin löste. Die verwendete Glucoseoxydase war die Qualität I von Boeh-ringer, und sie besass eine Aktivität von 200 Einheiten pro mg. Die verwendete Katalaselösung war die Lösung 40 Nr. 10683 von Boehringer, die 260 000 Einheiten pro ml enthielt.

Unter kontinuierlichem Kühlen wurde die Mischung während 1 Stunde geknetet, wobei man eine Endtemperatur von 30 °C erreichte. Die erhaltene Mischung wurde während 16 45 Stunden bei 6 °C gelagert. Dann wurde das erhaltene Gel extrudiert, wobei sich Stränge bildeten, die einen Durchmesser von 0,5 mm besasssen. Diese extrudierten Stränge wurden unter Verwendung eines Luftstromes von 30 °C getrocknet und schliesslich gemahlen, wobei man Körner erhielt, die 50 eine Länge von etwa 0,5 mm besassen.

B) Waschverfahren sowie Bestimmung des Verlustes an Enzym durch Bestimmung der Aktivität des Waschwassers und homogene Katalyse 55 4,0 g des lufttrockenen Produktes, das einen Feuchtigkeitsgehalt von etwa 10 Gew.-% aufwies, und das nach dem obigen Arbeitsverfahren A) hergestellt wurde, und das ferner einen Glucoseoxydase-Gehalt von etwa 0,125 Gew.-% besass, wurden während verschiedenen Zeiten mit Anteilen von 30 g 60 eines etwa 0,005 molaren Phosphatpuffers eines pH-Wertes von 5,6 geschüttelt. Nach dem Dekantieren wurde der Rückstand zweimal mit Portionen von 25 ml einer frischen Pufferlösung gewaschen, und alle Waschflüssigkeiten wurden miteinander vereinigt, und die gesamte Glucoseoxydase-Aktivi-65 tät der Waschflüssigkeiten wurde bestimmt. Dieses Waschverfahren wurde mit dem gleichen Material wiederholt, und die dabei erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle F zusammengestellt.

653 704

Tabelle F Verlust an Enzym durch Waschen

Waschvorgang

Zeit

Temperatur

Verlust*** an Enzym

Nr.

in Stunden in °C

in mg

1*

0,75

22

0,08

2*

3

22

0,06

3**

16

6

0,05

4*

4

22

0,02

5**

40

6

0,02

6*

6

22

0,02

7**

90

6

0,02

* Bei diesen Waschvorgängen wurde mit der Pufferlösung gerührt.

** Bei diesen Waschvorgängen Hess man in der Pufferlösung bei 6 °C stehen.

*** Der Verlust an Enzym in mg wurde aus der Bestimmung der Aktivität in der Waschflüssigkeit berechnet.

Man sieht aus den angegebenen Werten, dass der Gesamtverlust an Enzym weniger als 0,27 mg oder 5,4% der Gesamtmenge ist.

C) Anwendung der unbeweglich gemachten Enzyme zur Entfernung von Sauerstoff aus einer 0,5prozentigen Glucoselö-sung

Methode der Analyse

0,200 g der unbeweglich gemachten Enzyme wurden, wie unter B) erläutert, gewaschen und dann in ein Glasreaktions-gefäss eines Rauminhaltes von 32 ml gegeben, das in einem Thermostaten bei 25,0 °C belassen wurde. Dieses Glasreak-tionsgefäss war mit einem magnetischen Rührer, einer «Clark»-Sauerstoffelektrode und einer Glaskapillare zur Gaszuführung ausgestattet. In das Gefäss wurde ein wässriger 0,02 molarer Natriumacetatpuffer eines pH-Wertes von 4,59 eingefüllt, bis ein Gesamtvolumen von 32 ml erreicht war.

Dann wurde Luft mit Atmosphärendruck durch die Kapillare geleitet, und es wurde die Sauerstoffaufnahme mit Hilfe eines biologischen Sauerstoffmonitors aufgezeichnet, der mit einem Schreiber versehen war und mit der «Clark»-Elektrode verbunden war. Der verwendete biologische Sauerstoffmonitor war das Gerät Y.S.I. «Biological Oxygen Monitor» der Firma Yellow Springs Instrument Co., Inc. Sobald die Sättigungskonzentration erreicht war, wurde das Instrument auf 100% Sättigung eingestellt, und dann wurde Stickstoff unter athmosphärischem Druck durchgeleitet, bis der Sättigungswert auf 50% gefallen war. Zu diesem Zeitpunkt beträgt die Menge an gelöstem Sauerstoff etwa 0,14 mMol pro Liter, oder etwa 4,4 mg pro Liter.

Dann wurden 0,5 ml einer wässrigen, sauerstofffreien Glucoselösung mit einem Glucosegehalt von 32% in das Gefäss durch die Kapillare injiziert, wobei gleichzeitig 0,5 ml der Pufferlösung ausgepresst wurden, und zwar liefen sie durch die Kapillare ab. Die Sauerstoffabnahme, die sofort begann, wurde wieder gegen die verstrichene Zeit aufgetragen, wobei man hierzu den angeschlossenen Schreiber verwendete. Sobald die Gesamtmenge des Sauerstoffes aufgebracht worden war, wurde die Glucoselösung von dem Reak-tionsgefäss abdekantiert, das Enzympräparat wurde 4mal mit Anteilen von 15 ml einer frischen, glucosefreien Pufferlösung gewaschen, und der Test wurde wiederholt.

Dieses Arbeitsverfahren wurde insgesamt 5mal wiederholt. Nach 15 Minuten zeigte es sich, dass etwa 20% der Sättigungskonzentration des Sauerstoffes anwesend waren, während nach 30 Minuten die Lösung praktisch sauerstofffrei war. Am Enzympräparat konnte keine Abnahme der Aktivität festgestellt werden.

Beispiel 13

Entfernung von Sauerstoff aus Bier

Nach dem Verfahren, das in Beispiel 3 C) beschrieben ist, wurden 32 ml Bier, dessen Sauerstoffgehalt auf 6,5 mg pro Liter eingestellt worden war, mit 200 mg desjenigen Enzymproduktes behandelt, das nach dem Beispiel 12 A) erhalten wurde. Das verwendete Bier war das Markenprodukt «Heinecken Oud Bruin».

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle G zusammengestellt.

Tabelle G

Sauerstoffgehalt eines Bieres nach der Behandlung mit unbeweglich gemachter Glucose-oxydase + Katalase bei

25 °C

Behandlungszeit mg Oi/1

Behandlungszeit mg 0:/l in Minuten

in Minuten

3

5,85

18

1,43

6

5,01

21

0,91

9

3,97

24

0,49

12

2,99

27

0,20

15

2,15

30

0,10

Wie man aus der Tabelle G sieht, war nach 24 Minuten eine Sauerstoffkonzentration erreicht, die für Bier annehmbar ist, während bereits nach 30 Minuten ein praktisch sauerstofffreies Bier, nämlich ein Bier mit einem Sauerstoffgehalt von weniger als 0,1 mg/1 erreicht ist.

Beispiel 14

Herstellung von Gluconsäure aus Glucose

In diesem Beispiel wird die Wirkung von 400 mg der unbeweglich gemachten Enzyme, die nach dem Verfahren gemäss Beispiel 12 A) erhalten wurden, auf eine wässrige Lösung von 0,9% Glucose, die mit 0,005 molarem Kaliumphosphat auf einen pH-Wert von 5,6 gepuffert ist, untersucht. Die Untersuchung erfolgte, während man kontinuierlich Sauerstoff unter Atmosphärendruck durchleitete. Die Bildung der Gluconsäure wurde durch den Verbrauch einer 0,1 normalen Natriumhydroxydlösung festgestellt, und dieser Verbrauch wurde mit einem Schreiber einer automatisch dosierenden Titrationsvorrichtung registriert, während durch diese Titration der pH-Wert konstant gehalten wurde.

Es zeigte sich, dass pro Stunde etwa 4% der ursprünglich anwesenden Glucose in eine äquivalente Menge an Gluconsäure umgewandelt werden.

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Claims

653 704

1. Unbeweglich gemachtes Enzym, dadurch gekennzeichnet, dass es geformte Strukturen eines trockenen Stärkegels umfasst, welches ein oder mehrere zellfreie Enzyme ein-schliesst.

2. Unbeweglich gemachtes Enzym nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es in Form von Körnern vorliegt.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Unbeweglich gemachtes Enzym nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es einen maximalen Enzymgehalt von 15 Gew.-% aufweist.

4. Unbeweglich gemachtes Enzym nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Laktase, Invertase, Katalase, Glucose-oxydase oder Katalase und Glucose-oxydase ist.

5. Unbeweglich gemachtes Enzym nach einem der Patentansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke Kartoffelstärke, Amylopektin und/oder Getreidestärke, insbesondere Maisstärke ist.

6. Unbeweglich gemachtes Enzym nach einem der Patentansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Stärke Amylopektin ist.

7. Verfahren zur Herstellung eines unbeweglich gemachten Enzyms gemäss Patentanspruch 1, bei dem man ein oder mehrere Enzyme in einem Stärkegel aufnimmt, dadurch gekennzeichnet, dass man ein mindestens teilweise geliertes Stärkesol mit einem Stärkegehalt von 20-60 Gew.-% mit dem Enzym oder mehreren Enzymen vermischt, die Mischung gelieren lässt und das Gel in die Form von getrockneten, geformten Strukturen bringt.

8. Verfahren nach Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass man die gelierte Mischung in die Form von getrockneten, geformten Strukturen bringt, indem man die Mischung zu Strängen extrudiert, die Stränge trocknet und die getrockneten Stränge in Stücke zerkleinert.

9. Verfahren nach Patentanspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Laktase, Invertase, Katalase, Glucose-oxydase oder Katalase und Glucose-oxydase ist.

10. Verfahren nach einem der Patenansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass man als Stärke Kartoffelstärke, Amylopektin, Getreidestärke, insbesondere Maisstärke, oder eine Mischung aus zwei oder mehreren derartigen Stärken verwendet.

11. Verfahren nach Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man als Stärke Amylopektin verwendet.

12. Verfahren nach einem der Patentansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass man die erhaltenen, getrockneten, geformten Strukturen zwecks Reinigung mit Wasser oder einer Salzlösung extrahiert.

13. Verfahren nach Patentanspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Salzlösung eine gepufferte Lösung ist.

14. Verfahren nach Patenanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die gepufferte Lösung eine 0,02 molare Kali-umphosphatpufferlösung ist.

15. Verfahren nach einem der Patentansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass man unbeweglich gemachte Laktase reinigt, indem man eine Extraktion mit einem 0,02 molaren Kaliumphosphatpuffer eines pH-Wertes von 7,0 durchführt.

16. Verwendung des unbeweglich gemachten Enzyms gemäss Patentanspruch 1 zur Durchführung einer enzymati-schen Reaktion.