DE2615349A1 - Verfahren zur chemischen modifikation von eiweisstoffen durch umsetzen mit chinonen - Google Patents

Description

betreffend

Verfahren zur chemischen Modifikation von Eiweißstoffen durch Umsetzen mit Chiuonen

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur chemischen Modifikation von Eiweißstoffen durch Umsetzen mit Chinonen.

Die Umsetzung kann stattfinden mit einem Chinon allein oder mit oiuem an eine Substanz mit hohem Molekulargewicht gebundenen Chinon, wobei man im letzteren Pail Proteine erhält, die an wasserlösliche oder in Wasser unlösliche hochmolekulare Polymere gebunden sind.

Die auf diese Weise modifizierten Eiweißstoffe sind aufgrund ihrer Punktionen auf verschiedenen Gebieten anwendbar. S.ind beispielsweise die Eiweißstoffe Enzyme, d.h. biologische Katalysatoren, so können sie, wenn sie an in V/asser unlösliche Matrizen gebunden sind, als heterogene Katalysatoren auf dem präparativen, analytischen und biomedizinischcn G-ebiet verwendet v/erden.

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AIs heterogene Katalysatoren lassen sie sich leicht aus Reaktionsgemischen, denen sie zugesetzt wurden, wieder abtrennen, besonders da sie, wie gefunden wurde, eine beträchtliche Stabilität aufweisen, so uai3 sie auch wieuerholt verwendet v/erden können.

Auch diejenigen Enzyme, aeren Isolierung und Reinigung sehr umständlich und verlustreich ist, können , wenn sie erst einmal modifiziert worden sind, wiederholt verwenuet werden, was beträchtliche wirtschaftliche Vorteile bietet.

Hit Hilfe des erf indungsgemäiBen Verfahrens können die Enzyme aber auch an wasserlösliche Polymere gebunden werden, wodurch ihre Stabilität gegen zu einer Denaturierung führende Mittel beträchtlich verbessert wird, so daß man sie auch unter l'estbedingungen verwenden kann, die drastischer sind als die gewöhnlich angewanuten.

• Auch bei den an lösliche Polymere gebundenen Enzymen ist aas Molekulargewicht gegenüber demjenigen der nativen Enzyme erhöht, so daß sie in Systemen verv/endet v/erden können, die durch Ultrafilter-Membranon, uurch welche nur die Reaktionsprodukte hindurch—gehen, getrenut werden.

Sind die Eiweißstoffe Antigene, so können diese, nachdem sie an wasserunlösliche Matrizen gebunden sind, in dieser Porn verv/endet v/erden, um mit selektiver Wirkung den entsprechenden in einem komplexen Gemisch anwesenden Antikörper abzutrennen.

Sind die Eiweißstoffe Enzym-Inhibitoren, so können sie, wenn sie an eine unlösliche Matrix gebunden sind, zur selektiven Gewinnung der von ihnen inhibierten Enzyme verwendet werden.

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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren finuet die Umsetzung zwischen den} Protein und der Chinonverbindung, die von "beliebigem Typ, auch vollständig substituiert»_sein kanu, "bei einer Temperatur statt, bei der die Stabilität des betreffenucn Proteins gewährleistet ist; man arbeitet vorzugsweise bei niedrigen Temperaturen (zwischen 0 unu 2L>⁰C) und wählt die Umsetzungstemperatur so, daß man sicher ist, daß die Reaktion mit entsprechender Geschwindigkeit und möglichst guter Ausbeute verläuft. Auch der pH-viert für die Anlagerungsreaktion, die vorzugsweise im wässrigen Medium stattfindet, richtet sich nach dem Protein, wobei allerdings die bevorzugten werte in der Gegend von 7,5 liegen. Die Reaktionsbedingungen werden jedenfalls so gewählt, daß das Protein nicht denaturiert wird, so daß man nach Durchführen der Umsetzung das nichtumgesetzte Protein wieder gewinnen kann. In einigen wenigen Fällen können auch Proteine verwendet werden, die nicht völlig rein sind.

Wenn das Protein an eine hochmolekulare Substanz gebunden ist, so ist es in erster Linie die letztere, die rait dem Chinon behandelt wird.

Die Reaktion zwischen der Matrix unu dem Chinon wird durchgeführt bei Temperaturen zwischen 0 und etwa IuO⁰C, vorzugsweise ungefähr bei 20⁰C.

Die Inkubationszeit schwankt je nach dom Hatrixtyp und liegt gewöhnlich zwischen einer halben Stunde und 100 Stunden und der pH-Wert des Reaktionsgemisches kann zwischen 1 und 11 liegen, sollte jedoch vorzugsv/eisc in der Gegend von 7>5 gehalten werden.

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D-ie zu aktivierende Matrix kann reaktionsfähige Gruppen der verschiedensten Art enthalten, z.B. Hydroxyl-, Amino-, Sulfhydryl-, Iraiuazol-, Pyrrol-, Phenol- ouer G-uanidingruppen oder andere. Die Reaktion kann sowohl im wässrigen wie im nichtwässrigen Medium durchgeführt werden je nach der Art des verwendeten Chinons und ues Polymers. V/cnn dann die Matrix aktiviert v/orden ist, führt man uie Umsetzung mit dem Protein, wie oben beschrieben, durch.

Die Chinone können, wie gefunuen wurden, auch zur gegenseitigen Vernetzung von Proteinmolekülen führen oder auch zur Bildung von intramolekularen Vernetzungen, die dann eine Stabilisierung des Proteins hinsichtlich seines Aufbaus zur Polge haben.

Der Vernetzungagrad kann dabei so eingestellt werden, daß man Proteinderivate mit höherem Molekulargev/icht als das Ausgangspro.tein erhält, die entweder immer noch wasserlöslich sind oder aber so weit vernetzt sind, daß sie ihre »fasserlöslichkeit eingebüßt haben.

Die Beispiele erläutern das erfinuungsgemäße Verfahren näher.

Beispiel 1 Immobilisierung von trypsin auf 4B-AH-Se?harose mit 1,4-Benzochinon

1 g 4B-AII-Sepharose (Hersteller Pharmacia Pine Chemicals AR-S-75104, Uppsala 1, Schweden) wird aufgeschlämmt in 20 ml einer wässrigen Ilatriumchloridlösung (0,5M) und über !facht stehen gelassen, Dann wird die Aufschlämmung in eine Kolonne (0,9 x 15 cm) eingebracht und mit 100 ml der obigen Kochsalzlösung und zum Schluß mit 50 til eitios 0,OyIi JTatriumphosphat-Puffers vom pH 7,4 gewaschen.

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Sämtliche !Feststoffe (4 ml) werden in 25 ml des Puffers aufgeschlämmt, -worauf 2 ml einer wässrigen Lösung von 1,4-Benzochinon (0,111), die frisch bereitet ist, zugesetzt werden. Hau rührt in einem vom Licht abgeschirmten Gofäio 24 Stunden lang bei Raumtemperatur und füllt die Aufschlämmung dann in eine Kolonne (0,9 x 1p cm), v/o die Feststoffe mit 100 ml frischer pufferlösung ausgewaschen werden. Haη erhält so einen aktiven Träger aus Feststoffeu von dunkelbrauner Färbung. Der Träger wird nun in 2i3 ml kalter pufferlösung auf geschlämmt und mit 5 ml kritallinem Trypsin (Hersteller British Drug Houses Ltd. Laboratory Chemicals Division, Poole, Englana) in kaltem Wasser (10 Milligramm je ml).versetzt.

Han läßt das Gänse 24 Stunden bei 2⁰O stehen una führt es dann wieder in eine Kolonne (0,9 x 1b cm) ein, v/o aie Feststoffe wieder ausgewaschen werden; hierzu verwendet raan für ein Gesamtvolumen von 150 ml Fraktionen von je 15 ml Phosphatpuffer (0,05M) bei einem pH-Wert von 7,4 und einem pH-Wert von 4,4. Auf diese Weise erhält mau ein Trypsin auf 4l3-AII~Sepharose als Träger, das eine Esteraseaktivität von '}^lj Einheiten je ml Träger entwickelt (die Esteraaeaktivität wurde bestimmt mit ii-oC-Benzoylargininäthylester^J3AJ3E_7 als Substrat bei 25° und einem pH-',;ert von 8,0 gemäß dem Verfahren von L.Goldstein, Methods in Enzymology, Bd. 19, S. 955-962 (1970). Eine Enzymeinheit bedeutet dabei die Menge an Enzym, die unter den obigen Bedingungen ein Hikromol Substrat je Minute hydrolisiert).

Die wie oben bereitete Probe von immobilisiertem Trypsin wurde. 3 Monate bei 4⁰C in 1m wässriger iiatriumchloridlösung und 0,5m Mononatriumphosphat (pH = 4,4 ) gelagert, wobei gelegentlich die überstehende Lösung erneuert wurde; nach Ablauf der 5 monatigen Lagerzeit zeigte sich, daß die Esteraseaktivität noch voll erhalten war.

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Eine Probe von 4B-AH-3epharose, die nicht mit dem Chinon "behandelt worden war und während der gleichen Zeit mit der gleichen I-Ienge an Trypsin in Berührung gestanden hatte, zeigte nach dem · Auswaschen keinerlei Enzymaktivität mehr, was bedeutet, daß keine physikalische Absorption von Enzym am träger stattgefunden hatte.

Beispiel 2

Immobilisierung von 'Trypsin auf 4B-Sepharose mit 1,4-Benzochinon

Eine Probe von 4 ml 43-Sepharose (Hersteller Fine Chemicals AB) wird gemäß Beispiel 1 gewaschen, in 25 ml 0,05m ITa tr iumphosphatpuixer bei einem pH von 7,4 aufgeschlämmt und mit 2 ml frisch hergestellter wässriger Lösung von 0,1m 1,4~Benzochinon versetzt. Das Geraisch v/ird im abgedunkelten Gefäß bei Raumtemperatur 20 Stunden lang gerührt, worauf der erhaltene dunkelbraune !Feststoff analog Beispiel 1 gewaschen, mit trypsin umgesetzt und dann wieder gewaschen wird. Man erhält zum Schluß eine trypsinhaltige 4B-Sepharose, die eine Esteraseaktivität von 26 Einheiten je ml Träger entwickelt.

ITach dreimonatiger Aufbewahrung analog Beispiel 1 beträgt die Esteraseaktivität immer noch 6

Zum Vergleich wurde auch in diesem Fall ein Träger benutzt, der nicht mit Ohinon behandelt worden war, jedoch mit der gleichen I-Ienge Enzym verbunden und dann ausgewaschen worden war; er entwickelte nach der Lagerung keine Ensymaktivität mehr.

Beispiel 3

Immobilisierung von Trypsin auf 4B-3epharose mit 1,4-Benzochinon

Gemäß Beispiel 1 wurde eine Probe von 4 tal 4B-Sepharose in

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25 ml 0,05m ITatriumphosphatpuff er bei einem pH von 10 aufgeschlämmt und mit 10 ml einer frisch bereiteten 0,1m Lösung von 1 ,'4 -Benzochinon in Wasser versetzt.

Each Stehen-lassen des Gemisches über ITacht im verdunkelten Gefäß wurde der aktiviörte Peststoff dann in eine Kolonne (0,9 χ 15c· überführt und mit 200 ml 0,05m ITatriumphosphatpuffer bei einem pH von 7,4 ausgewaschen, worauf er gemäß !Beispiel 1 mit Enzym umgesetzt und gewaschen wurde. Das so erhaltene feste Produkt entwickelt eine Esteraseaktivität von 65 Einheiten je ml.

Beispiel 4

Immobilisierung von 'i'rypsin auf p-Aminobcnsylcellulose mit 1,4-Benzochinon

2g Paraamino-Benzylcellulose (0,11 mäq. je g) (Hersteller British Drug-Houses Ltd. - Laboratory Chemicals Division) werden in Wasser aufgeschlämmt und in eine Kolonne (0,9 χ 15 cm) eingeführt, wo sie '5 Waschzyklen unterworfen werden, bei denen jedesmal 50 ml 0,1 η IICl in Wasser, 20 ml II_o0, 50 ml 0,1 η ITaOH in Wasser und 20 ml HpO verwendet werden. Zum öchlui3 werden sie noch mit 200 ml 0,05m ITatriumphosphatpuffer (pH = 7,4) ausgewaschen und in zwei gleiche Portionen aufgeteilt.

Die eine Portion wird in 25 ml des Puffers aufgeschlämmt, mit 4 ml frisch bereiteter 0,1m wässriger Lösung von 1,4-Benzochinon versetzt und unter Rühren zwei Sage lang bei Raumtemperatur steheugelassen. Die so erhaltenen braunen Peststoffe v/erden in eine Kolonne (0,9 x 15 cm) mit 150 ml des gleichen Puffers gewaschen unu dann in 25 ml des Puffers in der Kälte aufgeschlämmt und mit 5 ml einer lcalten Lösung von !Trypsin (10 mg je ml) versetzt. Das Gemisuh wird dann zwei weitere Sage

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bei 4⁰O gerührt. ,Schließlich wird der ]?eGtstoff wieder mit dem oben verwendeten Puffer ausgewaschen bis die v.^raschwässer Icein spektrometrisch (bei 2JO nm)uachweisbares Protein mehr enthalten. Das so hergestellte Produkt entwickelt eine Tryptinesterase-Akti vität von 55 Einheiten je Gr aera.

Der ant'.ere Teil p-Arainobeuiiylcellulose, der ebenfalls ausgewaschen, jedoch ui<.:ht ta it Uhinou behandelt worden war, entwickelte uab.h Ue ha α dl Ling oit dem Eu Ky α und Auswaschen wie oben keinerlei U η a yuia 1: t iν i t lit.

Beispiel 5

Immobilisierung von Penicilliii-Acylase auf 4-13-LSeοharöse mit 1 ,^-b'

Eine Probe von 4 ml 4I3-3epharoae, die gemäß Beispiel 1 ausgewaschen und dann mit 100 ml 0,05m Hatriumphosphatpuffer bei' einem pH von ü,0 behandelt worden war, wird in 16 ml ruffer auf ge schlämmt und mit 5 ml frisch bereiteter 0,1 m wässriger Lösung von 1,4-Bensochinon versetzt. Das Gemisch wird 13 Stunden im abgedunkelten Gefäß gerührt. Die so erhaltenen dunklen Feststoffe v/erden in einer Kolonne (0,9 x 15 cm) mit 100 ml des obigen Puffers ausgewaschen, dann in 6 ml Pufferlösung aufgeschäumt und mit 25 ml einer Lösung von Penicillin-Acylase von Escherichia CoIi AiCOG 9657 im gleichen puffer ausgewaschen. (Das Enzym war hergestellt v/orden gemäß Marconi et al, Journal of Antibiotics Vol. 26, S.228 0975J} · Das Gemisch wird einige Zeit bei Raumtemperatur gerührt uud dann in eine Koloune (0,9 χ 15 cm) überführt, wo die Feststoffe bei pH o,0 abwechselnd mit je 15 ml O,05a und 1,0m Puffer ausgewaschen werden. Das Gesamtvolumen an Waschflüssigkeit beträgt 150-ml, von denen die ersten 50 ml nur Proteine enthalten, die spektrophotometriüch bei 280nra nachgewiesen werden können. Man erhält auf diese ,[eise dunkle Peststoffe, die ein Enzym enthalten, welches eine Aktivität von 125 Einheiten je ml entwickelt.

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Die mil; den 1'es "υ st off en umgesetzten 25 ml Enzymlüsung enthielten 1400 Enzymeinhoiten mit einer spezifischen Aktivität von 21,1 Einheiten je Hillifjraniui, während Cig Mutterlauge aus eiern Reaktionsgemiüuh und die waschflüssigkeiton ausaraiaen 90ri Enzyme i nhe ite u enthi el ten.

Praktisch erhält man das gesamte zur UmGotzung gebrachte Enzym zurück; außerdem entwickelt aac iauiobilioierte Enzym die gleiche Aktivität als wenn es in Lösung ist.

Eine Probe von 4B-oepharose, die nicht mit den Chinon, jedoch mit dem Enzym auf gleiche Jeise wie oben behandelt worden war, zeigt keinerlei Euzymaktivität, was bedeuüet, daß unter den obigen Bedingungen keinerlei Enzymabsor_v>cion auf dem Träger stattgefunden hatte.

(Die Enzymaktivität wurde mit Penicillin G- als Substrat bei 27⁰O und einem pH vou 3,0 bestimmt, getnäiö der Methode von Marconi et al, Journal of Antibiotics, Vol. 26, 3. 223, 197^). Eine Enzymeinheit ist die Menge au Enzym, nie unter den Versuchsbedingungen ein Micromol Penicillin Gf je Minute hydrousiert. Die mehrfach wiederholte Verwendung des gleichen immobilisierten Enzyms innerhalb eines Monats führte nur zu vernachlässigbaren Aktivitätsverlusten.

Beispiel 6 Immobilisierung von Penicillin-Acylase auf 413-oepharose mit

1,4-Benzochinon

Eine Probe von 4 ml 4B-Sepharose wird analog den vorangehenden Beispielen gewaschen und mit 1,4-Benzochinon aktiviert. Das Produkt wird dann mit 1530 Einheiten Penicillin-Acylase von Escherichia coli, die eine spezifische Aktivität von 2,7 Einheiten je mg hat, umgesetzt.

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Die Urasetzungazeit beträgt 15 Standen, während die anderen Arbeitsgänge und das Auswaschen dem vorangehenden Beispiel entsprochen.

Aus uen Hutterlaubeη und V/aschf lüssigkeiten werden 1300 Einheiten Enzymaktivität wiedergewonnen und die feststoffe entwickeln eine Enzymaktivität von 67,5 Einheiten je ml.

Zu bemerken ist₇ dass in dieceu Fall das Verfahren auch dann befriedigende Resultate ergibt, wenn ein nicht allzu reines Enzym verwendet wird. Die wiederholte Verwendung des immobilisierten Enzyms innerhalb eines Monats führte auch in diesem Fall nur zu vernachlässigbaren iüctivitätsverlusten.

Beispiel 7

Immobilisierung von Penicillin-Acylase auf 4-B-AH-Sepharöse mit 1 ,2 -liapht ο c h i η ο η.

1 g 4B-AH Liepharöse wurde gemäß Beispiel 1 mit 0,5m wässriger HGl gewaschen unu daraufhin nochmals mit 100 ml 0,05m Natriuraphophatpuffer (pH o,0) ausgewaschen und in 25 al d'ieses Puffers aufgeschlämmt, worauf 25 ml Dioxan mit einem G-ehalt an 0,5 Millimol 1,2-iTaphthochinon zugesetzt wurden. Nach 18 stündigem Stehen in verdunkeltem G-efäß bei llaumtemxjeratur wird das G-emisch filtriert und die Feststoffe mit 50 ml einer Lösung ausgewaschen, die erhalten wurde durch Vermischen von e inera ⁰FlYo⁰S³^lIa t puff er (0,05m, pH 8,0) mit einem Volumen Dioxan. SchliejSlich werden die Feststoffe in einer Kolonne wie oben mit 100 ml Puffer ausgewaschen.

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Eine Enzymeinheit bedeutet auch hier die Enzjnnmenge, die ein MicromolSubstrat je Minute umwanuelt.

Beispiel 9

Immobilisierung eines Anti-'i',-Antikörpers auf 4B-Sepharose mit 1 ,"4 Benzochinon

Eine Probe von 4 ml 4B~Sepharose wird go ei LLiO Beispiel 5 aktiviert mit 0,5 liillimol 1 ,4-Benzoohiuon und dann mit Anti-T_v-Antiserum (5,3 '-Trijodtyronin) von Kaninchen umgesetzt. Das Reaktiönsgemisch enthält 4 ml aktivierte 4B~oepharose, 20 ml Antiserum, 0,2m Kaliumphosphatpui'fer 0,1m KGl und hat einen pl-I-i/iert von 7,4 und ein G-esaratvolumen von '50 ral. Mau hält das Gemisch unter geu.nu.em Rühren über ITacht bei 4⁰O und wäscht dann die abfiltrierten Feststoffe mit 200 ml 0,02ia Kaliumphosphatpuffer und 0,ODm Trishydroxyraethylaminomethan-Hydrochlorid--(Tris-HCl)-Puffer bei pH 7,4 aus, worauf mau sie noch 24 Stunden bei 4° in der Pufferlösung hält.

Zum Vergleich führt man die gleichen Arbeitsgänge an einer probe durch, die jedoch nicht mit dem Antiserum behandelt ist. An den beideu so vorbereiteten Peststoffträgern wird die Aufnahme von !--Hormon wie folgt festgestellt: 0,6 ml Träger (entspricht etwa 20 mg trockenem Produkt) werden ins Gleichgewicht gebracht mit '-j^l5 lianograram T-, das mit J^._;._:- markiert ist; die Gesamtmenge beträgt dabei 1,5 ml und darj Gemisch enthält noch 0,2m Phosphatpuffer und 0,1m iLül bui einem pH von 7,4; es wird eine Stunue bei 57⁰C und über Hacht bei 4⁰C gehalten. Dann wird ah den abzentrifugierten Feststoffen die aufgenommene Radioaktivität gemessen.

ö^v

Die mit dem Antiserutn behaudelten IreütGtoffe haben ^lj8'/o_ der insgesamt eingebrachten Radioaktivität aufgenommen, während das unbeheindolte Yergleichsmaterial nur 11>ό aufuiimat.

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— 1 ' —

Beispiel 10

lMuiouiliGio^uti;; ,α;.'] L'-'y .-niuiuhiji"l;o:.Tj aus ,Joyabohnen au.J 4B-o.'jG alt Ί ,'■i-~JjGui;o:juinou

Lino ,.roue: you 4 uJ. 45-.iü_;/uaro."c- ^τ,7ίι\<. f;οu.''.«/ Beispiel 5 gewasoheu ait 0,j I-iillinol 1 ,4-13οη£θοίιΐ"αοιι aktiviert und dann innerhalb 1ü ouinuen mil; ,·.:> El ü,02u jiatriumpkosphatpuffer (pH o,0) uud 60 της; 'Trypaiu-Inhibitor aus Joyabohnen (Boehringer ilatmheira) ua^Grjotat. Zs vrird dann iiociimalG niiu 0,1 ta ICCl-Puffer und 0,ü2ni iiatrinuphoüpiiat (pil ο,ϋ) tiaoh^ewaaoliou "bis die iiaschflücsigkeit l:ein jrouein ω ohr euthlllt. Die ilutt erlauf en und die v/acohflüssi^keit ouühalven sucanaen 46 rag rüc^atlLadißes Protein. Der Träger v/iru uau;i uocli Mit ÜOO ul oineo Puffers (pH 2,0) ausr,ev/asclioii_f aor 0,0^u Tria-ilül, 0,1ra ,1Cl und Ο,Οίίω GaOl enthält, worauf uau ihn 24 utun^en bei 4 0 in u-cj Puff erlüsunc stehen

. Die go Torüereitete 4nil-irobc beGitst die Fuliigiieit, 13,3 mg kristalliues [Cry-, ,y in ^n binden, v/ob ei die v/irliüauilceit 6'y/a höher ist ale beia nicht irnaobiliüicrtotn Inhibitor (beatitnat nach der Hethode von L.J. jiOeffler und I.V. pierce in 'piociiinica et Biophysica Aota,'"Ld. 317, .'J. 20, 1^cj73).

Beispiel 11 Stabilisierung von x'r.yprjiu arit 1 ,4-Penzochi'aon

50 i-liligrataiij kriRtalliuoc 'Jrypsiu (ileratoller British Drug Houses) v/erdeu ^;olör;t in -jO ml 0,03a ITatriumphoDi-tiatpuffer (pH 7,3) und versetzt mit 0,02 nl einer 0,1a v/'isarisen Lösung von

Ι,ψ-ΒΘηζοοΙιίηοιΊ. Jas Gemisch v/ird Z otunien bni jla um te πι ρ era tür und anschlieiöond 20 .'Jtunden box 4°C gerührt. Zum Schlufj v/ird das Reaktiouscemisch in der .".CiItG ;;c;_;on ./aoccr aialysiert, das mit verdünnter Chlorv/ai3so.-:rj boff s^v.ure auf ein pH von y,0 /;ebi'acht wurde.

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BAD ORIGINAL

Die gleichen Arbeitsgänge werden parallel au einer Vergleichsprobe durchgeführt, wobei jedoch Ire in Ohinou zugesetzt wird. Sowohl die obige Lösung wie die Vergleichsprobe werdcnnach der Dialyse bei 4 C gelagert, worauf in "beiden Jj¹LlIlen nach l> Tagen und nach 11 Tagen die Ensymaktivität boatimut wird. En zeigt aich, daß bei dem behandelten Trypsin die Aktivität nach ^:j Tagen noch 1005"», nach 11 Tagen noch 97^fp beträgt, während die unbehaudel'üe Probe eine Aktivität von nur u4^c> bzvj. 74>> aufv/ciot.

Pat e η tanspr liehe

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Claims (6)

1. P a t ο η t a η α ρ r ü c Ii c

   \J Verfahren zur chemischen Modifizierung τοη Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß man das "betreffende Protein mit einem Ohinon umsetzt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung Dei einer Temperatur zwischen O⁰C und der Temperatur, bei der die Denaturisierung des Proteins "beginnt, vorzugsweise zwischen O und 2Jj⁰C, durchführt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion innerhalb eines pH-Bereiches von ;> bis 11 durchführt.
4. 4.

   Verfahren nach einem der Ansprüche 1,2 oder 5, dadurch

   gekennzeichnet, daß man zur Umsetzung mit dem Protein ein Chinon verwendet, das an eine Substanz mit hohem Molekulargewicht, die wasserlöslich oder in Uasser unlöslich sein kann, angelagert oder chemisch gebunden ist.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch ge kennzeich net, daß man als hochmolekulare Substanz, an die das Chinon chemisch gebunden ist, eine Substanz mit Hydroxyl-, Amino-, Sulfhydryl-, Imidasol-, pyrrol-, Phenol-, SuIfonsäure- oder bzw. und Quanidingruppen als reaktionsfähigen Gruppen verwendet,

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6. 6.· Verfahren nach Anspruch 4 oder 5» dadurch gekennzeichnet, ua.ü iTian zur Urasetsunc mit o.or.i j.-roLein ein Chinon verwenaet, da ο "bei 0 nis 1IjU⁰U unu oinou pll-l'/ert von 1 "bis 11 innerlialb einer haloen bis 10ü Ütuuaeu mit der in Wasser löslichen oder unlöslichen hochmoleiculareu Substanz umgesetzt wurde.

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