DE2952815C1

DE2952815C1 - Verfahren zur Konservierung von immobilisierten Eiweissstoffen

Info

Publication number: DE2952815C1
Application number: DE19792952815
Authority: DE
Inventors: Leonid V. Koslov; Julia I. Moskau/Moskva Krylova; Ljudmila V. Serpuchov Kudrjavzeva; Vladimir I. Pu&scaron;ino-na-Okje Surovzev
Original assignee: INST BIOORG CHIMII M M SEMJAKI
Current assignee: INST BIOORG CHIMII M M SEMJAKI
Priority date: 1978-05-29
Filing date: 1979-04-13
Publication date: 1985-05-30
Also published as: SU943280A1; CH633560A5; GB2049700B; CS222968B1; GB2049700A; SE8000648L; WO1979001137A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Konservierung von immobilisierten Eiweißstoffen durch lyophile Trocknung ihrer Gusperrstrom in Wasser oder in einer Pufferlösung.

In der Festphasenbiochemie werden die Fragen behandelt, die mit der Ausnutzung funktioneller Eigenschaften der Eiweißstoffe unter Bedingungen der heterogenen Systeme durch Überführung der Eiweißstoffe in den unlöslichen Zustand, hauptsächlich durch Bildung von beständigen Bindungen mit unlöslichen (festen) Trägern, verbunden sind. Die Immobilisierung (die Überführung in den unlöslichen Zustand) der Eiweißstoffe ermöglicht, diese als heterogne Katalysatoren (Fermenttechnologie), biospezifische Sorptionsmittel (Affinationschromatographie) und für die immunochemische Analyse (immobilisierte Antikörper und Antigene) zu verwenden. Für die praktische Anwendung der immobilisierten Proteine spielt die Frage ihrer Aufbewahrung und des Transports ohne wesentlichen Verlust an Aktivität vom Zeitpunkt der Herstellung bis zum Zeitpunkt der Verwendung eine wichtige Rolle.

Verfahren zur Konservierung können bei der Herstellung von Präparaten von immobilisierten Fermenten, Inhibitoren, Immunoglobulinen, zur Bereitstellung von Affinationssorptionsmitteln, Präparaten für eine schnelle und bequeme biochemische Analyse eine breite Verwendung finden und sind daher für die chemische, medizinische, mikrobiologische Industrie sowie in der medizinischen und Laborpraxis von hoher Bedeutung.

Die lyophile Trocknung ist bekannt und wird in der Industrie- und Laborpraxis der Eiweißstoffe bereits breit angewandt; sie ermöglicht es, in den meisten Fällen die negativen Eigenschaften und die funktioneile Aktivität von Eiweißstoffen voll zu erhalten. Wenn sich bei der lyophilen Trocknung die Aktivität freier Eiweißstoffe teilweise oder vollständig verliert, wurden bereits Verfahren zur Stabilisierung durch Zugabe verschiedener inerter fester löslicher Füllmittel in die Lösung vor der Trocknung vorgeschlagen (siehe beispielsweise die US-Patentschrift 31 33 001).

Immobilisierte Eiweißstoffe unterscheiden sich von den gemäß der US-PS 31 33 001 eingesetzten freien Eiweißstoffen in einer Reihe von Eigenschaften. So sind sie unlöslich und können nur in Suspensionsform erhalten werden, und die Eigenschaften dieser immobilisierten Eiweißstoffe unterscheiden sich von den Ausgangs-Eiweißstoffen häufig in quantitativer wie auch in qualitativer Hinsicht sehr stark. Während bei löslichen Eiweißstoffen in zahlreichen Fällen eine lyophile Trocknung ohne Aktivitätsverlust möglich ist, wurden bei immobilisierten Eiweißstoffen bei Versuchen einer lyophilen Trocknung in der Regel drastische Aktivitätsverluste beobachtet. Die lyophile Trocknung immobilisierter Eiweißstoffe zu Konservierungszwecken und Transportzwecken wurde daher in der Fachliteratur bis in die jüngste Zeit als ungeeignete Maßnahme angesehen.

Immobilisierte Proteine wurden daher bisher nur in Form von Suspensionen in Wasser und in wäßrigen Lösungen aufbewahrt und transportiert, was jedoch eine Reihe von Nachteilen mit sich bringt, die sich aus der Notwendigkeit, tiefe Temperaturen eines engen Temperaturbereiches aufrechtzuerhalten, aus der Gefahr einer mikrobiologischen Infizierung und einer begrenzten Aufbewahrungsfrist wegen der geringen Stabilität der Eiweißstoffe bei deren Aufbewahrung im feuchten Zustand ergeben. Die bequemeren lyophil getrockneten Präparate standen jedoch für immobilisierte Proteine bisher nicht zur Verfügung. Bei der lyophilen Trocknung büßen die am unlöslichen Träger immobilisierten Eiweißstoffe oft einen bedeutenden Teil ihrer negativen Eigenschaften und funktioneilen Aktivität ein; dabei hängt der Grad des Aktivitätsverlustes nicht primär von der Natur des Eiweißstoffes ab, sondern vom Charakter des benutzten Trägers. So verliert beispielsweise das Ferment Pepsin, welches bei der lyophilen Trocknung 100% Aktivität aufrechterhält, bei der lyophilen Trocknung nach der Immobilisierung am Silochrom bis zu 90% Aktivität (Ju. I. Krylowa, L. W. Koslow, W. K. Antonow, B. S. Gaina, E. N. Datunaschwili, N. M. Pawlenko (1976), Bioorganische Chemie 2, 273-278). Somit stellt zur Zeit die Aufbewahrung und der Transport immobilisierter Eiweißpräparate ein Problem dar.

Der Erfindung wurde die Aufgabe zugrundegelegt, ein neues Verfahren zur Konservierung immobilisierter Eiweißstoffe durch deren lyophile Trocknung anzugeben, bei welcher die Aktivität der Präparate aufrechterhalten wird.

Die gestellte Aufgabe wurde durch ein Verfahren zur Konservierung immobilisierter Eiweißstoffe durch lyophile Trocknung ihrer Suspensionen in Wasser oder in einer Pufferlösung gelöst, das erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet wird, daß die lyophile Trocknung in Gegenwart eines inerten wasserlöslichen festen Füllmittels durchgeführt wird.

Das Gewichtsverhältnis des Füllmittels und des immobilisierten Eiweißstoffes wird in jedem konkreten Fall ausgewählt und hängt vom gewählten Füllmittel, Eiweißstoff und Träger ab, auf welchem der Eiweißstoff immobilisiert worden ist, und kann von 1:1 bis 20 :1 betragen.

Als inertes wasserlösliches festes Füllmittel können anorganische Salze, beispielsweise Natriumchlorid, Aminosäuren, beispielsweise Glycin, Kohlenhydrate, beispielsweise Glukose, synthetische Polymere, beispielsweise Polyvinylpyrrolidon sowie beliebige andere Füllmittel, die wasserlöslich und gegenüber Eiweißstoff inert sind, in Frage kommen.

Weitere Beispiele für geeignete Füllstoffe sind GIycylglycin, Ochsenserumalbumin, Saccharose, Polysaccharide wie Dextran oder Polyalkohole wie Polyäthylenglykol.

Der auf Aerosil (pulverartiges Silikagel) immobilisierte Eiweißstoff, beispielsweise Schweinepepsin, wird in Wasser suspendiert, das eine Lösung von Polyäthylenglykol (Mol. Masse 3000) in derselben Gewichtsmenge wie das Eiweißpräparat enthält, eingefroren und lyophil getrocknet. Das getrocknete Präparat wird in 0,01 MoI Azetatpuffer bei einem pH-Wert von 4,5 suspendiert,

ORIGINAL INSPECTED

das Füllmittel wird durch aufeinanderfolgende Auswaschungen mit Pufferlösung unter Abtrennung des Eiweißpräparats durch Zentrifugieren entfernt. Man nimmt die Einwaage des feuchten Präparats des immobilisierten Ferments und bestimmt dessen Aktivität nach der Hämoglobinhydrolyse. Man bestimmt auch die Aktivität des Ausgangspräparats des immobilisierten Pepsins und die Aktivität des ohne Zugabe des Füllmittels (Polyäthylenglyko!) lyophil getrockneten Präparats.

Die Aktivität des Ausgangspräparats wird gleich 100% gesetzt; dann beträgt die Aktivität des ohne Füllstoff lyophil getrockneten Präparats 9% und die Aktivität des in Gegenwart von Polyäthylenglykol lyophil getrockneten Präparats 78%. Dadurch wird es möglich, durch das gegebene Verfahren zur lyophilen Trocknung trockene Fermentpräparate zu erhalten, deren Aktivität um das 8,7fache höher ist als bisher bekannt.

Die Erfindung gestattet, die Verluste an Aktivität und nativen Eigenschaften der immobilisierten Eiweißstoffe bei deren lyophiler Trocknung zu vermeiden und diese Präparate in einer für eine längere Aufbewahrung und den Transport bequemen Form zu erhalten. Recht bequeme Träger für die Immobilisierung der Eiweißstoffe stellen anorganische Träger, insbesondere Kieselerden (Silikagele, Glas) dar. Bei der lyophilen Trocknung ver-Heren jedoch die auf solchen Trägern immobilisierten Eiweißstoffe ihre nativen Eigenschaften und funktioneile Aktivität fast vollständig. Im Zusammenhang damit werden diese Träger zur Herstllung von Präparaten, die der Aufbewahrung unterliegen, nicht verwendet, und die darauf immobilisierten Eiweißpräparate werden industriemäßig für den Verkauf nicht hergestellt, sondern unmittelbar vor dem Gebrauch erzeugt. Die Verwendung der Erfindung gestattetes, auf anorganischen Trägern immobilisierte Industriemuster der Eiweißpräparate herzustellen, welche in bequemer Form — in der lyophil getrockneten Form — aufbewahrt werden können.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Man suspendiert 20 mg auf Aerosil immobilisierte Schweinepepsin in 1 ml Wasser, das 200 mg Glycin enthält. Man trocknet das Gemisch lyophil. Vor dem Gebrauch suspendiert man das Präparat in 0,01 Mol Azetatpuffer beim pH-Wert von 4,5 und entfernt das Füllmittel durch aufeinanderfolgende Auswaschungen mit derselben Pufferlösung unter Abtrennung des Eiweiß-Präparats durchs Zentrifugieren. Man entnimmt die Einwaage des feuchten Präparats des immobilisierten Ferments und bestimmt dessen Aktivität nach der Hämoglobinhydrolyse. Die Aktivität beträgt 16%, bezogen auf die Aktivität des Ausgangspräparats bis zur lyophilen Trocknung. Die lyophile Trocknung ohne Füllmittel ergibt ein Präparat mit einer Aktivität von 9%, bezogen auf den Ausgangswert.

B e i s ρ i e 1 2

Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 400 mg Glycin hinzugesetzt. Die Aktivität des Präparats beträgt 25%.

65

Beispiel 3 Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 200 mg Glycylglycin hinzugesetzt. Die Aktivität des Präparats beträgt 20%.

Beispiel 4

Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 20 g Ochsenserumalbumin hinzugesetzt. Die Aktivität des Präparats beträgt 63%.

Beispiel 5

Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 20 mg Glukose hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 50%.

Beispiel 6

Die Konservierung wird wie in Beispiel 5 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 200 mg Glukose hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 53%.

Beispiel 7

Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 20 mg Saccharose hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 44%.

Beispiel 8

Die Konservierung wird wie in Beispiel 7 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 400 mg Saccharose hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 63%.

Beispiel 9

Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 20 mg Polyvinylpyrrolidon (mit der Mol. Masse von 25 000) hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 67%.

Beispiel 10

Die Konservierung wird wie in Beispiel 9 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 200 mg Polyvinylpyrolidon hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 75%.

Beispiel 11

Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 20 mg Dextran (mit der Mol. Masse von 50 000) hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 25%.

Beispiel 12

Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 20 mg Polyäthylenglykol (mit der Mol. Masse von 3000) hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 78%.

Beispiel 13

Die Konservierung wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 20 mg Natriumchlorid hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 21 %.

5

Beispiel 14 Präparat in demselben Puffer suspendiert und das Füll

mittel wird durch Auswaschungen entfernt Man be-

Die Konservierung wird wie in Beispiel 13 durchge- stimmt die Aktivität nach der Bindung (125/) von Ovalführt, nur werden als Füllmittel 200 mg Natriumchlorid bumin im Vergleich zur Ausgangsaktivität. Die Aktivihinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 31%. 5 tat beträgt 73%. Die Aktivität des ohne Füllmittel ge trockneten Präparats beträgt 12%. Beispiel 15

Die Konservierung wird wie in Beispiel 13 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 400 mg Natriumchlorid hinzugesetzt. Die Aktivität beträgt 35%.

Beispiel 16

20 mg auf Diatomeenerde immobilisiertes Huhnpepsin werden analog dem Beispiel 1 konserviert. Als Füllmittel verwendet man 20 mg Glycin. Die Präparataktivität, bezogen auf das Hämoglobin, beträgt nach der Iyophilen Trocknung mit dem Füllmittel 60%. Die Aktivität des lyophil getrockneten Präparats ohne Füllmittel beträgt 50%.

Beispiel 17

Die Konservierung wird wie in Beispiel 16 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 200 mg Glycin hinzugesetzt Die Aktivität beträgt 67%.

Beispiel 18 ;

-

20 mg auf Sphären Ar A 1000 Handelsprodukt immobilisiertes Protosubtilin werden in 1 ml 0,01 Mol Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 8,0 suspendiert, der 20 mg Glukose enthält Weiter wird die Konservierung wie in Beispiel 1 durchgeführt Die Präparataktivi- tat nach Hämoglobin beträgt nach der lyophilen Trocknung 93%. Die Aktivität des ohne Füllmittel lyophil getrockneten Präparats beträgt 80%.

Beispiel 19

Die Konservierung wird wie in Beispiel 18 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 20 mg Polyäthylenglykol (mit der Mol. Masse von 3000) hinzugesetzt Die Aktivität beträgt 86%.

Beispiel 20

20 mg auf Enzakryl AA Handelsprodukt immobilisiertes Protosubtilin werden analog dem Beispiel 18 konserviert Die Präparataktivität beträgt 100%. Die Aktivität des ohne Füllmittel lyophil getrockneten Präparats beträgt 74%.

Beispiel 21

Die Konservierung wird wie in Beispiel 20 durchgeführt, nur werden als Füllmittel 20 mg Polyäthylenglykol (mit der Mol. Masse von 3000) hinzugesetzt Die Aktivität beträgt 93%.

Beispiel 22

20 mg auf Aerosil immobilisiertes Ovalbuminantiserum des Kaninchens werden in 0,01 Mol Tris-HCl-puf- fer, der 20 mg Polyäthylenglykol (MoL Masse 3000) enthält, bei einem pH-Wert von 7,6 suspendiert, eingefroren und lyophil getrocknet Vor dem Gebrauch wird das

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Konservierung von immobilisierten Eiweißstoffen durch lyophile Trocknung ihrer Suspensionen in Wasser oder in einer Pufferlösung, dadurch gekennzeichnet, daß die lyophile Trocknung in Gegenwart eines inerten wasserlöslichen festen Füllmittels durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Füllmittel zur Suspension des immobilisierten Eiweißstoffes in Gewichtsverhältnissen zum letzteren von 1:1 bis 20: 1 hinzugesetzt wird.

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