DE4219149C2 - Verfahren zur Haltbarmachung einer immobilisierten immunologisch reaktiven Substanz - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Halt­ barmachung einer immunologisch reaktiven antigenen Substanz gemäß Patentanspruch 1.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Tech­ nik, welche angewendet wird auf die immunologische Überwa­ chung von Zellen, was im Hinblick auf klinische Medizin wichtig ist, oder genauer, auf ein Verfahren zum Haltbarma­ chen antigener Zellen für einen Festphasenimmunassay, wel­ ches umfaßt: Immobilisieren unterschiedlicher antigener Zel­ len auf einem festen Träger, wie z. B. einem Reaktionsgefäß zum Typisieren der unterschiedlichen antigenen Typen, expri­ miert in den antigenen Zellen und zur Bestimmung der Exi­ stenz von Antikörpern, welche die antigenen Zellen neutrali­ sieren.

Eine Reihe von Blutkomponenten zur Transfusion und Zellen von Transplantationsorganen exprimieren unterschiedliche an­ tigene Typen. Deshalb wird die Zelle, welche jene Antigene auf ihrer Oberfläche aufweist, im allgemeinen als die anti­ gene Zelle bezeichnet. Für den antigenen Typ, welcher durch jene antigenen Zellen exprimiert wird, wird vor Durchführen einer Transplantation oder Transfusion der die genaue Kompa­ tibilität testende oder neutralisierende Antikörperbestäti­ gungstest zwischen einem Empfänger und einem Spender durch­ geführt. Wenn zu dieser Zeit eine Transplantation oder Transfusion trotz der ungenügenden Kompatibilität oder der Existenz neutralisierender Antikörper durchgeführt werden würde, würde dies einen Empfänger Gefahren aussetzen, wie beispielsweise schwere Abstoßung oder graft-versus-host- Reaktion (GVH-reaction). Demzufolge ist es bei Transfusions­ tests erforderlich, daß die Bluttypen bzw. Blutgruppen un­ terschiedlicher Blutzellen, wie beispielsweise rote Blutzel­ len, Plättchen oder weiße Blutzellen, präzise mit guter Re­ produktion typisiert werden sollten. Um dies zu gewährlei­ sten, ist gegenwärtig ein Verfahren weit verbreitet, wobei das vorliegen der Antigen-Antikörper-Reaktion bestimmt wird durch Inkontaktbringen der Blutzellen, deren Blutgruppe be­ kannt ist, mit der Blutprobe des Patienten. Zum Verwenden dieses Verfahrens ist es erforderlich, einen konstanten und stabilen Nachschub an Blutzellen in beliebiger Menge zu ge­ währleisten. Für diesen Zweck wurde ein Verfahren durchge­ führt, wobei die Maximalmenge verfügbarer Blutzellen im Voraus erhalten wurde und unter Frieren oder Kühlen konser­ viert wurde. Jedoch beträgt die immunologisch wirksame Zeit­ spanne lebender Blutzellen ca. 3-4 Wochen, was eine kurze Zeit darstellt und mit fortschreitender Zeit tritt ein be­ merkenswerter Verlust ihrer antigenen Eigenschaften auf. Deshalb wurden zahlreiche Versuche zur histologischen Stabi­ lisierung von Blutzellen unternommen.

Im allgemeinen wurden bei dem passiven (indirekten) Aggluti­ nationstest und in dem direkten Agglutinationstest, bei wel­ chem rote Blutzellen als Indikatorzellen präzipitiert werden und ihr Verteilungsmuster getestet wird, eine Reihe von Al­ dehydbehandlungen zum histologischen Stabilisieren von Blut­ zellen durchgeführt.

In Immunochemistry, 6, 67, 1969, S. Avrameas et al. wird ein Verfahren offenbart, um die Indikatorzellen für den passiven Agglutinationstest zu erhalten durch histologisches Stabili­ sieren roter Blutzelloberflächen durch Behandeln mit Alde­ hyd, welcher stark genug ist, damit ihre antigenen Eigen­ schaften verlorengehen und anschließendes Binden des Anti­ gens oder Antikörpers für unterschiedliche pathogene Sub­ stanzen andere als Blutgruppensubstanzen, auf der Oberfläche der roten Blutkörperchen. Ebenso wird in der EP-A-317 085 ein Verfahren zum Erhalten der Indikatorzellen für den di­ rekten Agglutinationstest offenbart, dessen Antigene histo­ logisch stabilisiert sind, während der Verlust der antigenen Eigenschaften minimiert wird durch Behandeln roter Blutkör­ perchen mittels histologischer Fixierung mit Aldehyd bei ge­ ringer Konzentration, wie beispielsweise 0,01-2% Formalde­ hyd (Formalin) oder 0,01-0,1% Glutaraldehyd (Glutar). Die sich ergebenden Indikatorzellen für den direkten Agglutina­ tionstest sind für die Zwecke des Aufrechterhaltens ihrer antigenen Eigenschaften suspendiert in einer komplexen Schutzlösung, umfassend etwa ein Dutzend unterschiedlicher Komponenten einschließlich Gelatine oder Dextran, und werden für drei oder sechs Monate unter Kühlung konserviert.

Unter Verwendung dieses Verfahrens ist es möglich, die Indi­ katorzellen in Bezug auf ihre antigenen Eigenschaften ver­ gleichsweise stabil zu halten, jedoch sind auch mit jenen Zellen die antigenen Eigenschaften der Oberfläche nicht vollständig frei von Inaktivierung. Desweiteren benötigen die obigen Indikatorzellen aufgrund ihrer fehlenden Fähig­ keit zur Adsorption von Antigenen ein Bindemittel, wie Tanninsäure zum Immobilisieren der Antigene auf deren Ober­ fläche. Darüber hinaus sind Antigene oder Antikörper, welche auf feinen Partikeln, wie beispielsweise Indikatorzellen im­ mobilisiert werden können, auf solche begrenzt, welche durch Beschallung löslich gemacht wurden.

In den vergangenen Jahren wurde hauptsächlich ein Festpha­ senimmunassay durchgeführt, bei welchem immunreaktive Zellen auf der Mikrotiterplatte, welche eine Vielzahl von hohlen Vertiefungen darauf aufweist, adsorbiert werden und wobei eine hochsensitive Bestimmung des Analyten in der Patienten­ probe möglich gemacht wird. Bei dem Festphasenverfahren ist es wichtig, eine große Menge des Antigens an einen festen Träger zu binden und die Aktivität dieser Antigene aufrechtzuerhalten und zu diesem Zweck müssen eine Reihe von Vorrichtungen, welche unten beschrieben sind, eingeführt werden.

Bei dem in der EP-A-140 489 offenbarten Verfahren werden Lö­ sungen, welche jeweils eine einzelne antigene Art, wie bei­ spielsweise Hormone oder Immunglobuline enthalten, in ein­ zelne Vertiefungen auf der Polyvinylchlorid-Mikrotiterplatte gegossen, wobei den Antigenen erlaubt wird, darauf durch physikalische Adsorptionskraft zu adsorbieren und dann mit den Lösungen, welche unterschiedliche Zucker enthalten, in Kontakt gebracht werden und dann trocknen gelassen werden. Als eine Alternative wird in der US-PS-4 891 319 ein Verfah­ ren offenbart, worin die anti-Leukozyten-Antikörper oder En­ zyme gegen eine einzige Antigenart in jede Vertiefung einer Polystyrol-Mikrotiterplatte gegossen, für eine lange Zeit zur physikalischen Adsorption stehengelassen, mit einer Tre­ halose-Lösung in Kontakt gebracht werden und zum Trocknen stehengelassen werden. Jedoch weisen Zellen, welche ledig­ lich durch physikalische Adsorptionskraft immobilisiert wer­ den, die Schwierigkeit auf, daß sie sich während des Aufbe­ wahrens oder bereits während des Reaktionsprozesses ablösen.

Die GB-PS-1 257 263 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Produkten, welche aktive Proteinsubstanzen enthalten. In diesem Verfahren werden Proteine, insbesondere Enzyme, über ein Quervernetzungsmittel an einem Substrat immobili­ siert.

Desweiteren offenbart die US-PS-5 030 560 ein Verfahren, wo­ bei zum Verhindern der Inaktivierung der antigenen Eigen­ schaften der Oberfläche der roten Blutkörperchen eine Aldehydbehandlung durchgeführt wird, wobei man den antigenen Blutzellen, beispielsweise den roten Blutkörperchen oder Plättchen, erlaubt, auf der Mikrotiterplatte immobilisiert zu werden für eine Festphasenimmunbestimmung durch einen Farbstoff mit positiven Ladungen als einem Bindemittel, Kon­ taktieren mit unterschiedlichen Zuckerlösungen und zum Trocknen stehenlassen. Wenn jedoch die Adsorption eines der­ artigen geladenen Bindemittels verwendet wird, binden die antigenen Blutzellen unspezifisch an unterschiedliche Pro­ teine, andere als der Analyt, was zu einer falschen Typisie­ rung des Ergebnisses führen kann.

Deshalb hat der Erfinder der vorliegenden Erfindung mit ei­ ner Absicht, die Typisierung von Antigenen zu Plättchen, wo­ nach verlangt wird, den Anti-Plättchenantikörpertestkit ent­ wickelt, welcher basiert auf der gemischten passiven Hämagglutination (MPHA), welche abhängt von der Verwendung der Mikrotiterplatte, auf welcher Plättchen lediglich durch physikalische Adsorptionskraft immobilisiert wurden, und von Indikatorzellen, welche erhalten werden durch Binden von anti-IgG-Antikörpern an rote Blutkörperchen aus Schafen. Dieser Kit wird vermarktet unter der Handelsbezeichnung OLYBIO und trägt bei zur Forschung in dem Gebiet der Trans­ fusionstests. Während dieser Kit jedoch frei ist von der Schwierigkeit, welche mit der Inaktivierung der antigenen Eigenschaft zusammenhängt, weil die Plättchen lediglich durch physikalische Adsorptionskräfte auf der Platte selbst immobilisiert werden, sind die Plättchen jedoch nicht not­ wendigerweise mit einer ausreichenden Bindungskraft auf der Platte immobilisiert. Obwohl eine Reihe von Studien wie oben beschrieben, versucht wurden, wurde jedoch kein Verfahren zum Immobilisieren antigener Blutzellen vorgeschlagen, wel­ ches sowohl eine ausgezeichnete Reaktionsspezifität als auch eine ausgezeichnete Adsorption an der Mikrotiterplatte auf­ weist und welches die stabile Aufrechterhaltung der antige­ nen Eigenschaften über eine lange Zeit erlaubt. Desweiteren verwenden die Mehrzahl der Untersuchungen in Bezug auf das Aufrechterhalten der antigenen Eigenschaften rote Blutzellen als ihr Material und trotz der Wichtigkeit bei der Transfu­ sion wurde der Fall, daß eine große Zahl an Antigentypen in Plättchen über eine lange Zeit stabil gehalten werden kann, bislang nicht vorgestellt.

Daher ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfah­ ren zum Haltbarmachen antigener Zellen für ein Festphasenim­ munassay zur Verfügung zu stellen, wobei die Zellen gut an einen festen Träger adsorbiert werden können, und wobei die spezifische Bindungsaktivität an den Analyten über eine lange Zeit stabil aufrechterhalten werden kann.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt durch die Merkmale des Pa­ tentanspruchs 1.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, ein Verfahren zum Haltbarmachen der antigenen Zellen für einen Festphasenimmunassay zur Verfügung zu stellen, welches es erlaubt, multiple antigene Typen in Plättchen über eine lange Zeit stabil zu erhalten.

Zur Lösung der obigen Aufgabe verwendet das vorliegende Ver­ fahren ein Verfahren zum Immobilisieren antigener Zellen durch Auswählen einer äußerst geeigneten Kombination der Bindungskräfte aus physikalischer Adsorption und chemischem Quervernetzen und Kontaktieren der antigenen Zellen mit ei­ ner Schutzlösung. Insbesondere wird durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung gestellt zum Haltbar­ machen einer immunologisch reaktiven Substanz, welche auf einer Oberfläche eines festen Trägers immobilisiert wird, um eine immunologische Untersuchung durchzuführen, wobei die folgenden Schritte umfaßt werden:
einen ersten Bindungsschritt zum Adsorbieren der reaktiven Substanz auf einer Oberfläche des Trägers durch eine physi­ kalische Adsorptionsbehandlung;
einen zweiten Bindungsschritt zum Bilden einer Brücken­ bindung zwischen der reaktiven Substanz und dem Träger durch chemische Quervernetzungsbehandlung, so daß die chemische Quervernetzung mit der physikalischen Adsorption zusammen­ wirkt, um eine genügend starke Immobilisierung zu bewirken, wobei die vollständigen antigenen Eigenschaften im wesentli­ chen erhalten bleiben; und
einen Eintauchschritt zum Schützen der auf dem Träger immo­ bilisierten reaktiven Substanz gegen einen strukturellen Schaden unter Verwendung einer Schutzlösung, welche wenig­ stens eine wirksame Menge eines Zuckers enthält.

Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung er­ geben sich anhand der nachfolgenden detaillierten Beschrei­ bung sowie anhand der Beschreibung von Beispielen.

In der vorliegenden Erfindung wird unter einer immunologisch reaktiven Substanz typischerweise eine antigene Zelle ver­ standen, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf an­ tigene Zellen beschränkt, sondern andere immunologisch reak­ tive Substanzen können auch verwendet werden. Die folgende detaillierte Beschreibung ist eine Ausführungsform der vor­ liegenden Erfindung für eine antigene Zelle.

Zuerst werden als Voraussetzung für die Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung antigene Zellen an einen festen Träger mittels physikalischer Adsorptionsbe­ handlung gebunden.

Die antigenen Zellen, welche für diese Erfindung verwendet werden sollen, können sämtliche Zellen einschließen, welche Antigene exprimieren, welche ihre immunologische Aktivität auf der Zelloberfläche aufweisen. Beispielsweise können die Zellen der inneren Organe verwendet werden, beispielsweise Knochenmark, Milz, Niere, Leber, Endothel, Hornhaut, maligner Tumor, menschliches Haar sowie die Zellen, welche die Blutkomponenten bilden, wie beispielsweise Plättchen, rote Blutkörperchen und weiße Blutkörperchen. Desweiteren können Kulturen, Homogenate oder Lysate, welche aus derarti­ gen Zellen hergestellt werden, wirksam verwendet werden.

Wenn die antigenen Zellen der vorliegenden Erfindung rote Zellen oder Plättchen sind, welche bekannte Antigentypen aufweisen, wird normalerweise eine Blutprobe mit Blutgruppe 0 verwendet zum Verhindern des Auftretens von nicht spezifi­ schen Reaktionen zwischen Antigenen unterschiedlicher AB0- Blutgruppen. Desweiteren wird es bevorzugt, solche antigenen Zellen zu verwenden, in welchen die HLA-Antigene auf der Zelloberfläche inaktiviert wurden, wenn das Testobjekt einen spezifischen Antigentyp, besonders an Plättchen betrifft. Sonst kann es zu Mißtypisierung führen, weil die HLA-Anti­ körper in der Patientenprobe ebenfalls mit dem aktiven HLA- Antigen, welches untersucht werden soll, reagieren können. Desweiteren verhindert die Verwendung von Blut, welches 30 min. oder länger nach dem Sammeln stehengelassen wird, bei einer Isolierung von Plättchen aus Blut eine Kontamination der Probe mit roten Blutkörperchen während einer Zentrifu­ gation. Der feste Träger, welcher für die vorliegende Erfin­ dung verwendet werden soll, kann jegliche Form aufweisen, wenn er hohle Teile hat, in welche eine Testprobe oder ein Reagenz gegeben werden kann oder Oberflächen, welche in eine Testprobe oder ein Reagenz eingetaucht werden können. Insbe­ sondere können beispielsweise Reaktionsgefäße verwendet wer­ den, beispielsweise Mikrotiterplatten, Reagenzgläser, schachtelförmige Küvetten oder Labortestgeräte, beispiels­ weise Glasplatten, Filter, Fasern oder röhrenförmige Fluß­ zellen. Die Oberflächenkonfiguration dieser festen Träger kann modifiziert werden, entsprechend den Eigenschaften des zu immobilisierenden Antigenes, der Testcharakteristik oder der Testreagenzien. Wenn beispielsweise die präzipitierten Indikatorzellen als ein Reagenz verwendet werden, können Reaktionsgefäße mit einer U- oder V-förmigen Basis vorzugs­ weise verwendet werden, und besonders bevorzugt werden Mikrotiterplatten verwendet. Desweiteren können in Testen, welche Farbreaktionen oder Lumineszenzreaktionen verwenden, jegliche Testgeräte verwendet werden, unabhängig davon, wel­ che Form ihre Oberfläche aufweist.

Das Material der festen Träger für die vorliegende Erfindung sollte eine physikalische Adsorption ermöglichen. Insbeson­ dere können z. B. bevorzugt Kunststoffe, wie beispielsweise Polystyrol, Polyethylen oder Polyvinylchlorid verwendet wer­ den. Das übliche Material, an welchem die physikalische Ad­ sorption durch gewisse elektrische, physikalische oder che­ mische Behandlungen durchgeführt wird, kann ebenfalls vor­ teilhaft verwendet werden. Beispielsweise kann eine Glas­ oberfläche verwendet werden, welche beschichtet wird mit ei­ ner wohlbekannten positiv geladenen Substanz, beispielsweise Polyethylenimin (PEI), Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder einem kationischen Farbstoff, oder einer wohlbekannten negativ ge­ ladenen Substanz, wie beispielsweise Pflanzengummi bzw. Stär­ kegummi, Stärke, Natriumalginat, Gelatine. Desweiteren ist es möglich, die physikalische Adsorptionsaktivität der obi­ gen Kunststoffprodukte durch Behandeln dieser mit jenen Sub­ stanzen zu verstärken. Beispielsweise kann die physikalische Adsorptionsaktivität von Mikrotiter­ platten in ihren U-förmigen Polystyrolvertiefungen verstärkt werden, ein­ schließlich der Modulplatten von der NUNC Inc., wie bei­ spielsweise Maxisorp (IgG Bindungsaktivität von ca. 400 ng/cm²) und Polysorp (100 ng/cm² IgG) oder solche von Grei­ ner Inc., wie beispielsweise Immuron 600 (600 ng/cm² IgG) und Immuron 200 (200 ng/cm² IgG).

Die Behandlung des festen Trägers mit solchen Substanzen sollte nicht so durchgeführt werden, daß eine hohe Konzen­ tration möglicherweise mit den Ergebnissen nach der Immobi­ lisierung wechselwirkt. Das Material des Trägers oder die Art der geladenen Adsorbenssubstanz, welche oben erwähnt wurde, wechseln geeignet ab, entsprechend den Adsorptionsei­ genschaften der antigenen Zelle selbst, welche immobilisiert werden soll, oder der Zellmenge. Die physikalische Adsorp­ tionsbehandlung der vorliegenden Erfindung kann erreicht werden durch Kontaktieren einer Zellsuspension, welche eine wirksame Menge suspendierter antigener Zellen aufweist, mit einem festen Träger und Stehenlassen der Anordnung bei Raumtemperatur für eine vorbestimmte Zeit oder Aussetzen einer Hoch­ geschwindigkeitszentrifugation. Die wirksame Menge antigener Zellen zur Immobilisierung enthält soviele Zellen, daß wenigstens eine Schicht antigener Zellen auf der Ober­ fläche des festen Trägers ausgebildet werden kann. Weil eine derartige wirksame Menge variiert, abhängend von der Art und Natur des zu immobilisierenden Antigens oder den physikali­ schen Adsorptionseigenschaften oder der Festphasenfläche des festen Trägers, wird es empfohlen, geeignete Zellkonzentra­ tionen und Mengenzusätze durch Variieren der zusammenhängen­ den Bedingungen geeignet auszuwählen. Besonders, wenn es er­ wünscht ist, physikalische Adsorption innerhalb einer kurzen Zeit zu bewirken, wird es bevorzugt, von der Hochgeschwin­ digkeitszentrifugation Gebrauch zu machen.

Die Lösung, in welcher die antigenen Zellen der vorliegenden Erfindung suspendiert werden, kann als geeignet ausgewählt werden aus denjenigen, welche wohlbekannt sind im Zusammen­ hang mit den Charakteristiken der zu immobilisierenden Zel­ len. Insbesondere können beispielsweise verschiedene Puffer oder physiologische Kochsalze verwendet werden. Desweiteren ist die bevorzugte Lösung, welche zum Suspendieren von Plättchen erfindungsgemäß verwendet werden soll, ACD-Lösung. Nach Behandlung sollte der Träger, falls nötig, mit einer geeigneten Waschlösung, beispielsweise gereinigtem Wasser, Puffer, Salz oder Blutverdünnung gewaschen werden.

Nach dieser physikalischen Adsorptionsbehandlung wird die chemische Quervernetzungsbehandlung auf dem festen Träger angewendet, an welchen die obigen antigenen Zellen gebunden wurden.

Dieser Reihenfolge sollte gefolgt werden, weil, wenn das chemische Quervernetzen gleichzeitig mit oder vor der physi­ kalischen Adsorptionsbehandlung abläuft, die chemische Quer­ vernetzung zuerst innerhalb der antigenen Zellen fortschrei­ ten wird, so daß die physikalische Adsorption oder die che­ mische Quervernetzung an dem festen Träger nicht genügend ausgeführt wird.

Die chemische Quervernetzungsbehandlung der vorliegenden Er­ findung wird durchgeführt durch Auflösen eines chemischen Quervernetzungsmittels in einem geeigneten Puffer oder Koch­ salz und Kontaktieren der Lösung mit dem festen Träger, auf dessen Oberfläche antigene Zellen immobilisiert werden sol­ len.

Jedes chemische Quervernetzungsmittel kann verwendet werden für die vorliegende Erfindung, beispielsweise eine Carboxyl­ säure, eine Epoxyverbindung, eine Halogenverbindung, ein Säureanhydrid, eine Silanverbindung, ein Isocyanat, ein Al­ kohol oder ein Amin, welche hauptsächlich an einer Hydroxyl­ gruppe oder einer Doppelbindung wirken, sofern es nicht selbst eine Fähigkeit aufweist, eine Antigen-Antikörper-Re­ aktion hervorzurufen oder Adsorptionsaktivitäten aufweist, welche seiner Ladung zugeschrieben werden. Es wird jedoch bevorzugt, auf Aldehyd basierende chemische Substanzen zu verwenden, beispielsweise Formalin, Glutar (Glutaraldehyd) oder Paraformaldehyd. Dies liegt daran, weil sie zusammen mit Verstärkung der Bindung der antigenen Zellen an dem fe­ sten Träger eine histologische Immobilisierung jener antige­ nen Zellen erlauben.

Besonders bevorzugt ist Glutaraldehyd. Die Verwendungskon­ zentration jener auf Aldehyd basierender Substanzen vari­ iert, abhängig von den Charakteristiken der Substanzen, wel­ che verwendet werden sollen. Wenn eine Formalin enthaltende Lösung verwendet wird, ist es bevorzugt, eine derartige Kon­ zentration auszuwählen, welche eine Endkonzentration von etwa 1,0-5,0% erlaubt. Wenn die Konzentration 5,0% über­ schreitet, gehen die antigenen Eigenschaften verloren und nach der Immobilisierung unterliegen die antigenen Zellen häufig unspezifischen Reaktionen des Aldehyds. Wenn die Kon­ zentration andererseits weniger als ca. 1,0% beträgt, lösen sich Zellteile von der Oberfläche der Vertiefung während des Waschschrittes, der Schutzbehandlung oder der Konservierung ab. Daher wird ein Konzentrationsbereich zwischen etwa 2,5% und 4,5% bevorzugt. Wenn eine Glutar enthaltende Lösung verwendet wird, liegt deren wirksame Glutarkonzentration vorzugsweise in einem Bereich von etwa 0,003-0,06%. Wenn die Konzentration unterhalb von ca. 0,003% liegt, wird die Fixierungskraft stark reduziert, wogegen die antigenen Ei­ genschaften verlorengehen, wenn die Konzentration ca. 0,06% überschreitet. Daher wird ein Bereich von etwa 0,005-0,02% besonders bevorzugt. Es ist möglich, eine stabile und öko­ nomische Immobilisierung aufrechtzuerhalten durch Einstellen einer geeigneten Aldehydkonzentration im Einklang mit der physikalischen Adsorptionskraft des festen Trägers, welcher untersucht wird, solange der obige wirksame Aldehydkonzen­ trationsbereich verwendet wird.

Darüber hinaus kann eine Mischung aus verschiedenen Aldehyd­ substanzen wirksam bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In diesem Fall ist es wünschenswert, den optimalen Bereich der Konzentration vor Verwendung zu bestimmen. Ob eine gegebene Aldehydkonzentration geeignet ist oder nicht, kann bestimmt werden durch Überprüfen auf schwimmende Zel­ len, welche immobilisiert sein sollten, in einer Waschlösung nach der Behandlung oder in einer Schutzlösung, welche nach dem Waschen zugegeben werden soll. Falls eine immobilisie­ rende Verbindung mit einem niedrigen Molekulargewicht, wie beispielsweise ein synthetisches Peptid oder Hapten immobi­ lisiert werden soll, ist es nötig, daß die Konzentration des Quervernetzungsmittels hoch sein wird, weil es schwierig ist, physikalische Adsorption zu verwenden.

Die Verfahren, durch welche die derart erhaltenen Lösungen mit einem festen Träger in Kontakt treten, sind solche, bei denen vorzugsweise die Lösung mit einer Pipette auf den fe­ sten Träger gebracht wird oder der feste Träger in die Lö­ sung eingetaucht wird. Wenn diese Verfahren in die Praxis umgesetzt werden, muß dies so sanft wie möglich geschehen. Dies liegt darin begründet, daß sonst Zellen durch den Flüs­ sigkeitsstrom abgelöst werden können. Die Kontakttemperatur liegt vorzugsweise bei etwa 4-37°C. Die Kontaktzeit be­ trägt vorzugsweise ca. 10-50 Minuten oder, besonders be­ vorzugt, ca. 20-40 Minuten. Dies liegt darin begründet, daß, wenn die Kontaktzeit zu lang ist, die histologische Fixierung der antigenen Zellen weiter fortschreitet als benötigt oder die antigenen Eigenschaften verlorengehen kön­ nen. Daher ist es notwendig, den festen Träger mit einer ge­ eigneten Lösung sofort nach einer vorbestimmten Zeit zu wa­ schen. Dabei werden antigene Zellen erhalten, welche fest immobilisiert sind und deren antigene Eigenschaften prak­ tisch vollständig erhalten sind.

In der vorliegenden Erfindung wird den antigenen Zellen auf dem festen Träger, welche durch eine oben beschriebene chemische Quervernetzungsbehandlung behandelt wurden, er­ laubt, mit einer Schutzlösung in Kontakt zu treten, um eine stabile Konservierung bzw. Haltbarmachung der antigenen Zel­ len über eine lange Zeit zu erreichen.

Als Schutzlösung, welche für die vorliegende Erfindung ver­ wendet werden kann, kann jede Lösung, welche Zucker und Zu­ satzstoffe enthält, verwendet werden. Es kann bevorzugt je­ der Zucker verwendet werden, beispielsweise Monosacchäride, Polysaccharide oder Zuckeralkohole. Besonders bevorzugt wer­ den Saccharose, Lactose oder Dextran im Hinblick auf Wirt­ schaftlichkeit und Verfügbarkeit verwendet. Diese Zucker bilden eine Schutzmembran auf der Oberfläche der antigenen Zellen, welche auf einem Träger immobilisiert sind und verhindern wirksam, daß die antigenen Zellen strukturelle Schäden während der Aufbewahrung, beispielsweise unter Frie­ ren, erleiden.

Als Lösungsmittel, welches die obigen Zucker lösen kann, kann jegliches Lösungsmittel verwendet werden, welches die physikochemische Natur der Zellen nicht beeinträchtigt. Je­ doch kann ein Puffer mit einer Pufferaktivität verwendet werden, welcher schwach genug ist, die physikochemische Na­ tur der Zellen nicht zu beeinträchtigen, oder man kann vor­ zugsweise physiologische Kochsalzlösung verwenden. Der Ge­ halt der obigen Zucker in der Lösung liegt bei ca. 0,5-10%. Insbesondere werden ca. 1-5% im Hinblick auf Wirtschaftlichkeit und Lagerstabilität bevorzugt.

Als Additiv, welches für die vorliegende Erfindung verwendet werden soll, kann jegliches bekannte Additiv verwendet wer­ den. Jedoch werden beispielsweise Serumalbumin, Gelatine, Natriumazid bevorzugt verwendet. Hiervon werden wiederum an­ tiseptische Substanzen, wie beispielsweise Natriumazid, am meisten bevorzugt. Die Konzentration und das Volumen unter­ schiedlicher Additive in einer Schutzlösung werden vorzugs­ weise als geeignet bestimmt im Einklang mit der Art und dem Volumen der Zellen, welche haltbargemacht werden sollen.

Als Beispiel einer Schutzlösung, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, kann sterilisiertes Koch­ salz, welche ca. 1% Saccharose und ca. 0,1% NaN₃ enthält, verwendet werden. Die Schutzlösung umfaßt wirksame Zusammensetzungen, die in der Lage sind, gleichzeitig Wirt­ schaftlichkeit und Konservierungszwecke in Einklang zu brin­ gen. Der wirksame Konzentrationsbereich von Zucker und NaN₃ dieser Lösung ist ca. 1-8% bzw. ca. 0,01-0,5%.

Nachdem der so erhaltenen Lösung erlaubt wurde, die Zellen zu kontaktieren, wird die Anordnung bei ca. 4-37°C eine geeignete Zeit lang inkubiert. Diese Behandlung erlaubt der Zuckerkomponente in der Schutzlösung, in Räume zwischen den Molekülen der Zellen einzudringen, wodurch die Denaturierung der physikochemischen Charakteristiken der Zellen verhindert wird.

In der vorliegenden Erfindung umfassen die Konservierungs­ verfahren, nachdem die Zellen und die Schutzlösung miteinan­ der in Kontakt gebracht wurden, solche, bei welchen der feste Träger, auf welchem die Zellen immobilisiert wurden, in ei­ ner Schutzlösung aufbewahrt wird oder solche, bei denen der Träger zur Konservierung getrocknet wird.

Die Temperatur zum Aufbewahren des Trägers in einer Schutz­ lösung liegt vorzugsweise bei ca. -5 bis 10°C oder, beson­ ders bevorzugt, bei ca. 4°C. Demzufolge sollte der Träger vorzugsweise unter Kühlen oder Frieren aufbewahrt werden. Wenn der Träger in einer Schutzlösung aufbewahrt wird, sollte darauf geachtet werden, daß kein Verdampfen oder Aus­ laufen während der Aufbewahrung auftritt. Dies liegt darin begründet, daß, wenn das Volumen der Schutzlösung sich än­ dert, sich die Konzentration verändert, so daß ihre Reakti­ vität unregelmäßig wird. Zur Verhinderung von Verdampfen und Auslaufen ist es ratsam, den Träger innerhalb einer luft­ dichten Box mit einem feuchten Tuch oder dergleichen einzuschließen.

Die Trocknungsverfahren zum Aufbewahren des Trägers durch Trocknen sind natürliches Trocknen oder Trocknen unter ver­ mindertem Druck, und jedes kann bevorzugt verwendet werden, obwohl natürliches Trocknen besonders bevorzugt wird. Jegli­ che Temperatur kann ausgewählt werden als die Temperatur, welche nötig ist zum Aufbewahren des festen Trägers nach na­ türlichem Trocknen, solange keine Hitzedenaturierung in den Zellen oder dem Träger auftritt, jedoch sollte der Träger vorzugsweise bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Wenn der Träger durch Trocknen haltbar gemacht wird, ist es wichtig zu verhindern, daß er einer oxidierenden Atmosphäre und Feuchtigkeit ausgesetzt wird. Dementsprechend wird es bevor­ zugt, ein Trocknungsmittel auf ihn zu legen oder ihn in ei­ ner Packung zu halten, welche mit einem getrockneten Gas ge­ füllt ist, oder in einer Vakuumverpackung.

Unbeachtlich, auf welches Verfahren zur Aufbewahrung zurück­ gegriffen wird, wird es bevorzugt, den festen Träger mit ei­ nem geeigneten Versiegelungsmaterial zu versiegeln und den Träger an einem Platz zu halten, welcher nur geringen Tempe­ raturschwankungen ausgesetzt ist, um Defekte jedes wirksamen Verfahrens zu eliminieren. Insbesondere, wenn die Mikroti­ terplatte als ein fester Träger verwendet wird, können be­ vorzugt Versiegelungen verwendet werden, welche speziell für die Platten gefertigt wurden. Insbesondere, wenn die Modul­ platte, welche eine kleine Anzahl von Vertiefungen, wie bei­ spielsweise 8 × 1 oder 8 × 2 umfaßt, verwendet wird, wird es bevorzugt, die speziell für sie hergestellten Kappen zu ver­ wenden. Dies liegt darin begründet, daß die Tragbarkeit und Handhabbarkeit merklich verbessert werden durch Verschließen des Trägers mit den Kappen.

Der Antigen-immobilisierte feste Träger, welcher behandelt wurde gemäß den obigen Aufbewahrungsbedingungen, kann eine Immobilisierungsbedingung und antigene Eigenschaften prak­ tisch permanent in einer Schutzlösung oder unter Trocknung aufrechterhalten.

Anschließend wird ein Beispiel zur Verwendung eines Festpha­ senimmunassays mit den immobilisierten Zellen, welche er­ findungsgemäß haltbargemacht wurden, beschrieben.

Der Verschluß oder die Kappe, welche auf dem festen Träger angewendet wird, wird entfernt und der Träger wird gründlich mit einer Waschlösung gewaschen, welche ein oberflächenakti­ ves Mittel, wie beispielsweise Tween 20, enthält. Mit dieser Waschbehandlung ist es möglich, wirksam die Überschußanhaf­ tungen, welche sich aus Desintegration oder Ablösen während der Konservierung ergeben, zu entfernen oder die Absonderun­ gen der antigenen Zellen, welche als ein Ergebnis von rauher Behandlung oder ungenügender Immobilisierung auftreten, zu entfernen. Zusätzlich bewahrt diese Behandlung den Träger vor statisch-elektrischer Aufladung, welche mit der Gesamt­ heit der immobilisierten Teile des Trägers wechselwirken kann.

Dem gewaschenen festen Träger wird es erlaubt, mit der Pati­ entenprobe, welche untersucht werden soll, beispielsweise Serum, Plasma oder das gesamte Blut, in Kontakt zu kommen, und die Anordnung wird bei 37°C für eine Zeit, welche für eine gegebene Reaktion nötig ist, inkubiert. Durch dieses Verfahren binden unterschiedliche Antigene auf der Zellober­ fläche, welche den festen Träger überschichten, mit den An­ tikörpern in der Probe, welche auf die Antigene spezifisch sind. Im allgemeinen wird der Träger nach der Reaktion einer Waschbehandlung ausgesetzt, um den Teil, welcher nicht rea­ giert, zu entfernen, jedoch ist eine solche Waschbehandlung nicht für das homogene Reaktionssystem erforderlich.

Dann wird der Träger zusammen mit einem Komplex einer Sub­ stanz inkubiert, welche eine spezifische Affinität zu einem Teil oder zu dem gesamten Typus der Antikörper und einer Markersubstanz aufweist. Anti-Immunglobulin Antikörper kön­ nen verwendet werden als eine Substanz, welche eine spezifi­ sche Affinität zu einem Teil oder dem gesamten Typus der An­ tikörper aufweist. Der Immunoglobulintyp der Antikörper, welche hier verwendet werden sollen, sollte derselbe sein wie derjenige der Antikörper aus der Probe. Die Markersub­ stanz kann ausgewählt werden aus einer Gruppe von Substan­ zen, welche ihrerseits objektiv bestimmt werden kann, bei­ spielsweise magnetische Substanzen, fluorenzierende Reagen­ zien, Radioisotope oder sichtbare Partikel und Farbsubstan­ zen oder Leuchtsubstanzen, welche mit Substraten oder Kata­ lysatoren reagieren. Die Temperatur zur Inkubation ist be­ vorzugt Raumtemperatur bis ca. 37°C. Wenn anti-IgG-Antikör­ per verwendet werden, wird die Reaktion in 4 Stunden gesät­ tigt, jedoch erfordert sie weitere Zeit, damit ihr Muster stabilisiert wird. Demnach läßt man die Reaktion bevorzugt über Nacht weiterlaufen.

Nach der Inkubation wird der feste Träger, von welchem der unumgesetzte Teil durch Waschen entfernt wurde, verwendet, um das Vorliegen der Markersubstanz und deren Anzahl zu be­ stimmen. Zur Bestimmung können geeignete bekannte Methoden verwendet werden. Insbesondere, wenn die Markersubstanz ein sichtbarer Partikel ist, dessen Durchmesser innerhalb eines Bereiches von etwa 2-10 µm liegt, kann der qualitative Analysentest makroskopisch durchgeführt werden.

Im folgenden werden detaillierte Beispiele gegeben, jedoch beschränkt sich der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht auf diese.

Beispiel 1 Immobilisierung auf Grundlage der Verwendung von Formalin und seine Konservierungswirkungen (1) Herstellung von Plättchen-immobilisierten Platten

Volumina von Gesamtblut, welches von 9 Spendern abgenommen wurde (wobei sämtliches Blut die Blutgruppe 0 aufwies) und 1 Volumen der ACD-Lösung wurden gemischt, und jede der sich ergebenden gemischten Lösung wurde bei 260 × g zentrifu­ giert, um plättchenreiches Plasma (PRP) zu erhalten. Zu 9 Volumina derartig erhaltenen PRP wurde ein weiteres Volumen ACD-Lösung gegeben und die Mischung wurde bei 1100 × g zen­ trifugiert, um Plättchenkonzentrat (PC) zu erhalten. Das derart erhaltene PC wurde mit physiologischer Lösung (Koch­ salz) gewaschen und in PBS-EDTA-Lösung, enthaltend 29% (W/V) Chloroquin (pH 5,0), bei Raumtemperatur für 30 Minuten be­ lassen, um die HLA Antigene des PC zu inaktivieren. Das HLA Antigen-inaktivierte PC wurde, nachdem es mit Kochsalz gewa­ schen wurde, mit Kochsalz eingestellt auf 8 × 10⁴ Zellen/µl, und die sich ergebende Suspension wurde in die Mikrotiter­ platte mit U-Grund gegeben (Nunc, Modultyp, Maxisorp) mit 50 µl/Vertiefung. Nachdem die Anordnung bei 670 × g zentrifu­ giert wurde, wurde die PBS Lösung (pH 6,7), welche Formalin in unterschiedlichen Konzentrationen enthält, sanft zu jeder Vertiefung mit 100 µl/Vertiefung gegeben. Sofort, nachdem man 20 Minuten bei Raumtemperatur belassen hat, wurde die Anordnung mit Kochsalz gewaschen und hierbei ergaben sich Mikrotiterplatten, auf welchen Plättchen zu einem notwendi­ gen Grad immobilisiert waren. Zu den derartig erhaltenen Platten wurde Kochsalz gegeben, enthaltend 1% Saccharose und 0,1% NaN₃ als eine Schutzlösung mit 50 µl/Vertiefung. Die sich ergebenden Mikrotiterplatten wurden auf zwei unter­ schiedliche Arten aufbewahrt. Nämlich, die eine Hälfte der Platten wurde jeweils verschlossen, wie sie waren, und in einem Kühlschrank bei 4°C für 15 Monate aufbewahrt. Die an­ dere Hälfte wurde, nachdem sie auf natürliche Weise für 24 Stunden bei 37°C getrocknet wurde, in eine Aluminiumtasche zusammen mit einem Trocknungsmittel eingeschlossen und bei Raumtemperatur für 6 Monate aufbewahrt.

(2) Bestimmung der anti-Plättchen Antikörper

Die Plättchen-immobilisierten Platten wurden, nachdem man auf obige zwei unterschiedliche Verfahren aufbewahrt hatte und ihre Verschlüsse geöffnet hatte, gründlich mit Kochsalz gewaschen, welches 0,05% Tween 20 enthält. Nachdem das Kochsalz entfernt wurde, wurde dieselbe Waschlösung in die Platten mit 25 µl/Vertiefung gegeben. Die Serumzubereitun­ gen, welche jeweils die Antikörper entsprechend den zu untersuchenden Antigenen enthielten, wurden auf das Vierfa­ che mit Kochsalz verdünnt. Jene wurden einer Ultrazentrifu­ gation bei ca. 3000-10 000 UPM ausgesetzt, wodurch präzi­ pitierende Komponenten, wie beispielsweise Debris und Fibrin, präzipitiert wurden. Die sich ergebenden Überstände wurden jeweils zu den Platten mit 25 µl/Vertiefung gegeben. Die Platten wurden leicht geschüttelt, um der Reaktion zu erlauben, bei Raumtemperatur für 3 Stunden weiterzulaufen. Die Platten wurden mit Kochsalz gewaschen, welches 0,05% Tween 20 enthält, und nachdem das Kochsalz entfernt wurde, wurde dieselbe Waschlösung zu den Platten mit 25 µl/Vertiefung gegeben. Die Indikatorzellsuspension (Olympus Optical Co.), welche rote Zellen des Schafes enthielt, die mit anti-Human IgG beschichtet waren, wurde zu den Platten mit 25 µl/Vertiefung gegossen und über Nacht zur Reaktion bei Raumtemperatur belassen. Das Reaktionsmuster, welches auf dem Grund der Vertiefungen nach einer Übernachtinkuba­ tion erschien, wurde makroskopisch untersucht. Während jedes Reaktionsprozesses wurden die, Mikrotiterplatten in einer Humidorbox gehalten, in welche ein Tuch mit Kochsalz, wel­ ches 0,05% Tween 20 enthält, eingebracht war, um wirksam ein Abdunsten zu verhindern. In Tabelle 1 unten ist die Reaktivität der Mikrotiterplatten gezeigt, nach Konservieren der Mikrotiterplatten, immobilisiert mit PBS Lösung (wobei die Formalinendkonzentration 4,7% betrug), enthaltend 7% Formalin.

Wenn die Vertiefungsböden einer Mikrotiterplatte beobachtet werden, wurde das Verteilungsmuster, welches die Indikator­ zellen einheitlich über die Vertiefung gebunden zeigt, als positiv (+) genommen, wogegen das Verteilungsmuster, bei welchem die Mehrheit der Indikatorzellen im Mittelpunkt der Vertiefung präzipitierten, als negativ (-) genommen wurde. (NT) in der Tabelle bedeutet, daß kein Antigen bestimmt wurde. Als eine Kontrolle ist die Reaktivität von Mikroti­ terplatten gezeigt, nach Konservieren der Mikrotiterplatten, welche lediglich durch herkömmliche Adsorption immobilisiert waren, wobei kein Aldehyd verwendet wurde.

Wie in Tabelle 1 oben gezeigt ist, zeigen die antigenen Ei­ genschaften unterschiedlicher Plättchen-Antigene aus 9 Per­ sonen keine Änderung nach Konservierung. Insbesondere für den antigenen Typ, HPA-2a, HPA-2b, HPA-5a und HPA-5b, deren antigene Eigenschaften als schwach angenommen werden, konn­ ten ihre antigenen Eigenschaften für eine lange Zeit auf­ rechterhalten werden. Demzufolge wird dieses Verfahren in hohem Maße nützlich sein für den Transfusionstest, in wel­ chem Plättchen mit jenen antigenen Typen verwendet werden. Darüber hinaus ändern sich, auch wenn Plättchen, nachdem sie immobilisiert worden sind, einer Trocknungsbehandlung ausge­ setzt werden, ihre antigenen Eigenschaften nicht. Dies macht es möglich, daß man Plättchen für eine bemerkenswert lange Zeit bei Raumtemperatur aufbewahren kann.

Vergleicht man die Ergebnisse, welche abgeleitet werden, wenn die Konzentrationen des zugegebenen Formalins verändert werden, so findet man, daß der wirksame Bereich der Formali­ nendkonzentration in einer Vertiefung bei etwa 1,0-5,0% liegt. Wenn die Konzentration diesen Bereich überschreitet, gehen die antigenen Eigenschaften verloren, wogegen Teile der Zellen, wenn die Konzentration niedriger ist als etwa 1,0%, dazu tendieren, sich von der Vertiefungsoberfläche während des Waschens, Schutzbehandlung oder Konservierung abzulösen. Die Formalinendkonzentration, welche derartige Unannehmlichkeiten gerade richtig verhindert, liegt bei etwa 2,5-4,5%.

In Korrelation mit der Konzentration des zugefügten For­ malins wurde eine Ausdehnung von Indikatorzellen, welche von unspezifischen Reaktionen herrühren kann, in dem Vertei­ lungsmuster, welches sich als negativ erwies, beobachtet. Wenn die Mikrotiterplattentypen zu einer solchen mit einer niedrigeren Bindungsaffinität wechselten (Nunc, Polysorp), wurde die wirksame PC-Konzentration mit etwa 150 000 Zel­ len/µl ermittelt. Die Zusatzkonzentration an PC zu den Mi­ krotiterplatten, deren physikalische Adsorption unterschied­ lich ist, betrug ca. 50 000-200 000 Zellen/µl.

Beispiel 2

Auf der Verwendung von Glutar basierende Immobilisierung und dessen konservierende Wirkung.

Plättchen, welche aus 3 Spendern (sämtliches Blut wies Gruppe 0 auf), verschieden von den 9 Spendern in Beispiel 1, genommen wurden, wurden in derselben Weise wie in Beispiel 1 behandelt, mit Ausnahme, daß der Aldehyd, der zugegeben wer­ den soll, durch Glutar ersetzt wurde.

In Tabelle 2 unten wird die Reaktivität der Mikrotiterplat­ ten angezeigt nach Aufbewahren der Mikrotiterplatten, immo­ bilisiert mit PBS Lösung, enthaltend 0,02% Glutar. Die Kri­ terien und der Punkt, welcher mit dem herkömmlichen Verfah­ ren verglichen wird, sind dieselben wie jene in Beispiel 1.

Wie in Tabelle 2 oben gezeigt ist, werden die unterschiedli­ chen Plättchenantigene aus den Plättchen der 3 Spender über eine lange Zeit durch Immobilisierungsbehandlung mit Glutar stabilisiert und zeigen keine Änderung in ihren antigenen Eigenschaften vor oder nach Aufbewahrung.

Im Gegensatz zu den Fällen, in denen Formalin verwendet wurde, trat in den Reaktionsergebnissen, welche erhalten wurden durch Verwenden der mit Glutar immobilisierten Plätt­ chen, keine Expansion der Indikatorzellen auf, welche sich ergibt aus unspezifischen Reaktionen bei Plättchen, welche mit Glutar immobilisiert werden. Des weiteren fand man heraus, daß aus den Ergebnissen der Plättchen-immobilisier­ ten Platten, welche erhalten wurden bei den unterschiedli­ chen Glutarkonzentrationen in PBS Lösung, daß, wenn die Glutarkonzentration in PBS Lösung niedriger als 0,003% be­ trägt, die Fixierungskraft merklich vermindert wird, woge­ gen, wenn sie 0,06% überschreitet, die antigenen Eigen­ schaften verlorengehen. Daraus wurde geschlossen, daß die Endkonzentration von Glutar, nachdem es zu der Präparation zugesetzt wurde, etwa 0,003-0,06% sein sollte, um wirksam zu sein, oder bevorzugt ca. 0,005- 0,02%.

Beispiel 3 Untersuchung der Zusammensetzung der Schutzlösung

Die Zusammensetzung der Schutzlösung wurde untersucht. Zu jeder Vertiefung der Plättchen-immobilisierten Mikrotiter­ platte, welche in der gleichen Weise wie in den Beispielen 1 und 2 behandelt wurde, wurde eine Schutzlösung zugegeben, welche hergestellt wurde durch Kombinieren von sterilisier­ ten Kochsalz- und einer Vielzahl Arten von Zuckerlösungen, welche konventionelle waren, und die Anordnung wurde bei 4°C über eine lange Zeit aufbewahrt. Nach dem Ablauf einer vor­ bestimmten Zeit wurde die Platte herausgenommen und in der­ selben Weise behandelt wie oben, um zu prüfen, ob die anti­ genen Eigenschaften abnahmen oder nicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 unten gezeigt.

Tabelle 3

Wie sich aus obiger Tabelle 3 ergibt, kann die Antigen­ immobilisierte Platte, welche durch das Immobilisierungsver­ fahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, über eine lange Zeit in einer Schutzlösung, welche eine sehr einfache Zusammensetzung aufweist, aufbewahrt werden. Desweiteren fand man heraus, daß, wenn die Saccharosekonzen­ tration in der Schutzlösung verändert wurde, der wirksame Bereich des Zuckers, welcher in die Schutzlösung gegeben werden soll, bei etwa 0,5 bis 10% liegt. Wenn Saccharose durch Lactose ersetzt wurde, wurde dieselbe Lagerstabilität erhalten. Wenn die Schutzlösung ferner derart vereinfacht wurde, daß sie nur Zucker und antiseptische Substanzen enthielt, fand man heraus, daß die antigenen Eigenschaften und die Adsorptionsaktivität auch nach 15 Monaten keiner Än­ derung unterlag. Deshalb kann behauptet werden, daß die immobilisierte Platte, welche erfindungsgemäß hergestellt wurde, praktisch permanent aufbewahrt werden kann, um bei Bedarf zu jeder Zeit verwendet werden zu können.

In Beispiel 3 wurde NaN₃ verwendet, jedoch können dieselben Lagerstabilitäten möglicherweise erhalten werden, wenn an­ dere unterschiedliche Additive zusammen zu der Schutzlösung gegeben werden.

Das Haltbarmachungsverfahren der vorliegenden Erfindung er­ laubt antigenen Zellen, fester an einen festen Träger zu binden als das Verfahren, welches einzig von einer physika­ lischen Adsorption zur Immobilisierung abhängig ist, weil es die physikalische Adsorptionsbehandlung und chemische Quer­ vernetzungsbehandlung in einer geeigneten Weise verknüpft und es ebenfalls erlaubt, unspezifische Reaktionen, die auf­ treten können, wenn lediglich physikalische Adsorption ver­ stärkt wird, zu verhindern. Desweiteren kann das vorliegende Verfahren durch Behandeln der Präparation mit Aldehyd einer geeigneten Konzentration die histologische Stabilität anti­ gener Zellen verbessern, während die Zerstörung und die Ab­ nahme der antigenen Eigenschaften wirksam verhindert wird.

Das Konservierungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann die antigenen Eigenschaften stabil aufrechterhalten, auch, wenn die Aktivität unterschiedlicher Antigene, welche mit den Plättchen zusammenhängen, gemäß ihren Typen variiert. Demzufolge können verläßliche Testergebnisse immer erhalten werden, wenn immobilisierte Zellen, welche durch das gegen­ wärtige Haltbarmachungsverfahren konserviert wurden, verwen­ det werden. Die immobilisierten Zellen in dem vorliegenden Verfahren werden fest immobilisiert und sind histologisch stabil, so daß es möglich ist, sie in einer einfachen Schutzlösung oder in einem getrockneten Zustand über eine lange Zeit zu konservieren. Dies ist ebenfalls wirtschaft­ lich sehr vorteilhaft.

Claims (13)

1. Verfahren zum Haltbarmachen einer immunologisch reaktiven Antigensubstanz, welche auf einer Oberfläche eines festen Trägers immobilisiert wurde, zum Durchführen einer Untersuchung der immunologischen Reaktivität unter optimalem Timing, die folgenden Schritte umfas­ send:

• (a) Inkontaktbringen von antigenen Zellen, welche in einer geeigneten Suspension suspendiert sind, und wobei die antigenen Zellen die immunologisch reak­ tive Antigensubstanz aufweisen, mit einer Oberfläche eines festen Trägers mit physikalischer Adsorptions­ fähigkeit mittels Zentrifugation, um es den antige­ nen Zellen zu erlauben, auf dem festen Träger mit­ tels physikalischer Adsorption immobilisiert zu wer­ den;
• (b) Inkontaktbringen einer 1,0 bis 5,0% Formaldehydlö­ sung oder einer 0,003 bis 0,06% Glutaraldehydlösung mit den mittels physikalischer Adsorption auf dem festen Träger adsorbierten antigenen Zellen, um die physikalische adsorptive Bindungsstärke zwischen den antigenen Zellen und dem festen Träger zu verstärken und die antigenen Zellen histologisch auf dem festen Träger zu fixieren, während die antigene Eigenschaft der antigenen Zellen erhalten bleibt;
• (c) Waschen des festen Trägers mit einer geeigneten Waschlösung, um Funktionen, welche durch Formaldehyd und Glutaraldehyd auftreten, zu stoppen; und
• (d) Inkontaktbringen der auf dem festen Träger immobili­ sierten antigenen Zellen mit einer Schutzlösung, welche 0,5 bis 10,0% Zucker und eine geeignete Menge einer antiseptischen Substanz enthält, um die immunologisch reaktive Antigensubstanz, welche auf dem festen Träger immobilisiert ist, vor strukturel­ lem Schaden zu schützen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Formaldehydkonzentration in der Formaldehydlösung etwa 2,5% bis 4,5% beträgt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Glutaraldehydkonzentration in der Glutaraldehydlösung etwa 0,005% bis 0,02% beträgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Schutzlösung wenigstens einen Zucker enthält, welcher ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus:
Saccharose, Lactose, Dextran sowie deren Mischungen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die antiseptische Substanz NaN₃ ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die antigene Zelle eine solche ist, welche Blutkomponenten bildet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die antigene Zelle eine Blutplättchenzelle ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutplättchenzelle einen HPA-2a, HPA-2b, HPA-5a oder HPA-5b Antigentyp hat.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutplättchen in der Suspension, welche in Schritt (a) verwendet wird, in einer Konzentration von ca. 50 000 bis 200 000 Zellen/µl suspendiert werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger mit einer solchen Vertiefung ausgestattet wird, die die gesamte Formalde­ hyd- oder Glutaraldehydlösung aufnehmen kann.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als fester Träger eine Mikrotiterplatte mit U- oder V- förmiger Bodenoberfläche verwendet wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger in Schritt (d) auf 4°C gebracht wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (d) ferner eine Trocknungs­ behandlung des festen Trägers umfaßt.