DE69534187T2

DE69534187T2 - Sterile und pyrogenfreie säulen, gekoppelt mit einem protein, zum binden und entfernen von substanzen aus dem blut

Info

Publication number: DE69534187T2
Application number: DE69534187T
Authority: DE
Inventors: Wolfgang BÖHM; A. Franz BIEBER; Jutta MÜLLER-DERLICH; Alan Barclay; Reiner Spaethe; Michael Bernhard; Christine Kraus
Original assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Current assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Priority date: 1994-05-13
Filing date: 1995-05-15
Publication date: 2005-11-17
Anticipated expiration: 2015-05-16
Also published as: AU2594495A; WO1995031727A1; EP0804734B1; ES2242189T3; EP0804734A1; CA2190268C; CA2190268A1; JPH09508976A; US5817528A; ATE294959T1; EP0804734A4; AU691297B2; JP3161604B2; DE69534187D1

Description

Technisches Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Säulen, über die Blut passiert wird, um Substanzen aus dem Blut zu entfernen. Insbesondere liegt die Erfindung auf dem Gebiet von Verfahren zum Herstellen steriler und Pyrogen-freier Säulen, an welche Proteine gekoppelt sind, die an vorher festgelegte Substanzen binden und sie aus dem Blut entfernen.
Stand der Technik
Schon lange war bekannt, dass bestimmte Krankheitszustände mit dem Vorliegen eines Überschusses von spezifischen Substanzen im Blut des Patienten im Zusammenhang stehen. Z. B. sind bei der familiären Hypercholesterinämie (FH) die Spiegel von Low-density-Lipoprotein (LDL) oder Lipoprotein a (Lp(a)) im Blut des Patienten aufgrund eines genetischen Defekts im LDL-Rezeptor stark erhöht. Durch die erhöhten LDL-Werte entwickelt sich in den Koronararterien des Patienten rasch eine Arteriosklerose, die ihrerseits zu einem frühen Herzanfall und zum Tod führt.
Um überschüssiges LDL zu entfernen, wird das Plasma von FH-Patienten über Säulen passiert, die eine Matrix enthalten, an welche Antikörper gekoppelt sind, die spezifisch an den LDL/Cholesterin-Komplex binden und ihn entfernen. Dieses Verfahren wird in den folgenden Veröffentlichungen beschrieben: Stoffel, W., et al., Lancet II, S. 1005–1007, 1981; Borberg, H., et al., J. Clin. Apheresis 4: 59–65, 1988; Gordon, B. R., et al., Transfusion 30: 327–332, 1990; Borberg, H., et al., „Plasma Separation and Plasma Fractionation", S. 266–271 (Karger, Basel, 1983); Hombach, V., et al., Deutsche Med. Wochenschrift 111: 1709–1715, 1986; Borberg, H., et al., Ärztl. Lab. 32: 57–62, 1986.
Ein weitere Typ einer Säule zum Entfernen von LDL wurde vorgeschlagen, mit der Cholesterin aus dem Blut des Patienten unspezifisch entfernt wird ( US 4 576 928 ; US 4 637 994 ; Liposorber^®, Sulflux^®, Kaneka Corporation, Osaka, Japan). Das Absorptionsmittel der Kaneka-Säule besteht aus einem wasserunlöslichen porösen harten Gel, auf dem eine sulfatierte Verbindung durch kovalente Bindung immobilisiert ist.
Außerdem wurde vorgeschlagen, LDL durch eine Heparin-induzierte extrakorporale LDL-Fällung zu entfernen (HELP^TM, Braun, Melsungen, Deutschland).
Auch bei bestimmten Autoimmunleiden und anderen Krankheiten ist es erforderlich, Substanzen aus dem Blut eines Patienten zu entfernen. Im Allgemeinen wird angenommen, dass die Symptome von Autoimmunleiden, z. B. systemischem Lupus erythematodes (SLE), rheumatoider Arthritis (RA), idiopathischer thrombozytopenischer Purpura (ITP), Myasthenia gravis und Vaskulitis, durch Autoantikörper und zirkulierende Immunkomplexe (CIC) im Blut des Patienten, die gegen die Selbstantigene des Patienten gerichtet sind, verursacht werden. Somit wurde vorgeschlagen, dass durch Entfernen eines großen Teils des Immunglobulins des Patienten, einschließlich der Autoantikörper und CIC, die Symptome gebessert werden und möglicherweise sogar eine Heilung erreicht wird.
An die Säulen wurde Protein A von Staphylococcus aureus gekoppelt, das an bestimmte Subklassen des menschlichen IgG bindet (Immunsorba^®, Excorim^®, Lund, Schweden). Zurzeit werden bestimmte Subklassen des IgG entfernt, indem das Plasma des Empfängers über diese S.-aureus-Protein-A-gekoppelten Säulen passiert wird. Die Protein-A-gekoppelten Säulen wurden zur Verwendung in der Behandlung von Patienten mit Autoimmunleiden vorgeschlagen, z. B. Goodpasture-Syndrom, Wegener-Granulomatose und SLE (EXCORIM^® Manual EM-32-101-B, 1989, Lund, Schweden; Bygren, P., et al., Lancet, 7. Dezember, S. 1295–1296, 1985). Die Protein-A-gekoppelten Säulen wurden auch zum Entfernen von Anti-HLA-Antikörpern aus hypersensibilisierten Patienten verwendet, die ein Nierentransplantat benötigen (Dantal, J., et al., New England J. Med. 550: 7–14, 1994; Palmer, A., et al., The Lancet, 7. Januar 1989, S. 10–12). Diese Patienten leiden typischerweise an einem idiopathischen nephrotischen Syndrom (INS). Häufig erleiden sie bald nach der Transplantation einen Rückfall, auch wenn man ihnen eine optimal übereinstimmende Spenderniere transplantiert, so dass es für sie praktisch ausgeschlossen ist, überhaupt ein Nierentransplantat zu erhalten. Die Wirksamkeit der Protein-A-Säulen-Behandlung bei verschiedenen INS-Patienten wurde beschrieben (Dantal et al., vorstehend; Palmer et al., vorstehend). Außerdem wurden Protein-A-gekoppelte Säulen in der Behandlung von Patienten mit Antikörper-Inhibitoren gegen die Koagulationsfaktoren VIII oder IX verwendet (Nilsson, I. M., et al., Blood 58: 38–44, 1981; Gjörstrup, P., et al., Vox. Sang. 61: 244–250, 1991).
Außerdem wurde Interferon als eine mögliche pathogene Substanz im Blut von Patienten in Betracht gezogen, die an Autoimmunkrankheiten, einer Allergie und der Abstoßung eines transplantierten Gewebes leiden. Es wurde vorgeschlagen, dass es möglich sein könnte, durch Anti-Interferon-Immunglobuline, die an einen Feststoff-Träger gekoppelt sind, das Interferon aus dem Blut solcher Patienten zu entfernen (Skurkovich, S. V., US 4 581 010 ; Skurkovich, S. V., US 4 362 155 ; DE 32 39 360 C2 ; GB 2122496B; WO 82/03331).
Auch können bestimmte Autoimmunkrankheiten behandelt werden, indem ein signifikanter Teil der Immunglobuline des Patienten entfernt wird, und zwar unter Verwendung einer Säule, an die Antikörper gekoppelt sind, die gegen menschliches Immunglobulin gerichtet sind. Die Verwendung solcher Säulen in der Behandlung von Autoimmunleiden wurde wie folgt beschrieben: Müller-Derlich, J., et al., „Congress in Monte Carlo", April 1992; Müller-Derlich, J., et al., IX. „Congress of the International Society for Artificial Organs", Juli 1993; Müller-Derlich, J., et al., „Ninth Scientific Congress of the European Society for Haemapheresis in Association with the British Blood Transfusion Society", September 1993; Müller-Derlich, J., et al., „XXIV. Tagung der Gesellschaft für Immunologie", September/Oktober 1993; Müller-Derlich, J., et al., „Conference on Immunoglobulins Intravenous IgIV", Lissabon, November 1993.
Ein weiterer Fall, bei dem Substanzen aus dem Blut von Patienten entfernt werden müssen, liegt vor, wenn der Patient ein Organtransplantat benötigt. Im Allgemeinen muss das transplantierte Organ mit dem Empfänger immunologisch übereinstimmen, um eine hyperakute Abstoßung des Spenderorgans zu verhindern. Jedoch gibt es weltweit zu wenig menschliche Organe, die für eine Transplantation geeignet sind, wobei die Vorgabe, dass das Spenderorgan immunologisch übereinstimmen soll, die Sache noch komplizierter macht.
Wenn ein Spenderorgan transplantiert wird, gegen das der Empfänger schon vorher Antikörper gebildet hat, folgt schnell nach der Transplantation eine hyperakute Abstoßung des Spenderorgans. Eine hyperakute Abstoßung tritt typischerweise bei einem allogenen Transplantat auf, wenn der Empfänger vorher Antikörper gegen den HLA-Typ des Spenderorgans gebildet hat (von Mensch auf Mensch), und sie tritt bei einem xenogenen Transplantat (von Tier auf Mensch) auf, da Menschen normalerweise vorher gebildete Antikörper gegen tierische Gewebe aufweisen.
Die „hyperakute Abstoßungsreaktion" kommt zustande, wenn das eigene Immunsystem des Empfängers das transplantierte Organ angreift und innerhalb von Minuten bis Stunden, typischerweise innerhalb von 48 Stunden nach der Transplantation zerstört. Auch wenn der Empfänger eine immunsuppressive Therapie erhält, wird die hyperakute Abstoßung dadurch nicht abgeschwächt.
Die Verwendung eines Organs aus einer Tierart, z. B. dem Schwein, ist nicht durchführbar, so lange noch kein Verfahren gefunden ist, mit dem die hyperakute Abstoßungsreaktion stark abgeschwächt oder verhindert werden kann. Die hyperakute Abstoßungsreaktion tritt vermutlich als Folge von vorher gebildeten Antikörpern im Blut des Empfängers auf, die xenogene Antigene im Gewebe des Spenderorgans erkennen und daran binden, sobald das transplantierte Organ an der richtigen Stelle vorliegt und mit dem Blut des Empfängers perfundiert ist. Diese vorher gebildeten Antikörper im Blut des Empfängers sind auch als „menschliche heterophile Antikörper", „natürliche Antikörper" oder „xenoreaktive Antikörper" bekannt. Wenn die xenoreaktiven Antikörper an die Endothelzellen der Blutgefäße des Spenderorgans binden, stimulieren sie die Ablagerung von Komplement-Proteinen, die auch aus dem Blut des Empfängers stammen. Die Ablagerung von xenoreaktivem Antikörper und Komplement setzt vermutlich den „klassischen" Stoffwechselweg der Komplementwirkung in Gang, der schließlich zum Aufreißen der Endothelzellen-Auskleidung der Blutgefäße des Spenderorgans führt (in: „Immunology", Hrsg.: Roitt, I. M., et al., J. B. Lippincott Co., Philadelphia, 1989, Kapitel 13, S. 13.1–13.16). Die hyperakute Abstoßungsreaktion führt innerhalb von Minuten bis Stunden nach der xenogenen Transplantation zu einem nekrotischen Spenderorgan. Man hat die Hypothese aufgestellt, dass eine Nekrose des Spenderorgans durch die „Aktivierung" seiner Endothelzellen zustande kommt, die ihrerseits zu Gewebeeinblutung, Entzündung, Ödem und Thrombose kleiner Gefäße führt (Platt, J. L., et al., Immunology Today 11: 450–456, 1990; Magee, J. C., et al., Therapeutic Immunolgy 1: 45–58, 1994).
Bei dem Versuch, beim Transplantieren von ABO-nicht-übereinstimmenden menschlichen Organen eine hyperakute Abstoßung zu vermeiden, wurden vorher gebildete Anti-A-/Anti-B-Antikörper aus dem Blut des Empfängers entfernt, indem eine extrakorporale Perfusion des Plasmas des Empfängers über synthetische Antigene der Blutgruppe A/B erfolgte, die kovalent an Kieselgel gebunden waren. Erfolgreiche Nieren- und Knochenmark-Transplantate unter Verwendung dieser Verfahren wurden beschrieben (Bannett, A. D., et al., Transplant. Proc. 1987, XIX: 4543–4546; Bensinger, W. I., et al., Transplantation 1982, 33: 427–429; US Patent Nr. 4 137 401; Europäisches Patent Nr. 89311540.2).
Verschiedene Verfahren wurden vorgeschlagen, mit denen xenoreaktive Antikörper aus dem Blut eines Empfängers eines tierischen Organs entfernt werden können. Z. B. könnte das Blut des Empfängers vor der Transplantation eines „frischen" Organs durch ein Organ der vorgeschlagenen Spenderart perfundiert werden. Andererseits könnte, wenn ein Schwein die Spenderart sein soll, z. B. eine „Säule" mit isolierten Endothelzellen des Schweins konstruiert werden. Das Plasma des Empfängers könnte vor der Transplantation über diese Säule perfundiert werden, um Anti-Schwein-Antikörper zu entfernen (Bach, F. H., in: „XENOTRANSPLANTATION", Hrsg.: Cooper, D. K. C., et al., Springer-Verlag, 1991, Kapitel 6).
Außerdem wurde vorgeschlagen, dass man die Antikörper vor einer xenogenen Transplantation unspezifisch aus dem Blut des Empfängers entfernt, in der Hoffnung, dass die xenoreaktiven Antikörper zusammen mit dem Rest entfernt werden. Immunglobulin kann unspezifisch durch Plasmapherese entfernt werden. Jedoch geht eine herkömmliche Plasmapherese mit Nebenwirkungen einher, die den Patienten, die eine Organtransplantation erhalten sollen, nicht zugemutet werden können.
Nilson, I. M., et al., beschreiben eine kommerziell verfügbare Pyrogen-freie und sterile Protein-A-Sepharose-Säulenmatrix, die in Ethylenoxid-sterilisierte Säulen verpackt ist (Nilson, I. M., et al., „A procedure for removing high titer antibodies by extracorporal Protein-A-Sepharose adsorption in hemophilia: Substitution therapy and surgery in a patient with hemophilia B and antibodies", Blood, Juli 1981, Bd. 58, Nr. 1, S. 38–44).
US 3 560 620 betrifft ein Verfahren zum Induzieren der Fibrinolyse bei Säugern und pharmazeutische Zusammensetzungen dafür. US 3 560 620 beschreibt das Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung aus einem pharmazeutischen Wirkstoff und Excipienten, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung aus sehr spezifischen kleinen organischen Molekülen besteht. Die Komponenten in US 3 560 620 sind gebrauchsfertige Produkte, die lediglich gemischt werden, die jedoch nicht chemisch reagieren, um ein neues Reaktionsprodukt zu bilden.
Was gebraucht wird, ist ein Verfahren zum Herstellen steriler und Pyrogen-freier Säulen, an die spezifische Proteine gekoppelt sind, zum Entfernen vorher festgelegter Substanzen aus dem Blut von Patienten, die an bestimmten Zuständen, z. B. einem erhöhten LDL/Cholesterin, Autoimmunleiden und Krankheiten leiden, die eine Transplantation von soliden Organen erforderlich machen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Herstellen einer sterilen und Pyrogen-freien Säule bereit, an die ein Protein gekoppelt ist, das eine vorher festgelegte Substanz im menschlichen Blut bindet, wodurch diese Substanz entfernt wird, wenn das Plasma des Individuums über die Säule passiert wird.
Die vorher festgelegten Substanzen, die gebunden und entfernt werden sollen, können z. B. Low-density-Lipoprotein (LDL) und Lp(a) sowie damit zusammenhängende Cholesterin-Komplexe sein. Andererseits können die vorher festgelegten Substanzen, die entfernt werden sollen, Immunglobuline, z. B. IgG, IgM, IgA und IgE, sowie zirkulierende Immunkomplexe sein.
Das gekoppelte Protein kann ein Gemisch aus polyclonalen, monoclonalen oder rekombinanten Antikörpern sein, die gegen menschliches LDL oder menschliches Immunglobulin gerichtet sind. Die gekoppelten Antikörper können in Tieren induziert werden, oder sie können als doppelkettige oder einzelkettige Antikörper rekombinant erzeugt werden. Wenn die gekoppelten Antikörper gegen menschliches Immunglobulin gerichtet sind, können sie spezifisch an menschliches IgG, IgM, IgA, IgE oder an ein Gemisch aus den menschlichen Immunglobulin-Klassen binden.
Demgemäß ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung das Bereitstellen eines Verfahrens zum Herstellen einer sterilen und Pyrogen-freien Säule, an welche ein Protein gekoppelt ist, das an eine vorher festgelegte Substanz bindet und sie aus dem Blut eines Primaten, einschließlich menschlicher Individuen, entfernt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens zum Herstellen einer sterilen und Pyrogen-freien Säule, an welche Antikörper gekoppelt sind, die spezifisch an menschliches LDL binden und es aus dem Plasma eines menschlichen Individuums entfernen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens zum Herstellen einer sterilen und Pyrogen-freien Säule, an welche Anti-Mensch-Immunglobulin-Antikörper gekoppelt sind, zur Verwendung zum Entfernen von Immunglobulin und zirkulierenden Immunkomplexen aus dem Plasma von Primaten, einschließlich menschlicher Individuen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist das Bereitstellen eines Verfahrens zum Herstellen von sterilen und Pyrogen-freien Protein-gekoppelten Säulen im großen Maßstab.
Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren zum Herstellen einer sterilen und Pyrogen-freien Säule gelöst, die ein Matrixmaterial enthält, an welches ein Protein gekoppelt ist, wobei die Säule zum Entfernen einer vorher festgelegten Substanz aus dem Blut eines menschlichen Individuums eingesetzt werden kann, wobei das Verfahren das Folgende umfasst:

• Bereitstellen einer gereinigten Lösung eines Proteins, das an die vorher festgelegte Substanz im menschlichen Blut bindet, wobei die Lösung Pathogen-frei ist,
• Bereitstellen eines sterilen und Pyrogen-freien Matrixmaterials, das chemisch aktiviert ist, wobei das Matrixmaterial durch ein Verfahren steril und Pyrogen-frei gemacht wird, das die folgenden Schritte umfasst:
(a) Spülen des Matrixmaterials unter keimfreien Bedingungen mit sterilem und Pyrogen-freiem Wasser, bis ein Test auf die biologische Belastung das Vorliegen von Null Enterobakterien, Null Pseudomonas aeruginosa, Null Staphylococcus aureus und weniger als einem aerob wachsenden Bakterium pro g anzeigt, und
(b) Dampfbehandeln des Matrixmaterials bei 115°C bei weniger als 2 bar, bis ein Wert von F_o = 6 erreicht ist,
• Inkontaktbringen des aktivierten Matrixmaterials unter keimfreien Bedingungen mit der Proteinlösung, wodurch die Kopplung des Proteins an das Matrixmaterial erreicht wird, und
• Verpacken des Matrixmaterials, an welches das Protein gekoppelt ist, unter keimfreien Bedingungen in ein steriles und Pyrogen-freies Gehäuse in Form einer Säule, wodurch eine sterile und Pyrogen-freie Säule hergestellt wird.

Kurze Beschreibung der Figur
1 ist ein Flussdiagramm des Verfahrens zum Herstellen steriler und Pyrogen-freier Säulen, an welche ein Protein gekoppelt ist.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt Verfahren zum Herstellen steriler und Pyrogen-freier Säulen, an welche ein Protein gekoppelt ist, zum Entfernen von vorher festgelegten Substanzen aus dem Blut eines Patienten bereit. Die Verfahren werden unter keimfreien Bedingungen unter Verwendung von sterilen Rohstoffen durchgeführt. Durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung schädlicher herkömmlicher Verfahren zum Sterilisieren medizinischer Produkte vermieden.
Der Begriff „Säule" ist hier als ein Modul einer beliebigen Form definiert, das ein Matrixmaterial aufweist, an welches Proteine chemisch gekoppelt werden können.
Wenn zum Bearbeiten des Bluts eines menschlichen Individuums eine Säule verwendet werden soll, ist es so zu verstehen, dass die Säule steril und Pyrogen-frei sein muss, so dass die Möglichkeit minimiert wird, dass pathogene Substanzen über den Säulenausfluss wieder zurück in das Individuum überführt werden könnten. Es gibt ein Hauptproblem beim Herstellen einer Protein-gekoppelten, sterilen und Pyrogen-freien Säule. Dieses Hauptproblem beruht auf der Tatsache, dass die fertige therapeutische Säule durch kein praktisches Verfahren sterilisiert werden kann, ohne dass ihre Funktion dabei zerstört wird. Die vier herkömmlichen Verfahren zum Sterilisieren eines medizinischen Produktes sind: (1) Ethylenoxid-Sättigung; (2) Glutaraldehyd-Sättigung; (3) Gamma-Bestrahlung; und (4) Dampfsterilisation. Die Sterilisation mit Ethylenoxid (EtO₂) umfasst die Sättigung des Endprodukts mit EtO₂, worauf das Eindampfen und das Evakuieren des EtO₂-Gases folgen. Die EtO₂-Sterilisation kann nur für Feststoffe verwendet werden und nicht für Produkte, die Flüssigkeiten enthalten, z. B. die Pufferlösung in der Säule der vorliegenden Erfindung. Die Glutaraldehyd-Sättigung bewirkt eine Fixierung und Vernetzung des gekoppelten Proteins und schwächt dadurch seine Bindungsfunktion ab. Die Gamma-Bestrahlung reißt vermutlich die dreidimensionale Struktur des gekoppelten Proteins auf und verändert das Säulen-Matrixmaterial. Außerdem ist in einigen Ländern, z. B. in Deutschland, die Verwendung von Gamma-Bestrahlung beim Herstellen von Arzneimitteln nicht erlaubt. Die herkömmliche Dampfsterilisation von 15 Minuten bei 121°C bei 2 bar würde das Säulen-Matrixmaterial schmelzen, so dass es für den vorgesehenen Zweck nicht mehr verwendet werden könnte, und das gekoppelte Protein denaturieren, wodurch seine Bindungsaktivität zerstört werden würde.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung löst das Problem der Sterilisation, indem es in jedem Herstellungsschritt sterile und Pyrogen-freie Stoffe verwendet. Die Verfahren zum Bereitstellen steriler und Pyrogen-freier Rohstoffe werden nachstehend in dem jeweiligen Schritt und außerdem noch genauer in den Versuchsbeispielen beschrieben.
Das an die Säule gekoppelte Protein kann Protein A von Staphylococcus aureus oder Protein G von Streptococcus, oder gegen menschliches LDL gerichtete Antikörper oder gegen menschliches Immunglobulin gerichtete Antikörper sein.
Die nachstehend angegebenen Arbeitsbeispiele beziehen sich auf Säulen, die Matrixmaterial enthalten, an welches Antikörper gekoppelt sind. Da Antikörper komplexe Proteine sind, die spezifische Bindungsaktivitäten besitzen, ist zu erwarten, dass die gleichen Verfahren auch erfolgreich angewendet werden können, um Säulen herzustellen, an die Protein A oder Protein G gekoppelt ist.
Wenn das Protein, welches an das Matrixmaterial der Säule gekoppelt werden soll, Antikörper enthält, können die Antikörper polyclonale Antikörper sein, die in Tieren, z. B. Schafen oder Kaninchen, durch bekannte Verfahren hervorgerufen wurden. Die Immunogene können menschliches Immunglobulin (Ig) oder menschliches LDL sein. Andererseits können die an die Säulen gebundenen Antikörper auch monoclonale Antikörper sein, die durch bekannte Verfahren unter Verwendung eines menschlichen Immunglobulins oder menschlichen LDL als Antigen hergestellt wurden. Das Screeningverfahren zum Auswählen eines geeigneten monoclonalen Antikörpers gegen ein menschliches Ig könnte auf der Selektivität für das menschliche Immunglobulin beruhen, das an die Endothelzellen des Schweins bindet. Sobald die Sequenz eines geeigneten monoclonalen Antikörpers bestimmt ist, könnte der Antikörper als ein doppelkettiger oder einzelkettiger Antikörper rekombinant hergestellt werden.
Wenn der Antikörper, welcher an die Säule gekoppelt werden soll, in einem Tier hervorgerufen wird, ist es besonders wichtig sicherzustellen, dass alle im Tierserum vorliegenden Viren inaktiviert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt Verfahren zum Inaktivieren von Viren bereit, wobei hohe Spiegel des funktionellen Antikörpers erhalten bleiben. Ein solches Verfahren ist die Hitzebehandlung. Kurz gesagt wird das tierische Serum mit einem Stabilisator gemischt, auf mindestens 60°C bis etwa 62°C erhitzt und mindestens zehn Stunden bei dieser Temperatur inkubiert. Dieser Prozess zur Antikörperinaktivierung wurde durch Studien bestätigt, bei denen verschiedene Typen von Testviren verwendet wurden, von denen man weiß, dass sie ein Spektrum von pathogenen Viren in ihrer Empfindlichkeit gegenüber der physikalisch-chemischen Inaktivierung nachahmen. Andere Verfahren sind Lösungsmittel/Verdünnungsmittel-Behandlung und Virusfiltration.
Sobald bestätigt wurde, dass das tierische Serum oder eine andere Antikörperquelle Pathogen-frei ist, wird es vorzugsweise gereinigt, wobei die geeigneten Antikörper selektiert werden, die an das therapeutische Säulenprodukt gekoppelt werden sollen. Geeigneterweise umfasst der Reinigungsschritt eine Passage der Antikörperlösung über eine erste Säule, die hier als eine „Vorsäule" bezeichnet wird und die ein Matrixmaterial enthält, an welches Albumin gekoppelt ist, und danach über eine zweite Säule, die hier als eine „Arbeitssäule" bezeichnet wird. Wenn Anti-LDL-Antikörper gereinigt werden sollen, ist an das Matrixmaterial der Vorsäule zusätzlich zum Albumin außerdem ein menschliches IgG gekoppelt.
Vorzugsweise enthält die Arbeitssäule ein steriles und Pyrogen-freies Matrixmaterial, an welches ein menschliches Immunglobulin oder menschliches LDL gekoppelt ist, unter sterilen Bedingungen. Eine Arbeitssäule mit einer Kapazität von etwa 450 bis 900 ml wird verwendet.
Das Säulen-Matrixmaterial wird sterilisiert durch (1) eine Reihe von Spülgängen mit sterilem Pyrogen-freiem Wasser, um die biologische Belastung zu reduzieren, gefolgt von (2) einer Dampfsterilisation von mindestens 20 Minuten bei 115°C bei < 2 bar (bis F_o = 6). Alle Sterilisationsverfahren werden in einem sterilisierten Isolator mit Glove-Boxen durchgeführt, der in einem Reinraum der Klasse 100 000 steht.
Die Arbeitssäule zum Reinigen von Antikörpern gegen menschliches Immunglobulin enthält geeigneterweise ein Matrixmaterial, an welches menschliches Immunglobulin gekoppelt ist. Vorzugsweise wird ein Präparat von gepooltem menschlichem Immunglobulin, z. B. Gammagard^® S/D (Baxter, Hyland Division), gereinigt, wodurch menschliches IgG erhalten wird, und das gereinigte menschliche IgG-Präparat wird mit Hilfe der CNBr-Aktivierung an eine sterile Matrix gekoppelt. Noch ein anderes Verfahren zum Koppeln wird bereitgestellt, bei dem 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI) als Aktivierungsmittel verwendet wird. Der Aktivierungs- und Kopplungsprozess wird auch in dem sterilisierten Isolator durchgeführt. Andererseits kann auch ein Gemisch aus menschlichen Immunglobulinen, z. B. IgG, IgM, IgA und IgE, an die sterile Matrix gekoppelt werden.
Zum Reinigen von Antikörpern gegen menschliches LDL wird die Matrix der Arbeitssäule geeigneterweise mit menschlichem LDL gekoppelt, das durch Affinitätschromatographie des Plasmas menschlicher Individuen hergeleitet wurde.
Die Lösung der für die Kopplung an die therapeutische Säule vorgesehenen Antikörper wird sodann durch Passage über die Vorsäule gereinigt, an welche die unerwünschten Substanzen binden. Das Eluat aus der Vorsäule wird anschließend über die Arbeitssäule passiert, welche die gewünschten Antikörper bindet, während sie die unerwünschten Substanzen aus der Säule abfließen lässt. Die Passage über Vor- und Arbeitssäulen wird geeigneterweise durch ein automatisches System durchgeführt, das in einem Reinraum der Klasse 100 000 aufgebaut ist. Für alle Prozesse werden sterile Puffer verwendet.
Sobald die gewünschten Antikörper an die Arbeitssäule gebunden sind und die unerwünschten Substanzen aus der Säule ausgeflossen sind, müssen die gewünschten Antikörper aus der Arbeitssäule eluiert werden. Bei diesem Schritt gibt es vier wichtige Hürden. Erstens müssen die gewünschten Antikörper in ausreichender Menge eluiert werden, so dass die Produktion der therapeutischen Säulen praktisch durchführbar und kostengünstig wird. Zweitens müssen die gewünschten Antikörper in einem funktionellen Zustand eluiert werden, d. h. ihre Bindungsstellen müssen ausreichend unverändert vorliegen, so dass sie noch ihre Epitope an menschliche Immunglobuline oder LDL binden können. Drittens sollte die resultierende eluierte Antikörperlösung keine Pufferchemikalie aufweisen, die in dem darauf folgenden Schritt selbst an die aktivierte Säulenmatrix binden würde. Viertens sollten die eluierten Antikörper bei der Lagerung eine längere Zeit im Elutionspuffer stabil sein. Nach dem Stand der Technik der Proteinreinigung schließen sich diese vier Anforderungen häufig gegenseitig aus. D. h. Bedingungen, die eine ausreichende Menge des Proteins eluieren, inaktivieren möglicherweise das Protein (Wilchek, M., et al., in: Methods in Enzymology, Bd. 104, „Enzyme Purification and Related Techniques", Hrsg.: W. B. Jakoby, 1984, Harcourt Brace Lovanovich, S. 19–34). Darüber hinaus ist ein Puffer, der das Protein wirksam eluiert, möglicherweise kein geeigneter Puffer für die spätere Verarbeitung, oder er trägt möglicherweise nicht zur Stabilität des Proteins während der Lagerung bei.
Glücklicherweise wurden drei Elutionspuffer entdeckt, die die vorstehenden Anforderungen erfüllen. Im Verlauf der Tests eines geeigneten Elutionspuffers wurde zuerst Glycinpuffer versucht, da Glycin verbreitet für herkömmliche Verfahren der Affinitätschromatographie eingesetzt wird. Da Glycin eine Aminosäure ist, sind Aminogruppen enthalten. Es wurde gefunden, dass das Glycin vor der Kopplung des eluierten Schaf-Antikörpers an die CNBr-aktivierte Säulenmatrix aus der Antikörperlösung entfernt werden muss, da ansonsten sowohl der Antikörper als auch die Glycin-Moleküle anschließend an das für das Endprodukt vorgesehene Säulen-Matrixmaterial gekoppelt werden. Dabei werden die aktivierten Kopplungsstellen durch Glycin besetzt und auf diese Weise die Protein-Kopplungsstellen verdrängt, so dass die Kapazität der Säule für die Bindung von Immunglobulin oder LDL reduziert ist. Das Entfernen des Glycinpuffers erforderte ein zeitaufwändiges Dialyseverfahren, in dem der Glycin- durch einen Carbonatpuffer ersetzt wurde.
Als nächstes wurde, um Aminogruppen zu vermeiden, ein Acetatpuffer getestet (0,10 M Natriumacetat/0,150 M NaCl/HCl). Jedoch wurde gefunden, dass die Arbeitssäulen ihre Bindungskapazität mit der Zeit verloren. Dies beruhte auf einer unvollständigen Elution des Antikörpers, wodurch es dazu kam, dass ein großer Anteil der Bin dungsstellen auf der Arbeitssäule permanent besetzt war. Zufällig wurden zwei geeignete Citrat-Elutionspuffer und außerdem ein besserer Acetatpuffer entdeckt. Bevorzugte Elutionspuffer sind:

(1) 5 mM Mononatriumcitrat/10 mM Citronensäure, pH 2,8,
(2) 5 mM Mononatriumcitrat/63 mM Citronensäure, pH 2,2,
(3) 5 mM Natriumacetat/Essigsäure, pH 2,8.

Der Elutionspuffer wird über die Arbeitssäule passiert, an welche die Antikörper gekoppelt sind, und die eluierten Antikörper werden direkt durch Sterilisierungsfilter laufen gelassen.
Vorzugsweise wird eine Arbeitssäule mit einer Kapazität von etwa 450 bis 900 ml verwendet. Nachdem 3 000 bis 8 000 ml Elutionspuffer über die Arbeitssäule laufen gelassen wurden, enthält das gewonnene Eluat 70 bis 100% der Antikörper, die ursprünglich an die Säule gebunden waren.
Die gewonnenen Anti-Mensch-Ig- oder Anti-Mensch-LDL-Antikörper werden sodann unter sterilen Bedingungen an ein steriles Matrixmaterial gekoppelt. Vorzugsweise ist das Matrixmaterial ein Kohlenhydrat-basiertes Material, z. B. Sepharose^TM. Andere geeignete Matrixmaterialien umfassen autoklavierbare Matrizen, z. B. Perlen, Fasern und Membranen, die aus Glas oder synthetischen Polymeren bestehen, z. B. Polymethacrylaten, Polystyrolen und Polyamiden.
Das Kopplungsverfahren wird in einem sterilisierten Isolator mit Glove-Boxen (Klasse 100) durchgeführt, der in einem Reinraum der Klasse 100 000 steht. Die inneren Teile des Isolators werden anhand eines speziellen Ultraschall-Gas-Zerstäubungsprozesses sterilisiert, wobei Peressigsäure und Wasserstoffperoxid in Essigsäure verwendet werden. Alle Stoffe, die in den Isolator eingeführt werden oder den Isolator verlassen, sind steril, oder es ist vorgesehen, dass sie steril-filtriert werden.
Das Kopplungsverfahren wird in einem für die Praxis geeigneten Maßstab durchgeführt, indem ein großes Aktivierungsgefäß aus rostfreiem Stahl verwendet wird, mit dem 1800 ml Sepharose in einem Ansatz innerhalb eines Isolators aktiviert werden können. Vorzugsweise wird das Gefäß aus rostfreiem Stahl durch Gaszerstäubung in dem Isolator sterilisiert. Andererseits kann das Gefäß aus rostfreiem Stahl auch bei 250°C in mindestens zwei Stunden hitzesterilisiert werden.
Das Matrixmaterial kann nicht durch herkömmliche Verfahren dampfsterilisiert werden, z. B. durch eine Dampfsterilisation (121°C, 15 Minuten, 2 bar), da das Material schmelzen würde. Dieses Problem wurde durch eine Reihe von Vorspülgängen mit einer sterilen Lösung umgangen, die innerhalb von Isolatoren so lange durchgeführt werden, bis eine sehr geringe biologische Belastung erreicht ist. Danach wird das vorgespülte Säulen-Matrixmaterial in Flaschen gefüllt und bei einer niedrigeren Temperatur dampfbehandelt, wie im nachstehenden Beispiel 4 beschrieben.
Anschließend wird das sterile, Pyrogen-freie Matrixmaterial durch Inkubation mit einer Cyanogenbromid-Lösung wie im nachstehenden Beispiel 5 beschrieben aktiviert.
Sobald das Säulen-Matrixmaterial aktiviert ist, werden die Antikörper durch Inkubation mit der aktivierten Matrix an die Säule gekoppelt (Beispiel 5).
Wenn andererseits die Aktivierung und die Kopplung gleichzeitig erfolgen sollen, wird die Antikörperlösung im Reaktionsgefäß mit 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI) kombiniert und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert (Beispiel 5).
Sobald das Kopplungsverfahren beendet ist, wird das Matrixmaterial, an welches Antikörper gekoppelt sind, gründlich gewaschen und sodann auf Cyanatester, Sterilität und Pyrogenität getestet. Das gekoppelte Matrixmaterial wird auch auf das gesamte gebundene Protein und die Bindungsaktivität des gekoppelten Proteins getestet. Danach wird das gekoppelte Matrixmaterial unter keimfreien Bedingungen in sterile, entpyrogenierte, silanierte Glasgehäuse gefüllt, wodurch sterile und Pyrogen-freie Proteingekoppelte Säulen hergestellt werden.
Somit stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Herstellen steriler und Pyrogen-freier Säulen bereit, an welche ein Protein gekoppelt ist, das seine gewünschte Bindungsaktivität beibehält. Die sterilen und Pyrogen-freien Säulen sind für die Verwendung im Zusammenhang mit menschlichen Individuen geeignet, bei denen vorher festgelegte Substanzen aus ihrem Blut entfernt werden müssen. Außerdem eignet sich das Verfahren zum Herstellen der Säulen in einem großen Maßstab, vorzugsweise mit etwa 40 000 Säulen pro Jahr oder mehr.
Die folgenden Versuchsbeispiele sollen die Erfindung lediglich erläutern und in keiner Weise den Umfang der Erfindung einschränken.
Beispiel 1
Herstellen und Virus-Inaktivieren von Anti-Mensch-Ig- und Anti-Mensch-LDL-Antikörperlösungen
Das Herstellen eines immunisierten Schaf-Plasmas erfolgte unter „Good Manufacturing Practices", die von der örtlichen Behörden in Heidelberg, Deutschland, zugelassen worden waren. Die Herde von gesunden männlichen Schafen wurde in einem speziellen Gehege von anderen Tieren isoliert gehalten. Ihr natürliches Grasfutter wurde mit zusätzlichem natürlichem Futter ohne Tiermehl angereichert. Alle Schafe wurden durch einen qualifizierten Tierarzt routinemäßig untersucht, wobei er schriftliche Vorgaben zur Pflege der Tiere befolgte. Die aufgenommenen neuen Schafe wurden anfangs mindestens drei Wochen unter Quarantäne gestellt und serologisch getestet (Suche nach Antikörpern gegen Brucella melitensis, Leptospira, Listeria monocytogenes und Border Disease-Virus). Ein weiterer Test auf Antikörper gegen das Maedi-Visna-Virus wurde alle sechs Monate, insgesamt drei Tests, durchgeführt.
Polyclonale Antiseren, die gegen menschliches Immunglobulin gerichtet waren, wurden induziert, indem den Schafen ein menschliches IgG-Immunogen injiziert wurde, das aus einer gepoolten menschlichen Immunglobulin-Plasmafraktion (Gammagard S/D^TM, Baxter Hyland) zusammen mit komplettem Freundschem Adjuvans hergestellt worden war.
Polyclonale Antiseren, die gegen menschliches LDL gerichtet waren, wurden induziert, indem den Schafen ein Immunogen injiziert wurde, das aus komplettem Freundschem Adjuvans und aus einem Affinitätschromatographie-gereinigten LDL aus dem Plasma menschlicher Individuen bestand. Die Individuen, die das LDL spendeten, wurden streng gescreent und nach dem Spenden auf die wichtigsten durch Blut übertragenen Viren überwacht. Außerdem betrug die Wartezeit zwischen dem Isolieren von LDL und seiner ersten Verwendung mindestens sechs Monate. So konnte das gespendete LDL von den Individuen, die während dieser Zeit auf ein Virus positiv getestet wurden, zurückgezogen werden, bevor das Produkt ausgeliefert wurde.
Die Tiere erhielten anfängliche und Booster-Injektionen des Immunogens. Das Plasma wurde aus den immunisierten Tieren durch eine Routine-Plasmapherese gewonnen, wobei eine Zelltrennvorrichtung verwendet wurde, die mit sterilen, Pyrogen-freien Einwegschläuchen ausgestattet war. Das Schafplasma wurde mit ACD antikoaguliert. Die Einwegschläuche wurden mit einer sterilen, Pyrogen-freien Natriumchloridlösung vorbereitet. Das Plasma wurde über ein geschlossenes Schlauchsystem in sterilen, Pyrogen-freien Transportverpackungen („transfer packs", Baxter/Fenwal) gewonnen und unmittelbar danach bei etwa –20°C (Bereich von –18°C bis –30°C) eingefroren. Das Plasma wurde bis zum nächsten Verarbeitungsschritt gefroren aufbewahrt.
Andererseits können auch monoclonale Antikörper gegen menschliches Immunglobulin hervorgerufen werden, indem Mäusen zuerst ein geeignetes Antigen injiziert wird, z. B. eine menschliche leichte Kappa- oder Lambda-Kette. Monoclonale Antikörper gegen menschliches LDL können induziert werden, indem Mäusen zuerst ein gereinigtes LDL-Paräparat injiziert wird. Danach können die Milzzellen der immunisierten Mäuse mit Myelomzellen fusioniert werden, wodurch Antikörper-produzierende Hybridome hergestellt werden (Köhler, G., und Milstein, C., 1975, Nature 256: 495–497).
Um die monoclonalen Antikörper zu selektieren, die dann an eine Säule gekoppelt werden sollen, die eingesetzt werden kann, um ein Individuum für ein Schweineorgan-Tranplantat vorzubereiten, können die ausgeschiedenen monoclonalen Anti-Mensch-Ig-Antikörper in einem ELISA-artigen Test auf Schweine-Endothelzellen wie folgt gescreent werden: (1) Gewebekulturplatten mit mehreren Vertiefungen („multiwell") werden mit einer Beschichtung von Schweine-Endothelzellen versehen; (2) die Schweine-Endothelzellen werden mit menschlichem Immunglobulin inkubiert, so dass menschliche Anti-Schwein-Antikörper an die Schweinezellen binden können; (3) sodann wird das menschliche Immunglobulin, das nicht an die Schweinezellen bindet, weggespült; (4) konditionierte Medien von einzelnen monoclonalen Hybridomen werden in den Vertiefungen inkubiert, so dass monoclonale Antikörper an die menschlichen Anti-Schwein-Antikörper binden können, die ihrerseits an die Schweinezellen in den Vertiefungen gebunden sind; (5) Marker für die monoclonalen Antikörper werden zugegeben, z. B. Fluorescein-konjugierte Schaf-Anti-Maus-Antikörper; (6) diejenigen Vertiefungen, die hell fluoreszieren, werden als positiv bewertet, d. h. sie enthalten einen monoclonalen Antikörper, der an menschliches Immunglobulin bindet, das seinerseits an Schweinezellen bindet.
Die ausgeschiedenen Anti-Mensch-LDL-Antikörper können in einem ELISA gescreent werden, der auf ELISA-Platten mit gebundenem LDL basiert.
Auf diese Weise können ein oder mehrere geeignete monoclonale Antikörper für die Produktion im großen Maßstab identifiziert werden. Diese monoclonalen Antikörper können sodann durch Affinitätschromatographie und anschließende Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt und danach an das Säulen-Matrixmaterial gekoppelt werden, wie nachstehend beschrieben.
Wenn ein geeigneter monoclonaler Antikörper identifiziert und sequenziert wurde, besteht die Möglichkeit, rekombinante Antikörper, z. B. mehrkettige oder einzelkettige Antikörper, zu produzieren. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können diese rekombinanten Antikörper an das Säulen-Matrixmaterial gekoppelt werden. Rekombinante mehrkettiger Antikörper können gemäß den Verfahren produziert werden, die im US-Patent Nr. 4 816 397 (Boss et al.) beschrieben sind. Rekombinante einzelkettige Antikörper können gemäß den Verfahren hergestellt werden, die im US-Patent Nr. 4 946 778 (Ladner et al.) beschrieben sind.
Wenn die Antikörper als monoclonale Antikörper oder durch Gentechnik hergestellt werden, ist es möglich, ihre Sterilität eng zu kontrollieren. Wenn jedoch der Antikörper, der an die Säule gekoppelt werden soll, in einem Tier hervorgerufen wird, ist es besonders wichtig sicherzustellen, dass alle Viren, die im Serum des Tiers vorliegen, inaktiviert werden.
Im Fall von polyclonalen Antiseren, die wie vorstehend beschrieben im Schaf induziert wurden, wurden die folgenden Prozeduren unter keimfreien Bedingungen durchgeführt, wobei sterile und Pyrogen-freie Instrumente, Kunststoffprodukte und Lösungen verwendet wurden. Der Plasmapool wurde durch Zugabe von 1 bis 10 μl CaCl₂-Lösung (1 Mol/l) pro ml Serum rekalzifiziert und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Plasmagerinnsel abzentrifugiert.
Das tierische Serum wurde für die Virus-inaktivierende Hitzebehandlung zubereitet, indem es mit einem Stabilisator gemischt wurde, der aus Saccharose (30%, Gew./Gew.) und Ascorbinsäure (5 mMol/l) bestand. Danach wurde das stabilisierte Se rum in leere Beutel gefüllt, auf mindestens 60°C bis etwa 62°C erhitzt und mindestens zehn Stunden bei dieser Temperatur gehalten. Sodann wurde das hitzebehandelte Serum durch ein 20-μm-Transfusionsfilter in leere Beutel filtriert. Die gefüllten Beutel wurden keimfrei versiegelt, beschriftet und bei –20°C (im Bereich von –18 bis –30°C) aufbewahrt.
Dieser Virus-Inaktivierungsprozess und auch die folgenden Prozesse wurden validiert, indem vor jedem Produktionsschritt drei Modellviren zugegeben wurden und danach das Produkt auf die eventuell verbliebenen infektiösen Viren getestet wurde. Diese drei Modellviren (menschliches Poliovirus Typ 2, menschliches Adenovirus Typ 2 und Maedi-Visna-Virus des Schafs) repräsentierten einen Bereich von menschlichen und tierischen Viren mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften. Das Maedi-Visna-Virus des Schafs ist ein Lentivirus (Retrovirus). Die Adenoviren sind große DNA-Viren und sind wie andere nicht-entwickelte Viren eher resistent gegenüber einer physikalisch-chemischen Behandlung als entwickelte Viren. Das Poliovirus ist ein kleines RNA-Virus, das besonders resistent ist gegenüber zahlreichen physikalischchemischen Verfahren, einschließlich der Verwendung von Puffern mit niedrigem pH-Wert, die nachstehend in mehreren Schritten eingesetzt werden. Bei Verfahren, die menschliche Blutprodukte umfassten, wurde anstelle des Adenovirus ein Herpesvirus zugegeben. Außerdem wurden bei menschlichen Blutprodukten spezifische Inaktivierungsstudien auf HIV durchgeführt.
Als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme können zwei weitere Verfahren zur Inaktivierung von Viren angewendet werden, eine Lösungsmittel/Detergens-Behandlung und eine Virusfiltration. Die Lösungsmittel/Detergens-Behandlung soll Lipid-entwickelte Viren inaktivieren. Zuerst wird der pH-Wert der Produktlösung auf pH 4,5 eingestellt. Dann werden die Lösungsmittel/Detergenzien Tween^® 80 (0,3%), Triton^® X-100 (1,0%) und Tri-N-butylphosphat (0,3%) zu der Produktlösung zugegeben. Nach Zugabe der Lösungsmittel/Detergens-Reagenzien wird das Gemisch mindestens eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt.
Die Virusfiltration entfernt Viren durch eine Tangentialflussfiltration. Hierfür wird die Membran Viresolve^TM 180 von Millipore eingesetzt. Die Porengröße der Membran schließt Moleküle aus, die größer als 180 kD sind. Zuerst wird die Membran mit sterilem Wasser gespült, um die zur Lagerung verwendete Lösung zu entfernen. Danach wird sie 60 Minuten bei 121°C autoklaviert. Vor der Virusfiltration wird die Membran mit Äquilibrierungspuffer äquilibriert. Zuerst werden 90% des Volumens der Produktlösung anhand einer Tangentialflussfiltration durch die Membran filtriert. Nach der ersten Filtration wird eine Diafiltration durchgeführt. Die verbliebenen 10% der Produktlösung werden mit 1 Volumenanteil Äquilibrierungspuffer verdünnt. Dieser Diafiltrationsschritt wird viermal durchgeführt. Nachdem die Filtration vollständig erfolgt ist, wird die Membran gereinigt und durch den „CORR-Test" auf Unversehrtheit getestet.
Nach dem Virusinaktivierungs-Schritt wird der Serumpool erneut wie vorstehend eingefroren. Der nächste Schritt beim Bearbeiten des Serumpools umfasst das Zirkulieren über zwei Glassäulen, die Vorsäule und Arbeitssäule genannt werden. Im Fall von Anti-LDL-Serum enthält die Vorsäule Sepharose^TM, an die menschliches Ig und menschliches Albumin gekoppelt ist, und die Arbeitssäule ist mit menschlichem LDL gekoppelt. Im Fall von Anti-Mensch-Ig-Serum enthält die Vorsäule Sepharose^TM, an die menschliches Albumin gekoppelt ist, und die Arbeitssäule ist mit menschlichem Ig gekoppelt.
Beispiel 2
Herstellen von Vor- und Arbeitssäulen
Alle Schritte wurden unter keimfreien Bedingungen durchgeführt.
Vorsäule für Anti-LDL: Menschliches Serumalbumin und IgIV (Gammagard^® S/D, Baxter Hyland Division) wurden an die Sepharose^TM im Wesentlichen wie nachstehend beschrieben gekoppelt.
Vorsäule für Anti-Mensch-Ig: Menschliches Serumalbumin wurde an die Sepharose^TM im Wesentlichen wie nachstehend beschrieben gekoppelt.
Arbeitssäule für Anti-LDL: LDL wurde durch Affinitätschromatographie aus dem Plasma von Individuen wie vorstehend beschrieben isoliert und an die Sepharose^TM wie nachstehend beschrieben gekoppelt.
Arbeitssäule für Anti-Mensch-Ig: Ein Präparat mit gepooltem menschlichem Immunglobulin (Gammagard^® S/D, Baxter, Hyland Division) wurde in Puffer gelöst (140 g Gammagard^®/100 ml Puffer). Das gelöste Gammagard^TM wurde einer Ultrafiltration unterworfen, um das Glycin zu entfernen, denn es hatte sich gezeigt, dass Glycin die chromatographische Trennung des IgG vom Albumin stört. Gammagard^® enthält typischerweise pro 10 g gefriergetrocknetes Produkt 4500 mg Glycin/100 ml. Das Ziel bestand darin, den Glycingehalt auf weniger als 960 mg/l zu reduzieren, hierfür waren sechs Ultrafiltrationsschritte erforderlich. Für die Ultrafiltration wurde das Gammagard^® mit sterilem Puffer auf 5000 ml verdünnt, die Lösung auf 100 ml eingeengt und die Schritte noch fünfmal wiederholt. Danach wurde die Gammagard^®-Lösung durch ein 0,2-μm-Sterilisierungsfilter passiert.
Menschliches IgG wurde aus dem Gammagard^® unter Verwendung von zwei Gradientenschritten einer Ionenaustausch-Chromatographie bei 2 bis 8°C isoliert (300 ml Q-Sepharose^TM Fast Flow, gepackt in eine XK50/30-Säule; Säulenlänge etwa 14 cm, Durchmesser 5 cm; Pharmacia). Die Reinheit des isolierten IgG wurde anhand einer SDS-Gel-Elektrophorese getestet.
Der nächste Schritt bestand darin, das IgG an das Säulen-Matrixmaterial zu koppeln. Dabei wurde jedoch entdeckt, dass TRIS und das restliche Glycin in der gereinigten IgG-Lösung die Koppelung des IgG an das Säulen-Matrixmaterial störten. Um dieses Problem zu umgehen, wurde ein 11-stufiges Ultrafiltrationsverfahren durchgeführt, mit dem der TRIS-Gehalt auf weniger als 211 μg/l und der Glycin-Gehalt auf weniger als 35 μg/l reduziert wurde. Das Volumen der IgG-Lösung wurde mit einem sterilen Natriumcarbonatpuffer auf 5000 ml, pH 9, gebracht. Die Lösung wurde durch Ultrafiltration unter konstantem Rühren auf 1000 ml eingeengt und die Prozedur zehnmal wiederholt. Nach dem zehnten Schritt wurde die Lösung auf 2000 bis 2500 ml reduziert. Danach wurde die Lösung auf den Protein-, TRIS- und Glycingehalt analysiert und in einem Isolator steril filtriert. In diesem Schritt wies die Lösung einen pH-Wert von 9 auf.
Andererseits kann ein Gemisch aus menschlichen Immunglobulinen, z. B. IgG und IgM, an die sterile Matrix gekoppelt werden.
Das Matrixmaterial wurde sterilisiert, aktiviert und mit der geeigneten Proteinlösung gekoppelt, wie nachstehend für das Herstellen der therapeutischen Säulen beschrieben wird.
Ergebnisse: Mindestens 15 g (Bereich von 10 bis 20 g) menschliches IgG wurden an 350 g (Bereich von 300 bis 400 g) Matrixmaterial gekoppelt, um eine ausreichende Bindungskapazität für die Arbeitssäule zu erreichen.
Beispiel 3
Sterile Reinigung von Anti-Mensch-Ig-Antikörpern
Der pasteurisierte Serumpool von Beispiel 1 wurde aufgetaut und über zwei Glassäulen zirkuliert, wobei die eine Sepharose CD4B, gekoppelt an Albumin (Vorsäule), und die andere Sepharose CL4B, gekoppelt an IgG (Arbeitssäule), enthielt.
Der Prozess zum Auftragen des Serums und Waschen der Säule erfolgte durch ein geschlossenes automatisches chromatographisches System (BioPilot^TM System, Pharmacia) in einem Reinraum der Klasse 100 000 bei einer Umgebungstemperatur von 2 bis 8°C. Das BioPilot^TM-System wurde fortlaufend auf die biologische Belastung kontrolliert, CIP-Läufe („cleaning in place procedure", Reinigen an Ort und Stelle) wurden routinemäßig durchgeführt, und während längerer Standzeiten wurden die Vor- und Arbeitssäulen mit 0,1% Natriumazidlösung gefüllt.
Die Verbindungen vom System zu den Behältern des Schafserums, den sterilen Puffern und den sterilen Filtern wurden unter keimfreien Bedingungen mit speziell entwickelten sterilen und Pyrogen-freien Einwegschläuchen aus Kunststoff hergestellt.
Zu Beginn jedes Laufs kann das Serum mit sterilem PBS-Puffer auf bis zu 5000 ml verdünnt werden. Danach wurde die Serumlösung automatisch über die Vorsäule passiert, worauf eine automatische Passage über die Arbeitssäule folgte.
Sobald die gewünschten Antikörper an die Arbeitssäule gebunden hatten und die unerwünschten Substanzen aus der Säule abgeflossen waren, wurden die gewünschten Antikörper aus der Arbeitssäule eluiert. Nachdem vorzugsweise 3000 bis 8000 ml Elutionspuffer passiert worden waren, enthielt das gewonnene Eluat 70 bis 100% der ursprünglich auf die Säulen aufgetragenen Antikörper.
Optimale Ergebnisse wurden erst erreicht, nachdem die bevorzugten Elutionspuffer entdeckt worden waren. Laborexperimente, bei denen verschiedene Elutionspuffer verwendet wurden, sind in den nachstehenden Tabellen 1 bis 3 angegeben:
Tabelle 1 Ausbeute des eluierten Schaf-Antikörpers unter Verwendung verschiedener Elutionspuffer
Die prozentuale Ausbeute wurde auf die Antikörpermenge bezogen, die mit Acetatpuffer (Baxter) eluiert wurde (100%).
Tabelle 2 Stabilität des isolierten Antikörpers
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Tabelle 2 (Fortsetzung)
Tabelle 2: Größenverteilung des Schaf-Anti-Mensch-IgG nach Lagerung bei 2 bis 8°C in verschiedenen Elutionspuffern
Kriterien für die gelagerten Antikörper: Σ Monomere plus Dimere ≥ 90%
Tabelle 3 Bindungskapazität von Ig-Therasorb^®-Arbeitssäulen nach Regeneration
Ergebnisse: Es wurde gefunden, dass Glycinpuffer ungeeignet ist, da die Glycin-Aminogruppen in der eluierten Antikörperlösung sich im anschließenden Kopplungsschritt an das aktivierte Matrixmaterial koppelten. Deshalb war beim Glycinpuffer ein zeitaufwändiger Dialyseschritt erforderlich, um das Glycin gegen Carbonat auszutauschen. Auch die ursprüngliche Acetatformulierung war ungeeignet (0,10 M Natriumacetat/0,150 M NaCl/HCl, pH 2,8). Bei Verwendung des Glycinpuffers oder der ursprünglichen Acetatformulierung nahm die Menge des aus der Arbeitssäule eluierten Antikörpers mit der Zeit ab, wodurch der Prozess relativ ineffektiv und teuer wurde. Jedoch wurden drei Pufferformulierungen entdeckt, die die gewünschten Antikörper effektiv eluieren konnten, wobei ihre Bindungskapazität erhalten blieb. Außerdem hatte das Vorliegen dieser neuen Pufferkomponenten keine ungünstige Wirkung auf die anschließenden Produktionsschritte. Die drei bevorzugten Elutions- und Lagerungspuffer sind:

(1) 5 mM Mononatriumcitrat/10 mM Citronensäure, pH 2,8;
(2) 5 mM Mononatriumcitrat/63 mM Citronensäure, pH 2,2, für den gefunden wurde, dass er für die Regeneration von Arbeitssäulen geeignet ist, dagegen für die langfristige Antikörperlagerung weniger geeignet ist;
(3) 5 mM Acetat/Essigsäure, pH 2,8.

Die Stabilität der gelagerten Antikörper wurde durch die Menge intakter Monomere und Dimere im Vergleich zu Fragmenten festgestellt. Nach einem Lagerungszeitraum von 77 Tagen bei 2 bis 8°C betrug der Gehalt an Monomeren und Dimeren in Puffer (1) 93% im Vergleich zu 86% in der früheren Acetatformulierung (0.10 M Natriumacetat/0,150 M NaCl/HCl, pH 2,8).
Die Bindungskapazität von gebrauchten Säulen wurde durch eine Regeneration mit dem vorstehenden Puffer (1) oder Puffer (2) um 33 bis 67% stark verbessert.
Während der Elutionsprozedur wurden die eluierten Antikörper direkt durch Sterilisierungsfilter (0,2 μM) passiert und in sterilen und Pyrogen-freien Einweg-Auffangbeuteln gesammelt und bei 2 bis 8°C aufbewahrt.
Um die Antikörperlösungen einzuengen, wurde ein Ultrafiltrationsschritt in einem Reinraum der Klasse 100 000 mit einer 10 000-kD-Membran durchgeführt (Omega-Serien, geringbindendes Polyethersulfon, Filtron Technology Corporation). Typischerweise wurde die Antikörperlösung etwa 20- bis 80-fach oder von etwa 50 bis 200 Liter hinunter auf etwa 2,5 Liter eingeengt. Von den prozessierten Antikörpern wurden unter keimfreien Bedingungen Proben entnommen, mit denen eine Überwachung während des Prozesses nach dem Ultrafiltrationsschritt erfolgte.
Zu diesem Zeitpunkt enthielt das eingeengte Eluat etwa 74 bis 97% der Antikörper, die ursprünglich an die Säule gebunden wurden.
Beispiel 4
Herstellen eines sterilen, Pyrogen-freien Säulen-Matrixmaterials
Das Säulen-Matrixmaterial wurde durch eine Serie von Vorspülgängen und eine darauf folgende Dampfsterilisation steril und Pyrogen-frei gemacht. Das Verfahren wurde innerhalb eines sterilisierten Isolators durchgeführt.
Etwa zwei Tage vor Beginn dieses Verfahrens wurde ein Agarose-Füllmaterial (Sepharose^TM CL4B) keimfrei in ein steriles und Pyrogen-freies 5-Liter-Becherglas gefüllt, so dass es sich über Nacht durch Schwerkraft absetzen konnte. Am zweiten Tag wurde das Volumen der Sepharose^TM auf ein Minimum von 2100 ml abgesetztes Gel (= 6 Flaschen à 350 ml) pro einem 5-Liter-Becherglas bestimmt. Das Volumen der Sepharose^TM wurde keimfrei eingestellt und diese, sofern erforderlich, erneut zum Absetzen stehengelassen.
Jeder Ansatz der Sepharose^TM wurde mit einem Gesamtvolumen von mindestens 21 Litern steriles und Pyrogen-freies Wasser in Schritten von jeweils 4500 ml gespült, wobei innerhalb des Isolators gearbeitet wurde. Zwischen den jeweiligen Schritten wurde die Sepharose^TM durch Vakuum vollständig getrocknet. Die endgültige gespülte Suspension wurde sodann in 500-ml-Flaschen gefüllt, die mit Gummistopfen verschlossen wurden.
Proben wurden entnommen, um die biologische Belastung zu bestimmen. [Der Test auf biologische Belastung wurde an mehreren Punkten im Produktionsprozess bei H30, 1, durchgeführt.] Der Test auf biologische Belastung war erforderlich, um zu zeigen, dass keine Enterobakterien, kein Pseudomonas aeruginosa und kein Staphylococcus aureus vorlagen; wobei die Alarmstufe auf ein aerob wachsendes Bakterium pro g Probe eingestellt wurde. Die Flaschen wurden unter keimfreien Bedingungen unter Verwendung einer Hand-Vakuumpumpe evakuiert und mit Metallkappen fest verschlossen.
Danach wurden die Flaschen mit der gespülten Sepharose^TM innerhalb von 72 Stunden nach dem vorstehenden Spülschritt dampfsterilisiert. Die Dampfsterilisation erfolgte unter Verwendung eines validierten Dampfautoklaven bei 115°C mindestens 20 Minuten bei < 2 bar. Die Zykluszeit wurde automatisch reguliert, so dass ein F_o-Wert von 6 erreicht wurde. Nach der Dampfsterilisation wurden Proben zum Bestimmen der biologischen Belastung und zum Testen auf Pyrogenität entnommen. Der Test auf biologische Belastung war erforderlich, um zu zeigen, dass maximal ein koloniebildender Organismus pro 100 ml vorlag. Der Pyrogenitätstest (Limulus-Amöbocytenlysat-Test) beruhte auf der Fähigkeit von Endotoxinen, das Gelieren von Eiweiß durch einen Amöbocytenextrakt zu bewirken. Danach wurde der Lowry-Eiweißtest verwendet, um die Endotoxinmenge kolorimetrisch bei 660 nm quantitativ zu bestimmen. Der Pyrogengehalt musste unter 0,25 EU/ml liegen.
Beispiel 5
Aktivieren von Matrixmaterial und Koppeln von Antikörpern
Dieses und andere Verfahren, wie vorstehend und in 1 gezeigt, wurden innerhalb eines sterilisierten Isolators durchgeführt. Eine der Hauptschwierigkeiten beim Verwenden von Isolatoren für die keimfreie Arbeit besteht darin, das Innere des Isolators selbst vor Beginn der keimfreien Prozedur zu sterilisieren. Ein Dampfgenerator (La Calhene, Frankreich) erhitzt Peressigsäure (PAA), so dass Dampf erzeugt wird, durch den der Isolator dampfsterilisiert wird. Dieses Verfahren läuft trocken ab, es wirkt jedoch langsam, aufgrund einer geringeren Aktivität von Chemikalie und Wasser und aufgrund von Problemen beim Mischen von Dampf/Luft. Zufällig wurde entdeckt, dass ein zu einem feinen Nebel zerstäubter Dampf die Sterilisation des Isolators erleichtern konnte, indem die erforderliche Zeit und der erforderliche Arbeitsaufwand verringert wurden. In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde das flüssige Sterilisationsmittel in den Isolator hinein in der kleinsten Menge zerstäubt, die erforderlich war, um einen gesättigten Dampf und eine Oberlächenkondensation bereitzustellen. Während des Einführens und der Exposition wurde das Sterilisationsmittel innerhalb des Isolators zirkuliert. Der Zerstäuber arbeitete, indem er eine Flüssigkeit in einem Behälter durch Zuführen von Energie bei Ultraschallfrequenzen aufbrach. Hierfür wurde der Zerstäuber Ultra Neb^TM 99 (DE VILBISS) verwendet. Der Behälter des Zerstäubers wurde mit 200 bis 210 ml Peressigsäure gefüllt und der Schlauch des Zerstäubers mit der Einlassöffnung an der Rückseite des Isolators verbunden. Der Ventilator wurde im Isolator am Greifer befestigt. Danach wurden in den Isolator die Stoffe, die für den nächsten Schritt erforderlich waren, gemäß eines validierten Bestückungsmusters eingebracht. Der Abluftschlauch wurde mit dem Abluftsystem verbunden. Der Zersfäubungsprozess wurde be gonnen, wobei innerhalb des Isolators ein Druck von nicht mehr als 1 mm Hg vorlag. Die Zerstäubung wurde beendet, wenn der PAA-Gehalt des Zerstäubers auf 160 ml abgenommen hatte (Zerstäubung von 40 bis 50 ml). Hierauf folgte eine Inkubationszeit von mindestens zehn Minuten. Nach der Inkubationszeit wurde der Isolator durchgespült, indem der Ventilator des Isolators angeschaltet wurde, so dass im Isolator ein Überdruck entstand (etwa 4 bis 5 mm Hg), anschließend wurde die Entlüftungsöffnung geöffnet. Für jeden einzelnen Isolator wurden eine Mindestspülzeit validiert (typischerweise mindestens 80 bis 110 Minuten).
Ein Aktivierungsgefäß aus rostfreiem Stahl wurde verwendet, um 1800 ml Sepharose^TM CL4B in einem Ansatz innerhalb eines Isolators zu aktivieren. Das Aktivierungsgefäß musste vor der Verwendung sterilisiert werden. Zuerst wurde das Gefäß aus rostfreiem Stahl mindestens zwei Stunden bei 250 bis 280°C hitzesterilisiert. Diese Behandlung führte jedoch zu Spannungen zwischen dem „scinter" und dem Körper des Aktivierungsgefäßes, wodurch es zu aufgelockerten oder feinen Flecken zwischen dem „scinter" und dem Boden kam. Durch diese Behandlung nutzte sich das Material des Aktivierungskessels rasch ab. Statt dessen wurde die Sterilisation anhand der Gaszerstäubung durchgeführt.
Ein Isolator wurde in einem Reinraum der Klasse 100 000 installiert. Alle Stoffe und Geräte wurden in dem Isolator installiert, dessen Inneres anschließend durch den vorstehend beschriebenen Ultraschall-Zerstäubungprozess sterilisiert wurde. Außerhalb des Isolators wurde ein mit Calciumhypochlorit gefüllter Abfallbehälter für die Inaktivierung von CNBr aufgestellt. Die Pall^TM-Sterilfiltereinheiten wurden sterilisiert und am Isolator befestigt. Das eine Filter wurde verwendet, um steriles Pyrogen-freies Wasser in den Isolator hinein zu filtrieren, und das andere wurde verwendet, um die Abfallflüssigkeiten in den äußeren Abfallbehälter zu überführen.
Die Sepharose^TM wurde dreimal mit sterilem, Pyrogen-freiem Wasser gespült und danach in 60% Aceton/Wasser gespült und resuspendiert, wobei innerhalb des Isolators gearbeitet wurde. Als nächstes wurde die Sepharose^TM mit CNBr und Triethylamin- (TEA-) Lösung aktiviert. CNBr: 14 bis 15 g Cyanogenbromid pro 96 ml Aceton. Für eine Aktivierung innerhalb des Gefäßes aus rostfreiem Stahl waren 1800 ml erforderlich. TEA: 30 ml Triethylamin (analytische Qualität, Merck) in 66,2 ml 87% Aceton. Die Aufschlämmung aus Sepharose^TM, Aceton und Wasser wurde auf –18°C gekühlt und die CNBr-Lösung (etwa 580 bis 650 ml) innerhalb einer Minute kontinuierlich zugegeben. Danach wurde die TEA-Lösung (etwa 580 bis 650 ml) innerhalb von zwei Minuten kontinuierlich zugegeben. Die Temperatur von –10°C wurde erreicht, wenn die exotherme Reaktion beendet war (etwa 45 Sekunden nach Beenden der TEA-Zugabe). Eine Minute nach der TEA-Zugabe wurde die Aceton/HCl-Lösung zugefügt. Aceton/HCl: 392 ml steriles, Pyrogen-freies Wasser, 16,3 ml 5 N HCl, 408 ml Aceton. Auf diese Weise wurden mehrere Flaschen Sepharose^TM jeweils einzeln aktiviert. Die aktivierte Sepharose^TM wurde innerhalb von drei Stunden, vorzugsweise so bald wie möglich, für die Kopplung verwendet.
Die Cyanatester wurden auf der aktivierten Sepharose^TM anhand des Spectroquant^®-Testkits (Merck) bestimmt, anschließend wurden die konzentrierten Antikörper zugegeben, wodurch die Effizienz der chemischen Aktivierung getestet werden konnte.
Nach der Aktivierung wurde die Sepharose^TM im Aktivierungsgefäß rasch fünfmal in sterilem, Pyrogen-freiem Wasser gespült. Dieser Schritt musste schnell durchgeführt werden, um die Hydrolyse der aktiven Gruppen zu vermeiden. Danach wurde die steril filtrierte Antikörperlösung in das Aktivierungsgefäß überführt und zwei Stunden gerührt. Nach zwei Stunden wurde die Sepharose^TM-Suspension zweimal abwechselnd mit Lösungen des pH-Werts 2,8 (Bereich von 2,2 bis 3,0) und PBS gespült. Die Sepharose^TM wurde vorsichtig in PBS resuspendiert und wiederholt gespült, wobei insgesamt 60 Liter (Bereich von 50 bis 200 Liter) 0,9% NaCl pro Aktivierungsgefäß-Ansatz (etwa 1800 ml Sepharose^TM) verwendet wurden. Danach wurde die Antikörper-gekoppelte Sepharose^TM-Masse in sterile Flaschen gefüllt und diese mit Metallkappen verschlossen. Die Flaschen wurden bis zum nächsten Produktionsschritt bei 2 bis 8°C gelagert. Es wurde gefunden, dass die Flaschen bis zu 12 Wochen gelagert werden konnten.
Die gebrauchten Filter wurden auf Unversehrtheit getestet. [Tests auf Unversehrtheit der Filter wurden während des Produktionsprozesses mehrmals durchgeführt, nämlich bei H17 und H31, 1.] Nach Beenden der Aktivierung und Kopplung wurde der Suspensionsüberstand einem weiteren Cyanid-Test auf das restliche Cyanid unterworfen.
Als nächstes wurde ein weiterer Spülgang mit steriler 0,9% NaCl durchgeführt, um im Überstand einen Gehalt an nicht-gekoppeltem Protein unter 10 ng pro ml zu erreichen. Die Mengen an gebundenem und ungebundenem Protein wurden durch Standardverfahren bestimmt. Unter Verwendung der vorstehenden Verfahren war es möglich, mindestens 50 bis 100 g Antikörper gekoppelt an 1800 ml Sepharose^TM (Bereich von 1800 bis 2000 ml) zu erhalten.
Jeder Ansatz wurde auf den Proteingehalt getestet, indem das BCA-Reagens (Bicinchoninsäure-Reagens) und die Absorption bei 562 nm verwendet wurden (Smith et al., Anal. Biochemie 1985).
Ein anderes Verfahren zum Aktivieren und Koppeln beruht auf der Verwendung von 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI). Dieses Verfahren funktioniert bei Matrixmaterialien, z. B. Cellulose, Agarose oder Polystyrol, die Hydroxy- oder Carboxylgruppen aufweisen, an welche die Antikörper gekoppelt werden können. Ein einzelnes Reaktionsgefäß wird für die gleichzeitige Aktivierung des Matrixmaterials und die Kopplung der Antikörper an das aktivierte Material verwendet. Der Reaktionspuffer ist 0,1 Mol/l NaHCO₃, pH 8,1 bis 8,2. CDI wird in das Reaktionsgefäß bis zu einer Endkonzentration von 6,2 mg/ml (38,2 mMol/l) zugegeben. Die Proteinlösung wird auf Konzentrationen zwischen 400 μg/ml und 1000 μg/ml zugefügt. Die ganze Umsetzung wird bei Raumtemperatur durchgeführt, umfassend die Inkubation des Matrixmaterials mit CDI und der Antikörperlösung über Nacht etwa 12 bis 20 Stunden, vorzugsweise 15 Stunden. Anschließend werden mögliche verbliebene aktive Gruppen gesättigt, indem das Antikörper-gekoppelte Matrixmaterial mit 0,1 Mol/l Ethanolamin in 0,1 Mol/l NaHCO₃, pH 8,0, gewaschen wird. Schließlich folgt ein Spülgang mit 0,1 Mol/l NaOAc-Puffer, pH 4,0, um die noch verbliebenen freien aktiven Gruppen zu zerstören. Die Menge des an das Matrixmaterial gekoppelten Antikörpers wird anhand des BCA-Proteintests bestimmt. Die Ausbeute des an das Matrixmaterial gekoppelten Antikörpers hängt von dem Verhältnis des Proteins zum Matrixmaterial im Reaktionsgemisch ab. Bei einem niedrigen Verhältnis des Antikörpers zum Matrixmaterial können bis zu 100% des Antikörpers gekoppelt werden. Wenn man das Verhältnis des Antikörpers zum Matrixmaterial erhöht, führt dies zu größeren absoluten Mengen des gekoppelten Antikörpers, bis ein Plateau erreicht wird. Von diesem Punkt ab führt das weitere Erhöhen des Verhältnisses des Antikörpers zum Matrixmaterial im Reaktionsgemisch zu niedrigeren prozentualen Anteilen des gekoppelten Antikörpers, dies beruht möglicherweise darauf, dass der Oberflächenbereich des Matrixmaterials mit dem Protein gesättigt ist.
Beispiel 6
Fertigstellen des endgültigen Produkts
Die Glassäulengehäuse mit Glassinter wurden gereinigt, getrocknet, silaniert und entpyrogeniert und sodann innerhalb eines sterilisierten Isolators mit den entsprechenden Verbindungsschläuchen verbunden.
Die gewaschene Protein-gekoppelte Sepharose^TM wurde innerhalb des sterilisierten Isolators in die Glassäulengehäuse gefüllt. Proben wurden entnommen für eine Schwermetallanalyse, Partikelanalyse, für Pyrogenitäts- und Sterilitätstests.
Beispiel 7
Monoclonale Antikörper als Alternativen für die an Säulen gebundenen polyclonalen Antikörper
Die Aufgabe der folgenden Experimente bestand darin, die Reduktion der Immunglobulin-Klassen IgG, IgM und IgA in menschlichem Plasma durch Verwendung einer Immunabsorptionsvorrichtung zu zeigen, die aus monoclonalen Antikörpern bestand, die kovalent an einen Feststoffträger gekoppelt waren. Außerdem sollte die Entfernung aller vier Subklassen des menschlichen IgG bestimmt werden.
Material:

– Sepharose^® CL-4B, Pharmacia
– Ultrafree^®-CL-Filter (nominale Molekulargewichtsgrenze: 10 kD), Millipore^®
– Mobicol^®, leere Säulen mit 10-μm-Membran, MoBitec^®
– Monoclonaler Antikörper gegen die menschliche leichte κ-Kette (Isotyp IgG₁, Maus), Biozol^®
– Monoclonaler Antikörper gegen die menschliche leichte λ-Kette (Isotyp IgG, Maus), Biozol^®
– IgG-Subklassen-Kit, ICN
– Antikörper IgG, IgM, IgA, incl. Puffer und Verdünnungsmittel, Beckman
– Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)(pH 7,2), Baxter
– Acetatpuffer (pH 2,8), Baxter
– Glycin (pH 2,8), Baxter

Verfahren
Das Binden menschlicher Immunglobuline der Klassen IgG (umfassend die Subklassen 1 bis 4), IgA und IgM und außerdem xenoreaktiver Antikörper (menschlicher IgG und IgM gegen Schweinezellen) wurde mit einem relativ einfachen Gemisch aus monoclonalen Antikörpern erreicht, die für die leichten κ-Ketten des menschlichen Immunglobulins und die leichten λ-Ketten des menschlichen Immunglobulins spezifisch waren. Die Experimente wurden im kleinen Maßstab mit 300 μl Antikörper-gekoppelter Sepharose^® durchgeführt.
Koppeln von Antikörpern an Sepharose^® CL-4B
Ein Gemisch aus zwei Typen von monoclonalen Antikörpern (jeweils 5 mg) wurde durch Zentrifugation in Ultrafree^®-CL-Filtern (2000 g, 8°C) auf eine Konzentration von 2 mg/ml eingeengt. Vor der Kopplung wurde der pH-Wert der Antikörperlösung mit Natriumhydrogencarbonat-Puffer, pH 11, auf den Wert 9,0 eingestellt. Die Aktivierung der Sepharose^® CL-4B mit Cyanogenbromid erfolgte wie vorstehend beschrieben. Danach wurden die Antikörper über Nacht bei 2 bis 8°C an die Sepharose^® gekoppelt. Für die Kopplung wurden 10 mg Antikörper pro 250 mg Sepharose^® eingesetzt. Nach der Kopplung wurde die Sepharose^® fünfmal abwechselnd mit Acetatpuffer, pH 2,8, und PBS-Puffer, pH 7,2, gewaschen, um die ungebundenen Antikörper auszuspülen.
Bearbeiten des Plasmas
Nach dem Überführen der Antikörper-gekoppelten Sepharose^® in eine leere Mobicol^®-Säule (66,5 mm × 105 mm, Volumen: 0,30 ml gepackes Medium) wurde menschliches Plasma aufgetragen. Das Plasma wurde 30 Minuten inkubiert. Danach wurde das Plasma mit einem zehnfachen Volumen PBS (3 ml) ausgespült.
Quantitative Bestimmung der Immunglobuline
Die quantitative Bestimmung der Immunglobuline (IgG 1 bis 4, IgA, IgM) im unbehandelten und im bearbeiteten Plasma erfolgte mittels einer Radialimmundiffusion (RID).
Quantitative Bestimmung der xenoreaktiven Antikörper
Die Verringerung der xenoreaktiven Antikörper wurde mit Hilfe eines Schweineendothelzellen- (PEC-) Immuntests (ELISA) gemessen, wie in Platt, J. L., et al., Transplantation 49: 1000–1001, 1990, beschrieben. Kurz gesagt wurden Endothelzellen aus der Schweineaorta isoliert und in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, das 20 fetales Kälberserum enthielt, gezüchtet (Ryan, U. S., et al., J. Tissue Cult Methods, 1986, 3). Die Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Nunc^TM) bis zur Konfluenz gezüchtet. Die Zellen in den Vertiefungen wurden in PBS gespült und in 200 μl kalter Glutaraldehydlösung (0,1%) fünf Minuten bei 4°C fixiert, worauf ein Waschgang in Hanks ausgeglichener Salzlösung (HH) folgte. Die unspezifischen Bindungsstellen auf den Zellen wurden blockiert, indem die Zellen in einer HH, die 1 Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, 45 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Als positive Kontrollseren diente ein gepooltes menschliches Serum (PHS). 50 μl der Kontroll- und Testseren wurden zu den Vertiefungen zugegeben und eine Stunde bei 4°C (beim IgM-ELISA) oder bei 37°C (beim IgG-ELISA) inkubiert, worauf drei Spülgänge in HH folgten. Sodann wurden 50 μl des sekundären Antikörpers zu jeder Vertiefung zugegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der sekundäre Antikörper beim IgM-ELISA war Ziegen-Anti-Mensch-IgM, konjugiert mit alkalischer Phosphatase; der sekundäre Antikörper beim IgG-ELISA war Ziegen-Anti-Mensch-IgG, genauso konjugiert. Nach dem Waschen wurde die Markerreaktion in Diethanolamin (0,1 M mit 0,5 × 10^–3 M MgCl₂) mit einem Phosphatase-Substrat (1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat) entwickelt. Das Entwickler/Substrat-Gemisch wurde mit 100 μl/Vertiefung zugegeben und die Platten im Dunkeln bei Raumtemperatur etwa 30 Minuten oder so lange inkubiert, bis die positive Kontrolle eine Absorption bei 405 nm von 1 bis 1,5 ergab. Die Platten wurden auf einem Standard-ELISA-Plattenlesegerät bei 405 nm abgelesen.
Ergebnisse Tabelle 4 Quantitative Bestimmung von Immunglobulinen
Die quantitative Bestimmung erfolgte durch Radialimmundiffusion (RID). Die verwendeten Standardseren wurden gemäß der Weltgesundheitsorganisation (WHO) standardisiert.
Bearbeitetes Plasmavolumen: 500 μl
Volumen der Sepharose^®: 300 μl
Zeit der Plasmabearbeitung: 30 Minuten
Wie in Tabelle 4 gezeigt wird, wurden alle Immunglobulinklassen und alle IgG-Subklassen (1 bis 4) durch die gekoppelten monoclonalen Antikörper reduziert.
Tabelle 5 Quantitative Bestimmung xenoreaktiver Antikörper
Bearbeitetes Plasmavolumen: 500 μl
Volumen der Sepharose^®: 300 μl
Zeit der Plasmabearbeitung: 30 Minuten
Das Anti-Schwein-IgG war um etwa 10% reduziert. Eine Reduktion des Anti-Schwein-IgM war nicht nachweisbar.
Diskussion
Es wurde gezeigt, dass es möglich ist, Immunglobuline im menschlichen Plasma zu reduzieren, und zwar nicht nur durch polyclonale, sondern auch durch monoclonale Antikörper, die an einen Feststoffträger gekoppelt sind. Um eine Reduktion aller Immunglobuline im Plasma zu erreichen, unabhängig von ihrem Typ und ihrer Spezifität, wurden monoclonale Antikörper gewählt, von denen man erwarten konnte, dass sie alle erkennen und an alle binden. Die verwendeten zwei Maus-Antikörper (Isotyp IgG₁) waren spezifisch für leichte κ-Ketten menschlicher Immunglobline bzw. leichte λ-Ketten menschlicher Immunglobline. Genauso hätte man auch monoclonale Antikörper mit anderen Epitop-Spezifitäten oder Isotypen oder rekombinante Antikörper auswählen können.
Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass alle vier IgG-Subklassen durch die Säule mit dem monoclonalen Antikörper reduziert wurden (Tabelle 4). Die IgG-Subklassen 1, 2, 3 und 4 wurden jeweils um etwa 30% reduziert. Wie aus Tabelle 5 ersichtlich ist, konnte eine Reduktion von xenoreaktiven Antikörpern nur für IgG, nicht jedoch für IgM bestimmt werden, da der Immuntest für die Bestimmung von IgM weniger empfindlich ist als für IgG.
Die relativ niedrige Reduktion der Immunglobuline war nicht erstaunlich, da das Experiment in einem kleinen analytischen Maßstab durchgeführt wurde, d. h. mit einer kleinen Antikörpersäule (300 μl Sepharose^®), und da nur ein einziger Plasmazyklus erfolgt war. Für klinische Zwecke sollten größere Säulen mit monoclonalen Antikörpern verwendet und mehrere Zyklen zur Plasmabearbeitung durchgeführt werden, so dass die Immunglobuline und gewünschten Antikörper in einem befriedigenden Ausmaß verringert werden können.

Claims

Verfahren zum Herstellen einer sterilen und Pyrogen-freien Säule, die ein Matrixmaterial enthält, an welches ein Protein gekoppelt ist, wobei die Säule zum Entfernen einer vorher festgelegten Substanz aus dem Blut eines menschlichen Individuums verwendet werden kann, wobei das Verfahren das Folgende umfasst: • Bereitstellen einer gereinigten Lösung eines Proteins, das an die vorher festgelegte Substanz im menschlichen Blut bindet, wobei die Lösung Pathogen-frei ist, • Bereitstellen eines sterilen und Pyrogen-freien Matrixmaterials, das chemisch aktiviert ist, wobei das Matrixmaterial durch ein Verfahren steril und Pyrogen-frei gemacht wird, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Spülen des Matrixmaterials unter keimfreien Bedingungen mit sterilem und Pyrogen-freiem Wasser, bis ein Test auf die biologische Belastung das Vorliegen von Null Enterobakterien, Null Pseudomonas aeruginosa, Null Staphylococcus aureus und weniger als einem aerob wachsenden Bakterium pro g anzeigt, und (b) Dampfbehandeln des Matrixmaterials bei 115°C bei weniger als 2 bar, bis ein Wert von F_o = 6 erreicht ist, • Inkontaktbringen des aktivierten Matrixmaterials unter keimfreien Bedingungen mit der Proteinlösung, wodurch die Kopplung des Proteins an das Matrixmaterial erreicht wird, und • Verpacken des Matrixmaterials, an welches das Protein gekoppelt ist, unter keimfreien Bedingungen in ein steriles und Pyrogen-freies Gehäuse in Form einer Säule, wodurch eine sterile und Pyrogen-freie Säule hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Lösung eines Proteins aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Staphylococcus-aureus-Protein-A, Streptococcus-Protein-G, Anti-Mensch-Immunglobulin-Antikörpern und Anti-Mensch-Low-density-Lipoprotein- (Anti-LDL-)Antikörpern besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die vorher festgelegte Substanz, die aus dem menschlichen Blut entfernt werden soll, aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Immunglobulin G (IgG), Immunglobulin M (IgM), Immunglobulin A (IgA), Im munglobulin E (IgE), Low-density-Lipoprotein (LDL) und Lipoprotein a (Lp(a)) besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Proteinlösung Antikörper umfasst, wobei die Antikörper aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus polyclonalen Antikörpern, monoclonalen Antikörpern und durch Gentechnik hergestellten rekombinanten Antikörpern besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Säulen-Matrixmaterial aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Perlen, Fasern und Membranen besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Säulen-Matrixmaterial aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Glas, Kohlenhydraten, Polymethacrylaten und Polyamiden besteht.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Säulen-Matrixmaterial eine Agarose ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Proteinlösung aus einem tierischen Serum hergeleitet ist, das Pathogen-frei gemacht wird durch die Schritte umfassend: (a) Zufügen eines Stabilisators, der ein Kohlenhydrat und ein Antioxidans enthält, zu dem Serum, wodurch ein stabilisiertes Serumgemisch erzeugt wird, (b) Erhitzen des stabilisierten Serumgemisches auf einen Temperaturbereich von mindestens 60 bis 62°C, (c) Beibehalten des Temperaturbereichs für mindestens 10 Stunden, und (d) Filtrieren des stabilisierten Serumgemisches durch ein 20-μm-Filter in einen sterilen und Pyrogen-freien Behälter.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Kohlenhydrat Saccharose bei einer Konzentration von 30% Gew./Gew. ist und das Antioxidans Ascorbinsäure bei einer Konzentration von 5 mMol/l ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Proteinlösung Anti-Mensch-Low-density-Lipoprotein- (LDL-)Antikörper umfasst und wobei die Proteinlösung gereinigt wird durch die Schritte umfassend: (a) Bereitstellen einer sterilen und Pyrogen-freien ersten Säule, die ein erstes Matrixmaterial enthält, an welches menschliches Albumin und menschliches Immunglobulin gekoppelt ist, (b) Passieren der Proteinlösung über die erste Säule unter keimfreien Bedingungen, wodurch jegliche unerwünschte Substanzen entfernt werden, die an das erste Matrixmaterial binden, (c) Bereitstellen einer sterilen und Pyrogen-freien zweiten Säule, die ein zweites Matrixmaterial enthält, an welches menschliches LDL gekoppelt ist, (d) Passieren der Proteinlösung aus Schritt (b) über die zweite Säule unter keimfreien Bedingungen, wodurch die Bindung der Anti-Mensch-LDL-Antikörper an das zweite Matrixmaterial erreicht wird, und (e) Eluieren der Anti-Mensch-LDL-Antikörper mit einem sauren Puffer.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Proteinlösung Anti-Mensch-Immunglobulin- (Ig-)Antikörper umfasst und wobei die Proteinlösung gereinigt wird durch die Schritte umfassend: (a) Bereitstellen einer sterilen und Pyrogen-freien ersten Säule, die ein erstes Matrixmaterial enthält, an welches menschliches Albumin gekoppelt ist, (b) Passieren der Proteinlösung über die erste Säule, wodurch jegliche unerwünschte Substanzen entfernt werden, die an das erste Matrixmaterial binden, (c) Bereitstellen einer sterilen und Pyrogen-freien zweiten Säule, die ein zweites Matrixmaterial enthält, an welches menschliches Ig gekoppelt ist, (d) Passieren der Proteinlösung aus Schritt (b) über die zweite Säule, wodurch die Bindung der Anti-Mensch-Ig-Antikörper an das zweite Matrixmaterial erreicht wird, und (e) Eluieren der Anti-Mensch-Ig-Antikörper mit einem sauren Puffer.
Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, wobei der saure Puffer aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 5 mM Mononatriumcitrat/10 mM Citronensäure, pH 2,8, und 5 mM Mononatriumcitrat/63 mM Citronensäure, pH 2,2, besteht.
Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei der saure Puffer aus 5 mM Acetat/Essigsäure, pH 2,8, besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die sterile und Pyrogen-freie Matrix unter keimfreien Bedingungen aktiviert wird durch die Schritte umfassend: (a) Bereitstellen eines sterilen und Pyrogen-freien Aktivierungsgefäßes, (b) Suspendieren der Matrix in Aceton in dem Aktivierungsgefäß, wodurch eine Matrix/Aceton-Lösung hergestellt wird, (c) Kühlen der Matrix/Aceton-Lösung auf –18°C, (d) Zufügen einer CNBr-Lösung, (e) Zufügen einer Triethylamin-Lösung, wodurch bewirkt wird, dass im Aktivierungsgefäß eine Temperatur von –10°C erreicht wird, und (f) Zufügen einer Aceton/HCl-Lösung, wodurch der Aktivierungsprozess beendet wird.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Schritt des Inkontaktbringens unter keimfreien Bedingungen durchgeführt wird durch die Schritte umfassend: (a) Zufügen der gereinigten Proteinlösung zu dem Aktivierungsgefäß, so dass eine Aufschlämmung erzeugt wird, (b) Rühren der Aufschlämmung, zwei Stunden, (c) Spülen der Aufschlämmung mit abwechselnd sauren und neutralen Lösungen, (d) Spülen der Aufschlämmung mit mindestens 50 Liter Phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pro 1800 ml Aufschlämmung, und (e) Resuspendieren der Aufschlämmung in PBS.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das sterile und Pyrogen-freie Matrixmaterial unter keimfreien Bedingungen aktiviert und mit der Proteinlösung in Kontakt gebracht wird durch die Schritte umfassend: (a) Bereitstellen eines sterilen und Pyrogen-freien Aktivierungs gefäßes, (b) Kombinieren des sterilen und Pyrogen-freien Matrixmaterials in dem Aktivierungsgefäß mit 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI) und mit der Proteinlösung, (c) Inkubieren des Matrixmaterials mit dem CDI und der Proteinlösung bei 19 bis 24°C, 12 bis 20 Stunden, wodurch die Kopplung des Proteins an das Matrixmaterial erreicht wird, (d) Waschen des Matrixmaterials mit 0,1 Mol/l Ethanolamin in 0,1 Mol/l NaHCO₃, pH 8,0, wodurch die restlichen aktiven Gruppen auf dem Matrixmaterial gesättigt werden, und (e) Zufügen von 0,1 Mol/l NaOAc-Puffer bei pH 4,0 zu dem Matrixmaterial, wodurch die restlichen freien aktiven Gruppen auf dem Matrixmaterial zerstört werden, an welches das Protein gekoppelt ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei in Schritt (b) das CDI bei einer Endkonzentration von etwa 38,2 mMol/l in einem Reaktionspuffer, umfassend 0,1 Mol/l NaHCO₃, bei pH 8,1 bis 8,2, kombiniert wird, und die Proteinlösung bei einer Konzentration von 400 bis 1000 μg/ml kombiniert wird.
Verfahren, mit dem ein Säulen-Matrixmaterial steril und Pyrogen-frei gemacht wird durch die Schritte umfassend: (a) Spülen des Matrixmaterials unter keimfreien Bedingungen mit sterilem und Pyrogen-freiem Wasser bis ein Test auf biologische Belastung das Vorliegen von Null Enterobakterien, Null Pseudomonas aeruginosa, Null Staphylococcus aureus und weniger als einem aerob wachsenden Bakterium pro g anzeigt, und (b) Dampfbehandeln des Matrixmaterials bei 115°C bei weniger als 2 bar, bis ein Wert von F_o = 6 erreicht ist.