DE69932817T2

DE69932817T2 - Reinigungsverfahren zur herstellng von mannan bindendem lectin (mbl) und mbl enthaltende medizinische zubereitung

Info

Publication number: DE69932817T2
Application number: DE69932817T
Authority: DE
Inventors: Inga Laursen
Original assignee: Statens Serum Institut SSI
Current assignee: Statens Serum Institut SSI
Priority date: 1998-06-10
Filing date: 1999-06-10
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2019-06-11
Also published as: CA2334696C; DE69932817D1; AU764066B2; DK1084143T3; EP1084143B1; NZ509089A; EP1084143A1; ATE336504T1; AU4134399A; CA2334696A1; WO1999064453A1; ES2272067T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Reinigungsverfahren zur Herstellung von Mannan bindendem Lektin (MBL) (früher Mannan-Bindungsprotein, MBP, bezeichnet) vorzugsweise aus Spenderplasma, das als eine medizinische MBL-Zubereitung verwendet werden soll. Eine pharmazeutische Formulierung des Produkts soll für die Substitutions- oder Ersatztherapie in Patienten mit vererbtem oder erworbenem MBL-Mangel, der mit funktionellen und/oder klinischen Symptomen assoziiert ist, verwendet werden, d.h. wo in Betracht gezogen wird, dass die Patienten von der Verabreichung von MBL z.B. für die Behandlung oder Verhinderung von Infektionen profitieren würden.
EINLEITUNG
Angeborene (auch genannt natürliche oder nicht antizipierende) Immunfunktionen haben kürzlich ein steigendes Interesse als wichtige Elemente in den Abwehrmechanismen gegen potentielle pathogene Mikroorganismen erhalten. Daher ist einer Gruppe von Lektinen, den Collektinen, von denen angenommen wird, dass sie eine wichtige Rolle in der unmittelbaren Abwehr gegen einen breiten Bereich von Mikroorganismen spielen, eine besondere Beachtung geschenkt worden. Das Serumprotein MBL ist ein Collektin, d.h. es ist als oligomere Strukturen aufgebaut, die durch Calcium-abhängige, C-Typ-Kohlenhydrat-Erkennungsdomänen (CRDs), die an kollagenöse Stäbe angeheftet sind, charakterisiert sind. Die genaue Oligomerisierung von zirkulierendem MBL bleibt unklar; oligomere Bouquet-ähnliche Strukturen von höherer Ordnung wie hexameres MBL mit mehreren Bindungsstellen erscheinen jedoch wesentlich für die funktionelle Aktivität von MBL zu sein (für neue Literaturübersichten siehe Bezugnahmen 1, 2) (eine Liste von Bezugnahmen ist am Ende dieser Beschreibung angegeben).
Das kumulative Wissen über MBL weist auf eine zukünftige Rolle dieses Proteins in der Interventionstherapie gegen schwere Infektionen hin. MBL ist strukturell ähnlich zum Komplementbestandteil C1q, einem wesentlichen Bestandteil in der Aktivierung des klassischen Signalwegs von Komplement. MBL scheint das Komplementsystem durch einen Mechanismus zu aktivieren, der analog zu jenem von C1q ist, d.h. durch assoziierte Serin-Proteasen, genannt MASPs (MBL-assoziierte Serin-Proteasen). Diese Antikörper-unabhängige Komplementaktivierung ist der „MB-Lektin-Signalweg der Komplementaktivierung" genannt worden (3, 4).
MBL bindet an Kohlenhydratstrukturen auf Oberflächen von Bakterien, Hefe, parasitischen Protozoen und Viren, und es ist gefunden worden, dass es durch Töten der Bakterien durch den terminalen, cytolytischen Signalweg des Komplementsystems oder durch die Förderung der Phagocytose durch Opsonisierung eine antibakterielle Aktivität zeigt. Der Spiegel von MBL im Plasma wird genetisch bestimmt. Jedes Individuum hat einen konstitutionellen MBL-Spiegel, der durch die genomische Struktur in der kontrollierenden Region sowie in der codierenden Region reflektiert wird. Die Konzentration von MBL im Plasma variiert daher von etwa 10 μg/ml bis weniger als 10 ng/ml. Kinder oder Erwachsene mit einem Mangel oder sehr niedrigen Spiegeln von MBL sind besonders empfänglich für Infektionen. Neuere Information zeigt auf eine Rolle des MBL-Mangels als ein Empfänglichkeitsfaktor für eine HIV-Infektion und auch darauf, dass ein MBL-Mangel mit schnellerem Tod nach der Entwicklung von AIDS assoziiert ist (1). Der MBL-Mangel kann auch für wiederkehrende spontane Aborte prädisponierend sein (5).
Mannan bindendes Lectin wurde zuerst 1983 (6) von menschlichem Serum durch Affinitätschromatographie auf Mannan-Sepharose (Mannan, gekoppelt an eine Sepharose-Matrix) in der Anwesenheit von Ca-Ionen isoliert. Die Elution von MBL aus der Affinitätssäule wurde durch EDTA durchgeführt.
Es erscheint von späteren Veröffentlichungen, dass MBL im Wesentlichen durch dasselbe Verfahren aus Serum und Plasma gereinigt worden ist. Die gereinigten MBL-Präparate, die von diesem Ein-Schritt-Verfahren gewonnen wurden, waren durch Antikörper mit einer Spezifität für Kohlenhydrate und die amyloide Serum-p-Komponente (SAP) stark kontaminiert. Um MBL von hoher Reinheit zu erhalten, wurden weitere chromatographische Schritte in die Reinigungsverfahren eingeschlossen, wie eine Sepharose-Vorsäule zu der Affinitätssäule und zusätzliche Affinitätsschritte unter Verwendung von verschiedenen Kohlenhydraten, die entweder an die Matrix gekoppelt oder zum Elutionspuffer zugefügt wurden; andere chromatographische Prinzipien wie Ionenaustausch- und Gelfiltrations-Chromatographie wurden auch angewendet (7, 8, 9, 10). Im Allgemeinen sind mindestens zwei affinitätschromatographische Schritte in den Verfahren zum Erhalten von hoch-gereinigtem MBL angewendet worden. Vor kurzem ist von Tan et al. ein Verfahren beschrieben worden, bei dem eine Plasmaprotein-Fraktion, die durch Präzipitation von menschlichem Plasma mit 7% PEG erhalten wurde, als das Ausgangsmaterial für die MBL-Reinigung verwendet wurde (11). Dieses Verfahren unterschied sich von jenen, die früher beschrieben wurden, dadurch, dass die Affinitätschromatographie auf einer nicht konjugierten, nicht vernetzten Sepharose (Sepharose ohne immobilisierte Kohlenhydrat-Liganden) durchgeführt wurde: zuerst wurde das gelöste PEG-Präzipitat einer diskontinuierlichen Adsorption auf Sepharose unterzogen, und nach der Elution von MBL durch EDTA wurde ein nachfolgender Affinitätschromatographie-Schritt auf einer Sepharosesäule durchgeführt, wobei MBL durch Mannose eluiert wurde. Durch dieses Verfahren, das zwei aufeinanderfolgende Affinitätsschritte anwendet, wurde MBL mit hoher Reinheit erhalten.
Das Produkt von Tan et al. (11) enthält jedoch synthetische Protease-Inhibitoren. Die Puffer, die für den Affinitätschromatographie-Schritt in Tan et al. verwendet wurden, wurden mit Proteaseinhibitoren wie Pefabloc und Phenanthrolin angepasst. Wenn Proteine vom Plasma mit PEG präzipitiert werden, ist es wohlbekannt, dass Fibrinogen als das erste Plasmaprotein präzipitieren wird. Daher wird das PEG-Präzipitat, das das Ausgangsmaterial darstellt, neben MBL Fibrinogen einschließen. Es ist wohlbekannt, dass die proteolytische Spaltung von Fibrinogen, die zu einer Fibringerinnselbildung, Fibrinaggregaten/Gerinnseln führt, Probleme während der Säulenchromatographie verursachen wird, wenn Ca²⁺-enthaltende Puffer verwendet werden, was zu einem Anwuchs an die Matrix und im besten Fall unkontrolliertem Fibrin-Aussickern während des Waschens und der Elution führt. Dies wird es unmöglich machen, das von Tan et al. beschriebene Verfahren durchzuführen, wenn keine Proteaseinhibitoren zu den Puffern zugefügt werden. EMEA und andere Gesundheits-regulierende Behörden-Richtlinien beschränken die Verwendung von chemischen Agenzien im Reinigungsverfahren sowie im Endprodukt. Daher kann das Produkt, das durch das Verfahren von Tan et al. erhalten wird, auf Grund des Gehalts, sogar in Spurenmengen, von synthetischen Proteaseinhibitoren nicht für die medizinische Verwendung geeignet sein.
Ein rekombinantes therapeutisches MBL-Produkt ist im US-Patent 5,270,199 an Ezekowitz (14) beschrieben. Dieses Produkt enthält jedoch nicht den MBL-MASP-Komplex, der für das Aktivieren des Komplementsystems entscheidend ist (1). Es enthält daher kein funktionell aktives, oligomeres MBL.
Koppel et al. (15) liefern ein Verfahren für die Reinigung von MBL, das als ein diagnostisches Mittel, insbesondere in der Identifizierung von sehr niedrigen Mengen von IgM, als eine Alternative zu der Verwendung von anti-IgM-Antikörpern verwendet werden soll. Es liefert darüber hinaus ein Produkt, das MBL umfasst, das aus Kaninchenserum gereinigt wurde.
Kilpatrick (16) liefert ein Verfahren für die Reinigung von menschlichem MBL. Signifikante Mengen eines bakteriostatischen Agens, Natriumazid, werden jedoch zu der Präparation zugefügt. Toxikologische Studien an Natriumazid haben histopathologische Läsionen im Gehirn (Nekrose des Großhirns und Thalamus) und in der Lunge (Kongestion, Hämorrhargie und Ödem) offenbart.
Die DNA, die das menschliche Mannose bindende Protein codiert, wird in WO98/01519 offenbart.
DETAILLIERTE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Mannan bindendem Lectin (MBL), vorzugsweise aus einer unbehandelten Plasmaprotein-Fraktion. Das Verfahren der Erfindung wird unter anderen Elementen mindestens zwei Schlüsselelemente einschließen: das Durchführen eines Affinitätschromatographie-Schritts auf einer nicht konjugierten vernetzten Polysaccharid-Matrix und das Durchführen von mindestens einem abgesicherten Virenreduktionsschritt.
Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Formulierung eines funktionell aktiven oligomeren MBL-Produkts, das vollkommen frei von synthetischen Proteaseinhibitoren und/oder bakteriostatischen Agenzien ist. In weiteren Aspekten betrifft die Erfindung die Formulierung eines MBL-Produkts für die Verwendung in der Medizin und die Verwendung der Formulierung für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten, die mit angeborenem, vererbtem oder erworbenem MBL-Mangel in einem Säuger assoziiert sind.
MBL kann aus einem weiten Bereich von Ausgangsmaterialen, die MBL enthalten, gereinigt werden. In einer Ausführungsform ist das Ausgangsmaterial für das Verfahren der Erfindung ein MBL enthaltender Überstand oder eine lysierte Zellsuspension von einer Hefe- oder einer Säuger-Zellkultur, die MBL exprimiert, wobei die Zellkultur Zellen umfasst, die Säuger (z.B. menschliches)-MBL codieren und optionell die MBL Assoziierten Serin-Proteasen (MASPs) codieren. Die MBL-exprimierende Zellkultur wird in einem Medium, das der Zellkultur die benötigten Nährstoffe bereitstellt, mit oder ohne Serum, das dem Kulturmedium zugefügt wird, gezüchtet. In einer anderen Ausführungsform wird MBL aus Mich und/oder Vormilch von einem Säuger gereinigt, der ein Säuger (z.B. menschliches)-MBL-Gen exprimiert. In einer Ausführungsform ist der Säuger ein transgenes nicht-menschliches Tier. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Ausgangsmaterial für das Verfahren der Erfindung eine unbehandelte Plasmaprotein-Fraktion, die von Ethanol-Fraktionierungsverfahren im industriellen Rahmen erhältlich ist, wie die Cohn-Fraktion I, II und III; die Cohn-Fraktion II und III; oder die Cohn-Fraktion III. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Plasmaprotein-Fraktion die Cohn-Fraktion II und III, wo eine Filterhilfe abhängig vom angewendeten Verfahren für die Isolierung der Cohn-Faktion, d.h. durch Filtration oder Zentrifugation, vorhanden sein kann oder nicht. Die Verwendung der Cohn-Faktion II und III als Ausgangsmaterial hat einige Vorteile. Diese umfassen, sind aber nicht limitiert auf: kein Bedarf einer weiteren Ethanol-Fraktionierung, Immunglobuline können für ein Immunglobulin-Produkt gewonnen werden, und MBL wird von einer Fraktion gewonnen, die normalerweise verworfen wird.
Jedes der Ausgangsmaterialien wird ein paar Vorbehandlungsschritte erfordern, um eine MBL enthaltende Lösung zu erhalten. Die Vorbehandlungsschritte werden unten diskutiert werden.
Das erste Schlüsselelement des vorliegenden Verfahrens, die Affinitätschromatographie auf einer nicht konjugierten vernetzten Polysaccharid-Matrix, hat einige Vorteile. Diese umfassen, sind aber nicht limitiert auf: kein Bedarf für eine vorherige Proteinpräzipitation, Selektivität für funktionell aktives MBL, ein hoher Grad der Reinigung, Entfernen von Viren, Konzentrierung durch Volumenreduktion.
Die MBL enthaltende Lösung ist ein komplexes Proteingemisch, wo MBL weniger als 0,05% der Gesamtproteine der Ausgangsmaterialien darstellen kann. Die Reinigung durch chromatographischen Verfahren alternativ zur Affinitätschromatographie würde eine weitere Protein-Fraktionierung der MBL enthaltenden Lösung z.B. durch Proteinpräzipitation erfordern. Der Vorteil des Anwendens eines Affinitätsschritts ist, dass keine vorherigen Protein-Fraktionierungsschritte wie Präzipitations- und Resuspensionsschritte benötigt werden, was daher erlaubt, die MBL enthaltende Lösung direkt auf die Säule aufzutragen.
Als eine Folge der Vorbehandlungsschritte, z.B. der Ethanolfraktionierung oder des Wesens des verwendeten MBL-Expressionssystems, wird erwartet, dass die MBL enthaltende Lösung MBL als natürliche, oligomere Proteine sowie denaturierte und strukturell beeinträchtigte Proteinformen enthält. Da das MBL-Produkt für die Verwendung in der Medizin durch funktionell aktives MBL dargestellt sein muss, ist es von großer Wichtigkeit, einen Reinigungsschritt durchzuführen, der auf Funktionalität selektiert. Die Affinitätschromatographie erfüllt diese Anforderung durch Selektieren auf funktionell aktives, oligomeres, Liganden bindendes MBL.
Es ist wohlbekannt, dass die Affinitätschromatographie das Verfahren der Wahl für die Reinigung von Proteinen aus einem komplexen Proteingemisch ist und oft in einer einige-tausendfachen Reinigung resultiert. Durch den Affinitätschromatographie-Schritt der vorliegenden Erfindung wird MBL zu einem sehr hohen Grad, d.h. mehr als 2500-fach, gereinigt. Die Affinitätschromatographie ist der Haupt-Reinigungsschritt des Verfahrens und trägt fast ausschließlich zu der hohen Reinheit bei, die in der endgültigen MBL-Präparation des Verfahrens erhalten wird. Sogar eine Reinigung zu einem geringen Grad ist weit über dem, was derzeit auf dem Fachgebiet bekannt ist. Auch eine Reinigung, die 500-fach, d.h. 1000-, 1500-, 2000- oder 2250-fach ist, ist akzeptabel. Eine Reinigung zu einem geringen Grad ist besonders akzeptabel, wenn weniger komplexe Proteingemische als das Ausgangsmaterial verwendet werden. Das heißt, wenn MBL mehr als etwa 0,05% des gesamten Proteingehalts ausmacht.
Obwohl die MBL enthaltende Lösung, die auf die Säule aufgetragen wird, konzentriert worden sein kann, ist die Konzentration von MBL noch relativ niedrig, und die Affinitätschromatographie dient durch mindestens 3-faches Konzentrieren des aufgetragenen MBL wie mindestens 4-faches Konzentrieren des aufgetragenen MBL als ein Konzentrierungsschritt.
Der Affinitätschromatographie-Schritt wird auf einer nicht konjugierten Polysaccharid-basierenden Matrix durchgeführt. Unter einer nicht konjugierten Matrix wird verstanden, dass keine Kohlenhydrat-Liganden an die Matrix gekoppelt sind. Die Vorteile umfassen, sind aber nicht limitiert auf: Die grundlegende Struktur des als Matrix verwendeten Mediums besteht aus Bündeln von Polysaccharidketten, die als Liganden für MBL wirken. Es gibt keinen Bedarf für eine spezielle Herstellung einer Matrix durch chemische Kopplung von Kohlenhydrat-Liganden. Die Probleme mit einer instabilen Matrix und/oder einem unkontrollierten Aussickern der Liganden werden vermieden.
Darüber hinaus ist die Matrix vernetzt. Der Vorteil eines vernetzten Polysaccharid-Materials ist die Starrheit und die hohe physikalische Stabilität, die die Verwendung einer großen Säule mit guten Durchflusseigenschaften in dem Verfahren ermöglicht. Die vernetzte Matrix hat darüber hinaus den Vorteil einer hohen chemischen Stabilität, die das Reinigen der Säule mit z.B. starken alkalischen Lösungen ermöglicht. Bevorzugte Materialien für den Affinitätschromatographie-Schritt sind Gelmaterialien, die Agarose und/oder Dextran und/oder Cellulose enthalten, wie Sepharose CL6B (Pharmacia), Ultrogel (Pharmacia), Bio-Gel A-Materialien, z.B. 0,5 m, 1,5 m, 15 m und 50 m (alle Bio-Rad), Sephadex-Gelmaterialien, z.B. G-50, G-75, G-100, G-150 und G-200 (alle Pharmacia), Sephacryl-HR-Gelmaterialien, z.B. S-300, S-400, S-500 (alle Pharmacia), Superdex 200 Präp.-Grad (Pharmacia), Superose 6 Präp.-Grad (Pharmacia) und Cellulose-Gelmaterial von Whatman, besonders bevorzugte Materialien für den Affinitätschromatographie-Schritt ist Sepharose CL4B (Pharmacia).
Vorzugsweise wird die Säule mit 0,5 M NaOH gereinigt, um aseptische Produktionsbedingungen sicherzustellen und Charge-zu-Charge-Kontaminierung zu vermeiden. Ein Fachmann wird den Vorteil dieses Reinigungsverfahrens und der Verwendung eines Matrix-Materials für viele Zyklen der Chromatographie schätzen.
Nach dem Auftragen der MBL enthaltenden Lösung auf die Affinitätsmatrix wird die Säule gewaschen. Die Puffer, die für das Auswaschen von Proteinkontaminationen von der Affinitätsmatrix verwendet werden, sind nicht denaturierende Puffer, die eine Zusammensetzung, einen pH-Wert und eine Ionenstärke aufweisen, die/der in der Eliminierung des Hauptanteils der Proteinkontaminationen ohne wesentliche Elution von MBL resultiert. Anfänglich wird ein Äquilibrierungspuffer verwendet. Dieser Puffer könnte ein Tris-Puffer mit einer Molarität innerhalb des Bereichs von 10–40 mM, vorzugsweise 10 mM, und einem pH-Wert von 7,0–8,0, vorzugsweise 7,3, mit einem NaCl-Gehalt im Bereich von 100–250 mM, vorzugsweise 145 mM; und einem CaCl₂-Gehalt von 3–15 mM, vorzugsweise 5 mM, sein. In der Folge wird ein Puffer mit einem niedrigen CaCl₂-Gehalt verwendet. Der niedrige CaCl₂-Gehalt könnte 0,2–2,0 mM, vorzugsweise 0,3–1,0 mM wie 0,5 mM, sein. Aufgrund der Anwendung einer Matrix, an die MBL mit hoher Affinität in einer Ca²⁺-abhängigen Weise bindet, kann die Konzentration von CaCl₂ im Waschpuffer gesenkt werden, nachdem eine stabile Adsorption von MBL an die Matrix ohne wesentliche Elution von MBL etabliert worden ist. Auf diese Weise werden Kontaminationen ausgewaschen, die Ca²⁺-abhängig mit niedrigerer Affinität an die Matrix binden, z.B. Kohlenhydrat-spezifische Antikörper.
Die Bindungskapazität der Säule wird als die Gesamtmenge an MBL, das an die Matrix adsorbiert und von der Matrix eluiert wird (berechnet als Volumen der Eluatfraktion mal der Konzentration), geteilt durch das Volumen der Gelmatrix, definiert. Es wird bevorzugt, dass die Bindungskapazität der Säule mehr als 20 μg MBL/ml gepackte Matrix, z.B. mehr als 25 μg MBL/ml gepackte Matrix wie mehr als 30 μg MBL/ml gepackte Matrix, mehr als 35 μg MBL/ml gepackte Matrix, mehr als 40 μg MBL/ml gepackte Matrix, mehr als 42 μg MBL/ml gepackte Matrix, mehr als 44 μg MBL/ml gepackte Matrix, mehr als 46 μg MBL/ml gepackte Matrix, mehr als 48 μg MBL/ml gepackte Matrix oder sogar mehr als 50 μg MBL/ml gepackte Matrix ist.
Nach dem Waschen der Affinitätschromatographie-Säule wird die Elution von MBL mit einem selektiven Desorptionsmittel in einem neutralen, nicht denaturierenden Puffer durchgeführt, der zu wirksamer Elution von MBL in der Lage ist. Dieser Puffer könnte ein Tris-Puffer mit einer Molarität im Bereich von 10–40 mM, vorzugsweise 15 mM; und einem pH-Wert von 7,0–8,0, vorzugsweise 7,3, mit einem NaCl-Gehalt im Bereich von 100–250 mM, vorzugsweise 100 mM sein. Das Desorptionsmittel könnte ein Saccharid wie N-Acetylglucosamin, Mannose, N-Acetylmannosamin oder Fucose und/oder ein Mittel, das Ca-Ionen cheliert, wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) sein. Optionell wird Mannose mit einer Konzentration im Bereich von 20–100 mM Mannose, vorzugsweise 30 mM, verwendet.
Das zweite Schlüsselelement im vorliegenden Verfahren ist das Durchführen mindestens eines abgesicherten Virenreduktionsschritts.
Wenn die Virenreduktionsschritte diskutiert werden, wird verstanden, dass ein Virenreduktionsschritt entweder ein Virenentfernungsschritt und/oder ein Vireninaktivierungsschritt sein kann. Mehr als ein (z.B. zwei) Virenentfernungsschritt(e) und/oder Vireninaktivierungsschritt(e) können in das vorliegende Verfahren eingeschlossen werden.
Das Ziel des Absicherns eine Produktionsschritts als ein Virenreduktionsschritt ist, einen Beweis zu liefern, dass der Produktionsprozess Viren wirksam inaktivieren/entfernen wird, von denen entweder bekannt ist, dass sie die Ausgangsmaterialien kontaminieren, oder die das denkbarerweise tun könnten. Absicherungsstudien involvieren die willkürliche Zugabe eines Virus vor den Produktionsschritten, die abgesichert werden sollen, und Messen des Ausmaßes seiner Entfernung/Inaktivierung nach dem Produktionsschritt oder den Produktionsschritten. GMP-Beschränkungen verhindern das willkürliche Einbringen von jeglichem Virus in die Produktionseinrichtungen. Daher sollte die Absicherung in einem getrennten Labor, das für virologische Arbeit ausgestattet ist, an einer reduzierten Version des Produktionsschritts durchgeführt und von Personal mit virologischer Fachkenntnis in Verbindung mit den Produktionstechnikern durchgeführt werden. Die Menge an Virus, das dem Ausgangsmaterial für den Produktionsschritt, der abgesichert werden soll, zugefügt wird, sollte so hoch wie möglich sein, um die Kapazität des Produktionsschritts, die Viren adäquat zu inaktivieren/entfernen, zu bestimmen. Der Viruszusatz sollte jedoch so zugefügt werden, dass die Zusammensetzung des Produktionsmaterials nicht signifikant verändert wird. Vorzugsweise wird das Volumen des Viruszusatzes gleich oder weniger als 10% sein.
Quantitative Infektiositätstests sollten gemäß den Prinzipien von GLP durchgeführt werden und können Plaquebildung, Nachweis von anderen cytopathischen Wirkungen wie Syncytien- oder Foci-Bildung, Endpunkt-Titration (z.B. TCID₅₀-Tests), Nachweis von Virus-Antigen-Synthese oder andere Verfahren involvieren. Die Verfahren sollten eine adäquate Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit haben und sollten mit genügend Wiederholungen und Kontrollen durchgeführt werden, um eine adäquate statistische Genauigkeit der Ergebnisse sicherzustellen.
Typischerweise wird ein Verfahrensschritt mit 6 log Virus herausgefordert, und wenn eine Reduktion in der Größe von 4 log oder mehr erhalten wird, weist das auf eine deutliche Wirkung mit dem bestimmten Testvirus hin, das untersucht wird. In ähnlicher Weise weist eine Reduktion in der Größe von 4,5 log, 5 log oder sogar 5,5 log auf eine deutliche Wirkung mit dem bestimmten Testvirus hin, das untersucht wird, und der Schritt kann als ein abgesicherter Virenreduktionsschritt klassifiziert werden.
Die Virus-Absicherungsstudien sollten mit Viren durchgeführt werden, die jenen, die das Produkt kontaminieren können, so eng wie möglich gleichen, und sollten zweitens einen so weiten Bereich von physikalisch-chemischen Eigenschaften wie möglich repräsentieren, um die Fähigkeit des Systems, Viren im Allgemeinen zu eliminieren, zu testen.
Absicherungsstudien haben gezeigt, dass der vorliegende Affinitätschromatographie-Schritt als ein Entfernungsschritt für nicht-behüllte Viren wirkt und von ihm erwartet werden wird, durch einen Teilungsvorgang auch behüllte Viren zu entfernen. Dadurch stellt die Affinitätschromatographie einen ersten Virenreduktionsschritt im vorliegenden Verfahren dar (siehe Beispiel 4).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der abgesicherte Virenreduktionsschritt eine Vireninaktivierungsschritt. Infektiöse behüllte Viren werden vorzugsweise durch die Zugabe einer viruziden Menge eines Viren inaktivierenden Agens zum MBL enthaltenden Eluat, das vom Affinitätschromatographie-Schritt gewonnen wurde, inaktiviert. Eine „viruzide Menge" eines Virus inaktivierenden Agens soll eine Menge bezeichnen, die eine Lösung hervorbringt, in der die Viruspartikel im Wesentlichen nicht-infektiös gemacht werden, und dadurch wird eine Virus-sichere MBL enthaltende Lösung erhalten. Eine solche „viruzide Menge" wird vom angewendeten Virus inaktivierenden Agens so wie von den Bedingungen wie Inkubationszeit, pH-Wert, Temperatur, Lipidgehalt und Proteinkonzentration abhängen.
Der Begriff „Virus inaktivierendes Agens" soll solch ein Agens oder ein Verfahren bezeichnen, das verwendet werden kann, um behüllte Viren sowie nicht behüllte Viren zu inaktivieren. Der Begriff „Virus inaktivierendes Agens" soll so verstanden werden, dass er sowohl eine Kombination von solchen Agenzien und/oder Verfahren, wenn das geeignet ist, als auch nur einen Typ eines solchen Agens oder Verfahrens umspannt.
Bevorzugte Virus inaktivierende Agenzien sind Detergentien und/oder Lösungsmittel, am meisten bevorzugt Detergens-Lösungsmittel-Gemische. Es soll selbstverständlich sein, dass das Virus inaktivierende Agens optionell ein Gemisch von einem oder mehreren Detergenzien mit einem oder mehreren Lösungsmitteln ist. Eine Lösungsmittel/Detergens (S/D)-Behandlung ist ein weit verbreitet verwendeter Schritt für die Inaktivierung von behüllten Viren (z.B. HIV1 und HIV2, Hepatitis Typ C und nicht A-B-C, HTLV1 und HTLV2, die Herpesvirus-Familie, einschließlich CMV und das Epstein Barr-Virus) in von Plasma abgeleiteten Produkten. Eine breite Vielzahl von Detergenzien und Lösungsmitteln kann für die Vireninaktivierung verwendet werden. Das Detergens kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus nicht ionischen und ionischen Detergenzien besteht, und wird ausgewählt, um im Wesentlichen nicht denaturierend zu sein. Vorzugsweise wird ein nicht ionisches Detergens verwendet, da es die Eliminierung des Detergens aus der MBL-Präparierung im folgenden Schritt erleichtert. Geeignete Detergenzien sind z.B. von Shanbrom et al. im US-Patent 4,314,997 und US-Patent 4,315,919 beschrieben. Bevorzugte Detergenzien sind jene, die unter den Handelsnamen Triton X-100 und Tween 80 verkauft werden, die alleine oder in Kombination verwendet werden können. Bevorzugte Lösungsmittel für die Verwendung in Virus inaktivierenden Mitteln sind Di- oder Trialkylphosphate, wie z.B. von Neurath und Horowitz im US-Patent 4,764,369 beschrieben. Ein bevorzugtes Lösungsmittel ist Tri(n-butyl)phosphat (TNBP). Ein besonders bevorzugtes Virusinaktiverungsmittel für die Durchführung der vorliegenden Erfindung ist ein Gemisch von TNBP und Tween 80, aber alternativ können andere Kombinationen verwendet werden. Das bevorzugte Gemisch wird in solch einem Volumen zugefügt, dass die Konzentration von TNBP in der Lösung innerhalb des Bereichs von 0,2–1,0 Gewichts-%, vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,3 Gewichts-%, liegt. Die Konzentration von Tween 80 in der Lösung ist im Bereich von 0,8–1,5 Gewichts-%, vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 1 Gewichts-%.
Der Virusinaktivierungsschritt wird unter Bedingungen durchgeführt, die behüllte Viren inaktivieren, was in einer im Wesentlichen Virus-sicheren MBL enthaltenden Lösung resultiert. Im Allgemeinen schließen solche Bedingungen eine Temperatur von 4–30°C wie 19–28°C, 23–27°C, vorzugsweise etwa 25°C, und eine Inkubationszeit ein, von der durch Absicherungsstudien gefunden wurde, dass sie wirksam ist. Im Allgemeinen ist eine Inkubationszeit von 1–24 Stunden, vorzugsweise 4–12 Stunden wie etwa 6 Stunden ausreichend, um eine ausreichende Vireninaktivierung sicherzustellen. Die geeigneten Bedingungen (Temperatur und Inkubationszeiten) hängen jedoch vom angewendeten Virus inaktivierenden Agens, dem pH-Wert und der Proteinkonzentration und dem Lipidgehalt der Lösung ab.
Absicherungsstudien der vorliegenden S/D-Behandlung sind in Beispiel 4 dargelegt.
Es wird in Betracht gezogen, dass andere Verfahren zum Entfernen oder Inaktivieren eines Virus auch angewendet werden können, um ein Virus-sicheres MBL-Produkt zu produzieren, wie die Zugabe von Methylenblau mit nachfolgender Inaktivierung durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht.
In einem Aspekt der Erfindung ist die Affinitätschromatographie ein abgesicherter Virenreduktionsschritt, so dass die zwei Schlüsselelemente als eines durchgeführt werden.
Das bevorzugte Verfahren für die Produktion von MBL aus einer unbehandelten MBL enthaltenden Plasmaprotein-Fraktion enthält die Schritte, die unten behandelt werden:
Schritt a) Herstellen einer wässrigen Suspension der unbehandelten MBL enthaltenden Proteinfraktion bei saurem pH-Wert und im Wesentlichen nicht denaturierender Temperatur,
Schritt b) Eliminieren der Mehrzahl von Immunglobulinen aus der Suspension von Schritt a) und Gewinnen einer MBL enthaltenden Proteinfraktion
Schritt c) Solubilisieren der MBL enthaltenden Fraktion von Schritt b), Extrahieren von MBL bei neutralem pH-Wert und Gewinnen einer MBL enthaltenden Lösung,
Schritt d) Zugabe eines Gemischs eines Lösungsmittels und eines Detergens zu der MBL enthaltenden Lösung von Schritt c),
Schritt e) Auftragen der MBL enthaltenden Lösung von Schritt d) auf eine nicht konjugierte vernetzte Polysaccharid-basierende Matrix unter Bedingungen, die die Bindung von MBL an die Matrix fördern,
Schritt f) Auswaschen von Proteinkontaminationen von der Polysaccharid-basierenden Matrix von Schritt e) mit einem nicht denaturierenden Puffer und/oder Puffern, die eine Zusammensetzung, einen pH-Wert und eine Ionenstärke haben, die in der Eliminierung des Hauptanteils der Proteinkontaminationen ohne wesentliche Elution von MBL resultiert,
Schritt g) Eluieren von MBL von der Polysaccharid-basierenden Matrix von Schritt e) mit einem selektiven Desorptionsmittel in einem neutralen, nicht denaturierenden Puffer mit wirksamer Elution von MBL, was ein MBL enthaltendes Eluat ergibt,
Schritt h) Zugabe einer viruziden Menge eines nicht denaturierenden Virus inaktivierenden Agens zum MBL enthaltenden Eluat von Schritt g), was in einer im Wesentlichen Virus-sicheren MBL enthaltenden Lösung resultiert,
Schritt i) Auftragen der MBL enthaltenden Lösung von Schritt h) auf eine Anionenaustausch-Matrix unter Bedingungen, bei denen MBL an die Matrix bindet,
Schritt j) Waschen der Anionenaustausch-Matrix von Schritt i) mit einem Puffer, der eine Ionenstärke und einen pH-Wert hat, die/der ausreicht, um das Viren inaktivierende Agens von der Matrix auszuwaschen, ohne eine wesentliche Elution von MBL zu verursachen,
Schritt k) Eluieren von MBL von der Anionenaustausch-Matrix von Schritt i) mit einem im Wesentlichen nicht denaturierenden Puffer, der eine Ionenstärke und einen pH-Wert aufweist, die/der ausreicht, um eine wirksame Elution von MBL zu verursachen, die ein MBL enthaltendes Eluat ergibt,
Schritt l) Unterziehen der MBL enthaltenden Eluatfraktion von Schritt k) einer Ultrafiltration, wodurch ein MBL enthaltendes Konzentrat gewonnen wird,
Schritt m) Unterwerten des MBL enthaltenden Konzentrats von Schritt l) einer Gelfiltrations-Chromatographie, wodurch eine MBL enthaltende Lösung von funktionell aktiven, oligomeren MBL-Proteinen in einem nicht denaturierenden physiologischen Puffer gewonnen wird.
Die Schritte a)–c) sind die Vorbehandlungsschritte des Verfahrens zum Reinigen von MBL aus einer unbehandelten Plasmaprotein-Fraktion.
Die Schritte e)–g) und der Schritt h) sind oben als die Schlüsselelemente des Verfahrens der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Schritt a) Daher ist der erste Schritt des vorliegenden Verfahrens für die Produktion von MBL aus Plasma die Herstellung einer wässrigen Suspension der präzipitierten Cohn-Fraktion mit nachfolgender Eliminierung des Hauptanteils der Immunglobuline aus der Suspension, wodurch eine im Wesentlichen Immunglobulin-freie MBL enthaltende Proteinfraktion gewonnen wird. Es wird bevorzugt, dass die präzipitierte Cohn-Fraktion in Wasser und/oder Puffer bei im Wesentlichen nicht denaturierender/denaturierendem Temperatur und pH-Wert suspendiert wird. Der Begriff „im Wesentlichen nicht denaturierend" bedeutet, dass die Bedingung, auf die sich der Begriff bezieht, weder einen beträchtlichen, irreversiblen Verlust der funktionellen Aktivität von MBL noch von den vorhanden Immunglobulinen verursacht. Vorteilhafterweise wird die Plasmaprotein-Fraktion in Wasser, das mit mindestens einem nicht denaturierenden Puffersystem angesäuert wurde, in Volumina von 6- bis 9-, vorzugsweise von 7- bis 8-mal von jenem der Plasmaprotein-Fraktion suspendiert. Der pH-Wert der Suspension wird vorzugsweise bei einem pH unter 6 wie innerhalb des Bereichs von 4,0–6,0, vorzugsweise 5,1–5,7, am meisten bevorzugt etwa 5,4, belassen. Jeder geeignete saure Puffer kann verwendet werden, aber das Puffersystem enthält vorzugsweise mindestens einen der folgenden Puffer und Säuren: Natriumphosphat, Natriumacetat, Essigsäure, HCl. Fachleute werden anerkennen, dass zahlreiche andere Puffer verwendet werden können. Die Proteinsuspension wird vorzugsweise bei einer kalten Temperatur belassen, unter anderem um eine beträchtliche Proteindenaturierung zu verhindern und um die Proteaseaktivität zu minimieren. Die Plasmaprotein-Suspension und Wasser sowie das zugefügte Puffersystem haben vorzugsweise dieselbe Temperatur innerhalb des Bereichs von 0–12°C, vorzugsweise 0–8°C, am meisten bevorzugt 1–4°C.
Schritt b) Das MBL enthaltende, nicht solubilisierte Proteinmaterial, genannt die „Rest-Paste", wird durch Tiefenfiltration oder durch Zentrifugation isoliert. Vorzugsweise wird die Suspension der Erfindung gefiltert. Die Filtration wird vorzugsweise durch Tiefenfilter, z.B. C150 AF, AF 2000 oder AF 1000 (Schenk), oder ähnliche Filter durchgeführt. Die Mehrzahl der Immunglobuline in der Suspension wird durch die Filtration eliminiert.
Schritt c) MBL wird in der Folge nach der Zugabe eines im Wesentlichen nicht denaturierenden Puffers von der Rest-Paste unter neutralen Bedingungen extrahiert, vorzugsweise bei einer Temperatur von 1–8°C. Der Puffer für die Extraktion ist vorzugsweise eine Tris-gepufferte Salzlösung (TBS) mit einer Tris-Konzentration von 10–40 mM, vorzugsweise 10 mM, mit einem pH-Wert von 7,5–9,0, vorzugsweise 8,5, und einer NaCl-Konzentration von 100–200 mM, vorzugsweise 140 mM. Fachleute werden anerkennen, dass andere nicht denaturierende Puffer verwendet werden können, um MBL zu extrahieren. Die durch Extraktion erhaltene MBL enthaltende Lösung wird durch Filtration durch Reihen von Tiefenfiltern mit sinkenden Porengrößen und einem Lipid-entfernenden Filter, vorzugsweise wie in Beispiel 1 beschrieben, gewonnen. Diese MBL enthaltende Lösung kann vorteilhafterweise durch Ultrafiltration vor dem Affinitätschromatographie-Schritt konzentriert werden.
Schritt d) Bevor die MBL enthaltende Lösung auf die Affinitätssäule aufgetragen wird, wird vorzugsweise ein Gemisch von Lösungsmittel und Detergens wie 0,8–1,5% Tween 80 und/oder Triton X-100 und 0,2–1,0% TNBP zu der Lösung zugefügt, am meisten bevorzugt 0,3% TNBP und 1,0% Tween 80, um den Gehalt der Lipoproteine in der MBL enthaltenden Lösung, die in dem folgenden Affinitätschromatographie-Schritt eluiert wird, zu reduzieren. Als eine Folge des hohen Gehalts von Lipid und Lipoproteinen in der Lösung wird diese Lösungsmittel/Detergens-Behandlung nicht einen Vireninaktivierungsschritt des Fachgebiets darstellen. Es wird jedoch erwartet werden, dass ein großer Anteil an behüllten Viren durch die Behandlung inaktiviert werden wird.
Schritt i) Wenn der Ionenaustauschchromatographie-Schritt für die Reinigung von MBL durchgeführt wird, wird es bevorzugt, dass die Bedingungen, z.B. der pH-Wert und die Ionenstärke, so gewählt werden, dass im Wesentlichen das gesamte MBL, das in der Lösung vorhanden ist, die auf die Anionenaustausch-Matrix aufgetragen wird, an die Matrix bindet. Ein Virus inaktivierendes Agens oder Virus inaktivierende Agenzien werden beim folgenden Waschen der Anionenaustausch-Matrix entfernt.
Wie einem Fachmann bekannt sein wird, können Ionenaustauscher auf verschiedenen Materialien in Bezug auf die Matrix so wie auf die angehefteten geladenen Gruppen basieren. Zum Beispiel können die folgenden Matrices verwendet werden, in denen die erwähnten Materialien mehr oder weniger vernetzt sein können: Agarose-basierend (wie Sepharose CL-6B^®, Sepharose Fast Flow^® und Sepharose High Performance^®), Cellulose-basierend (wie DEAE Sephacel^®), Dextran-basierende (wie Sephadex^®), auf Silikamaterial und auf synthetischem Polymer-basierend. Für die Anionenaustausch-Matrix können die geladenen Gruppen, die kovalent an die Matrix angeheftet sind, z.B. Diethylaminoethyl (DEAE), quaternäres Aminoethyl (QAE) und/oder quaternäres Ammonium (Q) sein. Andere Anionenaustauscher können verwendet werden.
Wenn zum Beispiel die gewählte Anionenaustausch-Matrix Q Sepharose FF^® ist, dann wird die Säule vorteilhafterweise mit einem nicht denaturierenden alkalischen Puffer äquilibriert, der etwa denselben/dieselbe pH-Wert und Ionenstärke wie die MBL-Lösung, die aufgetragen werden soll, aufweist. Alle einer Vielzahl von Puffern sind für die Äquilibrierung der Ionenaustausch-Säulen geeignet, z.B. Natriumphosphat, Tris(hydroxymethyl)aminomethan. Fachleute werden anerkennen, dass zahlreiche andere Puffer für die Äquilibrierung verwendet werden können, so lange der pH-Wert und die Leitfähigkeit etwa dieselben wie für die aufgetragene MBL-Lösung sind. Ein bevorzugter Puffer für die Äquilibrierung der Anionenaustausch-Säule ist ein Tris-Puffer, der eine Tris-Konzentration im Bereich von 10–40 mM wie im Bereich von 20–30 mM, vorzugsweise etwa 15 mM, aufweist. Es wird bevorzugt, dass der pH-Wert des Tris-Puffers, der für die Äquilibrierung verwendet wird, im Bereich von 7,0 bis 9,0 wie im Bereich von 7,5–8,5, vorzugsweise etwa 8,0, ist. Der verwendete Puffer enthält vorzugsweise eine NaCl-Konzentration im Bereich von 10–40 mM wie 20–30 mM, vorzugsweise 25 mM, NaCl.
Schritt j) Das anfängliche Waschen wird vorteilhafterweise durch Verwenden des Äquilibrierungspuffers durchgeführt, obwohl andere Puffer mit einer/einem ähnlichen Konzentration und pH-Wert für das Waschen verwendet werden können. Das Waschen wird mit einem Volumen, das 10–20-mal von jenem des Säulenvolumens beträgt, durchgeführt.
Schritt k) Die Elution des MBL aus der Anionenaustausch-Matrix wird vorzugsweise mit einem im Wesentlichen nicht denaturierenden Puffer durchgeführt, der einen pH-Wert und eine Ionenstärke aufweist, die ausreichen, um eine wirksame Elution des MBL zu bewirken, wodurch ein MBL enthaltendes Eluat gewonnen wird. In diesem Zusammenhang bedeutet wirksame Elution, dass mindestens 80% wie mindestens 90%, z.B. mindestens 95% der MBL-Proteine auf die Anionenaustausch-Matrix geladen werden. Die Elution wird vorteilhafterweise mit einem Tris-Puffer durchgeführt, der 5–25 mM wie 10–30 mM, vorzugsweise 15 mM, Tris und 0,1–1,0 M wie 0,3–0,7 M, vorzugsweise 0,5 M, NaCl mit einem pH-Wert im Bereich von 6,0–9,0 wie 7,0–8,0, vorzugsweise 7,4, enthält.
Es wird bevorzugt, dass die Salzkonzentration des eluierenden Puffers ausreichend hoch ist, um das MBL von der Matrix abzulösen. Es wird jedoch in Betracht gezogen, dass ein Absinken des pH-Werts und eine niedrigere Salzkonzentration verwendet werden können, um das MBL von der Matrix zu eluieren.
Schritt l) Nach der Elution von der Anionenaustausch-Säule wird das Eluat vorzugsweise konzentriert. Die Membranen, die für die Ultrafiltration angewendet werden, haben vorteilhafterweise einen nominalen Gewichtsausschluss im Bereich von 10 000–100 000 Da. Ein bevorzugter Membrantyp für das vorliegende Verfahren ist eine Membran mit einem nominalen Gewichtsausschluss von 100 000 Da, die von Sartorius erhalten wird. Andere Ultrafiltrationsmembranen von vergleichbarer Porosität können angewendet werden.
Schritt m) Der letzte Chromatographie-Schritt des Verfahrens, der Gelfiltrations-Schritt, kann als ein Feinfiltrationsschritt angesehen werden, durch den SAP, IgG, Proteinaggregate und strukturell beeinträchtigtes MBL, die sich während der Schritte nach der Affinitätschromatographie gebildet haben könnten, eliminiert werden.
Das bevorzugte Verfahren für die Produktion von MBL von einer MBL enthaltenden, lysierten Zellsuspension oder einem Überstand umfasst zu mindestens den Vorbehandlungsschritt des Filterns der MBL enthaltenden, lysierten Zellsuspension oder des Überstands, um die Lösung zu klären und z.B. Zelltrümmer zu entfernen.
Nach diesem Vorbehandlungsschritt, durch den eine MBL enthaltende Lösung erhalten wird, werden die Schitte d)–m) durchgeführt, wie oben beschrieben. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren für die Produktion von MBL aus einer MBL enthaltenden, lysierten Zellsuspension oder einem Überstand den Vorbehandlungsschritt und die Schritte e)–m).
Das bevorzugte Verfahren für die Produktion von MBL von einem/einer MBL enthaltenden Milchprodukt oder Vormilch enthält die folgenden Vorbehandlungsschritte:
Schritt 1) Zugabe eines wasserlöslichen, im Wesentlichen nicht denaturierenden Proteinfällungsmittels zu dem/der MBL enthaltenden Milchprodukt oder Vormilch in einer Menge, die ausreicht, um die Präzipitation eines hohen Anteils der nicht-MBL-Komponenten zu bewirken, ohne eine beträchtliche Präzipitation von MBL zu bewirken, oder eine Präzipitation der Mehrheit von MBL ohne eine beträchtliche Präzipitation von nicht-MBL-Komponenten zu bewirken; wodurch ein Gemisch eines festen Präzipitats und eines flüssigen Überstands gebildet wird.
Schritt 2) Gewinnen eines geklärten, MBL enthaltenden Überstands von dem Gemisch von Schritt 1) oder eines geklärten, resuspendierten, MBL enthaltenden Präzipitats von dem Gemisch von Schritt 1).
Schritt 1) Im Wesentlichen nicht denaturierende, wasserlösliche Proteinfällungsmittel sind auf dem Gebiet der Proteinreinigung wohlbekannt. Solche Fällungsmittel werden für die Proteinfraktionierung verwendet, was in einer teilweisen Reinigung von Proteinen von Suspensionen resultiert. Geeignete Proteinfällungsmittel für die Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung schließen verschiedene Molekulargewichtsformen von PEG, Caprylsäure und Ammoniumsulfat ein. Fachleute werden anerkennen, dass einige andere, nicht denaturierende, wasserlösliche Fällungsmittel als alternative Mittel für die Präzipitation verwendet werden können. Der Begriff „Zugabe eines Proteinfällungsmittels" und Varianten von jenem Begriff beziehen die Zugabe von einem oder mehreren Typen von Proteinpräzipitierungs-Agentien ein.
Schritt 2) Nach Beendigen der Proteinpräzipitierung wird ein MBL enthaltender Überstand oder eine Lösung des resuspendierten Präzipitats gewonnen. Der erste Teil des Gewinnens wird durch konventionelle Techniken für das Trennen der flüssigen von der festen Phase wie Zentrifugation und/oder Filtration durchgeführt. Vorzugsweise wird eine Durchflusszentrifuge mit 1000–5000 g Stärke verwendet. In einer anderen Ausführungsform wird der erste Teil der Gewinnung durch eine Tiefenfiltration auf einer Filterpresse durchgeführt. Der MBL enthaltende Überstand wird hierdurch gewonnen.
Das Präzipitat, das den Großteil von MBL, das durch den ersten Teil der Gewinnung erhalten wurde, enthält, wird durch Zugabe eines nicht denaturierenden neutralen Puffers resuspendiert.
Optionell wird der gewonnene MBL enthaltende Überstand oder das resuspendierte Präzipitat tiefengefiltert, um größere Partikel und Aggregate zu entfernen. Dies wird optionell von einer sterilen Filtration gefolgt, die durch die Verwendung eines konventionellen Sterilisierungsfilters (wie ein 0,22 μm-Filter von Millipore oder Sartorius) durchgeführt wird, was z.B. Bakterien aus der Lösung entfernt.
Nach den Vorbehandlungsschritten 1) und 2), durch die eine MBL enthaltende Lösung erhalten wird, fährt das bevorzugte Verfahren für die Produktion von MBL von einem/einer MBL enthaltenden Milchprodukt oder Vormilch mit den Schritten d)–m) fort, wie oben beschrieben.
Das Verfahren der Erfindung wird optimiert, um einen hohen Ertrag von MBL mit einer hohen Reinheit zu erhalten (siehe Beispiel 3). Der Ertrag des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird als der Prozentsatz der Menge an MBL im Endprodukt im Verhältnis zu der durchschnittlichen Menge von MBL in der MBL enthaltenden Lösung, die auf die Affinitätschromatographie-Säule aufgetragen wird, berechnet. Dieser Ertrag ist mehr als 40%, was als zufriedenstellend angesehen wird, insbesondere mit der begleitenden Reinheit des endgültigen MBL-Präparats vor der Formulierung, wobei MBL etwa 60% der Gesamtproteine ausmacht. Mit einem anderen Ausgangsmaterial können auch niedrigere Erträge akzeptabel sein. Vorzugsweise ist der Ertrag mindestens 20% wie 25%, 30%, 35%, 40% oder sogar mehr als 40%.
Die Verfahren im Stand der Technik, die im Einleitungsabschnitt beschrieben sind, sind alle in einem kleinen Labormaßstab mit dem Ziel durchgeführt worden, MBL für analytische Forschung zu erhalten, d.h. es ist bis zu etwa 1 Liter Plasma als ein Ausgangsmaterial angewendet worden. Die vorliegende Erfindung zielt auf das Produzieren von Mannan bindendem Lektin in einem großen Produktionsrahmen hin. Unter „großem Produktionsrahmen" wird verstanden, wenn eine unbehandelte Plasmaprotein-Fraktion das Ausgangsmaterial ist, dass das Ausgangsmaterial vorzugsweise ein Plasmapool von mehr, nicht weniger als 1000 Spendern ist. Eine andere, allgemeinere Idee des „großen Produktionsrahmens" ist eine Bindungskapazität der Säule im ersten Schlüsselschritt von mehr als 20 μg MBL/ml gepackte Matrix, z.B. mehr als 25 μg MBL/ml gepackte Matrix wie mehr als 30 μg MBL/ml gepackte Matrix, mehr als 35 μg MBL/ml gepackte Matrix, mehr als 40 μg MBL/ml gepackte Matrix, mehr als 42 μg MBL/ml gepackte Matrix, mehr als 44 μg MBL/ml gepackte Matrix, mehr als 46 μg MBL/ml gepackte Matrix, mehr als 48 μg MBL/ml gepackte Matrix oder sogar mehr als 50 μg MBL/ml gepackte Matrix.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung zielt darüber hinaus auf das Reinigen von MBL von einem Zellkultur-Überstand, von einer lysierten Zellsuspension, einem Milchprodukt oder einer Vormilch für die nachfolgende Verwendung des MBL-Produkts als ein medizinisches Produkt in Menschen. Daher muss das Herstellungsverfahren den Anforderungen, die in den Anweisungen und Richtlinien von EEC für medizinische Produkte wie biotechnologische/biologische Produkte oder Produkte, die von menschlichem Plasma stammen, z.B. der Note for Guidance on Plasma derived medicinal Products, CPMP/BWP/269/95, oder ähnlichen Richtlinien festgelegt sind, entsprechen.
Diese Anforderungen schließen die Verwendung von chemischen Agenzien im Reinigungsverfahren so wie im Endprodukt ein, sind aber nicht darauf limitiert. Im vorliegenden Verfahren wird MBL ohne die Zugabe von Proteaseinhibitoren wie PMSF oder bakteriostatischen Agenzien wie Azid und Merthiolat gereinigt. Das Produkt ist daher vollkommen frei von zugefügten Proteaseinhibitoren und bakteriostatischen Agentien.
Das MBL-Produkt wird gemäß GMP unter aseptischen Bedingungen in klassifizierten Bereichen hergestellt. Um eine proteolytische Degradierung von Proteinen während der Produktion zu vermeiden, wird das Verfahren vorwiegend in kalten Räumen durchgeführt. Das Verfahren der Erfindung ist so gestaltet, um ein MBL-Produkt für die Verwendung in der Medizin zu produzieren.
Das MBL-Produkt des vorliegenden Reinigungsverfahrens wird trotz aller Bemühungen andere Proteine als MBL enthalten. Unter Verwendung von menschlichem Plasma als das Ausgangsmaterial werden Plasmaproteine wie IgM vorhanden sein.
Es ist von größter Wichtigkeit für die klinische Wirkung des MBL-Produkts, dass die funktionelle Aktivität von MBL bewahrt wird, d.h. das Produkt wird durch ein funktionell aktives oligomeres MBL dargestellt. In diesem Zusammenhang wird ein funktionell aktives MBL als ein MBL, das in der Lage ist zum a) Binden an ein Kohlenhydrat auf den Oberflächen von Mikroorganismen (z.B. Hefe-Mannan), b) durch seine Fähigkeit, die Phagocytose von MBL gebundenen Mikroorganismen durch die Interaktion mit Collektin-Rezeptoren auf phagocytischen Zellen zu erleichtern, und c) durch seine Fähigkeit, Komplement als eine Folge der Bindung an z.B. die Oberfläche von Mikroorganismen zu aktivieren, definiert. Diese Aktivierung von Komplement scheint durch die MBL-assoziierten Serin-Proteasen MASP 1 und 2 zu erfolgen und löst Komplement-Effektorfunktionen wie Entzündungsreaktionen, Opsonisierung und cytolytische Reaktionen aus.
Die funktionelle MBL-Aktivität kann in vitro durch Binden von MBL an Mannan in Mannan-beschichteten ELISA-Platten, einen phagocytischen Test, bei dem MBL-beschichtete Zymosan-Partikel durch phagocytische Zellen aus dem peripheren Blut aufgenommen werden, und durch die Komplementaktivierung, die durch die Ablagerung von Komplementfaktoren (z.B. C3 oder C4) nach der Bindung von MBL an ein Kohlenhydrat in einem ELISA-Typ-Test sichtbar gemacht wird, gezeigt werden.
Um die MBL-Proteine während der Lagerung zu stabilisieren, wird das Produkt durch Zugabe von mindestens einem Protein-stabilisierenden Agens formuliert. Protein-stabilisierende Agentien sind Fachleuten bekannt und schließen z.B. verschiedene Zuckeralkohole und Saccharide (wie Sorbit, Glucose, Saccharose, Trehalose, Maltose), Proteine (wie Albumin) und Aminosäuren (wie Lysin, Glycin) ein. In der vorliegenden Erfindung wird Albumin als eine Proteinstabilisator bevorzugt, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1–1 Gewichts-% wie 0,5 Gewichts-%.
Die MBL-Zubereitung wird als ein flüssiges Produkt für die intravenöse Verabreichung formuliert. Ein wichtiger Aspekt des Verfahrens der Erfindung ist, dass das gereinigte MBL hoch konzentriert wird. Es ist daher möglich, ein Produkt mit einer Konzentration von mindestens 250 μg MBL pro ml zu erhalten. Die hohe Konzentration von MBL erhöht die Stabilität des flüssigen Produkts. Das MBL-Produkt kann auch lyophilisiert sein, um die Stabilität über die Zeit zu erhöhen. Die Konzentration des lyophilisierten Produkts wird durch Befolgen der Richtlinien berechnet, die durch den Hersteller für die Wiederherstellung der lyophilisierten Zubereitung angegeben werden.
Die primären Indikationen für das MBL-Produkt ist ein angeborener und erworbener MBL-Mangel. Zusätzlich hat das MBL-Produkt einige Indikationen:
Neurologie: chronische entzündliche Entmarkungs-Polyneuropathie (CIDP), multifokale motorische Neuropathie, multiple Sklerose, Erb-Goldflam-Syndrom, Lambert-Eaton-Rooke-Syndrom, Opticus Neuritis, Epilepsie;
Gynäkologie: Abortus habitualis, primäres Antiphospholipid-Syndrom;
Rheumatologie: rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematodes, systemisches Skleroderm, Vasculitis, Wegener-Granulomatose, Sjörgen-Syndrom, juvenile rheumatoide Arthritis;
Hämatologie: autoimmune Neutropenie, autoimmune hämolytische Anämie, Neutropenie;
Gastrointestinal: Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Zöliakie;
Andere: Asthma, septisches Schocksyndrom, chronisches Ermüdungssyndrom, Psoriasis, toxisches Schocksyndrom, Diabetes, Sinusitis, dilatierte Kardiomyopathie, Endokarditis, Atherosklerose, Erwachsene mit AIDS und bakteriellen Infektionen, primäre Hypo-/Agammaglobulinämie, einschließlich üblichem variierendem Immundefekt, Wiskott-Aldrich-Syndrom und schwerem kombiniertem Immundefekt (SCID), sekundäre Hypo-/Agammaglobulinämie in Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) und multiplem Myelom, Kinder mit AIDS und bakteriellen Infektionen, akute und chronische idiopathische thrombozytopenische Purpura (ITP), allogene Knochenmarkstransplantation (BMT), Kawasaki-Syndrom und Guillan-Barre-Syndrom.
BEISPIELE
Es soll selbstverständlich sein, dass die unten beschriebenen Beispiele erläuternd für Ausführungsformen des vorliegenden Verfahrens sind, und die Erfindung soll nicht so limitiert sein.
Beispiel 1: VERFAHRENSSCHRITTE IN DER REINIGUNG VON PLASMAABGELEITETEM MBL, DAS ALS EIN MEDIZINISCHES PRODUKT VERWENDET WERDEN SOLL
Alle Schritte werden bei 5 ± 3°C durchgeführt, außer Schritt 5, der bei 25°C durchgeführt wird, und die Schritte 7 und 8, die bei Raumtemperatur durchgeführt werden.
Schritt 1: Herstellung der Cohn-Fraktion II + III-Paste:
Die Cohn-Fraktion II + III-Paste wird von menschlichem Plasma durch ein Standard-Cohn-Fraktionierungs-Verfahren (12), im Wesentlichen wie durch Kistler-Nitschmann modifiziert (13), hergestellt. Die Ethanol-Präzipitation wird begonnen, nachdem das Cryopräzipitat entfernt worden ist und, wenn erwünscht, nach der Adsorption von bestimmten Plasmaproteinen (wie Faktor IX und Antithrombin) an z.B. ein Ionenaustausch-Material und/oder eine Heparin Sepharose-Matrix. Die genauen Bedingungen (pH-Wert, Ethanol-Konzentration, Temperatur, Protein-Konzentration) zum Erhalten der Fraktion II + III-Paste erscheinen aus der Figur auf Seite 266 in Harns JR (Hrsg.), Blood Separation and Plasma Fractionation, Wiley-Liss, New York, 1991. Die Paste wird auf einer Filterpresse durch Zugabe einer Filterhilfe vor der Filtration isoliert.
Schritt 2: Extraktion von Immunglobulinen von der Cohn-Fraktion II + III-Paste:
Von 140 kg der Fraktion II + III-Paste, einschließlich 30 kg Filterhilfe (Schenk, Deutschland), entsprechend einem Startvolumen von Plasma von etwa 1150 kg, wird die Extraktion durch zuerst Zugeben von 525 kg 2,3 mM Natriumphosphat/acetat-Puffer, pH 4,0, mit langsamem Rühren für etwa 1,5 Stunden, gefolgt von 2 aufeinander folgenden Zugaben von 350 kg Wasser zur Injektion (WFI) mit Rühren für etwa 1,5 Stunden nach jeder Zugabe erreicht. Schließlich werden etwa 280 kg 21,5 mM Natriumphosphat/acetat, pH 7,0, zugefügt, wodurch die Suspension auf einen endgültigen pH-Wert von 5,4 eingestellt wird. Die Suspension wird durch einen Tiefenfilter (C-150AF, Schenk, Deutschland) gefiltert. Das Filtrat enthält unter anderen Proteinen die Immunglobuline, wohingegen MBL in der gewonnenen Rest-Paste verbleibt.
Schritt 3: Herstellung einer MBL enthaltenden Lösung:
Zu der MBL enthaltenden Rest-Paste (die etwa 80 kg einschließlich Filterhilfe ausmacht) wird Tris-gepufferte Salzlösung, TBS (10 mM Tris, 140 mM NaCl), pH 8,4, in einer Menge zugefügt, die äquivalent zu 3 kg pro kg Rest-Paste ist. Die Suspension wird für etwa 16 Stunden gerührt, um MBL zu extrahieren. Die Suspension wird durch Reihen von Tiefenfiltern mit sinkenden Porengrößen und einen Lipidentfernungsfilter: C-150-AF- und AF-1000-Filterplatten (Schenk, Deutschland) und Patronen von 50LA, von 90LA und von Lipidentfernungsfiltern (Cuno, Frankreich) gefiltert. Die gefilterte, MBL enthaltende Lösung wird auf einem System ultrafiltriert, das Membranen mit einem nominalen Gewichtsausschlusswert von 300 kDa (Sartorius, Deutschland) anwendet; dadurch wird die Lösung ungefähr 10-fach konzentriert. Die konzentrierte, MBL enthaltende Lösung wird schließlich durch eine 0,45 μm-Filterpatrone (Pall SLK 7002 NLZP, GB) gefiltert. Tri-n-butylphosphat (TNBP) und Tween 80 werden zu der endgültigen Lösung zu Konzentrationen von 0,3 Gewichts-% beziehungsweise 1,0 Gewichts-% zugefügt. Dieses Gemisch wird für 3,5 Stunden gerührt. Danach wird CaCl₂ zu einer Konzentration von 5 mM zugefügt, gefolgt von der Zugabe eines gleichen Volumens von TBS, enthaltend 5 mM CaCl₂, pH 7,3.
Schritt 4: Affinitätschromatographie auf Sepharose CL4B:
Eine Säule wird mit 10 Litern Sepharose CL4B^® (Pharmacia Biotech, Schweden) bepackt und mit TBS, enthaltend 5 mM CaCl₂ (10 mM Tris, 145 mM NaCl, 5 mM CaCl₂), pH 7,3, äquilibriert. Die MBL enthaltende Lösung wird auf die Säule aufgetragen. Nach dem Auftragen wird die Säule nacheinander mit 3 Säulenvolumina des Äquilibrierungspuffers und 6 Säulenvolumina von TBS, enthaltend 0,5 mM CaCl₂ (10 mM Tris, 200 mM NaCl, 0,5 mM CaCl₂), pH 7,3, gewaschen. MBL wird aus der Affinitätssäule mit TBS, enthaltend Mannose (15 mM Tris, 100 mM NaCl, 30 mM Mannose), eluiert, und die eluierte MBL-Fraktion wird gewonnen.
Schritt 5: S/D-Behandlung:
Die Mannose-Konzentration der eluierten MBL-Fraktion wird auf etwa 10 g/kg durch Zugabe von 4,6 g Mannose pro kg Eluat eingestellt, dann wird eine Filtration durch einen kombinierten 0,45 und 0,2 μm-Filter (Sartobran P Capsule, Sartorius, Deutschland) durchgeführt. Das Filtrat wird danach durch die Zugabe von Tween 80 und TNBP zu Endkonzentrationen von 1,0 Gewichts-% beziehungsweise 0,3 Gewichts-% S/D-behandelt. Die S/D-Behandlung erfolgt für mindestens 6 Stunden bei 25°C.
Schritt 6: Entfernen von S/D durch Anionenaustauschchromatographie:
Eine Säule wird mit 600 ml Q Sepharose FF^® (Pharmacia Biotech, Schweden) bepackt und mit 15 mM Tris, enthaltend 25 mM NaCl, pH 8,0, äquilibriert. Die S/D-behandelte MBL-Lösung wird mit einem Volumen von 15 mM Tris, pH 8,0, das dreifach von jenem der Lösung ist, verdünnt. Die verdünnte MBL-Lösung wird auf die Anionenaustausch-Säule aufgetragen, die Säule wird danach mit 10 Säulenvolumina äquilibriertem Puffer gewaschen, und MBL wird mit 15 mM Tris, enthaltend 0,5 M NaCl, pH 7,4, eluiert.
Schritt 7: Konzentrierung durch Ultrafiltration:
Die eluierte MBL-Fraktion wird durch Zugabe von 2 Volumina 15 mM Tris, pH 7,1, verdünnt und einer Konzentrierung durch Ultrafiltration, die ein Sartocon Micro UF System (Sartorius, Deutschland) mit einer nominalen 100 kDa-Gewichtsausschluss-Membran anwendet, unterzogen. Die konzentrierte Lösung, die 5 bis 7 mg MBL/ml enthält, wird durch einen kombinierten 0,45 und 0,2 μm-Filter (Sartobran 300, Sartorius, Deutschland) gefiltert und durch Zugabe von festem EDTA auf 3 mM EDTA eingestellt.
Schritt 8: Gelfiltration auf Superose 6:
Eine Säule wird mit 4 Litern Superose 6 Präp.-Grad (Pharmacia Biotech, Schweden) beladen und mit PBS (8 mM Na₂HPO₄, 1,4 mM NaH₂PO₄, 145 mM NaCl), pH 7,3, äquilibriert. Das EDTA-eingestellte und gefilterte MBL-Konzentrat wird auf die Säule aufgetragen, und eine Gelfiltration wird mit PBS als Puffer durchgeführt. Die endgültige MBL-Fraktion eluiert als der erste Hauptpeak aus der Säule und wird gesammelt.
Schritt 9: Formulierung des MBL als ein flüssiges medizinisches Produkt:
Die endgültige MBL-Fraktion ist eine Lösung von MBL in einem physiologischen Puffer (PBS, pH 7,3) mit einer Konzentration im Bereich von 300 bis 400 μg MBL pro ml. Zu dieser MBL-Lösung wird der Protein-Stabilisator Albumin als eine nano gefilterte (durch einen 15 nm-Filter) Lösung zu einer Konzentration von 0,5% (Gew./Vol) zugefügt. Die endgültige, Albumin-stabilisierte MBL-Präparation wird steril gefiltert (Sartobran 300, Sartorius) und aseptisch mit 3 mg MBL pro Portion in einem Volumen von nicht mehr als 10 ml abgefüllt.
Beispiel 2: ANALYTISCHES VERFAHREN, UM MBL IN DEM VERFAHREN ZU QUANTIFIZIEREN
Mengen-Bestimmung von MBL durch einen spezifischen ELISA:
MBL wird in einem MBL-spezifischen Sandwich-ELISA quantifiziert. Ein monoclonaler Maus-anti-MBL-Antikörper wird für das Einfangen und auch für den Nachweis von MBL verwendet. In diesem Test ist der Nachweis-Antikörper biotinyliert. Nach dem Binden an die biotinylierten Antikörper wandelt die Streptavidin-konjugierte HRP das Farbreagenz OPD in einer konzentrationsabhängigen Weise um. Die Konzentration der analysierten Proben wird durch die Verwendung eines MBL-Serumstandards geschätzt.
Beispiel 3: ERTRAG VOM REINIGUNGSVERFAHREN
Das Volumen der MBL enthaltenden Lösung, die von 80 kg Rest-Paste hergestellt wurde, macht insgesamt etwa 360 kg mit einer Konzentration von etwa 1,7 mg MBL pro Liter aus. Die MBL enthaltende Lösung wird durch Ultrazentrifugation unter Anwenden einer Membran mit einem Ausschlusswert von 300 kDa ungefähr 10-fach konzentriert, um ein Volumen zu haben, das im folgenden Reinigungsverfahren leichter zu handhaben ist, und um einen Teil der Proteine mit einem niedrigeren Molekulargewicht aus der MBL enthaltenden Lösung zu eliminieren. Die endgültige, konzentriertes MBL enthaltende Lösung mit einem mittleren Volumen von 38 kg enthält etwa 68 g Gesamtprotein und hat eine mittlere Konzentration von 14,6 mg MBL pro Liter (p = 1,011 kg/l). Der Gesamtgewinn des Extraktionsverfahrens resultiert in etwa 550 mg MBL, was äquivalent zu 0,48 mg pro kg des Ausgangsplasmas, 3,9 mg pro kg der Paste II und III und 6,9 mg MBL pro kg Rest-Paste ist.
Die konzentrierte, MBL enthaltende Lösung stellt das Material für die folgenden Reinigungsschritte des Verfahrens dar, startend mit dem Affinitätschromatographie-Schritt. Der Ertrag des Reinigungsverfahrens (Beispiel 1) ist etwa 235 mg MBL, was einem Gewinn von etwa 43% des MBL, das in der Lösung vorhanden ist, entspricht. Die Reinheit der endgültigen MBL-Präparation vor der Formulierung ist hoch, MBL stellt etwa 60% des gesamten Proteingehalts, dar.
Beispiel 4: ABSICHERUNG DER VIRUSREDUKTIONSSCHRITTE
Die Virusreduktionsschritte wurden gemäß der CPMP-Note for Guidance on Virus Validation Studies: The Design, Contribution and Interpretation of Studies Validating the Inactivation and Removal of Viruses (CPMP/BWP/268/95) und Note for Guidance on Plasma Derived Medicinal Products (CPMP/BWP/269/95), abgesichert.
Absicherung des S/D-Behandlungsschritts
Der S/D-Behandlungsschritt des Reinigungsverfahrens wurde für eine Virusinaktivierung abgesichert. Drei behüllte Viren wurden für diese Untersuchung ausgewählt, das virale Diarrhoe-Virus des Rindes (BVDV), das menschliche Immunschwäche-Virus (HIV) und das Pseudorabies-Virus des Schweins (PRV). Die Wahl der Viren reflektiert die Viren, die menschliches Blut und/oder Plasma kontaminieren können und/oder schließt Modell-Viren dieser Viren ein.
Proben des relevanten Stadiums des Produktionsverfahrens wurden mit den Viren der Wahl versetzt, und eine S/D-Behandlung wurde durchgeführt. Die Proben wurden gewonnen und die Menge an Virus wurde durch Tests in Zellkulturen quantifiziert. Die Virenbeseitigungs- und Reduktionsfaktoren wurden dann berechnet. Die Ergebnisse der Untersuchung sind wie folgt zusammengefasst:
Absicherung des Affinitätschromatographie-Schritts als ein Virenentfernungsschritt
Das Ziel dieser Untersuchung war es, die Wirksamkeit (ausgedrückt als ein Reduktionsfaktor) des Affinitätschromatographie-Schritts des Produktionsverfahrens, gemessen als die Entfernung von CPV (Parvovirus des Hundes) beziehungsweise HAV (Hepatitis A-Virus), zwei kleinen, nicht-behüllten Viren von hoher physikalisch-chemischer Resistenz, zu bestimmen.
Die Wirksamkeit dieses Schritts wurde durch Vergleich der gemessenen Menge an beimpften Virus im Ausgangsmaterial und der Gewinnung des Virus im Material, das von der Säule eluiert wurde, berechnet und als der Reduktionsfaktor ausgedrückt. Die Reduktionsfaktoren sind wie folgt zusammengefasst:
BEZUGNAHMEN

1. M.W. Turner, Immunology Today, 1996, 17, 532–540
2. H.J. Hoppe und K.B.M. Reid, Protein Sci, 1994, 3, 1143–1158
3. M. Matsushita et al., Biochem Biophys Res Commun, 1992, 183, 645–651
4. S. Thiel et al., Nature, 1997, 386, 506–510
5. D.C. Kilpatrick et al., Hum Reproduc, 1995, 10, 2501–2505
6. Kawasaki, N., et al., J. Biochem (Tokyo), 1983, 94, 937–947
7. J.A. Summerfield und M.E. Taylor, Biochem Biophys Acta, 1986, 883, 197–206
8. J. Lu et al., J. Immunol, 1990, 144, 2287–2294
9. T. Kawasaki et al., Methods Enzymol, 1989, 179, 310–321
10. M. Kyogashima et al., Arch Biochem Biophys, 1990, 283, 217–222
11. S.M. Tan et al., Biochem J., 1996, 319, 329–332
12. E. Cohn et al., J Am Chem Soc, 1946, 68, 459–475
13. P. Kistler und H.S. Nitschmann, Vox Sang, 1952, 7, 414–424
14. US-A-5 270 199
15. A. Koppel et al. Journal of chromatography B: medical applications, 1994, 662, 191–196
16. D.C. Kilpatrick, Transfusion medicine, 1997, 7, 289–294

Claims

Verfahren zur Reinigung von Mannan bindendem Lecithin (MBL), welches mindestens folgende Elemente umfasst: – Durchführen eines Affinitätschromatographie-Schritts auf einer nicht konjugierten vernetzten Polysaccharid-Matrix; – Durchführen mindestens eines abgesicherten Virenreduktionsschritts.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Ausgangsmaterial ein/eine MBL enthaltende/r/s Überstand, Suspension, Milchprodukt, Vormilch oder unbehandelte Plasmaproteinfraktion ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Ausgangsmaterial ein MBL enthaltendes Milchprodukt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Ausgangsmaterial ein MBL enthaltender Überstand ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Ausgangsmaterial eine unbehandelte Plasmaproteinfraktion ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die unbehandelte Plasmaproteinfraktion eine Cohn-Fraktion ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Vorverfahrensschritte des Verfahrens die Mehrzahl der Immunglobuline aus der Suspension entfernen, wobei eine MBL enthaltende Proteinfraktion gewonnen wird.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der oder die Puffer, welche/r für das Auswaschen von Proteinverunreinigungen von der Affinitätschromatographie-Matrix nach dem Auftragen der MBL enthaltenden Lösung verwendet wird/werden, nicht denaturierend ist/sind und eine derartige Zusammensetzung, pH-Wert und Ionenstärke aufweist/aufweisen, dass der Hauptanteil an Proteinverunreinigungen ohne wesentliche Elution von MBL entfernt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei einer der Puffer ein Tris-Puffer mit einem Ca-Ionen-Gehalt von 0,2 bis 2,0 mM ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Elution von der Affinitätschromatographie-Matrix mit einem selektiven Desorbtionsmittel in einem neutralen nicht denaturierenden Puffer durchgeführt wird, der zu einer wirksamen Elution des MBL fähig ist.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das Desorbtionsmittel ein Saccharid ist.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das Desorbtionsmittel ein Mittel ist, welches Ca-Ionen cheliert.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Affinitätschromatographie-Schritt als ein Virenentfernungsschritt dient.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Virenreduktionsschritt durch Hinzufügen einer viruziden Menge eines nicht denaturierenden, Viren-inaktivierenden Mittels zu der MBL enthaltenden Lösung durchgeführt wird, wodurch eine im wesentlichen virus-sichere MBL enthaltende Lösung erhalten wird.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei das nicht denaturierende, Viren-inaktivierende Mittel ein Gemisch aus mindestens einem im wesentlichen nicht denaturierenden Detergens und mindestens einem Lösungsmittel ist.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das nicht denaturierende Gemisch eines Detergens und eines Lösungsmittels 0,8 bis 1,5% Tween 80 und/oder Triton X-100 und 0,2 bis 1,0% TNBP ist.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Endausbeute von MBL mehr als 40% der Menge an MBL in der MBL enthaltenden Lösung, welche auf die Affinitätssäule aufgebracht wird, beträgt.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das letztendliche MBL-Produkt durch das Hinzufügen mindestens eines Proteinstabilisators formuliert wird.
Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei alle Schritte unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden.
Pharmazeutische Formulierung eines funktionell aktiven, oligomeren MBL-Produkts, welches vollständig frei von synthetischen Proteaseinhibitoren und/oder bakteriostatischen Mitteln ist.
Formulierung gemäß Anspruch 20, wobei die Formulierung virus-sicher ist.
Formulierung gemäß Anspruch 21 mit einer Konzentration von mindestens 250 μg MBL pro ml.
Formulierung gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22, welche ein flüssiges MBL-Produkt ist.
Formulierung gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22, welche ein lyophilisiertes MBL-Produkt ist.
Formulierung gemäß einem der Ansprüche 20 bis 24 zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung einer Formulierung gemäß einem der Ansprüche 20 bis 24 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von oder Vorbeugung gegen mit angeborenem, vererbtem oder erworbenem MBL-Mangel verbundenen Erkrankungen in einem Säuger.
Verwendung gemäß Anspruch 26 zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung gegen oder Behandlung von Infektionen.
Verwendung gemäß Anspruch 26 oder 27, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei die Infektionen mit funktionellen und/oder klinischen Symptomen verbunden sind.
Verwendung gemäß Anspruch 29, wobei die funktionellen oder klinischen Symptome ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus chronischer entzündlicher Entmarkungs-Polyneuropathie (CIDP), multifokaler motorischer Neuropathie, multipler Sklerose, Erb-Goldflam-Syndrom, Lambert-Eaton-Rooke-Syndrom, Opticus Neuritis, Epilepsie, Abortus habitualis, primärem Antiphoshopolipid-Syndrom, rheumatoide Arthritis, systemischem Lupus erythematodes, systemischem Skleroderm, Vasculitis, Wegener-Granulomatose, Sjögren-Syndrom, juvenile rheumatoide Arthritis, autoimmuner Neutropenie, autoimmuner hämolytischer Anämie, Neutropenie, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Zöliakie; und Asthma, septischem Schocksyndrom, chronischem Ermüdungs-Syndrom, Psoriasis, toxischem Schocksyndrom, Diabetes, Sinuitis, dilatierter Kardiomyopathie, Endokarditis, Arteriosklerose, Erwachsenen mit AIDS und bakteriellen Infektionen, primärer Hypo-/Agammaglobulinämie, einschließlich üblichem variierenden Immundefekt, Wiskott-Aldrich-Syndrom und schwerem kombinierten Immundefekt (SCID), sekundärer Hypo-/Agammaglobulinämie in Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) und multiplem Myelom, Kindern mit AIDS und baktieriellen Infektionen, akuter und chronischer idiopathischer thrombozytopenischer Purpura (ITP), allogener Knochenmarkstransplantation (BMT), Kawasaki-Syndrom und Guillan-Barre-Syndrom.