AT514675B1

AT514675B1 - Herstellung von faktor h (fh) und fh-derivaten aus plasma

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Publication number: AT514675B1
Application number: ATA50852/2014A
Authority: AT
Original assignee: Baxalta Inc; Baxalta GmbH
Priority date: 2009-07-23
Filing date: 2010-07-23
Publication date: 2019-05-15
Also published as: US8304524B2; AT516600B1; AT514675A3; US8822656B2; US20130102537A1; US9109044B2; WO2011011753A1; AT516600A5; US20110021432A1; US20130303731A1; AT514675A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Herstellen angereicherter Faktor H-Zusammensetzungen aus Plasma bereit. Das Verfahren umfasst folgende Schritte: (a) Ausfällen von Proteinen aus einer kryoarmen Plasmafraktion in einem ersten Präzipitationsschritt mit 6 % bis 10 % Alkohol bei einem pH-Wert zwischen 7,0 und 7,5, um ein erstes Präzipitat und einen ersten Überstand zu erhalten; und (b) Extrahieren von Faktor H aus dem Präzipitat mit einem Faktor H-Extraktionspuffer, dadurch Herstellen einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung.

Description

Beschreibung

STAND DER TECHNIK [0001] Im Gegensatz zu anderen Biologika, die über rekombinante Expression von DNA-Vektoren erzeugt werden, werden aus Plasma gewonnene Proteine aus menschlichem Blut und Plasmaspenden fraktioniert. Die Lieferung dieser Produkte kann daher nicht einfach durch Vergrößern des Produktionsvolumens erhöht werden. Vielmehr ist die Menge der kommerziell erhältlichen Blutprodukte durch die verfügbare Lieferung von Blut und Plasmaspenden begrenzt. Diese Dynamik führt zu einem Mangel in der Verfügbarkeit von rohem menschlichem Plasma zur Herstellung von neuen aus Plasma gewonnenen Blutfaktoren, die weniger etablierte Handelsmärkte haben, einschließlich des Komplementfaktors H (CFH).

[0002] Faktor H (FH) ist ein Element der Regulatoren der Komplementaktivierungsfamilie und ist ein Komplementsteuerungsprotein. Er ist ein großes (155 Kilodalton), lösliches Glykoprotein, das in menschlichem Plasma zirkuliert (bei einer Konzentration von 500-800 Mikrogramm pro Milliliter). Seine Hauptaufgabe ist es, den Alternativen Weg des Komplementsystems zu regulieren, womit sichergestellt wird, dass das Komplementsystem gegen Pathogene gerichtet ist und kein Wirtsgewebe schädigt. Faktor H reguliert die Komplementaktivierung an eigenen Zellen, dadurch dass er Cofaktoraktivität für Faktor l-vermittelte C3b-Spaltung und zerfallsbeschleunigende Aktivität gegen die C3-Konvertase des Alternativen Wegs, C3bBb, besitzt. Daher schützt Faktor H die Eigenzellen, aber keine fremden Pathogene (z.B. Bakterien, Protisten und Viren), durch Komplementaktivierung durch Bindung an Glykosaminoglykane (GAGS), die auf der Oberfläche von menschlichen Zellen vorhanden sind, nicht aber auf den Oberflächen pathogener Zellen.

[0003] Auf Grund seiner regulatorischen Rolle bei der Komplementaktivierung ist Faktor H als potenzielles therapeutisches Mittel für mehrere menschliche Krankheitszustände angesehen worden, einschließlich altersabhängiger Makuladegeneration (AMD), des hämolytischen Urämiesyndroms (aHUS) und der membranproliferativen Glomerulonephritis (MPGN). Obwohl eine kausale Beziehung zwischen dem einzelnen Nukleotid-Polymorphismus (SNP) im Komplementsteuerungsprotein (CCP)-Modul 7 von Faktor H und der altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) gekennzeichnet wurde, sind Medikamente auf der Grundlage dieser kausalen Beziehung bisher noch nicht festgestellt worden.

[0004] Teilweise auf Grund der wachsenden globalen Nachfrage und Schwankungen in der verfügbaren Lieferung von aus Plasma gewonnenen Blutprodukten, wie zum Beispiel Immunglobulinprodukten, haben mehrere Länder, einschließlich Australien und England, Managementprogramme implementiert, um Lieferungen dieser Produkte für die Patienten mit dem höchsten Bedarf in Zeiten von Produktknappheit zu schützen.

[0005] Es ist zum Beispiel berichtet worden, dass 2007 26,5 Millionen Liter Plasma fraktioniert wurden, was 75,2 Tonnen IVIG erzeugte, bei einer durchschnittlichen Produktionsausbeute von 2,8 Gramm pro Liter (Robert P, s.o.). Derselbe Bericht schätzt, dass den Erwartungen zufolge die globalen MG-Ausbeuten sich auf etwa 3,43 Gramm pro Liter in 2012 steigern werden. Auf Grund des fortgesetzten Wachstums in der globalen Nachfrage nach IVIG, die auf etwa 7 % bis 13 % jährlich zwischen jetzt und 2015 vorhergesagt wird, wird mehr Rohplasma für die Immunglobulinreinigung bereitgestellt, um die Nachfrage trotz der erwarteten Verbesserung der IVIGGesamtausbeute zu befriedigen. Diese Forderung begrenzt die Verfügbarkeit von Plasma zur Herstellung von neuen aus Plasma gewonnenen Blutprodukten.

[0006] Auf Grund das Mangels an Plasma, das zur Herstellung von neuen, aus Plasma gewonnenen Produkten verfügbar ist, muss ihre Herstellung in den bestehenden Rahmen für die etablierten Herstellungsprozesse für aus Plasma gewonnene Produkte integriert werden, wie zum Beispiel Immunglobuline und Albumin. Faktor H, der als potenzielles Therapeutikum für AMD, aHUS und MPGN abgesehen wird, ist unter anderen Bedingungen ein solches aus Plasma gewonnenes Blutprodukt, dem die Ärzte Aufmerksamkeit widmen. Auf Grund der Ressour /75

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Patentamt cen, die zum Beispiel bei der Herstellung von IgG-Gammaglobulin eingesetzt werden, werden jedoch Verfahren für die Herstellung von Faktor H benötigt, die in die bestehenden Herstellungsmuster eingeführt werden. Mehrere Verfahren sind vorgeschlagen worden, um genau dies zu erreichen, jedoch erfordern viele dieser vorgeschlagenen Lösungen eine Modifizierung des bestehenden Herstellungsmusters für etablierte Produkte. Solche Änderungen erfordern neue Genehmigungsverfahren für die etablierten Produkte und können sogar zu Änderungen der Merkmale der etablierten Produkte führen.

[0007] Zum Beispiel beschreibt WO 2007/066017 Verfahren zur Herstellung von Faktor HPräparationen für den Überstand eines Kryopräzipitats. Das offenbarte Verfahren besteht aus der Präparation eines Überstandes eines Kryopräzipitats, Unterziehen des Überstandes einer Anionen-Austauschchromatographie (AEC), Weiterleiten des Flusses durch die AEC zur Heparin-Affinitätschromatographie (HAC), Weiterleiten des relevanten Eluats von der HAC zur starken Kationen-Austauschchromatographie (CEC), Weiterleiten des relevanten Eluats von der CEC zur starken Anionen-Austauschchromatographie (sAEC) und Eluieren des Faktors H aus der sAEC. Ungünstig ist, dass Kryopräzipitat-Überstände häufige Zwischenfraktionen bei Herstellungsprozessen vieler kommerziell wichtiger, aus Plasma gewonnener Blutprodukte sind, einschließlich IgG-Gammaglobuline (IVIG und subkutan) und Albumin. Wenn diese Fraktion Chromatographieschritten unterworfen wird, so ändert das den Kryopräzipitat-Überstand und erfordert, dass die Herstellungsprozesse der etablierten ablaufseitigen Blutprodukte in unbekannter Weise angepasst werden. Neben der Anforderung einer vollständigen Neuüberprüfung und der möglichen Neugestaltung dieser Herstellungsprozesse wird eine behördliche Neugenehmigung der Herstellungsprozeduren von wichtigen Überwachungsstellen benötigt.

[0008] Analog beschreibt WO 2008/113589 Verfahren zur Herstellung von Faktor H-Präparationen aus menschlichem Plasma. Speziell beschreibt diese Publikation die Reinigung von Faktor H aus drei bekannten Plasmaverarbeitungsfraktionen, nämlich einem Cohn-Oncley-Fraktion I-Überstand, einem Cohn-Oncley-Fraktion II-I-Präzipitat und einer Kistler/Nitschmann-Präzipitat B-Fraktion. Mit Bezug auf das erste Verfahren offenbart WO 2008/113589, dass Faktor H aus einem Cohn-Oncley-Fraktion I-Überstand durch Hinzufügen eines Heparin-Affinitätschromatographieschritts entfernt werden kann. Es ist ungünstig, dass der Oncley-Fraktion I-Überstand eine häufige Zwischenfraktion in den Herstellungsprozessen vieler kommerziell wichtiger, aus Plasma gewonnener Blutprodukte ist, einschließlich IgG-Gammaglobuline (IVIG und subkutan) und Albumin. Analog beruhen viele Immunglobulin- (z.B. IgG, IVIG usw.) Herstellungsprozesse nicht auf der Cohn-Oncley-Fraktion 111-Präzipitation oder Kistler/Nitschmann-Präzipitat BSchritten, zum Beispiel Gammagard® Liquid und Kiovig (Baxter International Inc.). Der Nachteil der Einführung von zusätzlichen Schritten, wie zum Beispiel Schritte einer Heparin-Affinitätschromatographie, Fraktion 111-Präzipitation oder Präzipitat B-Schritte, in die Herstellungsmuster etablierter Blutprodukte, wie oben angeführt, ist, dass sie die Neuüberprüfung der Herstellungsprozedur, behördliche Neugenehmigung der Herstellungsprozeduren von wichtigen Überprüfungsstellen erfordert und ferner unvorhergesehene Konsequenzen für die Ausbeute und/oder Reinheit der ansonsten etablierten Produkte haben kann.

[0009] Daher bleibt ein Bedarf im Fachgebiet an Verfahren zur Herstellung von Faktor H, die keine Verwendung von zusätzlichem eingeleitetem Plasma oder die Umgestaltung und behördliche Neugenehmigung bestehender Herstellungsprozesse für kommerziell wichtige, aus Plasma gewonnene Blutprodukte erfordern, wie zum Beispiel Albumin und IgG-Gammaglobuline für die intravenöse (IVIG) oder subkutane Verabreichung. Es ist vorteilhaft, dass die vorliegende Erfindung diese und andere Bedürfnisse durch das Bereitstellen von Verfahren zur Herstellung von Faktor H erfüllt, die vollständig auf vorher ungenutzten Nebenprodukten der Produktion beruhen. Neben anderen Erscheinungsformen sorgt die vorliegende Erfindung auch für neuartige Faktor H-Zusammensetzungen und Verfahren zum Behandeln von Krankheiten und Störungen, die in Beziehung zu Faktor H und Komplement stehen.

KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG [0010] Neben anderen Aspekte sorgt die vorliegende Erfindung für Verfahren zum Herstellen

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Patentamt von angereicherten Zusammensetzungen von aus Plasma gewonnenem Faktor H. Es ist vorteilhaft, dass die Verfahren, die hierin bereitgestellt werden, die industrielle Herstellung von Faktor H-Zusammensetzungen aus Materialien ermöglichen, die anderenfalls während der Herstellung anderer kommerziell wichtiger Blutprodukte durch Plasmafraktionierung verworfen werden.

[0011] Gemäß einem Aspekt sorgt die vorliegende Erfindung für ein Verfahren zur Herstellung einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung aus Plasma durch Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion II+III-Filterkuchen. In einer Ausführungsform beinhaltet das Verfahren die Gewinnung von Faktor H aus einer Fraktion Il+Ill-Suspension durch eine feste Phase und Abtrennung aus der sich ergebenden Fraktion Il+Ill-Suspension.

[0012] Gemäß einem zweiten Aspekt sorgt die vorliegende Erfindung für ein Verfahren zur Herstellung einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung aus Plasma durch Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion I-Präzipitat.

[0013] Gemäß einem dritten Aspekt sorgt die vorliegende Erfindung für Zusammensetzungen des aus Plasma gewonnenen Faktor H aus Materialien, die anderenfalls während der Herstellung anderer kommerziell wichtiger Blutprodukte durch Plasmafraktionierung verworfen werden, zum Beispiel IgG-Gammaglobuline.

[0014] Gemäß einem vierten Aspekt sorgt die vorliegende Erfindung für pharmazeutische Zusammensetzungen des aus Plasma gewonnenen Faktors H aus Materialien, die anderenfalls während der Herstellung anderer kommerziell wichtiger Blutprodukte durch Plasmafraktionierung verworfen werden, zum Beispiel IgG-Gammaglobuline.

[0015] Gemäß einem fünften Aspekt sorgt die vorliegende Erfindung für die Behandlung einer Krankheit oder Störung, die mit einer Faktor H-Dysfunktion in einer Person verbunden ist, das diese benötigt, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis einer Faktor HZusammensetzung, die aus Materialien hergestellt ist, welche anderenfalls während der Herstellung anderer kommerziell wichtiger Blutprodukte durch Plasmafraktionierung verworfen werden. Krankheiten und Störungen, die mit einer Faktor H-Dysfunktion verbunden sind, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, den Komplement Faktor H-(CFH)-Mangel, das atypische hämolytische urämische Syndrom (aHUS), die altersabhängige Makuladegeneration (AMD), membranproliferative Glomerulonephritis Typ II, Herzinfarkt, koronare Herzkrankheit / koronare Arterienkrankheit (CAD/CHD) und Alzheimer-Krankheit.

[0016] Gemäß einem sechsten Aspekt sorgt die vorliegende Erfindung für die Behandlung einer Krankheit oder Störung, die mit anomaler Komplementaktivität des Alternativen Weges in einer Person verbunden ist, das diese benötigt, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis einer Faktor H-Zusammensetzung, die aus Materialien hergestellt ist, welche anderenfalls während der Herstellung anderer kommerziell wichtiger Blutprodukte durch Plasmafraktionierung verworfen werden. Krankheiten und Störungen, die mit anomaler Komplementaktivität des Alternativen Weges verbunden sind, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Rheumatoide Arthritis, IgG-Nephropathie, Asthma, systemischen Lupus erythematodes und Ischämiereperfusionsschädigung.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

[0017] Figur 1. [0018] Figur 2.	Überblick über ein beispielhaftes Plasmafraktionierungsschema. Chromatographien von (A) DEAE Sepharose™ und (B) Heparin Sepharose™-Anreicherungsschritten eines Faktor H-Herstellungsprozesses, der einen Fraktion Il+lII-Filterkuchen als Ausgangsmaterial nutzt. SDS-PAGE und Western Blot-Analyse der (C) DEAE Sepharose™ und (D) Heparin Sepharose™-Chromatographie.
[0019] Figur 3.	7,5 %-SDS-PAGE-Analyse (nicht-reduzierendes Gel), die eine kommerzielle Präparation von Faktor H (CompTech; Säule 2) mit Faktor H-Zusammensetzungen, die aus Fraktion I-Präzipitat (Säule 4) und Fraktion

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Patentamt [0020] Figur 4.

[0021] Figur 5.

[0022] Figur 6.

[0023] Figur 7.

[0024] Figur 8.

[0025] Figur 9.

[0026] Figur 10.

Il+lII-Filterkuchen (Säule 6) hergestellt wurden. 1 pg Protein wurde in jede Säule eingebracht. Die Proteine wurden durch Färben mit Coomassie sichtbar gemacht. Säule eins enthält eine Protein-Molekulargewichtsleiter, die Bande bei 250, 150, 100, 75 und 50 kDa hat.

Menge von Faktor H, ausgedrückt als Prozentsatz des gesamten Proteins, festgestellt in verschiedenen Fraktionen eines beispielhaften Plasmafraktionierungsschemas.

Faktor H-Hemmung der alternativen Komplementaktivierung unter Verwendung von Faktor H, der aus einem Fraktion Il+lII-Filterkuchen gewonnen wurde.

Vergleich der Fraktion I-Cofaktoraktivität einer kommerziellen Präparation von Faktor H (CompTech; u) mit Faktor H-Zusammensetzungen, die aus Fraktion I-Präzipitat (s) und Fraktion Il+lII-Filterkuchen (n) hergestellt wurden.

SDS-PAGE-Analyse von Faktor H, der aus einem Fraktion Il+Ill-Filterkuchen unter Verwendung eines EDTA-Extraktionspuffers (Säule 3; 20 mM Tris (pH 8,0), 5 mM EDTA, 200 mM Natriumchlorid) oder eines Phosphatextraktionspuffers (Säule 4; 100 mM Natriumphosphat (pH 7,5), 150 mm Natriumchlorid) extrahiert wurde. Proben wurden durch Verdünnung auf 500 pg/ml Faktor H-Gehalt (gemessen durch Enzymimmunassay (ELISA)) vor dem Laden aus das Gel (7.5 % Mini-Protean® TGX™ Gel, BioRad®) normalisiert. Säule 1 enthält einen Faktor H-Standard (1,05 mg/ml, 97 % Reinheit, Calbiochem®; Gesamtlast 5 pg), und Säule 2 enthält Standard-Proteinmolekulargewichtsmarker (Precision Plus Protein™ Standards, Bio-Rad®). Beide Puffersysteme extrahierten Faktor H effizient.

Quantifizierung der Menge an Faktor H (g FH/I Plasma, wie durch ELISA gemessen), der aus einem Fraktion Il+Ill-Filterkuchen durch kontinuierliche Umwälzung eines Extraktionspuffers (Phosphat/Natriumchlorid) durch das Filter über 10 bis 60 Minuten extrahiert wurde. Durchschnittliche Gesamtausbeute für kombinierte Filtrat- und Nachspülfraktionen, wie im letzten Balken gezeigt.

SDS-PAGE-Analyse des resultierenden Proteingehalts aus Präzipitationen, die an Faktor H-Lösungen ausgeführt wurden, welche aus einem Fraktion Il+Ill-Filterkuchen extrahiert wurden. Säule 1 enthält StandardProteinmolekulargewichtsmarker (Precision Plus Protein™ Standards, Bio-Rad®); Säule 2 enthält einen Faktor H-Standard (1.05 mg/ml, 97 % Reinheit, Calbiochem®; Gesamtbeladung von 1 pg); die Säulen 3, 5, 7, 9 und 11 enthalten gelöste Präzipitate aus PEG-Präzipitationen (10 %, 12,5 %, 17,5 %, 20 % bzw. 12,5 % + 0,2 % Tween); die Säulen 4, 6, 8 und 10 enthalten Überstände aus PEG-Präzipitationen (10 %, 12,5 %, 17,5 % bzw. 20 %); Säule 12 enthält einen Überstand aus einer 15 % ÄthanolPräparation, die bei pH 8,0 ausgeführt wurde, und Säule 13 enthält ein gelöstes Präzipitat aus einer 25 % Äthanol-Präparation, die bei pH 6,0 ausgeführt wurde. Präzipitationen mit Äthanol sowie mit PEG sind effizient. Nur sehr kleine Mengen von Faktor H verblieben in den Überständen.

(A) Chromatogramm, (B) SDS-Page-Analyse und (C) Western Blot-Analyse von DEAE-Chromatographie, die mit schrittweise Elution einer Faktor HLösung ausgeführt wurde, welche aus einem Fraktion Il+Ill-Filterkuchen extrahiert wurde. Säule 1 enthält Standard-Proteinmolekulargewichtsmarker; Säule 2 enthält eine Probe der Faktor H-Lösung, die auf das

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DEAE-Harz geladen wurde; die Säulen 3 und 4 enthalten Proben des Durchflusses aus der DEAE-Beladung; Säule 5 enthält eine Probe des 100 mM-Elutionspeaks; Säule 6 enthält enthält eine Probe der 100 mMElutionsschulter; Säule 7 enthält eine Probe des 155 mM-Elutionspeaks; Säule 8 enthält eine Probe des 230 mM-Elutionspeaks und Säule 9 enthält einen kommerziellen Faktor H-Standard.

[0027] Figur 11. (A) Chromatogramm, (B) SDS-Page-Analyse und (C) Western Blot-Analyse von Heparin-Sepharose™-Chromatographie, die mit stufenweiser Elution einer Faktor H-Peakfraktion ausgeführt wurde, welche durch DEAEChromatographie angereichert wurde. Säule 1 enthält Standard-Proteinmolekulargewichtsmarker; Säule 2 enthält eine Probe der Faktor FlLösung, die auf das Heparin-Harz geladen wurde; die Säulen 3, 4 und 5 enthalten Proben des Durchflusses aus der Heparin-Beladung; Säule 6 enthält eine Probe des 98 mM-Elutionspeaks; Säule 7 enthält enthält eine Probe der 98 mM-Elutionsschulter; Säule 8 enthält eine Probe des 204 mM-Elutionspeaks und Säule 9 enthält einen kommerziellen Faktor HStandard.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

I. EINLEITUNG [0028] Faktor H ist als potenzielles Therapeutikum für mehrere menschliche Krankheitszustände genannt worden, einschließlich der altersabhängigen Makuladegeneration, des hämolytischen urämischen Syndroms und der membranproliferativen Glomerulonephritis (MPGN). Faktor H ist ein relativ häufiges Plasmaprotein (0,5 bis 0,8 mg/l Plasma); dieses Protein wird jedoch aktuell bei den Arbeitsgängen verschiedener Fertigungen verworfen, die sich auf die Fraktionierung von menschlichem Plasma spezialisieren. Neben anderen Erscheinungsformen sorgt die vorliegende Erfindung für die Isolierung von Faktor H aus verworfenen Fraktionen verschiedener Fraktionierungsprozesse, zum Beispiel Cohn, Oncley, Cohn-Oncley, Deutsch, Nitschmann, Kistler und ähnliche Fraktionierungsprozesse, ohne die normale oder etablierte Verarbeitung des Plasmas zu beeinträchtigen, zerstören oder verändern, das zur Herstellung anderer aus Plasma gewonnener Produkte verwendet wird. So macht die Erfindung in einer Erscheinungsform Gebrauch von verworfenen Plasmafraktionen für die Herstellung eines nützlichen Medikamentes für die Behandlung von AMD und anderen Störungen.

[0029] Dementsprechend ist es in einer Erscheinungsform eine Aufgabe der Erfindung, eine gereinigte Präparation von Faktor H aus einer gepoolten Plasmaprobe zu erzeugen. In einer verwandten Erscheinungsform beinhaltet die Erfindung die Verwendung einer solchen gereinigten Fraktion zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von AMD.

[0030] In einer Erscheinungsform sorgt die vorliegende Erfindung für neue Verfahren für die Herstellung von Faktor H aus gepooltem Plasma. In speziellen Ausführungsformen dienen die Verfahren der Herstellung von Faktor H aus gepooltem menschlichem Plasma und umfassen die folgenden Schritte: Ausführen der Cohn-Fraktionierung, um Fraktion Il+Ill-Präzipitate zu erhalten, und Herstellen einer Suspension der kombinierten Präzipitate; Filtern der neu suspendierten Fraktion Il+Ill-Präzipitate, um den verworfenen AerosilO-Filterkuchen zu erhalten, der nach Filtration der Fraktion Il+Ill-Suspension zurückbleibt; Extrahieren des Filterkuchens gemäß einem Verfahren, das folgende Schritte umfasst: (I) Auflösen des Filterkuchens in einem geeigneten Puffer von geeigneter lonenstärke über einen Zeitraum, der zum Auflösen des Proteins ausreicht, welches auf dem Filterkuchen liegt; (II) Verdünnen des aufgelösten Proteins mit zusätzlichem Puffer (III) Entfernen von losem Material aus dem verdünnten Protein; (IV) Reinigen von Faktor H-Protein aus der verdünnten Proteinpräparation durch Ultrafiltration des verdünnten Proteins in einem 0,45 pm-Filter, um ein Filtrat zu erzeugen, das den Faktor H enthält; (V) Anwendung einer Anionen-Austauschchromatographie auf das Filtrat, das Faktor H enthält, unter Verwendung eines NaCI-Gradienten im laufenden Puffer oder eine Einschritt-Elution bei

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Patentamt einer höheren Salzkonzentration, um eine gepoolte rohe Faktor H-Fraktion zu erzeugen; und (VI) Reinigen von Faktor H aus der rohen Faktor H-Präparation durch Heparin-Sepharose™Chromatographie unter Verwendung eines Gradienten von NaCI oder einer Einschritt-Elution bei einer höheren Salzkonzentration. In anderen Ausführungsformen kann Faktor H möglicherweise unter Verwendung der Schritt-Elution von einem chromatographischen Harz gewonnen werden, wie zum Beispiel einem Anionen-Austauschharz oder einem Heparin-Affinitätsharz.

[0031] Obwohl in speziellen Ausführungsformen die Anionen-Austauschchromatographie DEAE-Sepharose™ als Anionen-Austauschharz verwendet wird, versteht es sich, dass jedes Anionen-Austauschharz verwendet werden kann, um die Anionen-Austauschchromatographie auszuführen.

[0032] Bei Verwendung des Verfahrens, das hierin beschrieben wird, ist der gereinigte Faktor H eine aktive Faktor H-Präparation, die sich aus einer Mischung von Tyr-402- und His-402-Isoformen im Bereich von 50 %±20 % His-402; 50 %±20 % Tyr-402 zusammensetzt.

[0033] In bestimmten Reinigungsschritten kann das Verfahren ferner das Hinzufügen von Fraktion I-Präzipitat mit dem Filterkuchen in Schritt (c)(1) umfassen.

[0034] In speziellen Ausführungsformen ist der Puffer, der verwendet wird, 25mM Tris; 5mM EDTA; 50mM NaCI, der einen pH- Wert von 8,0 hat.

[0035] Der Faktor H, der durch das Verfahren erzeugt wird, welches beschrieben wird, kann weiter lyophilisiert werden.

[0036] Eine weitere Erscheinungsform der Erfindung ist eine stark gereinigte Faktor H-Präparation, die gemäß einem Verfahren hergestellt wird, welches hierin beschrieben wird. Genauer gesagt, ist die Faktor H-Präparation eine aktive Faktor H-Präparation, die sich aus einer Mischung von Tyr-402- und His-402-Isoformen im Bereich von 50 %±20 % His-402; 50 %±20 % Tyr-402 zusammensetzt.

[0037] Die Erfindung betrachtet ferner ein Verfahren zum Begrenzen der Komplementaktivierung, was zum verzögerten Fortschreiten oder Einsetzen der Entwicklung einer altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) in einem Patienten führt; es umfasst das Verabreichen einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge einer Faktor H-Präparation der Erfindung. Das Verfahren der Verabreichung kann an einem Patienten ausgeführt werden, der keine AMDSymptome aufweist, aber in einem Alter ist und eine Anamnese hat, die darauf hinweist, dass der Patient gefährdet ist, solche Symptome zu entwickeln. In einigen Ausführungsformen hat der Patient Drusen. Das Verfahren kann auch zur effektiven Behandlung von Patienten verwendet werden, die Zeichen und/oder Symptome von AMD zeigen. Der Patient kann zum Beispiel die Diagnose AMD erhalten haben.

[0038] In bestimmten Ausführungsformen erfolgt die Verabreichung in intravenöser Form. In anderen Ausführungsformen erfolgt die Verabreichung durch Augentropfen oder auf einem anderen intravitrealem Weg (z.B. intravitreale Injektion).

[0039] In anderen Ausführungsformen sorgt die Erfindung für die Begrenzung der Komplementaktivierung, die anderenfalls zu einer Krankheit oder Störung führt, welche mit einer Faktor HDysfunktion verbunden ist, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Complement Faktor H (CFH)-Mangel, atypisches hämolytisches urämisches Syndrom (aHUS), altersabhängige Makuladegeneration (AMD), membranproliferative Glomerulonephritis Typ II, Herzinfarkt, koronare Herzkrankheit / koronare Arterienkrankheit (CAD/CHD) und Alzheimersche Krankheit, oder Krankheiten oder Störungen, die mit anomaler Komplementaktivität des alternativen Weges, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Rheumatoide Arthritis, IgA-Nephropathie, Asthma, systemischer Lupus erythematodes und Ischämie-Reperfusionsschädigung, durch Verabreichung einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge einer Faktor H-Präparation, die hierin bereitgestellt wird.

[0040] Es wird auch ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten betrachtet, der in Gefahr ist, eine Krankheit oder Störung zu entwickeln, die mit einer Faktor H-Dysfunktion verbunden ist,

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Patentamt einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Complement Faktor H-(CFH)-Mangel, atypisches hämolytisches urämisches Syndrom (aHUS), altersabhängige Makuladegeneration (AMD), membranproliferative Glomerulonephritis Typ II, Herzinfarkt, koronare Herzkrankheit / koronare Arterienkrankheit (CAD/CHD) und Alzheimersche Krankheit, oder eine Krankheit oder Störung, die mit anomaler Komplementaktivität des alternativen Weges verbunden ist, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Rheumatoide Arthritis, IgA-Nephropathie, Asthma, systemischer Lupus erythematodes und Ischämie-Reperfusionsschädigung, das den Schritt des Verabreichens einer therapeutisch oder prophylaktisch wirksamen Menge einer Faktor HPräparation, die gemäß den Verfahren, die hierin beschrieben werden, und das Wiederholen der Verabreichung an den Patienten umfasst. In einigen Beispielen wird die Verabreichung über eine Zeit wiederholt, die wirksam ist, um das Fortschreiten und das Einsetzen der Entwicklung der Makuladegeneration beim Patienten zu verzögern. In speziellen Ausführungsformen wird der Patient danach beurteilt, ob er in Gefahr ist, die altersabhängige Makuladegeneration zu entwickeln, wie auf der Grundlage des Vorhandenseins von einem oder mehreren genetischen Markern festgestellt, die mit der Entwicklung der altersabhängigen Makuladegeneration verbunden sind. Zum Beispiel ist der genetische Marker ein Polymorphismus. In einer Ausführungsform wird bei einem Patienten durch Nachweis einer speziellen Sequenzvariante im CFH-Gen die Diagnose gestellt, dass er in Gefahr ist, AMD zu entwickeln. In einigen Ausführungsformen kann das Behandlungsverfahren an einem Patienten ausgeführt werden, bei dem noch nicht die Diagnose AMD gestellt wurde. Die Behandlung kann allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen für AMD ausgeführt werden. Das Behandlungsverfahren kann bei einem Patienten ausgeführt werden, der bisher noch nicht auf AMD behandelt worden ist und als solcher unbehandelt ist.

[0041] Eine weitere Erscheinungsform der Erfindung ist eine pharmazeutische Präparation, die eine aktive Faktor H-Präparation umfasst, welche nach einem Verfahren, das hierin beschrieben wird, und mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger hergestellt wird.

II. DEFINITIONEN [0042] Wie hierin verwendet, bezieht sich Faktor H auf eine Proteinkomponente des Alternativen Weges von Komplement, die durch das Komplementfaktor-G-Gen codiert wird (zum Beispiel CFH; NM000186; GenelD:3075; UniProt ID P08603; Ripoche et al., Biochem. J. 249:593602(1988)). Faktor H wird als ein 1.213-Aminosäuren-Präkursorpolypeptid translatiert, das durch Entfernen eines 18-Aminosäuren-Signalpeptids verarbeitet wird, was zum reifen Faktor H-Protein führt (Aminosäuren 19-1231). Wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, umfasst Faktor H alle natürlichen Varianten, alternativen Sequenzen, Isoformen oder mutierten Proteine, die in einer Plasmaprobe gefunden werden können, zum Beispiel in einer menschlichen Plasmaprobe. Beispiele für Faktor H-Mutationen, die in der menschlichen Bevölkerung gefunden werden, umfassen ohne Einschränkung Y402H; V62I; R78G; RI27L; A224; Q400K; C431 S; T493R; C536R; I551T; R567G; C630W; C673S; C673Y; E850K; S8901; H893R; C915S; E936D; Q950H; Y951H; T956M; C959Y; W978C; N997T; V10071; V1007L; A1010T; T10171; Y1021F; C1043R; N1O5OY;I1O59T; Q1076R; R1078S; D1119G; V1134G; Y1142D; Q1143E; W1157R; C1163W; W1183L; W1183R; T1184R; L1189R; S1191L; G1194D; V1197A; E1198A; F1199S; R1210C; R1215G; R1215Q; YPTCA- KR1225:1231FQS; und PI226S. Bei vielen dieser Mutationen wurde festgestellt, dass sie mit einer Vielzahl von Krankheiten und Störungen verbunden sind, einschließlich des atypischen hämolytischen urämischen Syndroms (aHUS), der altersabhängigen Makuladegeneration (AMD), der membranproliferativen Glomerulonephritis Typ II (MPGNII), CFH-Mangel und basaler laminarer Drusen. Faktor H umfasst auch Proteine, die posttranslationale Modifikationen enthalten. Man glaubt zum Beispiel, dass der Faktor H durch N-Acetylglucosamin (GIcNAc) an den Resten 529, 718, 802, 822, 882, 911, 1029, und 1095 modifiziert wird.

[0043] Wie hierin verwendet, bezieht sich kryoarmes Plasma auf den Überstand, der nach dem Entfernen des Kryopräzipitats erzeugt wird, welches durch das Auftauen von Plasma oder gepooltem Plasma bei Temperaturen nahe der Gefriertemperatur gebildet wird, z.B. bei Tempe

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Patentamt raturen unter etwa 10 °C, vorzugsweise bei einer Temperatur, die nicht höher als etwa 6 °C liegt. Im Kontext der vorliegenden Erfindung kann sich Plasma austauschbar auf wiedergewonnenes Plasma beziehen (d.h. Plasma, das von Vollblut ex vivo abgetrennt wurde) oder Ursprungsplasma (d.h. Plasma, das durch Plasmapherese gesammelt wurde). Kryopräzipitation wird im allgemeinen durchgeführt, zum Beispiel durch Auftauen von vorher gefrorenem gepooltem Plasma, das bereits auf Sicherheit und Qualitätsaspekte untersucht wurde, obwohl frisches Plasma ebenfalls verwendet werden kann. Nach dem vollständigen Auftauen des gefrorenen Plasmas bei niedriger Temperatur wird die Abtrennung der festen Kryopräzipitate vom flüssigen Überstand in der Kälte (z.B. <6 °C) durch Zentrifugation der Filtration ausgeführt.

[0044] Wie hierin verwendet, bezieht sich ein Cohn-Pool auf das Ausgangsmaterial, das zur Fraktionierung einer Plasmaprobe oder eines Pools von Plasmaproben verwendet wird. CohnPools umfassen Vollplasma, kryoarme Plasmaproben und Pools von kryoarmen Plasmaproben, die einem Vorverarbeitungsschritt ausgesetzt sein können oder nicht. In bestimmten Ausführungsformen ist ein Cohn-Pool eine kryoarme Plasmaprobe, aus der ein oder mehrere Blutfaktoren in einem Vorverarbeitungsschritt entfernt worden sind, zum Beispiel Adsorption an einer festen Phase (z.B. Aluminiumhydroxid, fein verteiltes Siliziumdioxid usw.), oder in einem chromatographischen Schritt (z.B. lonen-Austausch- oder Heparin-Affinitätschromatographie). Verschiedene Blutfaktoren, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Faktor Vlll-InhibitorBypassaktivität (FEIBA), Faktor IX-Komplex, Faktor Vll-Konzentrat oder Antithrombin HlKomplex, können aus der kryoarmen Plasmaprobe isoliert werden, um einen Cohn-Pool zu bilden.

[0045] Wie hierin verwendet, bezieht sich Fraktion ll+lll- Filterkuchen auf eine feste Phase, die nach der Filtration oder Zentrifugation einer Cohn-Oncley- oder äquivalenten Fraktion ll+lllPastensuspension rückgewonnen wird. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Fraktion II+Ill-Suspension mit einem adsorbierenden Material behandelt, zum Beispiel fein verteiltes Siliziumdioxid, um Verunreinigungen zu entfernen, wie zum Beispiel Lipide, Fibrinogen, amidolytische Aktivität, Prekallikrein-Aktivität und Lipoproteine. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform können Filterhilfsmittel vor der Zentrifugation oder Filtration der Fraktion ll+lllSuspension zugesetzt werden. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform wird ein Fraktion II+Ill-Suspension sowohl mit einem adsorbierenden Material wie auch mit einem Filterhilfsmittel vor der Zentrifugation oder Filtration behandelt. Bei Abtrennung des geklärten Fraktion Il+Ill-Suspensionsüberstandes wird das rückgewonnene Festphasenmaterial als Fraktion Il+lII-Filterkuchen bezeichnet.

[0046] Wie hierin verwendet, bezieht sich fein verteiltes Siliziumdioxid oder fein verteilte Kieselerde auf ein Oxid von Silizium, das die Formel SiO₂ hat und in einerWeise hergestellt ist, die die Adsorption von Faktor H auf seiner Oberfläche ermöglicht. Beispielhafte Formen von fein verteiltem Siliziumdioxid, die sich zur Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, pyrogene Kieselsäure, Aerosil®, Cab-OSii™, kolloidale Kieselsäure, Diatomeenerde und dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein kommerzielles hydrophiles pyrogenes Kieselsäureprodukt für die Verfahren verwendet, die hierin bereitgestellt werden. Nicht-einschränkende Beispiele für diese Produkte umfassen die von Evonik Industries unter dem Warenzeichen Aerosil vermarkteten Produkte (z.B. Aerosil 90, Aerosil 130, Aerosil 150, Aerosil 200, Aerosil 300, Aerosil 380, Aerosil OX 50, Aerosil EG 50, Aerosil TT 600, Aerosil 200 SP, Aerosil 300 SP und Aerosil 300/30).

[0047] Wie hierin verwendet, bezieht sich eine Krankheit oder Störung, die mit einer Faktor HDysfunktion verbunden ist auf jede Krankheit, Störung oder Zustand in einem Patienten, die durch einen reduzierten Pegel an Faktor H-Aktivität im Patienten verursacht, gekennzeichnet ist oder zu demselben führt. Für Zwecke der vorliegenden Erfindung kann sich Faktor H-Aktivität auf die Fähigkeit von Faktor H beziehen, ein Protein oder einen Liganden zu binden, zum Beispiel C3b, C3bBb, C3b2Bb, csbC3b, Komplementfaktor B (CFB), C-reaktives Protein, Endothelzellen, Glycosaminoglycane (GAGS), oder kann sich alternativ auf seine Faktor I-Cofaktoraktivität oder seine Fähigkeit beziehen, die irreversible Dissoziation von C3bBb und C3b2Bb zu beschleunigen. In einer Ausführungsform führt eine Krankheit oder Störung, die mit einer Faktor

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H-Dysfunktion verbunden ist, zu einem C3-Mangel und zur Anfälligkeit für bakterielle Infektionen. In einigen Fällen umfassen Krankheiten oder Störungen, die mit einer Faktor H-Dysfunktion verbunden sind, Zustände, die durch Mutationen und Polymorphismus im CFH-Gen verursacht werden oder mit demselben verbunden sind, das Faktor H codiert (Überblick siehe Barlow et al., Adv Exp Med Biol. 2008;632:117-42). Krankheiten, die in Verbindung mit Mutationen oder Polymorphismen im CFH-Gen gesehen werden, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Faktor H-Mangel, atypisches hämolytisches urämisches Syndrom (aHUS), altersabhängige Makuladegeneration (AMD), membranproliferative Glomerulonephritis Typ II (MPGNII; de Cordoba and de Jorge, Clinical and Experimental Immunology 151,1-13 (2008)), Myokardinfarkt (Kardys et al., Journal of the American College of Cardiology 47, 1568-1575 (2006); Mooijaart et al., Experimental Gerontology 42, 1116-1122 (2007); Nicaud et al., Journal of Molecular Medicine 85, 771-775 (2007); Pai et al., European Heart Journal 28, 1297-1303 (2007); Stark et al., Clinical Science (Loud) 113, 213-218 (2007)), coronary heart disease/coronary artery disease (CAD/CHD; (Meng et al., BMC Medical Genetics 8, 62 (2007); Pulido et al., Mayo Clinic Proceedings 82, 301-307 (2007); Topol et al., Human Molecular Genetics 15 Spec No 2, R117—R123 (2006)), und Alzheimer- Krankheit (Hamilton et al., Neuromolecular Medicine 9, 331-334 (2007); Zetterberg et al., American Journal of Ophthalmology 143, 1059-1060 (2007)).

[0048] Wie hierin verwendet, bezieht sich eine Krankheit oder Störung, die mit anomaler Komplementaktivität des alternativen Weges verbunden sind auf eine Krankheit, Störung oder einen Zustand, der sich aus der ungesteuerten oder abweichenden Aktivierung des alternativen Weges von Komplement ergibt. Allgemein kann die ungesteuerte oder abweichende Aktivierung des alternativen Weges von Komplement zu Nebenschäden von Wirtszellen und -geweben führen sowie zur Verarmung an C3 und eine entsprechende Anfälligkeit für pathogene Infektionen (z.B. Pilz-, Bakterien-, Viren- und Protisteninfektionen). Beispiele für Krankheiten und Störungen, die mit anomaler Komplementaktivität des alternativen Weges verbunden sind, umfassen, ohne Einschränkung, verschiedene Autoimmunkrankheiten (wie zum Beispiel rheumatoide Arthritis, IgG-Nephropathie, Asthma, systemischer Lupus erythematodes, Multiple Sklerose, Anti-Phospholipidsyndrom, ANCA-assoziierte Vaskulitis, Pemphigus, Uveitis, Myasthenia gravis, Hashimoto-Thyroiditis), Nierenkrankheiten (wie zum Beispiel IgA-Nephropathie, hämolytisches urämisches Syndrom, membranproliferative Glomerulonephritis), andere Krankheiten, wie zum Beispiel Asthma, Alzheimer-Krankheit, Makuladegeneration des Erwachsenen, proximale nächtliche Hämoglobinurie, abdominelles Aortenaneurisma, Ischämie und Sepsis.

[0049] Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff Ultrafiltration (UF) eine Reihe von Membranfiltrationsverfahren, bei denen der hydrostatische Druck eine Flüssigkeit gegen eine semipermeable Membran drückt. Suspendierte Feststoffe und gelöste Substanzen von hohem Molekulargewicht werden zurückgehalten, während Wasser und gelöste Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht die Membran passieren. Dieser Trennprozess wird oft zum Reinigen und Konzentrieren von makromolekularen (10³ - 10⁶ Da) Lösungen, besonders Proteinlösungen, verwendet. Es steht je nach der Größe der Moleküle, die sie zurückhalten, eine Reihe von Ultrafiltrationsmembranen zur Verfügung. Die Ultrafiltration ist normalerweise durch eine Membranporengröße zwischen 1 und 1000 kDa und Betriebsdrücke zwischen 0,01 und 10 bar gekennzeichnet.

[0050] Wie hierin verwendet, wird Diafiltration mit derselben oder einer ähnlichen Membran wie die Ultrafiltration und normalerweise in einem Tangential-Flow-Filtrationsmodus ausgeführt. Während der Diafiltration wird Puffer in den Recyclingtank eingeleitet, während Filtrat aus der Grundoperation entfernt wird. Bei Prozessen, bei denen das Produkt in der zurückgehaltenen Substanz ist (zum Beispiel Faktor H), ist die Diafiltration besonders für die Abtrennung von Protein von kleinen Molekülen nützlich, wie zum Beispiel Zucker und Salze. In bestimmten Fällen kann die Diafiltration zum Austauschen der Lösung, des Puffers oder individueller Komponenten eines Puffersystems verwendet werden.

[0051] Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff etwa einen ungefähren Bereich von plus oder minus 10 % von einem angegebenen Wert. Zum Beispiel umfasst der Ausdruck etwa 20 % einen Bereich von 18 bis 22 %.

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Patentamt [0052] Wie hierin verwendet, beschreibt der Begriff Mischen das aktive Bewirken einer Gleichverteilung von zwei oder mehr verschiedenen Verbindungen oder Substanzen in einer Lösung oder Suspension durch irgendeine Form des Rührens. Vollständig gleichförmige Verteilung aller Bestandteile in einer Lösung oder Suspension ist nicht als Ergebnis des Mischens gefordert, wie der Begriff in dieser Anmeldung verwendet wird.

[0053] Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff Lösungsmittel jede flüssige Substanz, die eine oder mehrere andere Substanzen auflösen oder dispergieren kann. Ein Lösungsmittel kann anorganischer Natur sein, wie zum Beispiel Wasser, oder es kann eine organische Flüssigkeit sein, wie zum Beispiel Ethanol, Aceton, Methylacetat, Ethylacetat, Hexan, Petrolether usw. Wie im Begriff Lösungsmittel-Detergenzien-Behandlung verwendet, bezeichnet Lösungsmittel ein organisches Lösungsmittel (z.B. tri-N-Butylphosphat), das Teil der Lösungsmittel-Detergenzien-Mischung ist, welche zum Inaktivieren von Viren mit Lipidhülle in Lösung verwendet wird.

[0054] Wie hierin verwendet, wird der Begriff Detergens in dieser Anmeldung austauschbar mit dem Begriff Tensid oder oberflächenaktiver Stoff verwendet. Tenside sind normalerweise organische Verbindungen, die amphiphil sind, d.h. sowohl hydrophobe Gruppen (Schwänze) wie auch hydrophile Gruppen (Köpfe) enthalten, welche die Tenside sowohl in organischen Lösungsmitteln wie auch in Wasser löslich machen. Ein Tensid kann durch das Vorhandensein von formal geladenen Gruppen in seinem Kopf klassifiziert werden. Ein nichtionisches Tensid hat keine Ladungsgruppen in seinem Kopf, während ein ionisches Tensid eine Nettoladung in seinem Kopf trägt. Ein zwitterionisches Tensid enthält einen Kopf mit zwei entgegengesetzt geladenen Gruppen. Einige Beispiele von häufigen Tensiden umfassen: Anionisch (auf der Grundlage von Sulfat-, Sulfonat- oder Carboxylatanionen): Perfluoroctanoat (PFOA oder PFO), Perfluoroctansulfonat (PFOS), Natriumdodecylsulfat (SDS), Ammoniumlaurylsulfat und andere Alkylsulfatsalze, Natriumlaurethsulfat (auch als Natriumlaurylethersulfat oder SLES bekannt), Alkylbenzensulfonat; Kationisch (auf der Grundlage von quaternären Ammoniumkationen): Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) auch bekannt als Hexadecyltrimethylammoniumbromid und andere Alkyltrimethylammoniumsalze, Cetylpyridiniumchlorid (CPC), polyethoxyliertes Talgamin (POEA), Benzalkoniumchlorid (BAC), Benzethoniumchlorid (BZT); Langkettige Fettsäuren und ihre Salze: einschließlich Caprylat, Caprylsäure, Heptanoat, Hexansäure, Heptansäure, Nonansäure, Decansäure und dergleichen; Zwitterionisch (amphoterisch): Dodecylbetain; Cocamidopropylbetain; Cocoamphoglycinat; nichtionisch: Alkylpoly(ethylenoxid), Alkylphenolpoly(ethylenoxid), Copolymere von Poly(ethylenoxid) und Polypropylenoxid) (kommerziell bekannt als Poloxamere oder Poloxamine), Alkylpolyglucoside, einschließlich Octylglucosid, Decylmaltosid, Fettalkohole (z.B. Cetylalkohol und Oleylalkohol), Cocamid MEA, Cocamid DEA, Polysorbate (Tween 20, Tween 80, usw.), Triton-Tenside und Dodecyldimethylaminoxid.

[0055] Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff therapeutisch wirksame Menge oder Dosis oder ausreichende Menge oder Dosis auf eine Dosis, die Effekte erzeugt, für welche sie verabreicht wird. Die exakte Dosis hängt vom Zweck der Behandlung ab und kann von einem Fachmann ermittelt werden, der bekannte Verfahren verwendet (siehe z.B. Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (Bd.. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); und Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).

[0056] Wie in dieser Patentanmeldung verwendet, bezieht sich der Begriff Sprühen auf ein Mittel zum Zuführen einer flüssigen Substanz zu einem System, z.B. während eines Alkoholausfällungsschritts, wie zum Beispiel als Cohn-Fraktionierung I- oder ll+llI-Ausfällungsschritt, in Form von feinen Tröpfchen oder Nebel der flüssigen Substanz. Sprühen kann durch eine unter Druck stehende Vorrichtung erreicht werden, wie zum Beispiel ein Behälter (z.B. eine Sprühflasche), die einen Sprühkopf oder eine Düse hat und manuell oder automatisch betrieben wird, um aus einer Flüssigkeit einen feinen Nebel zu erzeugen. Normalerweise wird das Sprühen ausgeführt, während das System, das die flüssige Substanz erhält, kontinuierlich gerührt oder auf andere Weise gemischt wird, um eine schnelle und gleichförmige Verteilung der Flüssigkeit

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Patentamt im System sicherzustellen.

III. VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON AUS PLASMA GEWONNENEM FAKTOR H [0057] Nachdem gezeigt wurde, dass die Verfahren, die hierin beschrieben werden, für die Herstellung und Erzeugung von menschlichem Faktor H geeignet sind, der die Aktivität beibehält, ist es eine spezifische Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Produktionsprozedur für eine aus Plasma gewonnene Version des menschlichen Faktor H zur therapeutischen Verwendung im Großmaßstab bereitzustellen. Großmaßstab in Bezug auf die vorliegende Erfindung bedeutet eine Produktionsprozedur, die aus mindestens 200 Litern Plasma beruht, vorzugsweise mindestens 500 Liter, noch besser mindestens 2000 Liter menschliches Plasma.

[0058] Bezüglich der Produktion sollen die beanspruchten Prozesse, die bei menschlichem Plasma anfangen, auf der Subfraktionierung von typischen industriellen Zwischenprodukten beruhen, die z.B. auf der Fraktionsausfällung durch Ethanol in der Kälte erhalten werden (besprochen in Schultze Η E, Heremans J F; Molecular Biology of Human Proteins. Bd. I: Nature and Metabolism of Extracellular Proteins 1966, Elsevier Publishing Company; p. 236-317). Eine bevorzugte Ausführungsform einer solchen Reinigung ist die Reinigung des funktionellen Faktors H aus Nebenfraktionen der Plasmafraktionierung im industriellen Maßstab, so dass die etablierten und lizenzierten Herstellungsprozesse von Plasmaprodukten, die unter der Kontrolle von pharmazeutischen Zulassungsbehörden stehen, zum Beispiel Immunglobuline, nicht beeinträchtigt werden. Zum Beispiel sind der Filterkuchen, der nach Filtration einer Fraktion ll+lllPastensuspension erhalten wird (Teschner W et al., Vox Sang. 2007 Jan;92(1 ):42-55), Precipitate III (Schultze Η E, Heremans J F; Molecular Biology of Human Proteins. Bd. I: Nature and Metabolism of Extracellular Proteins 1966, Elsevier Publishing Company; p. 236-317 auf S. 253) und Präzipitat B (Verfahren von Kistler und Nitschmann; oben auf S. 253) Beispiele für solche industriellen Quellen für Faktor H. Beginnend bei diesen Nebenfraktionen, können die Reinigungsprozeduren, die im Fachgebiet bekannt sind, zum Reinigen von Faktor H verwendet werden. Sie können auf der Ausfällung mit Polyethylenglykol (Nagasawa S, Stroud R M; Mol Immunol 1980; 17:1365-72), Affinitätschromatographie über immobilisiertes Heparin (Literaturstelle wie vorher), lonen-Austauschchromatographie (Crossley L G, Porter R R; Biochem J 1980; 191:173-82) und hydrophobe Interaktionschromatographie (Ripoche J, AI Salihi A, Rousseaux J, Fontaine M; Biochem J 1984; 221,89-96) beruhen.

[0059] Das Ausgangsmaterial für die Erfindung wird unter Verwendung von Cohn-Fraktionen hergestellt. Diese Fraktionierung ist eine bekannte Fraktionierung, die zur Herstellung von Immunglobulinpräparationen verwendet wird, die aus Spenderserum oder monoklonalen oder rekombinanten Immunglobulinen hergestellt werden können. In einem typischen Beispiel wird Blut gesunden Spendern abgenommen. Normalerweise wird das Blut von derselben Tierart abgenommen wie der Patient, dem die Immunglobulinpräparation verabreicht wird (die normalerweise als homologe Immunglobuline bezeichnet wird). Die Immunglobuline werden aus dem Blut durch geeignete Prozeduren isoliert, wie zum Beispiel Cohn-Fraktionierung, Ultrazentrifugation, elektrophoretische Herstellung, lonen-Austauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Immunaffinitätschromatographie, Polyethylenglykol-Fraktionierung oder dergleichen. (Siehe, z.B. Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68:459-75 (1946); Oncley et al., J. Am. Chem. Soc. 71:541-50 (1949); Barundern et al., Vox Sang. 7:157-74 (1962); Koblet et al., Vox Sang. 13:93102 (1967); U.S. Pat. Nos. 5,122,373 und 5,177,194). Die vorliegende Erfindung verwendet die verworfenen Fraktionen aus der Herstellung von Immunglobulinen. Insbesondere verwendet die vorliegende Erfindung die Fraktion, die auf dem Filterkuchen ausgefällt ist, sobald der Fraktion II+III-Extrakt durch ein AerosilO-Filter gefiltert ist.

[0060] Allgemein können Faktor H-Präparationen gemäß der vorliegenden Erfindung aus allen geeigneten Ausgangsmaterialien hergestellt werden, zum Beispiel rückgewonnenes Plasma oder Ursprungsplasma. In einem typischen Beispiel wird Blut oder Plasma gesunden Spendern abgenommen. Normalerweise wird das Blut von derselben Tierart abgenommen wie der Patient, dem die Faktor H- Präparation verabreicht wird (die normalerweise als homologer Faktor H bezeichnet wird). Faktor H wird aus dem Blut oder Plasma durch geeignete Prozeduren

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Patentamt isoliert, wie zum Beispiel Präzipitation (Alkoholfraktionierung oder Polyethylenglykolfraktionierung), chromatographische Verfahren (lonen-Austauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Immunaffinitätschromatographie usw.), Ultrazentrifugation und elektrophoretische Präparation und dergleichen. (Siehe, z.B. Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68:459-75 (1946); Deutsch et al., J. Biol. Chem. 164:109-118; Oncley et al., J. Am. Chem. Soc. 71:541 -50 (1949); Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 72:465-474 (1950); Cohn et al., Blood Celis and Plasma Proteins: Their State in Nature (J.L. Tullis, ed), pp. 158, Academic Press, New York and London (1953); Nitschmann et al., Helv. Chim. Acta 37:866-873; Kistler and Nitschmann, Vox Sang. 7:414-424 (1962); Barundern et al., Vox Sang. 7:157-74 (1962); Koblet et al., Vox Sang. 13:93102 (1967); U.S. Patent Nr. 5,122,373 und 5,177,194).

[0061] In bestimmten Ausführungsformen wird Faktor H aus Material gewonnen, das anderenfalls während der Herstellung anderer kommerziell wichtiger Blutprodukte durch Plasmafraktionierung verworfen wird. Zum Beispiel wird in einer beispielhaften Ausführungsform Faktor H aus einem Fraktion I- Präzipitat extrahiert und/oder aus einem Filterkuchen extrahiert, der nach Zentrifugation oder Filtration einer neu suspendierten Fraktion ll+lIl-Paste gebildet wird. Es ist vorteilhaft, dass gemäß den Verfahren, die hierin bereitgestellt werden, die industrielle Herstellung von Faktor H erreicht werden kann, ohne die Notwendigkeit von zusätzlich eingegebenem Plasma oder Umgestaltung und behördliche Neuzulassung bestehender Herstellungsprozesse für andere kommerziell wichtige, aus Plasma gewonnene Blutprodukte, wie zum Beispiel IgGGammaglobuline zur intravenösen (IVIG) oder subkutanen Verabreichung.

[0062] In einer Erscheinungsform sorgt die vorliegende Erfindung für ein Verfahren zur Herstellung einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung aus Plasma durch Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion Il+lII-Filterkuchen. In einer verwandten Ausführungsform beinhaltet das Verfahren die Adsorption von Faktor H aus einem suspendierten Fraktion Il+Ill-Präzipitat und Abtrennung aus der Suspension.

[0063] In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Herstellen einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung aus Plasma bereitgestellt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Ausfällen von Proteinen aus einer kryoarmen Plasmafraktion in einem ersten Präzipitationsschritt mit etwa 6 % bis etwa 10 % Alkohol bei einem pH zwischen etwa 7,0 und etwa 7,5, um ein erstes Präzipitat und einen ersten Überstand zu erhalten; Ausfällen von Faktor H aus dem ersten Überstand in einem zweiten Präzipitationsschritt mit etwa 20 % bis etwa 30 % Alkohol bei einem pH zwischen etwa 6,7 und etwa 7,3, um ein zweites Präzipitat zu bilden; (c) Wiedersuspendieren des zweiten Präzipitats, um eine Suspension zu bilden; (d) Mischen von fein verteiltem Siliziumdioxid (SiO₂) mit der Suspension aus Schritt (c); (e) Abtrennen der Suspension, um einen Filterkuchen und einen Überstand zu bilden; und (f) Extrahieren von Faktor H aus dem Filterkuchen mit einem Faktor H-Extraktionspuffer, dadurch Herstellen einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Filterkuchen vom Überstand durch Filtern der Suspension durch eine Filterpresse getrennt, die ein geeignetes Filter enthält. In einer Ausführungsform kann Faktor H durch Umwälzen eines Extraktionspuffers durch eine Filterpresse extrahiert werden, die einen Filterkuchen enthält.

[0064] In einer zweiten Erscheinungsform sorgt die vorliegende Erfindung für ein Verfahren zur Herstellung einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung aus Plasma durch Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion I-Präzipitat.

[0065] In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Herstellen einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung aus Plasma bereitgestellt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Ausfällen von Proteinen aus einer kryoarmen Plasmafraktion in einem ersten Präzipitationsschritt mit 6 % bis 10 % Alkohol bei einem pH zwischen 7,0 und 7,5, um ein erstes Präzipitat und einen ersten Überstand zu erhalten; und (b) Extrahieren von Faktor H aus dem Präzipitat mit einem Faktor H-Extraktionspuffer, dadurch Herstellen einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung.

[0066] In einer Erscheinungsform wird ein Verfahren zur Herstellung einer angereicherten

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Faktor H-Zusammensetzung aus Plasma bereitgestellt, indem Faktor H aus einem Pool von zwei oder mehr Nebenproduktfraktionen extrahiert wird, die durch einen Prozess erzeugt werden, der zum Bereitstellen eines zweiten Blutproteins ausgelegt ist, zum Beispiel von IgGGammaglobulinen. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Poolen eines Fraktion I-Präzipitats und eines Fraktion ll+lIl-Filterkuchens, der während der Herstellung von IgGGammaglobulinen (z.B. IVIG) gebildet wird, und das Extrahieren von Faktor H aus den gepoolten Fraktionen.

[0067] In einer verwandten Erscheinungsform wird Faktor H, der aus zwei oder mehr Nebenproduktfraktionen extrahiert wurde, die durch einen Prozess erzeugt werden, der zum Bereitstellen eines zweiten Blutproteins ausgelegt ist, zum Beispiel IgG-Gammaglobuline, gepoolt und weiter gereinigt. In einer Ausführungsform wird Faktor H, der aus einem Fraktion I-Präzipitat und einem Fraktion Il+lII-Filterkuchen extrahiert wird, gepoolt und anschließend weiter gereinigt.

[0068] In bestimmten Ausführungsformen kann eine angereicherte Faktor H-Zusammensetzung nach der Extraktion aus einem Fraktion I-Präzipitat und/oder einem Fraktion Il+lII-Filterkuchen weiter gereinigt werden. Es stehen verschiedene Verfahren zur weiteren Reinigung von Faktor H zur Verfügung, einschließlich, ohne Einschränkung, zusätzlicher Ausfällungsschritte oder Fraktionierungen, Affinitätschromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Größenausschluss-Chromatographie, Lösungsmittel/Detergenzienbehandlung (S/D), Nanofiltration, Ultrafiltration, Diafiltration und dergleichen.

[0069] In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner das Ausfällen von Verunreinigungen aus einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung. In bestimmten Ausführungsformen umfasst dieser Schritt das Ausfällen von mindestens einer Verunreinigung, zum Beispiel eines Lipides oder Proteins, aus der Zusammensetzung und dann das Abtrennen des Präzipitats aus dem Überstand, der Faktor H enthält. Optional kann Faktor H dann aus dem Überstand in einer separaten Präzipitation ausgefällt werden.

[0070] Es ist vorteilhaft, dass die Präzipitation und die anschließende neue Suspendierung von Faktor H aus einer angereicherten Zusammensetzung die Reduzierung des Volumens vor zusätzlichen Reinigungsschritten ermöglicht, wie zum Beispiel Chromatographie oder Nanofiltration. In einer Ausführungsform kann die angereicherte Faktor H-Zusammensetzung nach der Extraktion aus einem Fraktion I-Präzipitat oder einem Fraktion ll+lll- Filterkuchen durch Ausfällen von Faktor H der angereicherten Zusammensetzung weiter gereinigt werden. In bestimmten Ausführungsformen kann eine angereicherte Faktor H-Zusammensetzung einem ersten Ausfällungsschritt ausgesetzt werden, um mindestens eine Verunreinigung aus der Zusammensetzung zu entfernen, wie oben beschrieben, und dann einem zweiten Ausfällungsschritt ausgesetzt werden, um Faktor H auszufällen und zu gewinnen.

[0071] In einer Ausführungsform wird eine Faktor H-Zusammensetzung, die aus einem Fraktion I-Präzipitat oder Fraktion Il+lII-Filterkuchen extrahiert wurde, durch Ausfällen von Verunreinigungen aus der angereicherten Faktor H-Zusammensetzung in einem zweiten oder dritten Ausfällungsschritt weiter angereichert, wodurch ein Überstand gebildet wird, der Faktor H enthält. Anschließend kann Faktor H durch Ausfällen von Faktor H in einem dritten oder vierten Präzipitationsschritt weiter angereichert werden. In einer Ausführungsform wird Faktor H mit 20 % bis 25 % Alkohol bei einem pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0 ausgefällt.

[0072] In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Verfahren zur Herstellung einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung ferner mindestens einen, vorzugsweise zwei chromatographische Schritte, um die Reinheit der Zusammensetzung weiter zu erhöhen. Allgemein kann jedes geeignete chromatographische Verfahren eingesetzt werden, um die Faktor HZusammensetzung weiter anzureichern, die aus einem Fraktion I-Präzipitat oder Fraktion ll+lllFilterkuchen extrahiert wurde. In bestimmten Ausführungsformen wird vor der chromatographischen Anreicherung die extrahierte Faktor H-Zusammensetzung einem oder mehreren zusätzlichen Präzipitationsschritten ausgesetzt, wie oben beschrieben, um die Verunreinigungen zu reduzieren, die in der Zusammensetzung vorhanden sind, das Beladungsvolumen für den chromatographischen Schritt zu reduzieren und/oder den Puffer der Zusammensetzung auszu13/75

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[0073] In bestimmten Ausführungsformen kann eine Faktor H- Zusammensetzung durch einen chromatographischen Schritt weiter angereichert werden, der Anionen-Austauschchromatographie (AEC), Kationen-Austauschchromatographie (CEC), Heparin-Affinitätschromatographie, hydrophobe Austauschchromatographie (HIC), Hydroxyapatit-Chromatographie (HAP), Immunaffinitätschromatographie, Größenausschlusschromatographie (d.h. Gelfiltration) oder einen anderen chromatographischen Schritt umfasst. Chromatographische Schritte können entweder im Chargen- oder im Säulenmodus ausgeführt werden.

[0074] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verwendung der Anionen-Austauschchromatographie und der Heparin-Affinitätschromatographie.

[0075] In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Verfahren, die hierin bereitgestellt werden, zur Herstellung einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung ferner mindestens einen, vorzugsweise mindestens zwei, am besten mindestens drei Vireninaktivierungs- oder -entfernungsschritte. Nichteinschränkende Beispiele für Vireninaktivierungs- oder -entfernungsschritte, die bei den Verfahren eingesetzt werden können, welche hierin bereitgestellt werden, umfassen die Detergenzienbehandlung (Horowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21- S28 and Kreil et al., Transfusion 2003 (43):1023-1028), Nanofiltration (Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56)230-236 und Yuasa et al., JGen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021-2024), Inkubation bei niedrigem pH-Wert und hohen Temperaturen (Kempf et al., Transfusion 1991 (31)423-427 und Louie et al., Biologicals 1994 (22):13-19), und Wärmebehandlung von lyophilisierten Factor H- Zusammensetzungen (Piszkiewicz et al., Thromb Res. 1987 Jul 15;47(2): 23541; Piszkiewicz et al., Curr Stud Hematol Blood Transfus. 1989;(56):44-54; Epstein and Fricke, Arch Pathol Lab Med. 1990 Mar;114(3):335-40).

[0076] In einer bevorzugten Ausführungsform sorgt die vorliegende Erfindung für ein Verfahren zum Herstellen einer virussicheren, angereicherten Faktor H-Zusammensetzung, die folgendes umfasst: (I) Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion ll+lll- Filterkuchen, (II) Ausführen eines ersten Präzipitationsschrittes, um mindestens eine Verunreinigung aus der Faktor HZusammensetzung auszufällen, (III) Ausführen eines zweiten Präzipitationsschrittes, um Faktor H aus der Zusammensetzung auszufällen, und (IV) Ausführen von mindestens einem Vireninaktivierungs- oder -entfernungsschritt und dadurch Herstellen einer virussicheren, angereicherten Faktor H-Zusammensetzung.

[0077] In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sorgt die Erfindung für ein Verfahren zum Herstellen einer virussicheren, angereicherten Faktor H-Zusammensetzung, die folgendes umfasst: (I) Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion I- Präzipitat, (II) Ausführen eines ersten Präzipitationsschrittes, um mindestens eine Verunreinigung aus der Faktor HZusammensetzung auszufällen, (III) Ausführen eines zweiten Präzipitationsschrittes, um Faktor H aus der Zusammensetzung auszufällen, und (IV) Ausführen von mindestens einem Vireninaktivierungs- oder -entfernungsschritt und dadurch Herstellen einer virussicheren, angereicherten Faktor H-Zusammensetzung.

[0078] In einer Erscheinungsform kann Faktor H, das aus Material isoliert wird, welches anderenfalls während der Herstellung von anderen kommerziell wichtigen Blutprodukten durch Plasmafraktionierung verworfen wird, z.B. ein Fraktion I-Präzipitat oder Fraktion ll+lllFilterkuchen, durch Chromatographie mit einer Reihe von schrittweisen Elutionen weiter angereichert werden, die für einen Herstellungsprozess im großen Maßstab zugänglich ist. In einer Ausführungsform werden DEAE Sepharose™ und Heparin Sepharose™-Chromatographieharze mit einem geeigneten Puffersystem verwendet, zum Beispiel mit einem, das 25 mM Tris(pH 8,0) und 5 mM EDTA enthält.

[0079] Die chromatographische Anreicherung einer Faktor H- Zusammensetzung kann modifiziert werden, um andere Puffersysteme zu verwenden als Tris/EDTA bei pH 8,0. Diese Prozesse können für Puffer und Lösungen angepasst werden, die häufig bei der Herstellung von Biopharmazeutika verwendet werden. Ein Beispiel ist ein Reinigungssystem, das Phosphatpuffer

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Patentamt bei pH 7,0 verwendet. Der Schlüsselparameter zur erfolgreichen Reinigung ist die Manipulation der Leitfähigkeit oder lonenstärke, um das Abtrennen der gewünschten Verbindung zu erreichen. Wenn der pH-Wert des Puffersystems auf pH 8,0 gehalten wird, muss die Leitfähigkeit der Elutionspuffer zum Reinigungsprozess passen, der hier beschrieben wird. Wenn der pHWert des Puffersystems geändert wird, ist eine gewisse Einstellung der lonenstärke erforderlich, die mit Standardverfahren erfolgen kann, welche bei der Optimierung von chromatographischen Prozessen verwendet werden.

[0080] In einer Erscheinungsform sorgt die vorliegende Erfindung für ein Verfahren zum Herstellen von Faktor H aus gepooltem menschlichem Plasma, das folgendes umfasst: (a) Ausführen der Cohn-Fraktionierung, um Fraktion Il+lIl-Präzipitate zu erhalten, und Herstellen einer Suspension der kombinierten Präzipitate, (b) Filtern der neu suspendierten Fraktion ll+ll-lPräzipitate, um den verworfenen AerosilO-Filterkuchen zu erhalten, der nach der Filtration der Fraktion Il+llI-Suspension zurückbleibt; (c) Extrahieren des Filterkuchens gemäß einem Verfahren, folgende Schritte umfassend: (I) Auflösen des Filterkuchens in einem geeigneten Puffer von geeigneter lonenstärke über einen Zeitraum, der zum Auflösen des Proteins ausreicht, welches auf dem Filterkuchen liegt; (II) Verdünnen des aufgelösten Proteins mit zusätzlichem Puffer, (III) Entfernen von losem Material aus dem verdünnten Protein, (IV) Reinigen von Faktor H-Protein aus der verdünnten Proteinpräparation durch Ultrafiltration des verdünnten Proteins in einem 0,45 pm-Filter, um ein Filtrat zu erzeugen, das den Faktor H enthält; (V) Unterwerfen des Filtrats, das Faktor H enthält, einer Anionen-Austauschchromatographie unter Verwendung eines NaCI-Gradienten (50-500 mM) im laufenden Puffer, um eine gepoolte rohe Faktor HFraktion zu erhalten; und (VI) Reinigen von Faktor H aus der rohen Faktor H- Präparation durch Heparin-Sepharose™-Chromatographie unter Verwendung eines NaCI-Gradienten (50-500 mM).

[0081] In einer Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von Faktor H verwendet die Anionen-Austauschchromatographie DEAE Sepharose™ als Anionen-Austauschharz.

[0082] In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von Faktor H ist der gereinigte Faktor H eine aktive Faktor H-Präparation, die aus einer Mischung von Tyr-402- und His-402-Isoformen im Bereich von 50 %±20 % His-402; 50 %±20 % Tyr-402 besteht.

[0083] In einerweiteren Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von Faktor H umfasst das Verfahren ferner das Platzieren des Fraktion I-Präzipitats im Filterkuchen in Schritt (c) (I).

[0084] In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung von Faktor H ist der Puffer in Schritt (c)(V) und/oder (c)(VI) 25mM TRIS/5mM EDTA/50mM NaCI, das einen pH von 8,0 hat.

[0085] In einerweiteren Ausführungsform des Verfahrens zum Herstellen von Faktor H umfasst das Verfahren ferner das Lyophilisieren des Faktors H, das in Schritt (c)(VI) erzeugt wurde.

[0086] In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens zum Herstellen von Faktor H verwendet die Anionen-Austauschchromatographie einen ersten Puffer, der eine lonenstärke hat, die gleich einer NaCI-Konzentration von etwa 50 mM bis etwa 65 mM ist, zum Binden von Faktor H an das Harz, und einen zweiten Puffer, der eine lonenstärke hat, gleich einer Natriumchloridkonzentration von mindestens etwa 100 mM, für das Eluieren des Faktors H aus dem Harz hat. In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Elutionspuffer eine lonenstärke gleich der einer Natriumchloridkonzentration zwischen etwa 100 mM und etwa 120 mM. Optional kann dann ein anschließender Heparin-Affinitätschromatographieschritt ausgeführt werden, um die Faktor H-Zusammensetzung weiter anzureichern. Der Heparin-Affinitätsschritt besteht aus dem Einstellen der lonenstärke der Faktor H-Zusammensetzung auf eine lonenstärke, die gleich einer NaCI-Konzentration von etwa 50 mM oder weniger ist, zum Binden von Faktor H an das Harz, optional Waschen der Säule mit einem Puffer, der eine lonenstärke hat, die gleich einer Natriumchloridkonzentration von etwa 50 mM NaCI bis etwa 75 mM NaCI ist, vorzugsweise etwa 50 mM NaCI oder weniger, und Eluieren von Faktor H aus dem Harz mit einem Puffer, der eine lonenstärke gleich einer Natriumchloridkonzentration zwischen etwa 100 mM und etwa 250

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Patentamt mM NaCI hat.

[0087] Ein alternativer Reinigungsprozess besteht aus dem Gewinnen des Fraktion I-Präzipitats oder des Fraktion ll+lll- Filterkuchenextrakts bei pH 8 und Einstellen der Salzkonzentration auf eine lonenstärke gleich der einer NaCI-Konzentration zwischen etwa 120 und 150 mM und dann Kontaktieren der Zusammensetzung mit einem Anionen-Austauschharz (z.B. DEAE Sepharose™), um unerwünschte Proteine im Extrakt zu binden. Faktor H bindet sich nicht an das Harz und kann in einer Durchflussfraktion wiedergewonnen werden, die zur weiteren Verarbeitung gesammelt wird. Die lonenstärke des Faktors H-Pools wird dann gleich der einer Natriumchloridkonzentration von nicht mehr als etwa 75 mM eingestellt, vorzugsweise nicht mehr als etwa 50 mM, um den Faktor H an ein Heparin-Affinitätsharz zu binden. Das Harz wird eluiert, um Faktor H mit einem Puffer zu gewinnen, der eine lonenstärke gleich der einer Natriumchloridkonzentration zwischen etwa 90 mM und etwa 250 mM hat, vorzugsweise zwischen etwa 100 mM und etwa 200 mM. Optional kann die lonenstärke des Faktor H-Eluats so eingestellt werden, dass sie gleich einer Natriumchloridkonzentration von nicht mehr als etwa 75 mM, vorzugsweise nicht mehr als etwa 65 mM, am besten nicht mehr als etwa 50 mM ist, um den Faktor H an ein zweites Anionen-Austauschharz zu binden, welches dasselbe oder ein anderes Harz als das erste Anionen-Austauschharz sein kann, um Verunreinigungen aus dem Pool zu entfernen, die eine geringe Affinität zu dem Harz haben. Faktor H wird dann aus dem Harz mit einem Puffer eluiert, der eine lonenstärke von mindestens etwa 100 mM Natriumchlorid hat, besser mindestens etwa 120 mM.

[0088] In einer Ausführungsform wird eine Faktor H-Zusammensetzung weiter angereichert durch (I) Binden von Verunreinigungen an ein Anionen-Austauschharz unter derartigen Bedingungen, dass Faktor H sich an das Harz bindet und in der Durchflussfraktion gesammelt wird; (II) Binden von Faktor H aus der Durchflussfraktion an ein Heparin-Affinitätsharz; (III) Eluieren von Faktor H vom Heparin-Affinitätsharz, um ein Eluat zu bilden; (IV) Binden von Faktor H aus dem Eluat an ein Anionen-Austauschharz; und (V) Eluieren von Faktor H aus dem AnionenAustauschharz, dadurch weiteres Reinigen von Faktor H.

[0089] Die Reinigung aus Fraktion I oder dem AerosilO-Filterkuchen kann durch mehrere alternative Verfahren ausgeführt werden, einschließlich Immunaffinitätsreinigung, abweichenden Harzen für die Anionen-Austauschchromatographie (z.B. DEAE Sephacel™ usw.) und Einbeziehung der Größenausschlusschromatographie (z.B. Sephacryl™ S-300) als optionaler Verfeinerungsschritt, falls notwendig. Die hydrophobe Austauschchromatographie (z.B. Phenyl Sepharose™) kann ebenfalls als Teil des obigen Reinigungssystems eingesetzt werden. Diese Faktor H-Reinigungssysteme sind alle beim Stand der Technik beschrieben worden. Außerdem kann der AerosilO-Filterkuchen mit einem Faktor H-Elutionspuffer von ausreichender lonenstärke 'am Ort gewaschen' werden, um Faktor H aus dem Filterkuchen aufzulösen, während seine funktionelle Aktivität beibehalten wird (wie zum Beispiel der 25 mM Tris; 200 mM NaCI; 5 mM EDTA; pH 8-Puffer, der oben beschrieben wird). Dieses Material würde dann über eine ablaufseitige Chromatographie verarbeitet werden (wie der oben beschriebenen), um den Faktor H bis zur Homogenität zu reinigen.

[0090] In einer Erscheinungsform wird ein Verfahren zum Herstellen einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung aus Plasma bereitgestellt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: (a) Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion I-Präzipitat und/oder einem Fraktion Il+lII-Filterkuchen, um einen Faktor H-Extrakt zu bilden; und (b) Ausfällen von Verunreinigungen aus dem Faktor H-Extrakt, um einen Überstand zu bilden, der Faktor H enthält, dadurch Herstellen einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung.

A. ALKOHOLPRÄZIPITATION UND CHROMATOGRAPHISCHE FRAKTIONIERUNGSVERFAHREN [0091] In einer Erscheinungsform sorgt die vorliegende Erfindung für Verfahren zur Herstellung von angereicherten Zusammensetzungen von Faktor H aus Material, das anderenfalls während des Herstellungsprozesses eines zweiten Blutfaktors verworfen wird. In einer als Beispiel die

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Patentamt nenden Ausführungsform kann Faktor H aus Fraktionen gewonnen werden, die durch den Herstellungsprozess für aus Plasma gewonnene IgG-Zusammensetzungen erzeugt wurden, wie zum Beispiel IgG-Zusammensetzungen, die für intravenöse (d.h. IVIG), subkutane und/oder intramuskuläre Verabreichung formuliert werden.

[0092] In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Herstellen einer angereicherten Zusammensetzung von Faktor H bereitgestellt, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (I) Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion I-Präzipitat und/oder Fraktion Il+llI-Filterkuchen, (II) optionales Ausführen eines ersten Präzipitationsschrittes zum Ausfällen von mindestens einer Verunreinigung aus der Faktor H-Zusammensetzung, (III) optionales Ausführen eines zweiten Präzipitationsschrittes, um Faktor H aus der Zusammensetzung auszufällen, (IV) optionales Ausführen von mindestens einem lonen-Austauschchromatographieschritt, (V) optionales Ausführen von mindestens einem Heparin-Affinitätschromatographieschritt; und (VI) Ausführen von mindestens einem Vireninaktivierungs- oder -entfernungsschritt.

[0093] In einer Ausführungsform umfasst ein Verfahren zur Herstellung einer angereicherten Zusammensetzung von Faktor H aus Material, das anderenfalls während eines IgG-Herstellungsprozesses verworfen werden würde, einen oder mehrere der folgenden Schritte.

1. HERSTELLUNG VON KRYOARMEM PLASMA [0094] In bestimmten Ausführungsformen besteht das Ausgangsmaterial für die Herstellung von Faktor H- und IgG-Zusammensetzungen im allgemeinen entweder aus gewonnenem Plasma (d.h. Plasma, das von Vollblut ex vivo abgetrennt wurde) oder Ursprungsplasma (d.h. Plasma, das über Plasmapherese gesammelt wurde). Der Reinigungsprozess beginnt normalerweise mit dem Auftauen von vorher gefrorenem gepooltem Plasma, das bereits auf Sicherheit und Qualitätsaspekte untersucht wurde, obwohl frisches Plasma ebenfalls verwendet werden kann. In bestimmten Ausführungsformen wird das Auftauen normalerweise bei einer Temperatur von nicht mehr als etwa 6 °C ausgeführt. Nach dem vollständigen Auftauen des gefrorenen Plasmas bei niedriger Temperatur wird das Zentrifugieren in der Kälte ausgeführt (z.B. <6 °C), um feste Kryopräzipitate aus dem flüssigen Überstand abzutrennen. Alternativ kann der Abtrennschritt durch Filtration statt durch Zentrifugation ausgeführt werden. Der flüssige Überstand (der auch als kryoarmes Plasma bezeichnet wird, nach den kalt unlöslichen Proteinen, die durch Zentrifugation aus dem frisch auftauten Plasma entfernt werden) wird dann im nächsten Schritt verarbeitet. Es können zu diesem Zeitpunkt verschiedene zusätzliche Schritte zur Isolierung von anderen Koagulationsfaktoren und Inhibitoren ausgeführt werden, z.B. Faktor Vlll-Inhibitorbypassaktivität (FEIBA), Faktor IX-Komplex, Faktor Vll-Komplex oder Antithrombin Ill-Komplex.

2. ERSTER PRÄZIPITATIONSSCHRITT - FRAKTION l-PRÄZIPITATION [0095] Die kryoarme Plasmalösung wird dann normalerweise bis auf 0 ± 1 °C gekühlt und der pH-Wert wird auf einen Wert zwischen etwa 7,0 und etwa 7,5 eingestellt. In einer weiteren Ausführungsform wird der pH-Wert zwischen etwa 7,1 und etwa 7,3 eingestellt. In einer Ausführungsform wird der pH-Wert des kryoarmen Plasmas auf etwa 7,2 eingestellt. Vorgekühlter Alkohol wird dann zugesetzt, während das Plasma bis zu einer Zielkonzentration zwischen etwa 6 % und etwa 10 % gerührt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Ethanol bis zu einer Zielkonzentration zwischen etwa 7 % und etwa 9 % zugesetzt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird Ethanol bis zu einer Zielkonzentration von etwa 8 % (v/v) zugesetzt. Gleichzeitig wird die Temperatur bis zu einem Wert zwischen etwa -4 °C und etwa 0 °C weiter abgesenkt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Temperatur auf etwa -2 °C abgesenkt, um Komponenten, wie zum Beispiel Fibrinogen, auszufällen. Normalerweise umfasst das Präzipitationsereignis eine Haltezeit von mindestens etwa 1 Stunde, obwohl kürzere oder längere Haltezeiten auch verwendet werden können. Anschließend wird der Überstand (Überstand I) vom Präzipitat (Fraktion I-Präzipitat) durch Zentrifugation, Filtration oder ein anderes geeignetes Verfahren abgetrennt.

[0096] Normalerweise wird der Fraktion I-Präzipitationsschritt ausgeführt, um Fibrinogen und

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Patentamt andere Verunreinigungen im Herstellungsprozess der aus Plasma gewonnenen Blutprodukte, wie zum Beispiel IgG und Albumin, zu entfernen. Es ist vorteilhaft festgestellt worden, dass eine beträchtliche Fraktion von Faktor H in diesem Präzipitat vorhanden ist. Zum Beispiel demonstriert Beispiel 1, dass mehr als 180 Gramm Faktor H, nahezu 10 % des Gesamtgehaltes, der im kryoarmen Plasmaausgangsmaterial (Cohn-Pool) gefunden wurde, im Fraktion I-Präzipitat einer industriellen Plasmafraktionierung vorhanden ist. Dementsprechend wird in einer Ausführungsform Faktor H aus dem Fraktion I-Präzipitat extrahiert. Geeignete Puffer und Verfahren zum Extrahieren von Faktor H aus dem Fraktion I-Präzipitat werden hierin bereitgestellt.

[0097] Beim Vergleich mit herkömmlichen Verfahren, die als erster Fraktionierungsschritt für kryoarmes Plasma eingesetzt werden (Cohn et al., oben; Oncley et al., oben), sorgt die vorliegende Erfindung in mehreren Ausführungsformen für Verfahren, die zu verbesserten Ausbeuten der Plasmafaktoren führen (z.B. Faktor H, IgG usw.). In einer Ausführungsform wird der Ausfällungsalkohol in einer Weise zugesetzt, die den Alkohol am Ort des Hinzufügens fein dispergiert oder schnell dispergiert. In einer Ausführungsform wird der Alkohol durch Sprühen zugesetzt. In einer zweiten Ausführungsform wird der Alkohol von unten zugesetzt oder direkt neben einer Rührvorrichtung, zum Beispiel einem Propeller. Das Zusetzen von Alkohol durch eine dieser Vorrichtungen vermeidet lokale Überkonzentration von Alkohol, die zum Beispiel am Ort des fließenden Hinzufügens auftritt und zur irreversiblen Denaturierung von Proteinen und/oder zur Ausfällung von Proteinen führt, die anderenfalls im Überstand wiedergefunden werden würden.

[0098] In einer weiteren Ausführungsform wird ein oder mehrere pH-Wert verändernde Mittel in einer Weise zugesetzt, die das pH-Wert verändernde Mittel am Ort des Hinzufügens fein dispergiert oder schnell dispergiert. In einer Ausführungsform wird das pH-Wert verändernde Mittel durch Sprühen zugesetzt. In einer zweiten Ausführungsform wird das pH-Wert verändernde Mittel von unten zugesetzt oder direkt neben einer Rührvorrichtung, zum Beispiel einem Propeller. In einer dritten Ausführungsform wird das pH-Wert verändernde Mittel durch Streuen eines festen pH-Wert verändernden Mittels über eine große Fläche zugesetzt.

[0099] In einer weiteren Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung nach dem Zusetzen des Alkohols eingestellt. In einer verwandten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung während des Zusetzens des Alkohols eingestellt. In einer Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf dem gewünschten pH-Wert während der Halte- oder Inkubationszeit der Präzipitation durch kontinuierliches Einstellen des pH-Wertes der Lösung gehalten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Alkohol Ethanol.

[00100] In bestimmten Ausführungsformen wird der pH-Wert der Lösung nach dem Hinzufügen des Ausfällungsalkohols zwischen etwa 7,0 und etwa 7,5 eingestellt. In anderen Ausführungsformen wird der pH-Wert der Lösung nach dem Hinzufügen des Ausfällungsalkohols zwischen etwa 7,1 und etwa 7,3 eingestellt. In noch anderen Ausführungsformen wird der pH-Wert der Lösung nach dem Hinzufügen des Ausfällungsalkohols auf etwa 7,0 oder etwa 7,1,7,2, 7,3, 7,4 oder 7,5 eingestellt. In einer speziellen Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung nach dem Hinzufügen des Ausfällungsalkohols auf etwa 7,2 eingestellt. In bestimmten Ausführungsformen geht eine reduzierte Menge von Blutfaktor während des ersten Präzipitationsschrittes auf Grund der Denaturierung von Protein unwiederbringlich verloren, im Vergleich zu einem analogen Präzipitationsschritt, bei dem der pH-Wert der Lösung vor und nicht nach dem Hinzufügen des Ausfällungsalkohols eingestellt wird.

[00101] In bestimmten anderen Ausführungsformen wird der Ausfällungsalkohol und/oder die Lösung, die zum Einstellen des pH- Wertes verwendet wird, durch Sprühen und nicht durch laufendes Hinzufügen zugesetzt. In diesem Fall geht in bestimmten Ausführungsformen eine reduzierte Menge von Blutfaktor während des ersten Präzipitationsschrittes auf Grund von Denaturierung von Protein unwiederbringlich verloren im Vergleich zu einem analogen Präzipitationsschritt, bei dem der Alkohol und/oder die Lösung, die zum Einstellen des pH-Wertes verwendet wird, durch laufendes Hinzufügen zugesetzt wird.

[00102] In noch anderen Ausführungsformen wird der pH-Wert der Lösung nach dem Zusetzen des Ausfällungsalkohols und durch Zusetzen des Ausfällungsalkohols und/oder einer Lösung,

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Patentamt die zum Einstellen des pH-Wertes verwendet wird, durch Sprühen und nicht durch laufendes Hinzufügen eingestellt. In einer speziellen Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 7,2 nach dem Zusetzen des Ausfällungsalkohols und durch Zusetzen des Ausfällungsalkohols und/oder einer Lösung, die zum Einstellen des pH- Wertes verwendet wird, durch Sprühen und nicht durch laufendes Hinzufügen eingestellt.

3. ZWEITER PRÄZIPITATIONSSCHRITT - FRAKTION ll+lll-PRÄZIPITATION [00103] Um den Gehalt und die Reinheit der entsprechenden Blutfaktoren zu erhöhen, die im Fraktion I-Überstand vorhanden sind (z.B. Faktor H, IgG), wird der Fraktion I-Überstand einem zweiten Präzipitationsschritt ausgesetzt, der eine Fraktionierung vom Typ Cohn-Oncley Fraktion ll+lII ist. Allgemein wird der pH-Wert der Lösung auf einen Wert zwischen etwa 6,6 und etwa 7,2 eingestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der pH- Wert der Lösung zwischen etwa 6,6 und etwa 6,8 eingestellt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird der pHWert der Lösung auf einen Wert von etwa 6,7 eingestellt. Dann wird Alkohol, vorzugsweise Ethanol, der Lösung zugesetzt, während sie bis zu einer Endkonzentration zwischen etwa 20 % und etwa 30 % (v/v) gerührt wird, um Faktor H und IgG, die in der Fraktion vorhanden sind, auszufällen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Alkohol bis zu einer Endkonzentration von etwa 25 % (v/v) zugesetzt, um das IgG in der Fraktion auszufällen.

[00104] Vor und gleichzeitig mit dem Hinzufügen von Alkohol wird die Lösung auf einen Wert zwischen etwa -5 °C und etwa -9 °C weiter gekühlt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Lösung auf eine Temperatur von etwa -7 °C gekühlt. Nach dem Abschluss des Hinzufügens des Alkohols wird der pH-Wert der Lösung sofort auf einen Wert zwischen etwa 6,6 und etwa 7,2 eingestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung zwischen etwa 6,6 und etwa 6,8 eingestellt. In einer speziellen Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 6,9 eingestellt. Normalerweise umfasst das Präzipitationsereignis eine Haltezeit von mindestens etwa 10 Stunden, obwohl kürzere oder längere Haltezeiten auch verwendet werden können. Anschließend wird das Präzipitat (Fraktion ll+lll), das den Großteil des Faktor H- und IgG-Gehaltes des kryoarmen Plasmas enthält, vom Überstand durch Zentrifugation, Filtration oder ein anderes geeignetes Verfahren abgetrennt und gesammelt. Im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren, die als zweiter Fraktionierungsschritt für kryoarmes Plasma verwendet werden (Cohn et al., oben; Oncley et al., oben), sorgt die vorliegende Erfindung in mehreren Ausführungsformen für Verfahren, die zu verbesserten Blutfaktorausbeuten im Fraktion ll+l IIPräzipitat führen. In einer verwandten Ausführungsform sorgt die vorliegende Erfindung für Verfahren, die zu einem reduzierten Verlust an Faktor H und IgG im Fraktion ll+llI-Überstand führen.

[00105] Im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren, die als zweiter Fraktionierungsschritt für kryoarmes Plasma verwendet werden (Cohn et al., oben; Oncley et al., oben), sorgt die vorliegende Erfindung in mehreren Ausführungsformen für Verfahren, die zu verbesserten Blutfaktorausbeuten im Fraktion Il+llI-Präzipitat führen. In einer Ausführungsform wird der Ausfällungsalkohol in einer Weise zugesetzt, die den Alkohol am Ort des Hinzufügens fein dispergiert oder schnell dispergiert. In einer Ausführungsform wird der Alkohol durch Sprühen zugesetzt. In einer zweiten Ausführungsform wird der Alkohol von unten zugesetzt oder direkt neben einer Rührvorrichtung, zum Beispiel einem Propeller.

[00106] In einer weiteren Ausführungsform wird ein oder mehrere pH-Wert verändernde Mittel in einer Weise zugesetzt, die das pH-Wert verändernde Mittel am Ort des Hinzufügens fein dispergiert oder schnell dispergiert. In einer Ausführungsform wird das pH-Wert verändernde Mittel durch Sprühen zugesetzt. In einer zweiten Ausführungsform wird das pH-Wert verändernde Mittel von unten zugesetzt oder direkt neben einer Rührvorrichtung, zum Beispiel einem Propeller. In einer dritten Ausführungsform wird das pH-Wert verändernde Mittel durch Streuen eines festen pH-Wert verändernden Mittels über eine große Fläche zugesetzt.

[00107] In einer weiteren Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung nach dem Zusetzen des Alkohols eingestellt. In einer weiteren Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung nach

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Patentamt dem Zusetzen des Alkohols eingestellt. In einer Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf dem gewünschten pH-Wert während der Halte- oder Inkubationszeit der Präzipitation durch kontinuierliches Einstellen des pH-Wertes der Lösung gehalten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Alkohol Ethanol.

[00108] In einer Ausführungsform liegt die Temperatur des Fraktion Il+llI-Präzipitationsschrittes zwischen etwa -7 °C und etwa -9 °C. In einer verwandten Ausführungsform beträgt die Konzentration des Alkohols (z.B. Ethanols), der im Fraktion ll+lll- Präzipitationsschritt verwendet wird, etwa 25 % (v/v), und die Temperatur liegt zwischen etwa -7 °C und etwa -9 °C. Zum Vergleich führen sowohl Cohn et al. wie auch Oncley et al. die Präzipitation bei -5 °C durch, und Oncley et al. verwenden 20 % Alkohol, um den Pegel von Verunreinigungen im Präzipitat zu reduzieren. Es ist vorteilhaft, dass die Verfahren, die hierin bereitgestellt werden, maximale Faktor H- und IgG-Ausbeute ohne hohe Verunreinigungswerte im Endprodukt ermöglichen.

[00109] In einer weiteren Ausführungsform wird der Präzipitationsschritt bei einer Temperatur zwischen etwa -7 °C und etwa -9 °C ausgeführt. In einer Ausführungsform wird der Präzipitationsschritt bei einer Temperatur von etwa -7 °C ausgeführt. In einer weiteren Ausführungsform wird der Präzipitationsschritt bei einer Temperatur von etwa -8 °C ausgeführt. In einer weiteren Ausführungsform wird der Präzipitationsschritt bei einer Temperatur von etwa -9 °C ausgeführt.

[00110] In bestimmten Ausführungsformen beträgt die Alkoholkonzentration des Präzipitationsschrittes zwischen etwa 20 % und etwa 30 %, vorzugsweise zwischen etwa 23 % und etwa 27 %. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Alkoholkonzentration zwischen etwa 24 % und etwa 26 %. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt die Alkoholkonzentration etwa 25 %. In anderen Ausführungsformen kann die Alkoholkonzentration etwa 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 % oder 30 % betragen. In einer speziellen Ausführungsform wird der zweite Präzipitationsschritt bei einer Temperatur von etwa -7 °C bei einer Alkoholkonzentration von etwa 25 % ausgeführt. In einer Ausführungsform ist der Alkohol Ethanol.

[00111] Es ist festgestellt worden, dass der pH-Wert der Lösung, wenn der pH-Wert der Lösung auf einen Wert von etwa 6,9 vor dem Hinzufügen des Ausfällungsalkohols eingestellt ist, sich teilweise auf Grund der Proteinausfällung von 6,9 auf einen Wert zwischen etwa 7,4 und 7,7 verschiebt. Wenn sich der pH-Wert der Lösung von 6,9 wegbewegt, wird die Präzipitation von IgG ungünstiger und die Präzipitation bestimmter Verunreinigungen wird günstiger. Es ist vorteilhaft, dass die Autoren festgestellt haben, dass durch Einstellen des pH-Wertes der Lösung nach dem Hinzufügen des Ausfällungsalkohols höhere Prozentsätze von IgG im Fraktion Il+llI-Präzipitat gewonnen werden. In einer Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf dem gewünschten pH- Wert während der Halte- oder Inkubationszeit der Präzipitation durch kontinuierliches Einstellen des pH-Wertes der Lösung gehalten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Alkohol Ethanol.

[00112] Dementsprechend gehen in einer Erscheinungsform reduzierte Mengen an Faktor H und/oder IgG in der Überstandsfraktion des Fraktion Il+llI-Präzipitationsschrittes verloren. Mit anderen Worten, es sind höhere Prozentsätze des anfänglichen Faktors H und/oder von IgG im Fraktion ll+lIl-Präzipitat vorhanden. In bestimmten Ausführungsformen wird der pH-Wert der Lösung nach dem Hinzufügen oder während des Hinzufügens des Ausfällungsalkohols zwischen etwa 6,6 und etwa 7,2 eingestellt. In einer weiteren Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf einem Wert zwischen etwa 6,6 und etwa 7,2 kontinuierlich während der Präzipitationsinkubationszeit gehalten. In anderen Ausführungsformen wird der pH-Wert der Lösung auf einen Wert zwischen etwa 6,8 und etwa 7,0 unmittelbar nach oder während des Hinzufügens des Ausfällungsalkohols oder auf einen pH-Wert von etwa 6,7, 6,8, 6,9, 7,0 oder 7,1 unmittelbar nach oder während des Hinzufügens des Ausfällungsalkohols eingestellt. In einer speziellen Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung nach dem Hinzufügen oder während des Hinzufügens des Ausfällungsalkohols auf etwa 6,9 eingestellt. In bestimmten Ausführungsformen wird der pH-Wert der Lösung auf einem Wert zwischen etwa 6,8 und etwa 7,0 kontinuierlich während der Präzipitationsinkubationszeit oder auf einem pH-Wert von etwa 6,9 kontinu

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Patentamt ierlich während der Präzipitationsinkubationszeit gehalten. In bestimmten Ausführungsformen geht eine reduzierte Menge von Faktor H und/oder IgG in der Überstandsfraktion des zweiten Präzipitationsschrittes im Vergleich zu einem analogen Präzipitationsschritt verloren, bei dem der pH-Wert der Lösung vor und nicht nach dem Hinzufügen des Ausfällungsalkohols eingestellt wird, oder zu einem analogen Präzipitationsschritt, bei dem der pH-Wert der Lösung nicht während der ganzen Präzipitationsinkubationszeit aufrechterhalten wird.

[00113] In einer weiteren Ausführungsform wird der Ausfällungsalkohol und/oder die Lösung, die zum Einstellen des pH-Wertes verwendet wird, durch Sprühen und nicht durch laufendes Hinzufügen zugesetzt. In bestimmten Ausführungsformen geht eine reduzierte Menge an Faktor H und/oder IgG in der Überstandsfraktion des zweiten Präzipitationsschrittes im Vergleich zu einem analogen Präzipitationsschritt verloren, bei dem der Alkohol und/oder die Lösung, die zum Einstellen des pH-Wertes verwendet wird, laufend hinzugefügt wird.

[00114] In einer weiteren Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf einen Wert zwischen etwa 6,7 und etwa 7,1 unmittelbar nach oder während des Hinzufügens des Ausfällungsalkohols durch Sprühen entweder des Alkohols oder des pH-Wert verändernden Mittels oder beider eingestellt. In einer weiteren Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 6,9 unmittelbar nach oder während des Hinzufügens des Ausfällungsalkohols durch Sprühen entweder des Alkohols oder des pH-Wert verändernden Mittels oder beider eingestellt. In einer Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf einem Wert zwischen etwa 6,7 und 7,1 durch kontinuierliches Einstellen des pH-Wertes während der Präzipitationsinkubationszeit durch Hinzufügen des Ausfällungsalkohols und/oder der Lösung, die zum Einstellen des pHWertes verwendet wird, durch Sprühen und nicht durch laufendes Hinzufügen aufrechterhalten. In einer weiteren Ausführungsform wird der pH- Wert der Lösung auf einem Wert von etwa 6,9 durch kontinuierliches Einstellen des pH-Wertes während der Präzipitationsinkubationszeit durch Hinzufügen des Ausfällungsalkohols und/oder der Lösung, die zum Einstellen des pHWertes verwendet wird, durch Sprühen und nicht durch laufendes Hinzufügen aufrechterhalten.

[00115] In einer weiteren speziellen Ausführungsform wird der Präzipitationsschritt bei einer Temperatur zwischen etwa -7 °C und -9 °C oder bei etwa -7 °C mit einer Alkoholkonzentration zwischen etwa 23 % und 27 % oder bei etwa 25 % ausgeführt. In einer Ausführungsform werden Faktor H und IgG bei einer Temperatur von etwa -7 °C mit etwa 25 % Alkohol, der durch Sprühen hinzugefügt wird, ausgefällt, wobei der pH-Wert der Lösung auf etwa 6,9 nach dem Hinzufügen des Ausfällungsalkohols eingestellt wird. In noch einer weiteren Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 6,9 über die ganze Präzipitationsinkubations- oder haltezeit gehalten.

4. EXTRAKTION DES FRAKTION ll+lll-PRÄZIPITATS [00116] Um den Faktor H und IgG-Gehalt des Fraktion ll+ll - I-Präzipitats in Lösung zu bringen, wird ein kalter Extraktionspuffer zum erneuten Suspendieren des Fraktion ll+llI-Präzipitats bei einem typischen Verhältnis von etwa 1 Teil Präzipitat zu 15 Teilen Extraktionspuffer verwendet. In einer weiteren Erscheinungsform wird ein kalter Extraktionspuffer zum erneuten Suspendieren des Fraktion ll+lIl-Präzipitats bei einem typischen Verhältnis von etwa 1 Teil Präzipitat zu 20 Teilen Extraktionspuffer verwendet. Andere geeignete Wiedersuspendierungsverhältnisse können verwendet werden, zum Beispiel in einem Bereich zwischen etwa 1:4 und 1:40, oder zwischen etwa 1:8 und 1:30, oder zwischen etwa 1:10 und 1:20, oder zwischen etwa 1:12 und 1:18, oder zwischen etwa 1:13 und 1:17, oder zwischen etwa 1:14 und 1:16. In bestimmten Ausführungsformen kann das Wiedersuspendierungsverhältnis etwa 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40 oder mehr betragen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Fraktion Il+Ill-Paste bei einem Verhältnis von etwa 1 Teil Präzipitat zu 15 Teilen Extraktionspuffer wieder suspendiert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Fraktion Il+Ill-Paste bei einem Verhältnis von etwa 1 Teil Präzipitat zu 20 Teilen Extraktionspuffer wieder suspendiert.

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Patentamt [00117] Geeignete Lösungen für die Extraktion des Fraktion ll+lIl-Präzipitats haben im allgemeinen einen pH-Wert zwischen etwa 4,0 und 5,5. In bestimmten Ausführungsformen hat die Lösung einen pH-Wert zwischen etwa 4,3 und 4,7, in anderen Ausführungsformen hat die Extraktionslösung einen pH-Wert von etwa 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4 oder 5,5. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der pH-Wert des Extraktionspuffers etwa 4,3. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt der pH-Wert des Extraktionspuffers etwa 4,5. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt der pHWert des Extraktionspuffers etwa 4,7. Allgemein können diese pH-Wert-Anforderungen unter Verwendung eines Pufferungsmittels erfüllt werden, das zum Beispiel aus Acetat, Zitrat, einbasigem Phosphat, zweibasigem Phosphat, Mischungen derselben und dergleichen ausgewählt wird. Geeignete Pufferkonzentrationen liegen normalerweise im Bereich von etwa 2,5 bis etwa 100 mM oder von etwa 5 bis etwa 50 mM oder etwa 2,5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 oder 100 mM Pufferungsmittel.

[00118] Der Extraktionspuffer hat vorzugsweise eine Leitfähigkeit zwischen etwa 0,5 mS*cm ¹und 2,0 mS’cm'¹. Zum Beispiel beträgt in bestimmten Ausführungsformen die Leitfähigkeit des Extraktionspuffers etwa 0,5 mS*cm^_1 oder etwa 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 oder etwa 2,0 mS’cm'¹. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird wissen, wie man Extraktionspuffer herstellt, die eine geeignete Leitfähigkeit haben.

[00119] In einer speziellen Ausführungsform kann ein als Beispiel dienender Extraktionspuffer etwa 5 mM einbasiges Natriumphosphat und etwa 5 mM Acetat bei einem pH-Wert von etwa 4,5 ± 0,2 und einer Leitfähigkeit von etwa 0,7 bis 0,9 mS/cm enthalten.

[00120] Im allgemeinen wird die Extraktion zwischen etwa 0 °C und 20 °C, vorzugsweise zwischen etwa 2 °C und 8 °C ausgeführt. In bestimmten Ausführungsformen kann die Extraktion bei etwa0°C, 1 °C, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C, 10°C, 11 °C, 12°C, 13°C, 14 °C, 15 °C, 16 °C, 17 °C, 18 °C, 19°C oder 20 °C ausgeführt werden. In einer speziellen Ausführungsform wird die Extraktion zwischen etwa 2 °C und 10 °C ausgeführt. Normalerweise wird der Extraktionsprozess unter ständigem Rühren ausgeführt, bis alle löslichen Komponenten der ll+ll- I-Paste in Lösung gegangen sind. In bestimmten Ausführungsformen dauert die Extraktion zwischen etwa 60 und 300 Minuten oder zwischen etwa 120 und 240 Minuten oder zwischen etwa 150 und 210 Minuten, während die Suspension kontinuierlich gerührt wird. In bestimmten Ausführungsformen dauert der Extraktionsprozess etwa 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 oder etwa 300 Minuten. In einer bevorzugten Ausführungsform dauert der Extraktionsprozess mindestens 60 Minuten unter kontinuierlichem Rühren.

[00121] In einer Ausführungsform enthält der Extraktionspuffer etwa 5 mM einbasiges Natriumphosphat, 5 mM Acetat und 0,051 % bis 0,06 Eisessig (v/v). In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Fraktion ll+lII-Präzipitat mit einem Verhältnis Paste zu Puffer von etwa 1:15 bei einem pH-Wert von etwa 4,5 ± 0,2 extrahiert.

[00122] In einer Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung über die Dauer des Extraktionsprozesses aufrechterhalten. In einer Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung zwischen etwa 4,1 und 4,9 über die Dauer des Extraktionsprozesses aufrechterhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung zwischen etwa 4,2 und 4,8 über die Dauer des Extraktionsprozesses aufrechterhalten. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung zwischen etwa 4,3 und 4,7 über die Dauer des Extraktionsprozesses aufrechterhalten. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der pH- Wert der Lösung zwischen etwa 4,4 und 4,6 über die Dauer des Extraktionsprozesses aufrechterhalten. In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 4,5 über die Dauer des Extraktionsprozesses aufrechterhalten.

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5. VORBEHANDLUNG UND EXTRAKTION VON FAKTOR H AUS FRAKTION ll+lll

Suspension [00123] Es ist vorteilhaft festgestellt worden, dass die Vorbehandlung von gelöstem Fraktion Il+Ill-Präzipitat mit fein verteiltem Siliziumdioxid (SiO₂) Verunreinigungen, wie zum Beispiel Lipide, Fibrinogen, amidolytische Aktivität, Prekallikren-Aktivität und Lipoproteine aus dem IgGHerstellungsprozess beträchtlich reduziert. Die Erfinder haben unerwartet festgestellt, dass der Großteil von Faktor H, der im Cohn-Poolausgangsmaterial gefunden wird, nach der Behandlung mit Siliziumdioxid und Filterhilfsmittel in den Fraktion Il+Ill-Filterkuchen gezogen wird. Zum Beispiel demonstriert Beispiel 1, dass mehr als 1,74 kg Faktor H, mehr als 80 % des gesamten Faktor H-Gehalts des kryoarmen Plasmaausgangsmaterials (Cohn-Pool), im Fraktion ll+lllPräzipitat einer industriellen Plasmafraktionierung (etwa 3000 I) vorhanden sind, jedoch im Filtrat vollkommen fehlt, nachdem die Fraktion Il+lII-Suspension mit Zusetzen von Siliziumdioxid und Filterhilfsmittel behandelt wurde. Des weiteren demonstriert Beispiel 2, dass Faktor H nicht unwiederbringlich verloren ist und dass er aus dem Fraktion Il+Ill-Filterkuchen extrahiert werden kann. Noch wichtiger ist, dass, wie in Beispiel 4 demonstriert, Faktor H, der aus dem Filterkuchen extrahiert wurde, äquivalente Faktor I-Cofaktor C3/C5-Konvertasehemmungsaktivität im Vergleich zu einer kommerziellen Präparation von Faktor H (CompTech) bewahrt.

[00124] Dementsprechend wird in einer Ausführungsform Faktor H aus einem Filterkuchen nach Filtration oder Zentrifugation einer Fraktion Il+Ill-Pastensuspension in Gegenwart von fein verteiltem Siliziumdioxid (z.B. Aerosil® und/oder Filterhilfsmittel) extrahiert.

[00125] In bestimmten Ausführungsformen wird Fraktion ll+lll- Präzipitat, das mit einem geeigneten Lösungspuffer extrahiert wurde, mit etwa 5 mg bis 100 mg fein verteiltem Siliziumdioxid pro Gramm suspendiertem Fraktion Il+Ill-Präzipitat behandelt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Fraktion Il+lII-Suspension mit etwa 20 mg bis 80 mg fein verteiltem Siliziumdioxid pro Gramm suspendiertes Fraktion Il+Ill-Präzipitat behandelt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird die Fraktion ll+llI-Suspension mit etwa 40 mg bis 60 mg fein verteiltem Siliziumdioxid pro Gramm suspendiertes Fraktion Il+Ill-Präzipitat behandelt. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Fraktion Il+lIl-Suspension mit etwa 50 mg fein verteiltem Siliziumdioxid pro Gramm suspendiertes Fraktion Il+Ill-Präzipitat behandelt. In bestimmten Ausführungsformen wird fein verteiltes Siliziumdioxid in einer Konzentration zwischen etwa 20 g/kg Il+Ill-Paste und 100 g/kg Il+Ill-Paste hinzugefügt (d.h. für ein Fraktion Il+Ill-Präzipitat, das mit einem Verhältnis von 1:15 extrahiert wird, sollte fein verteiltes Siliziumdioxid mit einer Konzentration zwischen etwa 20 g/16 kg Il+Ill-Suspension und 100 g/16 kg Il+Ill-Suspension oder einer Endkonzentration zwischen etwa 0,125 % (w/w) und 0,625 % (w/w) hinzugefügt werden). In bestimmten Ausführungsformen kann das fein verteilte Siliziumdioxid mit einer Konzentration von etwa 5 g/kg ll+ll - I-Paste oder von etwa 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 oder 100 g/kg Il+Ill-Paste hinzugefügt werden. In einer spezifischen Ausführungsform wird fein verteiltes Siliziumdioxid der Fraktion Il+Ill-Suspension bis zu einer Endkonzentration von etwa 40 g/16 kg Il+Ill-Suspension hinzugefügt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das fein verteilte Siliziumdioxid, das verwendet wird, Aerosil® 380 oder ein Äquivalent desselben.

[00126] Im allgemeinen wird die Behandlung mit fein verteiltem Siliziumdioxid bei einer Temperatur zwischen etwa 0 °C und 20 °C, vorzugsweise zwischen etwa 2 °C und 8 °C ausgeführt. In bestimmten Ausführungsformen kann die Behandlung bei etwa 0 °C, 1 °C, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C, 10 °C, 11 °C, 12 °C, 13 °C, 14 °C, 15 °C, 16 °C, 17 °C, 18 °C, 19°C oder 20 °C ausgeführt werden. Normalerweise wird die Fraktion ll+lll- Suspension mit fein verteiltem Siliziumdioxid mindestens 15 Minuten lang gerührt. In bestimmten Ausführungsformen wird die Fraktion Il+Ill-Suspension mit fein verteiltem Siliziumdioxid mindestens 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 Minuten lang oder mindestens 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder mehr Stunden lang ausgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Fraktion Il+IllSuspension mit fein verteiltem Siliziumdioxid zwischen etwa 30 und 60 Minuten lang gerührt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Fraktion Il+Ill-Suspension mit fein verteil

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Patentamt tem Siliziumdioxid mindestens 30 Minuten lang gerührt.

[00127] In bestimmten Ausführungsformen wird Filterhilfsmittel, zum Beispiel Celpure C300 (Celpure) oder HyfloSupper-Cel (World Minerals), zugesetzt, um die Tiefenfiltration zu erleichtern. Filterhilfsmittel kann mit einer Endkonzentration von etwa 0,1 kg/kg Fraktion ll+lllPräzipitat bis etwa 0,7 kg/kg Fraktion Il+Ill-Präzipitat, oder von etwa 0,2 kg/kg Fraktion ll+lllPräzipitat bis etwa 0,6 kg/kg Fraktion Il+Ill-Präzipitat oder von etwa 0,3 kg/kg Fraktion ll+lllPräzipitat bis etwa 0,5 kg/kg Fraktion Il+Ill-Präzipitat hinzugefügt werden. In bestimmten Ausführungsformen wird das Filterhilfsmittel mit einer Endkonzentration von etwa 0,1 kg/kg Fraktion Il+Ill-Präzipitat oder etwa 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6 oder 0,7 kg/kg Fraktion Il+Ill-Präzipitat hinzugefügt.

[00128] Um die nicht gelöste und adsorbierte Fraktion des Fraktion Il+Ill-Präzipitats (d.h. den Fraktion Il+lII-Filterkuchen) nach der Siliziumdioxidbehandlung zu entfernen, wird die Suspension gefiltert, wobei normalerweise die Tiefenfiltration verwendet wird. Tiefenfilter, die in den Verfahren eingesetzt werden können, welche hierin bereitgestellt werden, umfassen metallische, Glas-, Keramik-, organische (zum Beispiel Diatomeenerde) Tiefenfilter und dergleichen. Beispiele für geeignete Filter umfassen ohne Einschränkung Cuno 50SA, Cuno 90SA und Cuno VR06-Filter (Cuno). Alternativ kann der Abtrennschritt durch Zentrifugation statt durch Filtration ausgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die mit fein verteiltem Siliziumdioxid behandelte Fraktion Il+Ill-Pastensuspension durch ein Tiefenfilter gefiltert, das sich in einer Filterpresse befindet.

6. EXTRAKTION VON FAKTOR H AUS FRAKTION l-PRÄZIPITAT UND FRAKTION ll+lllFILTERKUCHEN [00129] Nach der Abtrennung eines Fraktion I-Präzipitats von einem Fraktion I-Überstand durch Zentrifugation oder Filtration kann Faktor H aus dem Fraktion I-Präzipitat durch Zusetzen eines Faktor H-Extraktionspuffers extrahiert werden, der zum Neususpendieren des Fraktion IPräzipitats bei einem Verhältnis von 1 Teil Präzipitat zu etwa 25 bis 30 Teilen Extraktionspuffer verwendet werden kann. Andere geeignete Wiedersuspendierungsverhältnisse können verwendet werden, zum Beispiel in einem Bereich zwischen etwa 1:4 und 1:40, oder zwischen etwa 1:8 und 1:30, oder zwischen etwa 1:10 und 1:20, oder zwischen etwa 1:12 und 1:18, oder zwischen etwa 1:13 und 1:17, oder zwischen etwa 1:14 und 1:16. In bestimmten Ausführungsformen kann das Wiedersuspendierungsverhältnis etwa 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40 oder mehr betragen.

[00130] In einer verwandten Ausführungsform kann Faktor H aus einem Fraktion I-Präzipitat durch Umwälzen eines Faktor H-Extraktionspuffers durch einen Fraktion I-Präzipitatkuchen oder -Pellet extrahiert werden. In einer Ausführungsform kann der Faktor H-Extraktionspuffer durch ein Fraktion I-Präzipitat (z.B. einen Fraktion I-Filterkuchen) bei einem Verhältnis von 1 Teil Präzipitat zu etwa 25 bis 30 Teilen Extraktionspuffer umgewälzt werden. Andere geeignete Wiedersuspendierungsverhältnisse können verwendet werden, zum Beispiel in einem Bereich von etwa 1:4 bis 1:40 oder zwischen etwa 1:8 und 1:30 oder zwischen etwa 1:10 und 1:20 oder zwischen etwa 1:12 und 1:18 oder zwischen etwa 1:13 und 1:17 oder zwischen etwa 1:14 und 1:16. In bestimmten Ausführungsformen kann das Wiedersuspendierungsverhältnis etwa 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40 oder mehr betragen. In einer bevorzugten Ausführungsform bleibt der Fraktion IFilterkuchen in der Filterpresse, die zum Filtern des Präzipitats aus dem Überstand während des Extraktionsprozesses verwendet wird.

[00131] Nach der Abtrennung eines Fraktion ll+lIl-Filterkuchens von einer Fraktion ll+lllSuspension durch Zentrifugation oder Filtration kann Faktor H aus dem Fraktion ll+lll - Filterkuchen durch Zusetzen eines Faktor H-Extraktionspuffers extrahiert werden, der zum Wiedersuspendieren des Fraktion ll+llI-Filterkuchens bei einem Verhältnis von 1 Teil Präzipitat zu etwa 25

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Patentamt bis 30 Teilen Extraktionspuffer verwendet werden kann. Andere geeignete Wiedersuspendierungsverhältnisse können verwendet werden, zum Beispiel in einem Bereich von etwa 1:4 bis 1:40 oder zwischen etwa 1:8 und 1:30 oder zwischen etwa 1:10 und 1:20 oder zwischen etwa 1:12 und 1:18 oder zwischen etwa 1:13 und 1:17 oder zwischen etwa 1:14 und 1:16. In bestimmten Ausführungsformen kann das Wiedersuspendierungsverhältnis etwa 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40 oder mehr betragen.

[00132] In einer verwandten Ausführungsform kann Faktor H aus einem Fraktion Il+Ill-Filterkuchen durch Umwälzen eines Faktor H-Extraktionspuffers durch einen Fraktion Il+lII-Filterkuchen oder -Pellet extrahiert werden. In einer Ausführungsform kann der Faktor H-Extraktionspuffer durch einen Fraktion Il+Ill-Filterkuchen bei einem Verhältnis von 1 Teil Präzipitat zu etwa 25 bis 30 Teilen Extraktionspuffer umgewälzt werden. Andere geeignete Wiedersuspendierungsverhältnisse können verwendet werden, zum Beispiel in einem Bereich von etwa 1:4 bis 1:40 oder zwischen etwa 1:8 und 1:30 oder zwischen etwa 1:10 und 1:20 oder zwischen etwa 1:12 und 1:18 oder zwischen etwa 1:13 und 1:17 oder zwischen etwa 1:14 und 1:16. In bestimmten Ausführungsformen kann das Wiedersuspendierungsverhältnis etwa 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40 oder mehr betragen. In einer bevorzugten Ausführungsform bleibt der Fraktion I-Filterkuchen in der Filterpresse, die zum Filtern des Präzipitats aus dem Überstand während des Extraktionsprozesses verwendet wird.

[00133] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Schritt des Extrahierens von Faktor H aus einem Filterkuchen oder Präzipitat das Umwälzen eines Faktor H-Extraktionspuffers durch eine Filterpresse, die den Faktor H-Filterkuchen enthält, über mindestens 10 Minuten. In anderen Ausführungsformen umfasst der Schritt des Extrahierens von Faktor H aus einem Filterkuchen oder Präzipitat das Umwälzen eines Faktor H-Extraktionspuffers durch eine Filterpresse, die den Faktor H-Filterkuchen enthält, über 10 bis 60 Minuten. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Schritt des Extrahierens von Faktor H aus einem Filterkuchen oder Präzipitat das Umwälzen eines Faktor H-Extraktionspuffers durch eine Filterpresse, die den Faktor H- Filterkuchen enthält, über 20 bis 40 Minuten. In noch anderen Ausführungsformen umfasst der Schritt des Extrahierens von Faktor H aus einem Filterkuchen oder Präzipitat das Umwälzen eines Faktor H-Extraktionspuffers durch eine Filterpresse, die den Faktor HFilterkuchen enthält, über mindestens 10 Minuten oder mindestens 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 oder 90 Minuten oder länger (z.B. mindestens etwa 2, 3, 4, 5 oder 6 Stunden).

[00134] Im allgemeinen wird die Extraktion zwischen etwa 0 °C und 20 °C, vorzugsweise zwischen etwa 2 °C und 8 °C ausgeführt. In bestimmten Ausführungsformen kann die Extraktion bei etwa 0 °C, 1 °C, 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C oder 10 °C, 11 °C, 12 °C, 13 °C, 14 °C, 15 °C, 16 °C, 17 °C, 18 °C, 19°C oder 20 °C ausgeführt werden. In einer speziellen Ausführungsform wird die Extraktion zwischen etwa 2 °C und 10 °C ausgeführt.

[00135] Es kann jeder geeignete Puffer für die Extraktion des Faktors H aus einem Fraktion IPräzipitat oder Fraktion Il+lII- Filterkuchen verwendet werden. Typische Extraktionspuffer enthalten mindestens ein Pufferungsmittel und ein Salz. In bestimmten Ausführungsformen enthält der Extraktionspuffer zwischen etwa 10 und 250 mM eines Pufferungsmittels. In bestimmten Ausführungsformen ist das Pufferungsmittel in einer Konzentration von etwa 10 mM oder 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250 mM oder mehr Pufferungsmittel vorhanden. In bestimmten Ausführungsformen hat der Extraktionspuffer eine lonenstärke zwischen etwa 5 und 100 mS/cm. In speziellen Ausführungsformen enthält der Extraktionspuffer zwischen etwa 50 und 500 mM Salz. In bestimmten Ausführungsformen ist das Salz in einer Konzentration von etwa 50 mM oder etwa 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 300, 350, 400, 450, 500 mM oder mehr Salz vorhanden.

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Patentamt [00136] Faktor H-Extraktionspuffer haben im allgemeinen einen pH-Wert zwischen etwa 6,0 und 9,0. In bestimmten Ausführungsformen hat ein Faktor H-Extraktionspuffer einen pH-Wert von etwa 6,0 oder von etwa 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, oder 9,0. In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Faktor H-Puffer einen pH-Wert zwischen etwa 7,0 und 8,0. In einer speziellen Ausführungsform hat der Extraktionspuffer einen pH-Wert von etwa 7,0. In einer weiteren speziellen Ausführungsform hat der Extraktionspuffer einen pH-Wert von etwa 7,5. In einer weiteren speziellen Ausführungsform hat der Extraktionspuffer einen pH-Wert von etwa 8,0. Nicht-einschränkende Beispiele für Pufferungsmittel, die für die Formulierung eines Faktor H-Extraktionspuffers verwendet werden können, umfassen Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Natriumacetat, Natriumzitrat, Ammoniumacetat, Kakodylsäure, Imidazol, Borsäure, Bicin, ACES, BES, BIS-Tris, BIS-Tris-Propan, CAPS, CHES, Gylcinamid, Glycylglycin, MES, MOPS, PIPES, HEPES, TAPS, TES, Tricin, Triethanolamin und Tris.

[00137] In einer Ausführungsform umfasst oder enthält der Faktor H-Extraktionspuffer 25 mM Tris; 5 mM EDTA; 200 mM NaCI; pH 8,0. In einer weiteren Ausführungsform umfasst oder enthält der Faktor H-Extraktionspuffer 100 mM Natriumphosphat; 150 mM Natriumchlorid; pH 7,5.

7. DRITTER PRÄPARATIONSSCHRITT - ENTFERNEN VON VERUNREINIGUNGEN [00138] In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner das Ausfällen von Verunreinigungen aus einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung, um ein Präzipitat (das hierin als Präzipitat 3 bezeichnet wird) und einen Überstand (der hierin als Überstand 3 bezeichnet wird) zu bilden. In bestimmten Ausführungsformen umfasst dieser Schritt das Ausfällen von mindestens einer Verunreinigung, zum Beispiel eines Lipids oder Proteins, aus der Zusammensetzung und dann das Abtrennen des Präzipitats aus dem Überstand, der Faktor H enthält. Fällungsmittel, die zum Ausfällen von Verunreinigungen aus einer aus Plasma gewonnenen Fraktion geeignet sind, sind im Fachgebiet gut bekannt und umfassen, ohne Einschränkung, Alkohol (z.B. Ethanol; Methanol usw.), wasserlösliche Polymere (z.B. PEG, Dextrane usw.), Salze (z.B. Ammoniumphosphat, Ammoniumsulfat, Natriumzitrat usw.), kurzkettige Fettsäuren (z.B. Hexansäure, Heptansäure, Caprylsäure, Nonansäure, Decansäure usw.) und dergleichen. In bestimmten Ausführungsformen kann das Ausfällen durch Anpassen des pH-Wertes der Lösung an den isoelektrischen Punkt einer interessierenden Komponente erleichtert werden, d.h. isoelektrische Punktausfällung.

[00139] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren den Schritt des Ausfällens von mindestens einer Verunreinigung aus einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung mit etwa 10 % bis 20 % Ethanol bei einem pH-Wert zwischen etwa 7,0 und 9,0. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren den Schritt des Ausfällens von mindestens einer Verunreinigung aus einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung mit etwa 12 % bis 18 % Ethanol bei einem pH-Wert zwischen etwa 7,3 und 8,7. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren den Schritt des Ausfällens von mindestens einer Verunreinigung aus einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung mit etwa 14 % bis 16 % Ethanol bei einem pH-Wert zwischen etwa 7,5 und 8,5. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren den Schritt des Ausfällens von mindestens einer Verunreinigung aus einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung mit etwa 14 % bis 16 % Ethanol bei einem pH-Wert zwischen etwa 7,8 und 8,2. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren den Schritt des Ausfällens von mindestens einer Verunreinigung aus einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung mit etwa 15 % Ethanol und einem pH-Wert von etwa 8,0.

[00140] Die Konzentration des Fällungsmittels, z.B. Ethanol, kann eingestellt werden, um die Präzipitation von einer oder mehreren Verunreinigungen zu maximieren und/oder die Präzipitation von Faktor H zu minimieren. In bestimmten Ausführungsformen kann das Ausfällen durch Zusetzen von etwa 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 % oder 20 % Ethanol ausgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Ausfällen durch

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Zusetzen von etwa 12 % bis 18 % Ethanol ausgeführt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird das Ausfällen mit etwa 13 % bis 17 % Ethanol ausgeführt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird das Ausfällen mit etwa 14 % bis 16 % Ethanol ausgeführt. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform wird das Ausfällen mit etwa 15 % Ethanol ausgeführt.

[00141] Der pH-Wert der Lösung kann eingestellt werden, um die Präzipitation von einer oder mehreren Verunreinigungen zu maximieren und/oder die Präzipitation von Faktor H zu minimieren. In bestimmten Ausführungsformen kann der pH-Wert der Lösung auf etwa 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 oder 9,0 eingestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 7,2 bis 8,8 eingestellt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 7,3 bis 8,7 eingestellt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der pHWert der Lösung auf etwa 7,4 bis 8,6 eingestellt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 7,5 bis 8,5 eingestellt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 7,6 bis 8,4 eingestellt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 7,7 bis 8,3 eingestellt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 7,8 bis 8,2 eingestellt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 7,9 bis 8,1 eingestellt. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform wird der pHWert der Lösung auf etwa 8,0 eingestellt.

8. VIERTER PRÄZIPITATIONSSCHRITT - FAKTOR H-PRÄZIPITATION [00142] In einer Ausführungsform kann die angereicherte Faktor H-Zusammensetzung weiter gereinigt werden, nachdem sie aus einem Fraktion I-Präzipitat, Fraktion ll+lIl-Suspension oder Fraktion ll+lIl-Filterkuchen durch Ausfällen von Faktor H aus der angereicherten Zusammensetzung extrahiert wurde, um ein Präzipitat (das hierin als Präzipitat 4 bezeichnet wird) und einen Überstand (der hierin als Überstand 4 bezeichnet wird) zu bilden. In bestimmten Ausführungsformen kann eine angereicherte Faktor H-Zusammensetzung einem dritten Präzipitationsschritt ausgesetzt werden, wie oben beschrieben, um mindestens eine Verunreinigung aus der Zusammensetzung zu entfernen, wie oben beschrieben, und dann einem vierten Präzipitationsschritt ausgesetzt werden, um Faktor H auszufällen und zu gewinnen.

[00143] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Ausfällen von Faktor H aus einer angereicherten Zusammensetzung das Hinzufügen von etwa 20 % bis etwa 30 % Ethanol bei einem pH-Wert zwischen etwa 5,0 und etwa 7,0. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren den Schritt des Ausfällens von Faktor H mit etwa 22 % bis etwa 28 % Ethanol bei einem pH-Wert von etwa 5,5 bis etwa 6,5. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren den Schritt des Ausfällens von Faktor H mit etwa 24 % bis etwa 26 % Ethanol bei einem pH-Wert von etwa 5,8 bis etwa 6,2. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren den Schritt des Ausfällens von Faktor H mit etwa 25 % Ethanol bei einem pH-Wert von etwa 6,0.

[00144] Die Konzentration des Fällungsmittels, z.B. Ethanol, kann eingestellt werden, um das Ausfällen von Faktor H zu maximieren und/oder das Ausfällen von einer oder mehreren Verunreinigungen zu minimieren. In bestimmten Ausführungsformen kann das Ausfällen durch Zusetzen von etwa 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 % oder 30 % Ethanol ausgeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Ausfällen durch Zusetzen von etwa 22 % bis 28 % Ethanol ausgeführt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird das Ausfällen mit etwa 23 % bis 27 % Ethanol ausgeführt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird das Ausfällen mit etwa 24 % bis 26 % Ethanol ausgeführt. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform wird das Ausfällen mit etwa 25 % Ethanol ausgeführt.

[00145] Der pH-Wert der Lösung kann eingestellt werden, um das Ausfällen von Faktor H zu maximieren und/oder das Ausfällen von einer oder mehreren Verunreinigungen zu minimieren. In bestimmten Ausführungsformen kann der pH-Wert der Lösung auf etwa 5,0, 5,1, 5,2, 5,3,

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5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 oder 7,0 eingestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 5,2 bis 6,8 eingestellt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 5,3 bis 6,7 eingestellt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 5,4 bis 6,6 eingestellt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 5,5 bis 6,5 eingestellt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 5,6 bis 6,4 eingestellt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 5,7 bis 6,3 eingestellt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 5,8 bis 6,2 eingestellt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 5,9 bis 6,1 eingestellt. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf etwa 6,0 eingestellt.

9. CHROMATOGRAPHISCHE VERFAHREN [00146] In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Verfahren zur Herstellung einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung ferner mindestens einen, vorzugsweise zwei oder mehr chromatographische Schritte, um die Reinheit der Zusammensetzung weiter zu erhöhen. Allgemein kann jedes geeignete chromatographische Verfahren eingesetzt werden, um die Faktor H-Zusammensetzung weiter anzureichern, die aus einem Fraktion I-Präzipitat oder Fraktion Il+lII-Filterkuchen extrahiert wurde.

[00147] In bestimmten Ausführungsformen kann der chromatographische Schritt AnionenAustauschchromatographie (AEC), Kationen-Austauschchromatographie (CEC), Heparin-Affinitätschromatographie, hydrophobe Austauschchromatographie (HIC), Hydroxyapatit-Chromatographie (HAP), Immunaffinitätschromatographie, Größenausschlusschromatographie (d.h. Gelfiltration) oder einen anderen geeigneten chromatographischen Schritt umfassen. Chromatographische Schritte können entweder im Chargen- oder im Säulenmodus ausgeführt werden.

[00148] In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die folgenden Schritte: Binden von Faktor H an ein Anionen-Austauschharz; Eluieren von Faktor H aus dem AnionenAustauschharz mit einem Elutionspuffer, dadurch Bilden eines ersten Eluats, das Faktor H enthält. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner die Schritte des Bindens von Faktor H aus dem Anionen-Austauscheluat an ein Heparin-Affinitätsharz mit einem Elutionspuffer, dadurch Bilden eines zweiten Eluats, das Faktor H enthält. In bestimmten Ausführungsformen können die chromatographischen Verfahren ferner Waschschritte umfassen, um lose gebundene Verunreinigungen vor der Elution von Faktor H aus dem chromatographischen Harz zu entfernen. In bestimmten Ausführungsformen kann Faktor H aus einem chromatographischen Harz durch Gradientenelution eluiert werden, z.B. mit einem Salzgradienten, oder durch Stufenelution, z.B. mit Puffern, die eine ansteigende lonenstärke haben.

[00149] Im allgemeinen wird die Leitfähigkeit der Faktor H- Lösung auf eine geeignete lonenstärke vor dem Binden von Faktor H an ein chromatographische Harz eingestellt. Die lonenstärke soll niedrig genug sein, um die Wechselwirkung zwischen Faktor H und dem Harz zu fördern, jedoch groß genug, die Stabilität des Proteins in Lösung aufrechtzuerhalten. Die Anforderungen an die lonenstärke der Lösung variieren je nach Faktoren, wie der Identität des Harzes, das verwendet wird (z.B. starkes gegenüber schwachem Anionen-Austauschharz) und der Anfangsreinheit der Lösung. Es können verschiedene Verfahren zum Reduzieren der lonenstärke einer Faktor H-Zusammensetzung eingesetzt werden, einschließlich, ohne Einschränkung, Verdünnen der Zusammensetzung mit einer Lösung, die eine geringe lonenstärke hat, Ausfällen von Faktor H aus der anfänglichen Zusammensetzung und Wiedersuspendieren in einem Puffer, der eine geringe lonenstärke hat, Ultrafiltration/Diafiltration, Entsalzen und/oder PufferAustauschchromatographie, Dialyse und dergleichen.

[00150] Es kann jedes geeignete Anionen-Austauschharz in den Verfahren verwendet werden, die hierin bereitgestellt werden. Nichteinschränkende Beispiele für Anionen-Austauschharze, die sich zur Verwendung eignen, umfassen Diethylaminoethyl (DEAE), quaternäre Aminoethyl

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Patentamt (QAE) und quaternäre Ammonium- (Q) Harze. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Anionen-Austauschharz, das verwendet wird, DEAE Sepharose™ (Diethylaminoethylsepharose). In bestimmten Ausführungsformen wird die Faktor H- Zusammensetzung aus einem Fraktion I-Präzipitat oder einem Filterkuchen gewonnen, der sich nach der Filtration oder Zentrifugation einer Fraktion Il+Ill-Pastensuspension in Gegenwart von fein verteiltem Siliziumdioxid und/oder Filterhilfsmittel gebildet hat, wie oben beschrieben.

[00151] In einer bevorzugten Ausführungsform wird Faktor H an ein DEAE Sepharose™-Harz in Gegenwart eines Ladepuffers geringer lonenstärke gebunden. Normalerweise wird die Säule mit demselben Beladungspuffer oder einem kompatiblen Puffer mit einer lonenstärke abgeglichen, die dem Beladungspuffer ähnlich ist. In bestimmten Ausführungsformen hat der Beladungspuffer und/oder Abgleichpuffer eine lonenstärke von weniger als etwa 12 mS/cm. In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Beladungspuffer und/oder Abgleichpuffer eine lonenstärke von weniger als etwa 10 mS/cm. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform hat der Beladungspuffer und/oder Abgleichpuffer eine lonenstärke von etwa 9 mS/cm. In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Beladungspuffer und/oder Abgleichpuffer eine Salzkonzentration von weniger als etwa 100 mM NaCI oder eine lonenstärke, die kleiner als die einer 100 mM-NaCI-Lösung ist. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform hat der Beladungspuffer und/oder Abgleichpuffer eine Salzkonzentration oder eine entsprechende lonenstärke von weniger als etwa 75 mM NaCI. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Salzkonzentration oder die entsprechende lonenstärke etwa 30 bis 70 mM NaCI. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform ist die Salzkonzentration oder die entsprechende lonenstärke etwa 50 mM NaCI.

[00152] Optional kann nach dem Binden von Faktor H das Anionen-Austauschharz mit einem oder mehreren Puffern gewaschen werden, die lonenstärken haben, welche zwischen dem Beladungspuffer und dem Elutionspuffer liegen. In bestimmten Ausführungsformen kann ein Waschpuffer eine lonenstärke von etwa 9 mS/cm bis 12,5 mS/cm haben. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Waschpuffer eine lonenstärke von etwa 5 mS/cm bis 10 mS/cm haben. In bestimmten Ausführungsformen hat der Waschpuffer eine Salzkonzentration oder lonenstärke, die etwa 30 bis 100 mM NaCI entspricht. In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Waschpuffer eine Salzkonzentration oder lonenstärke, die etwa 40 bis 70 mM NaCI entspricht. In bestimmten Ausführungsformen hat der Waschpuffer eine Salzkonzentration oder lonenstärke, die etwa 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, oder 100 mM NaCI entspricht.

[00153] In bestimmten Ausführungsformen wird Faktor H aus dem Anionen-Austauschharz (z.B. DEAE Sepharose™) mit einem Elutionspuffer eluiert, der eine geeignete lonenstärke hat, um die Wechselwirkung zwischen dem Harz und Faktor H zu zerstören. In einigen Ausführungsformen hat der Elutionspuffer keine geeignete lonenstärke, um die Wechselwirkung zwischen dem Harz und einer Verunreinigung zu zerstören, die das Harz mit stärkerer Affinität als Faktor H bindet. In bestimmten Ausführungsformen hat der Elutionspuffer eine lonenstärke von mindestens 12 mS/cm. In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Beladungspuffer und/oder Abgleichpuffer eine lonenstärke von etwa 13 mS/cm. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat der Elutionspuffer eine lonenstärke von etwa 14 mS/cm. In bestimmten Ausführungsformen hat der Elutionspuffer eine Salzkonzentration oder lonenstärke, die mindestens etwa 100 mM NaCI, vorzugsweise mindestens etwa 120 mM entspricht. In bestimmten Ausführungsformen hat der Elutionspuffer eine Salzkonzentration oder lonenstärke, die mindestens etwa 90 mM NaCI oder mindestens etwa 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 140, 150 mM NaCI oder mehr entspricht.

[00154] Es kann jedes geeignete Heparin-Affinitätsharz in den Verfahren verwendet werden, die hierin bereitgestellt werden, zum Beispiel Harze, die an einen Heparin-Liganden konjugiert werden, der von einem Heparin-Liganden abgeleitet ist oder denselben nachahmt, oder an einen heparinähnlichen Liganden (z.B. sulfatiertes Glycosaminglycan). In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Heparin-Affinitätsharz, das verwendet wird, Heparin Sepharose™.

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Patentamt [00155] In einer Ausführungsform wird Faktor H weiter durch Heparin-Affinitätschromatographie gereinigt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Faktor H aus dem Eluat eines AnionenAustauschchromatographieschrittes durch Heparin-Affinitätschromatographie weiter gereinigt, z.B. ein Heparin Sepharose™-Harz. In einer Ausführungsform wird die lonenstärke des Faktor H-Eluats durch ein geeignetes Verfahren reduziert, z.B. Verdünnen, Pufferaustausch, Dialyse usw., und Faktor H wird an Heparin-Affinitätsharz gebunden. In bestimmten Ausführungsformen ist die lonenstärke des Anionen-Austauscheluats auf weniger als etwa 12 mS/cm reduziert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die lonenstärke auf weniger als etwa 10 mS/cm reduziert. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die lonenstärke auf weniger als etwa 8 mS/cm reduziert. In bestimmten Ausführungsformen kann die lonenstärke auf weniger als etwa 4 mS/cm oder weniger als etwa 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 oder 12 mS/cm sein. In bestimmten Ausführungsformen ist die Salzkonzentration des Anionen-Austauscheluats oder die lonenstärke, die dieser entspricht, auf weniger als etwa 100 mM NaCI reduziert. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Salzkonzentration oder die lonenstärke, die dieser entspricht, auf weniger als etwa 75 mM NaCI reduziert. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Salzkonzentration oder die lonenstärke, die dieser entspricht, auf weniger als etwa 50 mM NaCI reduziert. In bestimmten Ausführungsformen ist die Salzkonzentration oder die lonenstärke, die dieser entspricht, auf weniger als etwa 20 mM NaCI oder weniger als etwa 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, or 100 mM NaCI reduziert.

[00156] Optional kann nach dem Binden von Faktor H das Heparin-Austauschharz mit einem oder mehreren Puffern gewaschen werden, die lonenstärken haben, welche zwischen dem Beladungspuffer und dem Elutionspuffer liegen. In bestimmten Ausführungsformen kann ein Waschpuffer eine lonenstärke von etwa 3 mS/cm bis 12,5 mS/cm haben. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Waschpuffer eine lonenstärke von etwa 5 mS/cm bis 10 mS/cm haben. In bestimmten Ausführungsformen hat der Waschpuffer eine Salzkonzentration oder lonenstärke, die dem entspricht, von etwa 30 bis 100 mM NaCI. In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Waschpuffer eine Salzkonzentration oder lonenstärke, die dem entspricht, von etwa 30 bis 80 mM NaCI. In bestimmten Ausführungsformen hat der Waschpuffer eine Salzkonzentration oder lonenstärke, die etwa 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, oder 100 mM NaCI entspricht.

[00157] In bestimmten Ausführungsformen wird Faktor H aus dem Heparin-Austauschharz (z.B. DEAE Sepharose™) mit einem Elutionspuffer eluiert, der eine geeignete lonenstärke hat, um die Wechselwirkung zwischen dem Harz und Faktor H zu unterbrechen. In einigen Ausführungsformen hat der Elutionspuffer keine geeignete lonenstärke, um die Wechselwirkung zwischen dem Harz und einer Verunreinigung zu unterbrechen, die das Harz mit stärkerer Affinität als Faktor H bindet. In bestimmten Ausführungsformen hat der Elutionspuffer eine lonenstärke von mindestens etwa 12 mS/cm. In bestimmten Ausführungsformen hat der Elutionspuffer eine Salzkonzentration oder lonenstärke, die dem entspricht, von mindestens etwa 100 mM NaCI. In einer weiteren Ausführungsform hat der Elutionspuffer eine Salzkonzentration oder lonenstärke, die dem entspricht, von mindestens etwa 150 mM NaCI. In noch einer weiteren Ausführungsform hat der Elutionspuffer eine Salzkonzentration oder lonenstärke, die dem entspricht, von mindestens etwa 200 mM NaCI. In bestimmten Ausführungsformen hat der Elutionspuffer eine Salzkonzentration oder lonenstärke, die mindestens etwa 90 mM NaCI oder mindestens etwa 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220 mM NaCI oder mehr entspricht.

[00158] Ein alternativer Reinigungsprozess besteht aus dem Nutzen einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung (z.B. aus einem Fraktion I-Präzipitat oder Fraktion ll+lllFilterkuchen extrahiert) bei einem pH-Wert von etwa 7,0 bis 9,0, vorzugsweise bei etwa 8,0, und Einstellen der lonenstärke derart, dass Faktor H sich nicht an ein Anionen-Austauschharz bindet, zum Beispiel an eine lonenstärke von etwa 120 bis 150 mM NaCI, und dann Kontaktieren der Lösung mit einem Anionen-Austauschharz (z.B. einer DEAE Sepharose™-Säule), um unerwünschte Proteine im Extrakt zu binden. Faktor H bindet sich nicht an die Säule und kann als Durchflussfraktion zur weiteren Verarbeitung gesammelt werden. Der Faktor H-Pool wird dann

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Patentamt auf eine lonenstärke eingestellt, die äquivalent kleiner oder gleich 65 mM NaCI, vorzugsweise kleiner oder gleich etwa 50 mM NaCI ist, und wird an ein Heparin-Affinitätsharz (z.B. eine Heparin Sepharose™-Säule) gebunden. Ein Puffer, der eine lonenstärke hat, welche zum Eluieren von Faktor H aus dem Harz geeignet ist, wird dann zugesetzt, um Faktor H zu gewinnen. In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Elutionspuffer eine lonenstärke, die einer Natriumchloridkonzentration von etwa 90 bis 250 mM NaCI, vorzugsweise etwa 100 bis 200 mM NaCI äquivalent ist. Die lonenstärke des Faktor H-Eluats kann dann auf einen Wert zum Binden von Faktor H an ein Anionen-Austauschharz abgesenkt werden, zum Beispiel auf eine lonenstärke, die einem Wert von kleiner oder gleich etwa 65 mM NaCI, vorzugsweise kleiner oder gleich etwa 50 mM NaCI äquivalent ist. Faktor H kann dann an das Anionen-Austauschharz gebunden werden (z.B. eine DEAE Sepharose™-Säule), um Verunreinigungen aus dem Pool zu entfernen, die unter diesen Bedingungen nicht das Harz binden. Faktor H wird mit einem Puffer eluiert, der eine geeignete lonenstärke hat, zum Beispiel eine lonenstärke, die äquivalent zu mindestens etwa 100 mM NaCI, vorzugsweise zu mindestens etwa 120 mM NaCI ist.

[00159] Es kann jedes geeignete Kation-Austauschharz in den Verfahren verwendet werden, die hierin bereitgestellt werden. Nichteinschränkende Beispiele für Kationen-Austauschharze zur Verwendung umfassen Carboxymethyl- (CM), Sulfopropyl- (SP), Methylsulfonat- (S)-Harze.

[00160] Es kann jedes geeignete Harz auf Basis von Hydroxyapatit oder Calcium in den Verfahren verwendet werden, die hierin bereitgestellt werden. Nichteinschränkende Beispiele für geeignete Harze umfassen Hydroxyapatitharze, Fluorapatitharze, Fluorhydroxyapatitharze und dergleichen.

[00161] Es kann jedes geeignete hydrophobe Interaktionschromatographieharz in den Verfahren verwendet werden, die hierin bereitgestellt werden. Nichteinschränkende Beispiele für geeignete Harze umfassen Phenylharze, Methylharze, Butylharze, Octylharze und dergleichen.

[00162] In bestimmten Ausführungsformen kann Faktor H ferner durch Immunaffinitätschromatographie weiter angereichert werden, zum Beispiel mit Harzen, die an einen Antikörper, Aptamer oder anderes Bindungsmolekül konjugiert werden, das spezifisch für Faktor H ist.

[00163] In bestimmten Ausführungsformen beruhen einzelne oder alle chromatographischen Schritte auf einem gemeinsamen Puffersystem, bei dem nur die Salzkonzentration zwischen Abgleich, Waschen und Elutionspuffern variiert. Es kann jeder geeignete Puffer verwendet werden, z.B. ein Trispuffer, ein Phosphatpuffer, ein Zitratpuffer usw. Der pH-Wert des Beladungspuffers liegt etwa zwischen 6,0 und 9,0. In einer bevorzugten Ausführungsform liegt der pH-Wert des Puffers zwischen etwa 7,0 und 9,0. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform liegt der pH-Wert des Puffersystems zwischen etwa 7,5 und 8,5. In einer am stärksten bevorzugten Ausführungsform liegt der pH-Wert des Puffersystems bei etwa 8,0.

10. VIRUSINAKTIVIERUNG UND -ENTFERNUNG [00164] In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Verfahren, die hierin bereitgestellt werden, zur Herstellung einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung ferner mindestens einen, vorzugsweise mindestens zwei, am besten mindestens drei Vireninaktivierungs- oder -entfernungsschritte. Nichteinschränkende Beispiele für Vireninaktivierungs- oder -entfernungsschritte, die bei den Verfahren eingesetzt werden können, welche hierin bereitgestellt werden, umfassen die Detergenzienbehandlung (Horowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21 - S28 und Kreil et al., Transfusion 2003 (43):1023-1028), Nanofiltration (Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56)230-236 und Yuasa et al., J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):20212024), und Inkubation bei niedrigem pH-Wert und hohen Temperaturen (Kempf et al., Transfusion 1991 (31)423-427 und Louie et al., Biologicals 1994 (22):13-19).

[00165] Virusinaktivierungs- oder -entfernungsschritte können an allen Faktor H-Zwischenfraktionen ausgeführt werden, die während des Herstellungsprozesses erzeugt wurden. Zum Beispiel kann in einer Ausführungsform ein Virusinaktivierungs- oder -entfernungsschritt an einem Fraktion I-Überstand, einer Fraktion ll+lIl-Suspension, einem Fraktion Il+lII-Filterkuchenextrakt, /75

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Überstand 3, Präzipitat 4-Suspension, Anionen-Austauscheluat, Heparin-Affinitäseluat und dergleichen ausgeführt werden.

[00166] In einer Ausführungsform wird ein Virusinaktivierungs- oder -entfernungsschritt am Fraktion Il+lII-Filterkuchenextrakt ausgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Fraktion Il+lII-Filterkuchenextrakt einer Lösungsmittel- und Detergenzien-(S/D)-Behandlung unterzogen.

[00167] In einer zweiten Ausführungsform wird ein Virusinaktivierungs- oder -entfernungsschritt am Präzipitat 3-Überstand (Überstand 3) ausgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Präzipitat 3-Überstand einer Lösungsmittel- und Detergenzien-(S/D)-Behandlung unterzogen.

[00168] In einer dritten Ausführungsform wird ein Virusinaktivierungs- oder -entfernungsschritt an der Präzipitat 4-Suspension ausgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Präzipitat 4-Überstand einer Lösungsmittel- und Detergenzien-(S/D)-Behandlung unterzogen.

[00169] In einer vierten Ausführungsform wird ein Virusinaktivierungs- oder -entfernungsschritt am Anionen-Austauscheluat ausgeführt, seits In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Anionen-Austauscheluat einer Lösungsmittel- und Detergenzien- (S/D)-Behandlung unterzogen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Anionen-Austauscheluat der Nanofiltration unterzogen.

[00170] In einer fünften Ausführungsform wird ein Virusinaktivierungs- oder -entfernungsschritt am Heparin-Affinitätseluat ausgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das HeparinAffinitäseluat einer Lösungsmittel- und Detergenzien- (S/D)- Behandlung unterzogen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Heparin-Affinitätseluat der Nanofiltration unterzogen.

[00171] In einer sechsten Ausführungsform wird ein Virusinaktivierungs- oder -entfernungsschritt an einer angereicherten Faktor H-Mengenlösung ausgeführt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die angereicherte Faktor H-Mengenlösung der Nanofiltration unterzogen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die angereicherte Faktor H-Mengenlösung der Inkubation bei niedrigem pH-Wert und/oder hohen Temperaturen ausgesetzt.

[00172] In einer siebenten Ausführungsform wird eine lyophilisierte Faktor H-Zusammensetzung wärmebehandelt, um Viren zu inaktivieren.

[00173] In einer Ausführungsform wird ein Herstellungsprozess für aus Plasma gewonnenen Faktor H bereitgestellt, der zwei Virusinaktivierungs- oder -entfernungsschritte enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Prozess sowohl Lösungsmittel- und Detergenzienbehandlungs- wie auch Nanofiltrationsschritte für die Inaktivierung und das Entfernen von Virusteilchen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Herstellungsprozess die Anwendung der S/D-Behandlung auf den Präzipitat 3-Überstand und der Nanofiltration auf das Heparineluat. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Herstellungsprozess die Anwendung der S/D-Behandlung auf die Präzipitat 4-Suspension oder ein geklärtes Filtrat derselben und der Nanofiltration auf das Heparineluat. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Herstellungsprozess ferner einen Virusinaktivierungsschritt, der das Inkubieren einer endgültigen Faktor H-Mengenzusammensetzung bei niedrigem pH-Wert über einen längeren Zeitabschnitt umfasst.

a) Lösungsmittel- und Detergenzien- (S/D)-Behandlung [00174] Um verschiedene virale Verunreinigungen zu inaktivieren, die in aus Plasma gewonnenen Produkten vorhanden sein können, können ein oder mehrere Faktor H-Zwischenlösungen einer Lösungsmittel-Detergenzien- (S/D)-Behandlung unterzogen werden. Verfahren für die Detergenzienbehandlung von aus Plasma gewonnenen Fraktionen sind im Fachgebiet gut bekannt (zur Übersicht siehe Pelletier JP et al., Best Pract Res OM Haematol. 2006;19(1 ):20542). Allgemein kann jede Standard-S/D-Behandlung in Verbindung mit den Verfahren verwendet werden, die hierin bereitgestellt werden. Zum Beispiel wird ein beispielhaftes Protokoll für

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Patentamt eine S/D-Behandlung unten angeführt.

[00175] In einer Ausführungsform werden Triton X-100, Tween- 20 und Tri(n-butyl)phosphat (TNBP) einer Faktor H-Zwischenlösung bei Endkonzentrationen von etwa 1,0 %, 0,3 % bzw. 0,3 % zugesetzt. Die Mischung wird dann bei einer Temperatur zwischen etwa 18 °C und 25 °C für mindestens etwa eine Stunde gerührt.

[00176] In einer Ausführungsform werden die S/D-Reagenzien (z.B. Triton X-100, Tween-20 und TNBP) durch Sprühen statt durch Flüssigkeitszusatz zugesetzt. In anderen Ausführungsformen können die Detergenzien als Feststoffe der Faktor H-Zwischenlösung zugesetzt werden, die gerührt wird, um für eine schnelle Verteilung der S/D-Komponenten zu sorgen. In bestimmten Ausführungsformen ist es besser, feste Reagenzien durch Aufstreuen der Feststoffe über einen größeren Flächenbereich des Filtrats zuzusetzen, so dass keine lokale Überkonzentrierung auftritt, wie beim Flüssigkeitszusatz. In einer weiteren Ausführungsform wird die Faktor Hhaltige Lösung in einen Tank gepumpt, wo die S/D- Reagenzien bereits vorhanden sind, entweder in konzentrierter oder in verdünnter Form.

b) Nanofiltration und Ultra-/Diafiltration [00177] Um die Viruslast der Faktor H-Zusammensetzung, die hierin bereitgestellt wird, weiter zu reduzieren, kann eine Faktor H-Fraktion, zum Beispiel das Heparin-Affinitätseluat, unter Verwendung einer geeigneten Nanofiltrationsvorrichtung nanogefiltert werden. In bestimmten Ausführungsformen hat die Nanofiltrationsvorrichtung eine mittlere Porengröße zwischen etwa 15 nm und 200 nm. Beispiele für Nanofilter, die sich für diese Verwendung eignen, umfassen ohne Einschränkung DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, Viresolve NFR (Millipore), Planova 15N, 20N, 35N und 75N (Planova). In einer speziellen Ausführungsform kann das Nanofilter eine mittlere Porengröße zwischen etwa 15 und 72 nm oder zwischen etwa 19 und 35 nm oder von etwa 15 nm, 19 nm, 35 nm oder 72 nm haben. In einer bevorzugten Ausführungsform hat das Nanofilter eine mittlere Porengröße von etwa 35 nm, wie zum Beispiel ein Asahi PLANOVA 35N-Filter oder ein äquivalentes.

[00178] Optional kann die Ultrafiltration/Diafiltration zum weiteren Konzentrieren des Nanofiltrats ausgeführt werden. In einer Ausführungsform wird eine Membran mit offenen Kanälen mit einer speziell ausgelegten Nachwäsche und Formulierung zum Ende des Produktionsprozesses hin verwendet, was zu einer Faktor H- Zusammensetzung hoher Konzentration führt.

[00179] Nach der Nanofiltration kann das Filtrat durch Ultrafiltration weiter konzentriert werden und/oder die Pufferzusammensetzung durch Diafiltration eingestellt werden. In einer Ausführungsform kann das Nanofiltrat durch Ultrafiltration bis zu einer Proteinkonzentration zwischen etwa 0,5 % und 10 % (w/v) konzentriert werden. In bestimmten Ausführungsformen wird die Ultrafiltration in einer Kassette mit einem Offen-Kanal-Schirm ausgeführt, und die Ultrafiltrationsmembran hat einen Abgrenzungswert des Nennmolekulargewichts (NMWCO) von weniger als etwa 150 kDa oder weniger als etwa 140, 130, 120, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 oder weniger kDa. In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Ultrafiltrationsmembran einen NMWCO von nicht mehr als 50 kDa.

[00180] Beim Abschluss des Ultrafiltrationsschrittes kann ein Pufferaustausch durch Diafiltration gegen eine Lösung ausgeführt werden, die sich für die intravenöse, intramuskuläre, intraokuläre, subkutane oder andere geeignete Verabreichung eignet. In bestimmten Ausführungsformen kann die Diafiltrationslösung ein Stabilisierungs- und/oder Pufferungsmittel umfassen, zum Beispiel Salze, Zucker und/oder ein nicht-ionisches Detergens (z.B. Polysorbat 80).

[00181] Normalerweise beträgt das minimale Austauschvolumen mindestens etwa das Dreifache des ursprünglichen Konzentratvolumens oder mindestens etwa das 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder Mehrfache des ursprünglichen Konzentratvolumens. Die Faktor H-Lösung kann bis zu einer Endproteinkonzentration von etwa 0,5 % bis 25 % (w/v) oder von etwa 1 % bis 25 % (w/v) oder von etwa 2 % bis 20 % (w/v) oder von etwa 3 % bis 15 % (w/v) oder von etwa 5 % bis 10 % (w/v) oder von etwa 9 % bis 12 % oder von etwa 3 % bis 7 % (w/v) oder von etwa 8 % bis 14 %

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Patentamt (w/v) oder von etwa 4 % bis 6 % oder bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,1 %, 0,25 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 % oder 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 % oder mehr konzentriert werden.

c) Inkubation bei niedrigem pH-Wert [00182] In bestimmten Ausführungsformen kann eine Faktor H- Lösung behandelt werden, um die Viruslast der Zusammensetzung zu reduzieren oder zu inaktivieren. In einer Ausführungsform wird dies durch Einstellen des pH-Wertes der Zusammensetzung auf einen niedrigen Wert, zum Beispiel weniger als etwa 6,0, und Inkubieren für mindestens etwa eine Woche vor der Freigabe der Zusammensetzung erreicht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der pHWert der Mengenlösung auf weniger als etwa 5,5 vor der Inkubation eingestellt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird der pH-Wert der Lösung auf weniger als etwa 5,0 vor der Inkubation abgesenkt. In bestimmten Ausführungsformen wird der pH-Wert der Lösung auf weniger als etwa 6,0 oder weniger als etwa 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1,5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1,4,0 oder niedriger vor der Inkubation abgesenkt.

[00183] In bestimmten Ausführungsformen wird die Lösung dann für mindestens etwa eine Woche oder für mindestens etwa 2, 3, 4 oder mehr Wochen oder für mindestens etwa 1, 2, 3 oder mehr Monate inkubiert. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Zusammensetzung bei einer Temperatur von mehr als etwa 20 °C oder bei mehr als etwa 25 °C oder mehr als etwa 30 °C inkubiert. In speziellen Ausführungsformen wird die Zusammensetzung bei einer Temperatur von etwa 20 °C oder bei etwa 21 °C, 22 °C, 23 °C, 24 °C, 25 °C, 26 °C, 27 °C, 28 °C, 29 °C, 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C, 36 °C, 37 °C, 38 °C, 39 °C, 40 °C oder mehr inkubiert.

d) Lyophilisierung und Wärmebehandlung [00184] In noch anderen Ausführungsformen sorgt die vorliegende Erfindung für lyophilisierte Faktor H-Zusammensetzungen. Die Virusaktivität dieser lyophilisierten Zusammensetzung, die vorher anderen Virusinaktivierungs- oder -entfernungsschritten ausgesetzt worden sein kann, wie zum Beispiel eine S/D-Behandlung oder Nanofiltration, kann weiter durch Wärmebehandlung der lyophilisierten Zusammensetzung (d.h. Faktor H-Lyokuchen) reduziert werden. Wärmebehandlungen für die Inaktivierung von Viruslasten in Blutfaktoren sind im Fachgebiet gut bekannt (siehe zum Beispiel Piszkiewicz et al., Thromb Res. 1987 Jul 15;47(2):235- 41; Piszkiewicz et al., Curr Stud Hematol Blood Transfus. 1989; (56):44-54; Epstein and Fricke, Arch Pathol Lab Med. 1990 Mar;114(3):335-40).

11. FORMULIERUNG [00185] Beim Abschluss des Faktor H-Anreicherungsprozesses, z.B. nach einem Enddiafiltrationsschritt, wird die Proteinkonzentration der Lösung mit einem Puffer, z.B. dem Diafiltrationspuffer, auf eine Endkonzentration von etwa 0,5 % bis 20 % (w/v) oder von etwa 1 % bis 25 % (w/v) oder von etwa 2 % bis 20 % (w/v) oder von etwa 3 % bis 15 % (w/v) oder von etwa 5 % bis 10 % (w/v) oder von etwa 9 % bis 12 % oder von etwa 3 % bis 7 % (w/v) oder von etwa 8 % bis 14 % (w/v) oder von etwa 4 % bis 6 % oder bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,1 %, 0,25 %, 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 % oder mehr eingestellt.

[00186] In bestimmten Ausführungsformen kann die formulierte Mengenlösung durch Filtern durch ein Membranfilter mit einer absoluten Porengröße von höchstens 0,22 Mikrometern, zum Beispiel von etwa 0,1 oder 0,2 Mikrometer, weiter sterilisiert werden. In bestimmten Ausführungsformen kann die Lösung aseptisch in Endcontainer zur ordentlichen Versiegelung verteilt werden, wobei Proben zum Testen entnommen werden.

B. ALKOHOLZUSATZ [00187] Es ist vorteilhaft festgestellt worden, dass für Zwecke der Fraktionierung von Blutprodukten (z.B. Faktor H, IgG, Albumin) aus Plasma das Hinzufügen von Alkohol durch ein Verfah

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Patentamt ren, das den Alkohol am Ort des Hinzufügens fein dispergiert oder schnell dispergiert, zu einem reduzierten Verlust an Blutproduktausbeute führt. Ohne an die Theorie gebunden zu sein, kann die vorübergehende lokale Überkonzentrierung von Alkohol am Eindringort von Flüssigkeit während des Flüssigkeitszusatzes zu einer Plasmafraktion zu Proteindenaturierung und irreversiblem Verlust und/oder Ausfällung eines Blutfaktors während der Schritte führen, bei denen der Blutfaktor im Überstand bleiben sollte. Des weiteren können diese Effekte verstärkt werden, wenn große Volumina von Alkohol zugesetzt werden müssen, wie zum Beispiel bei industriellen Reinigungen, die die Fraktionierung von mindestens 100 I gepooltes Plasma beinhalten.

[00188] In einer Ausführungsform wird Alkohol in einem oder mehreren Präzipitationsschritten durch ein Verfahren hinzugefügt, das den Alkohol über eine weite Fläche fein verteilt. Zum Beispiel kann Alkohol einem Fraktionierungsschritt durch Aufsprühen auf die Oberfläche des Behälters oder Tanks, der die Plasmafraktion enthält, zugesetzt werden. Dementsprechend werden in einer Erscheinungsform die Verfahren, die hierin bereitgestellt werden, durch Sprühzusatz von Alkohol ausgeführt. In bestimmten Ausführungsformen kann der Sprühzusatz durch Verwendung einer unter Druck stehenden Vorrichtung erreicht werden, wie zum Beispiel ein Behälter (z.B. eine Sprühflasche), die einen Sprühkopf oder eine Düse hat und manuell oder automatisch betrieben wird, um aus einer Flüssigkeit einen feinen Nebel zu erzeugen. In bestimmten Ausführungsformen wird der Sprühzusatz ausgeführt, während das System fortlaufend gerührt oder auf andere Weise durchmischt wird, um die schnelle und gleichförmige Verteilung der Flüssigkeit im System sicherzustellen.

[00189] In einerweiteren Ausführungsform wird Alkohol in einem oder mehreren Präzipitationsschritten durch ein Verfahren hinzugefügt, das den Alkohol am Ort des Hinzufügens schnell dispergiert. Zum Beispiel kann Alkohol unterhalb des Behälters oder Tanks, der die Plasmafraktion enthält, direkt neben einer Rührvorrichtung (z. B. einem Propeller) zugeführt werden. In bestimmten Ausführungsformen wird der Flüssigkeitszusatz an einem Einleitungspunkt direkt neben einer Rührvorrichtung ausgeführt, während das System gerührt oder auf andere Weise durchmischt wird, um die schnelle und gleichförmige Verteilung der Flüssigkeit im System sicherzustellen.

C. EINSTELLUNG DES PH-WERTES [00190] Die Proteinpräzipitationsprofile von Plasmafraktionen hängen stark vom pH-Wert der Lösung ab, bei dem die Plasmaproteine ausgefällt werden. Diese Tatsache wird von Wissenschaftlern, die Plasmaproteine fraktionieren, seit der Einführung der Verfahren von Cohn und Oncley 1946 bzw. 1949 ausgenutzt. Üblicherweise wird der pH-Wert einer Plasmafraktion vor dem Zusetzen von Alkohol eingestellt, um das Erreichen der höchstmöglichen Ausbeuten für die interessierenden Komponente(n) zu erleichtern. Es ist vorteilhaft festgestellt worden, dass durch Einstellen des pH-Wertes der Lösung direkt nach dem Zusetzen von Alkohol oder gleichzeitig mit dem Zusetzen von Alkohol zu einer besser definierten und reproduzierbareren Ausfällung führt. Es wurde festgestellt, dass der Zusatz von Ethanol zu Plasmafraktionen zu Schwankungen im pH-Wert der Lösung führt, im allgemeinen durch Erhöhung des pH-Wertes der Lösung. Durch Einstellen des pH-Wertes einer Plasmafraktion auf einen vorgegebenen pH-Wert, aber nicht vor dem Zusetzen von Alkohol, tritt die Präzipitationsreaktion bei einem nicht optimalen pH-Wert auf.

[00191] Analog beeinflusst das Ausfällen von Proteinen aus einer Plasmafraktion die elektrostatische Umgebung und ändert daher den pH-Wert der Lösung. Dementsprechend beginnt bei Fortschreiten eines Präzipitationsereignisses der pH-Wert der Lösung, von dem vorgegebenen pH-Wert abzuweichen, der eine maximale Gewinnung der interessierenden Proteinart ermöglicht. Das gilt insbesondere für Präzipitationsereignisse, bei denen eine große Fraktion des Proteins ausgefällt wird, Präzipitationsereignisse, bei denen ein hoher Alkoholgehalt verwendet wird, und Präzipitationsereignisse, die eine lange Inkubationszeit erfordern.

[00192] Dementsprechend wird in einer Erscheinungsform der Verfahren, die hierin bereitgestellt werden, der pH-Wert einer Plasmafraktion direkt nach dem Zusetzen von Alkohol einge

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Patentamt stellt. In verwandten Ausführungsformen kann der pH-Wert vor und nach dem Zusetzen von Alkohol oder während und nach dem Zusetzen von Alkohol oder vor, während und nach dem Zusetzen von Alkohol eingestellt werden. In einer verwandten Ausführungsform wird der pHWert einer Lösung während eines oder mehrerer Alkoholpräzipitationsereignisse oder Inkubationen kontinuierlich eingestellt. In bestimmten Ausführungsformen wird der pH-Wert einer Lösung kontinuierlich eingestellt oder aufrechterhalten, während das System kontinuierlich gerührt oder auf andere Weise durchmischt wird, um eine schnelle und gleichförmige Verteilung des pH-Wert modifizierenden Mittels im System sicherzustellen.

[00193] Analog zu dem Fall mit dem Zusatz von flüssigem Alkohol ist jetzt festgestellt worden, dass der flüssige Zusatz von großen Volumina eines pH-Wert modifizierenden Mittels vorübergehende lokale pH-Wert-Variationen verursachen kann, was zu unerwünschter Proteindenaturierung oder -ausfällung führt. Dementsprechend können in einer Ausführungsform der Verfahren, die hierin bereitgestellt werden, pH-Wert modifizierende Mittel in einen oder mehrere Plasmafraktionierungsschritte durch ein Verfahren eingeführt werden, das den Alkohol am Ort des Hinzufügens fein dispergiert oder schnell dispergiert.

[00194] In einer Ausführungsform wird ein pH-Wert modifizierendes Mittel in einen oder mehrere Schritte durch ein Verfahren hinzugefügt, das das pH-Wert modifizierende Mittel über eine breite Fläche fein dispergiert. Zum Beispiel kann das pH-Wert modifizierende Mittel einem Schritt durch Aufsprühen auf die Oberfläche der Plasmafraktion hinzugefügt werden, die in einem Behälter oder Tank enthalten ist. In einer weiteren Ausführungsform der Verfahren, die hierin bereitgestellt werden, kann der pH-Wert einer Plasmafraktion oder Präzipitationsschrittes durch Sprühzusatz eines pH-Wert modifizierenden Mittels eingestellt werden. In bestimmten Ausführungsformen kann der Sprühzusatz durch Verwendung einer unter Druck stehenden Vorrichtung erreicht werden, wie zum Beispiel eines Behälters (z.B. eine Sprühflasche), die einen Sprühkopf oder eine Düse hat und manuell oder automatisch betrieben wird, um aus einer Flüssigkeit einen feinen Nebel zu erzeugen. In bestimmten Ausführungsformen wird der Sprühzusatz ausgeführt, während das System fortlaufend gerührt oder auf andere Weise durchmischt wird, um die schnelle und gleichförmige Verteilung der Flüssigkeit im System sicherzustellen.

[00195] In einer weiteren Ausführungsform wird ein pH-Wert modifizierendes Mittel in einen oder mehrere Schritte durch ein Verfahren hinzugefügt, das das pH-Wert modifizierende Mittel am Ort des Hinzufügens schnell dispergiert. Zum Beispiel kann ein pH-Wert modifizierendes Mittel unterhalb des Behälters oder Tanks, der die Plasmafraktion enthält, direkt neben einer Rührvorrichtung (z.B. einem Propeller) zugeführt werden. In bestimmten Ausführungsformen wird der Flüssigkeitszusatz an einem Einleitungspunkt direkt neben einer Rührvorrichtung ausgeführt, während das System gerührt oder auf andere Weise durchmischt wird, um die schnelle und gleichförmige Verteilung der Flüssigkeit im System sicherzustellen.

[00196] In noch einer weiteren Ausführungsform wird ein pH- Wert modifizierendes Mittel einem oder mehreren Schritten durch Aufstreuen eines festen pH-Wert modifizierenden Mittels über eine breite Fläche auf der Oberfläche der Plasmafraktion hinzugefügt. In bestimmten Ausführungsformen wird das Hinzufügen dieses Mittels ausgeführt, während das System fortlaufend gerührt oder auf andere Weise durchmischt wird, um die schnelle und gleichförmige Verteilung des pH-Wert modifizierenden Mittels im System sicherzustellen.

IV. FAKTOR H-ZUSAMMENSETZUNGEN [00197] Für die Behandlung bestimmter komplementbezogener Störungen sind Faktor HZusammensetzungen beschrieben worden. (Siehe zum Beispiel US- Patent Publication Nr. US 2009/0118163 und Europäische Patentanmeldung Nr. EP 0 222 611 A2) [00198] In einer Erscheinungsform stellt die vorliegende Erfindung Faktor H-Zusammensetzungen bereit, die gemäß einem Verfahren hergestellt werden, welches hierin beschrieben wird. In einer Ausführungsform wird Faktor H aus Materialien hergestellt, die anderenfalls während der Herstellung eines anderen kommerziellen aus Plasma gewonnenen Blutproduktes, zum

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Beispiel IgG oder Albumin, verworfen werden würden. In einer Ausführungsform wird eine Faktor H-Zusammensetzung bereitgestellt, wobei Faktor H aus einem Fraktion I-Präzipitat und/oder einem Fraktion I l+l I I-Filterkuchen extrahiert wird.

[00199] Faktor H, wie in dieser Erfindung beschrieben, kann zu pharmazeutischen Präparaten zur therapeutischen Verwendung formuliert werden. Das gereinigte Protein kann in herkömmlichen, physiologisch kompatiblen wässrigen Pufferlösungen aufgelöst werden, denen optional pharmazeutische Trägerstoffe zugesetzt werden können, um für pharmazeutische Präparate zu sorgen.

[00200] Solche pharmazeutischen Träger und Trägerstoffe sowie geeignete pharmazeutische Formulierungen sind im Fachgebiet gut bekannt (siehe zum Beispiel Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) or Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000)). Insbesondere kann die pharmazeutische Zusammensetzung, die die Polypeptidvariante der Erfindung umfasst, in lyophilisierter oder stabiler löslicher Form formuliert werden. Die Polypeptidvariante kann mit einer Reihe von Prozeduren lyophilisiert werden, die im Fachgebiet bekannt sind. Lyophilisierte Formulierungen werden vor Verwendung durch Zusetzen von einer oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungen wiederhergestellt, wie zum Beispiel steriles Wasser zur Injektion oder sterile physiologische Kochsalzlösung.

[00201] Formulierungen der Zusammensetzung werden dem Individuum durch pharmazeutisch geeignete Mittel der Verabreichung zugeführt. Verschiedene Zufuhrsysteme sind bekannt und können zum Verabreichen der Zusammensetzung auf einem beliebigen geeigneten Weg verabreicht werden. Vorzugsweise werden die Zusammensetzungen der Erfindung systemisch verabreicht. Zur systemischen Verwendung wird Faktor H der Erfindung zur parenteralen (z.B. intravenösen, subkutanen, intramuskulären intraperitonealen, intrazerebralen, intrapulmonalen, intranasalen, intravitrealen oder transdermalen) oder enteralen (z.B. oralen, vaginalen oder rektalen) Zufuhr gemäß herkömmlichen Verfahren formuliert. Die Formulierungen können kontinuierlich durch Infusion oder durch Bolusinjektion verabreicht werden. Einige Formulierungen umfassen Systeme mit langsamer Freisetzung. Bevorzugte Verabreichungswege hängen von der Indikation ab, die behandelt, bekämpft oder verhütet wird. Zum Beispiel wird in einer Ausführungsform, bei der Faktor H zur Behandlung von AMD verabreicht wird, der bevorzugte Verabreichungsweg intravitreal sein. In einer zweiten Ausführungsform, bei der Faktor H zur Behandlung oder Bewältigung von aHUS verabreicht wird, wird der bevorzugte Verabreichungsweg intravenös sein. Ein Arzt wird ohne weiteres den bevorzugten Verabreichungsweg für das bestimmte Leiden feststellen können, das behandelt, bekämpft oder verhütet wird.

[00202] In einer weiterer Erscheinungsform stellt die vorliegende Erfindung eine stark gereinigte Faktor H-Präparation bereit, die gemäß einem Verfahren hergestellt wird, welches hierin bereitgestellt wird. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren: (a) Ausführen der CohnFraktionierung, um ein Fraktion ll+lIl-Präzipitat zu erhalten, und Herstellen einer Suspension der kombinierten Präzipitate, (b) Filtern des neu suspendierten Fraktion Il+Ill-Präzipitates, um den verworfenen Filterkuchen zu erhalten, der nach der Filtration der Fraktion II+Ill-Suspension zurückbleibt; (c) Extrahieren des Filterkuchens gemäß einem Verfahren, das folgende Schritte umfasst: (I) Auflösen des Filterkuchens in einem geeigneten Puffer von geeigneter lonenstärke über einen Zeitraum, der zum Auflösen des Proteins ausreicht, welches auf dem Filterkuchen liegt; (II) Verdünnen des aufgelösten Proteins mit zusätzlichem Puffer, (III) Entfernen von losem Material aus dem verdünnten Protein, (IV) Reinigen von Faktor H-Protein aus der verdünnten Proteinpräparation durch Ultrafiltration des verdünnten Proteins in einem 0,45 pm-Filter, um ein Filtrat zu erzeugen, das den Faktor H enthält; (V) Unterwerfen des Filtrats, das Faktor H enthält, einer Anionen-Austauschchromatographie unter Verwendung eines NaCI-Gradienten (50-500 mM) im laufenden Puffer, um eine gepoolte rohe Faktor H-Fraktion zu erhalten; und (VI) Reinigen von Faktor H aus der rohen Faktor H-Präparation durch Heparin Sepharose™-Chromatographie unter Verwendung eines NaCI-Gradienten (50-500 mM).

[00203] In einer Erscheinungsform der stark gereinigten Faktor H-Präparation ist die Faktor H

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Patentamt

Präparation eine aktive Faktor H-Präparation, die aus einer Mischung von Tyr-402- und His402-lsoformen im Bereich von 50 %±20 % His-402; 50 %±20 % Ty- r-402 besteht.

A. WÄSSRIGE ZUSAMMENSETZUNGEN [00204] In einer Erscheinungsform sorgt die vorliegende Erfindung für wässrige Zusammensetzungen des aus Plasma gewonnenen Faktor H aus Materialien, die anderenfalls während der Herstellung anderer kommerziell wichtiger Blutprodukte durch Plasmafraktionierung verworfen werden. Wässrige Faktor H- Zusammensetzungen, die mit den Verfahren hergestellt werden, welche hierin bereitgestellt werden, haben einen hohen Faktor H- Gehalt und Reinheit. Zum Beispiel können die Faktor H-Zusammensetzungen, die hierin bereitgestellt werden, einen Proteingehalt von mindestens etwa 3 % (w/v) und einen Faktor H-Gehalt von mehr als etwa 90 % Reinheit haben.

[00205] In einer Ausführungsform werden wässrige Zusammensetzungen von Faktor H bereitgestellt, die aus einem Fraktion Il+lII-Filterkuchen hergestellt werden. In einer Ausführungsform wird eine wässrige Zusammensetzung von Faktor H bereitgestellt, die durch ein Verfahren hergestellt wird, welche die folgenden Schritte umfasst: (I) Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion ll+lIl-Filterkuchen, (II) optionales Ausführen eines ersten Präzipitationsschrittes zum Ausfällen von mindestens einer Verunreinigung aus der Faktor H-Zusammensetzung, (III) optionales Ausführen eines zweiten Präzipitationsschrittes, um Faktor H aus der Zusammensetzung auszufällen, (IV) optionales Ausführen von mindestens einem lonen-Austauschchromatographieschritt, (V) optionales Ausführen von mindestens einem Heparin-Affinitätschromatographieschritt; und (VI) optionales Ausführen von mindestens einem Virusinaktivierungs- oder -entfernungsschritt, dadurch Herstellung einer wässrigen Faktor H-Zusammensetzung.

[00206] In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Faktor H-Zusammensetzung bereitgestellt, die mit einem Verfahren hergestellt wird, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Ausfällen von Proteinen aus einer kryoarmen Plasmafraktion in einem ersten Präzipitationsschritt mit etwa 6 % bis etwa 10 % Alkohol bei einem pH zwischen etwa 7,0 und etwa 7,5, um ein erstes Präzipitat und einen ersten Überstand zu erhalten; (b) Ausfällen von Faktor H aus dem ersten Überstand in einem zweiten Präzipitationsschritt mit etwa 20 % bis etwa 25 % Alkohol bei einem pH zwischen etwa 6,7 und etwa 7,3, um ein zweites Präzipitat zu bilden; (c) Wiedersuspendieren des zweiten Präzipitats, um eine Suspension zu bilden; (d) Mischen von fein verteiltem Siliziumdioxid (SiO₂) mit der Suspension aus Schritt (c); (e) Filtern der Suspension mit einer Filterpresse, dadurch Bilden eines Filterkuchens und eines Überstandes; und (f) Extrahieren von Faktor H aus dem Filterkuchen mit einem Faktor H-Extraktionspuffer, dadurch Herstellen einer wässrigen Faktor H-Zusammensetzung.

[00207] In bestimmten Ausführungsformen wird Faktor H aus dem Filterkuchen durch Umwälzen eines Extraktionspuffers durch die Filterpresse extrahiert, die den Filterkuchen enthält. Im allgemeinen wird der Extraktionspuffer durch den Filterkuchen für etwa 5 Minuten bis 2 Stunden umgewälzt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Extraktionspuffer durch den Filterkuchen für etwa 10 bis 60 Minuten umgewälzt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Extraktionspuffer durch den Filterkuchen für etwa 20 bis 40 Minuten umgewälzt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Extraktionspuffer durch den Filterkuchen für etwa 30 Minuten umgewälzt. In anderen Ausführungsformen wird der Extraktionspuffer durch den Filterkuchen für mindestens etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120 oder mehr Minuten umgewälzt.

[00208] In einer weiteren Ausführungsform werden wässrige Zusammensetzungen von Faktor H bereitgestellt, die aus einem Fraktion I-Präzipitat hergestellt werden. In einer Ausführungsform wird eine wässrige Zusammensetzung von Faktor H bereitgestellt, die durch ein Verfahren hergestellt wird, welches die folgenden Schritte umfasst: (I) Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion I-Präzipitat, (II) optionales Ausführen eines ersten Präzipitationsschrittes zum Ausfällen von mindestens einer Verunreinigung aus der Faktor H-Zusammensetzung, (III) optionales Ausführen eines zweiten Präzipitationsschrittes, um Faktor H aus der Zusammensetzung aus

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Patentamt zufällen, (IV) optionales Ausführen von mindestens einem lonen-Austauschchromatographieschritt, (V) optionales Ausführen von mindestens einem Heparin-Affinitätschromatographieschritt; und (VI) Ausführen von mindestens einem Virusinaktivierungs- oder -entfernungsschritt, dadurch Herstellung einer wässrigen Faktor H-Zusammensetzung.

[00209] In einer bevorzugten Ausführungsform werden wässrige Zusammensetzungen von Faktor H bereitgestellt, die aus einem Fraktion I-Präzipitat hergestellt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Faktor H-Zusammensetzung bereitgestellt, die mit einem Verfahren hergestellt wird, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Ausfällen von Proteinen aus einer kryoarmen Plasmafraktion in einem ersten Präzipitationsschritt mit etwa 6 % bis etwa 10 % Alkohol bei einem pH zwischen etwa 7,0 und etwa 7,5, um ein erstes Präzipitat und einen ersten Überstand zu erhalten; und (b) Extrahieren von Faktor H aus dem Präzipitat mit einem Faktor H-Extraktionspuffer, dadurch Herstellen einer wässrigen Faktor HZusammensetzung.

[00210] In bestimmten Ausführungsformen wird Faktor H aus dem Fraktion I-Präzipitat durch Umwälzen eines Extraktionspuffers durch eine Filterpresse extrahiert, die das Fraktion IPräzipitat enthält. Im allgemeinen wird der Extraktionspuffer durch das Präzipitat für etwa 5 Minuten bis 2 Stunden umgewälzt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Extraktionspuffer durch das Präzipitat für etwa 10 bis 60 Minuten umgewälzt. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Extraktionspuffer durch das Präzipitat für etwa 20 bis 40 Minuten umgewälzt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Extraktionspuffer durch das Präzipitat für etwa 30 Minuten umgewälzt. In anderen Ausführungsformen wird der Extraktionspuffer durch das Präzipitat für mindestens etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120 oder mehr Minuten umgewälzt.

[00211] In bestimmten Ausführungsformen wird Faktor H aus dem Fraktion I-Präzipitat oder Fraktion Il+lII-Filterkuchen durch Zusetzen eines Faktor H-Extraktionspuffers extrahiert, der zum Wiedersuspendieren des Fraktion I-Präzipitats mit einem Verhältnis von 1 Teil Präzipitat zu etwa 25 bis 30 Teilen Extraktionspuffer verwendet werden kann. In anderen Ausführungsformen beträgt das Wiedersuspendierungsverhältnis etwa 1:4 bis 1:40 oder zwischen etwa 1:8 und 1:30 oder zwischen etwa 1:10 und 1:20 oder zwischen etwa 1:20 und 1:30 oder zwischen etwa 1:12 und 1:18 oder zwischen etwa 1:13 und 1:17 oder zwischen etwa 1:14 und 1:16. In einer Ausführungsform ist das Wiedersuspendierungsverhältnis etwa 1:25. In einer weiteren Ausführungsform ist das Wiedersuspendierungsverhältnis etwa 1:30. In bestimmten Ausführungsformen kann das Wiedersuspendierungsverhältnis etwa 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40 oder mehr betragen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Faktor H durch Umwälzen des Extraktionspuffers durch ein Filter oder eine Filterpresse extrahiert, die das Fraktion I-Präzipitat oder den Fraktion I l+l IIFilterkuchen enthält.

[00212] In bestimmten Ausführungsformen wird eine wässrige Zusammensetzung von Faktor H bereitgestellt, wobei die Faktor H- Zusammensetzung unter Verwendung eines Reinigungsverfahrens hergestellt wird, das hierin beschrieben wird, wobei das Verfahren das Zusetzen von einer oder mehreren Lösungen umfasst, die anderenfalls in eine Plasmafraktion durch Flüssigkeitszusatz eingeführt werden würde, mit einem Verfahren, das die Lösung am Ort des Hinzufügens fein dispergiert oder schnell dispergiert. Zum Beispiel umfasst in bestimmten Ausführungsformen das Verfahren das Einführen von Alkohol (z.B. Ethanol) in eine Plasmafraktion durch Sprühen. In anderen Ausführungsformen umfassen, ohne Einschränkung, Lösungen, die einer Plasmafraktion durch Sprühen hinzugefügt werden können, eine pH-Wert modifizierende Lösung, eine Lösungsmittellösung, eine Detergenslösung, eine Verdünnungslösung, eine Leitfähigkeit modifizierende Lösung und dergleichen. In einer Ausführungsform wird ein oder mehrere Alkoholpräzipitationsschritte durch Zusetzen von Alkohol zu einer Plasmafraktion durch Sprühen ausgeführt. In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform wird ein oder mehrere pHWert-Einstellungsschritte durch Zusetzen einer pH-Wert modifizierenden Lösung zu einer Plasmafraktion durch Sprühen ausgeführt.

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Patentamt [00213] In bestimmten Ausführungsformen wird eine wässrige Faktor H-Zusammensetzung bereitgestellt, die durch ein Reinigungsverfahren hergestellt wird, welches hierin beschrieben wird, wobei das Verfahren das Einstellen des pH-Wertes einer Plasmafraktion umfasst, die nach und/oder gleichzeitig mit dem Zusetzen des Fällungsmittels (z.B. Alkohol oder Polyethylenglycol) ausgefällt wird. In einigen Ausführungsformen wird für eine Prozessverbesserung gesorgt, bei der der pH-Wert einer Plasmafraktion, die aktiv ausgefällt wird, während der ganzen Präzipitationsinkubation oder des Halteschritts durch kontinuierliche Überwachung und Einstellung des pH-Wertes aufrechterhalten wird. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Einstellen des pH-Wertes durch Sprühzusatz einer pH-Wert modifizierenden Lösung ausgeführt.

[00214] In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung wässrige Faktor HZusammensetzungen bereit, die eine Proteinkonzentration zwischen etwa 10 g/l und 250 g/l umfassen. In bestimmten Ausführungsformen beträgt die Proteinkonzentration der Faktor HZusammensetzung zwischen etwa 50 g/l und 200 g/l oder zwischen etwa 70 g/l und 150 g/l oder zwischen etwa 90 g/l und 120 g/l oder zwischen etwa 30 g/l und 70 g/l oder zwischen etwa 40 g/l und 60 g/l oder eine geeignete Konzentration innerhalb dieser Bereiche, zum Beispiel etwa 10 g/l oder etwa 15 g/l, 20 g/l, 25 g/l, 30 g/l, 35 g/l, 40 g/l, 45 g/l, 50 g/l, 55 g/l, 60 g/l, 65 g/l, 70 g/l, 75 g/l, 80 g/l, 85 g/l, 90 g/l, 95 g/l, 100 g/l, 105 g/l, 110 g/l, 115 g/l, 120 g/l, 125 g/l, 130 g/l, 135 g/l, 140 g/l, 145 g/l, 150 g/l, 155 g/l, 160 g/l, 165 g/l, 170 g/l, 175 g/l, 180 g/l, 185 g/l, 190 g/l, 195 g/l, 200 g/l, 205 g/l, 210 g/l, 215 g/l, 220 g/l, 225 g/l, 230 g/l, 235 g/l, 240 g/l, 245 g/l, 250 g/l oder mehr. In einer bevorzugten Ausführungsform haben Faktor H-Zusammensetzungen, die hohe Proteinkonzentrationen aufweisen, auch einen hohen Reinheitsgrad. In einer Ausführungsform sind mindestens 90 % des Proteins in der Zusammensetzung Faktor H. In einer bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 95 % des Proteins in der Zusammensetzung Faktor H.

[00215] Die Verfahren, die hierin bereitgestellt werden, ermöglichen die Herstellung von Faktor H-Zusammensetzungen, die einen hohen Reinheitsgrad haben. In einer Ausführungsform sind mindestens 90 % des Gesamtproteins in einer Zusammensetzung, die hierin bereitgestellt wird, Faktor H. In einer bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 95 % des Gesamtproteins in einer Zusammensetzung, die hierin bereitgestellt wird, Faktor H. In anderen Ausführungsformen sind mindestens 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5% oder mehr des Gesamtproteins der Zusammensetzung Faktor H. In einer bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 96 % des Gesamtproteins der Zusammensetzung Faktor H. In einer bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 97 % des Gesamtproteins der Zusammensetzung Faktor H. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 98 % des Gesamtproteins der Zusammensetzung Faktor H. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 99 % des Gesamtproteins der Zusammensetzung Faktor H.

B. PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN [00216] In einer Erscheinungsform sorgt die vorliegende Erfindung für pharmazeutische Zusammensetzungen des aus Plasma gewonnenen Faktors H aus Materialien, die anderenfalls während der Herstellung anderer kommerziell wichtiger Blutprodukte durch Plasmafraktionierung verworfen werden. Pharmazeutische Faktor H- Zusammensetzungen, die mit den Verfahren hergestellt werden, welche hierin bereitgestellt werden, haben einen hohen Faktor H- Gehalt und Reinheit. Zum Beispiel können die Faktor H-Zusammensetzungen, die hierin bereitgestellt werden, eine Proteinkonzentration von mindestens etwa 1 % (w/v) und einen Faktor HGehalt von mehr als etwa 90 % Reinheit haben. Diese hochreinen pharmazeutischen Faktor HZusammensetzungen und Formulierungen eignen sich für die therapeutische Verabreichung. In bestimmten Ausführungsformen bestehen die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die hierin bereitgestellt werden, aus wässrigen Formulierungen von Faktor H, die zur therapeutischen Verabreichung formuliert wurden. In anderen Ausführungsformen bestehen die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die hierin bereitgestellt werden, aus lyophilisierten Formulierungen von Faktor H, die für die therapeutische Verabreichung nach Rekontitution mit Wasser zur Injektion (WFI) oder mit einer biologisch kompatiblen Flüssigkeit, z.B. einer Kochsalzlösung

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Patentamt oder gepufferten Lösung, formuliert wurden.

[00217] In einer Ausführungsform werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die hierin bereitgestellt werden, durch Formulieren einer wässrigen Faktor H-Zusammensetzung hergestellt, die unter Verwendung eines Verfahrens, das hierin bereitgestellt wird, isoliert wird. Im allgemeinen umfasst der Herstellungsweg zur formulierten Zusammensetzung mindestens einen, vorzugsweise mindestens zwei, am besten mindestens drei Virusinaktivierungs- oder -entfernungsschritte. Nichteinschränkende Beispiele für Vireninaktivierungs- oder -entfernungsschritte, die bei den Verfahren eingesetzt werden können, welche hierin bereitgestellt werden, umfassen die Detergenzienbehandlung (Horowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21-S28 und Kreil et al., Transfusion 2003 (43):1023-1028), Nanofiltration (Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56)230-236 und Yuasa et al., JGen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021-2024 und Inkubation bei niedrigem pH-Wert und hohen Temperaturen (Kempf et al., Transfusion 1991 (31)423- 427 und Louie et al., Biologicals 1994 (22):13-19).

[00218] In einer Ausführungsform werden pharmazeutische Zusammensetzungen von Faktor H bereitgestellt, die aus einem Fraktion Il+Ill-Filterkuchen hergestellt werden. In einer Ausführungsform wird eine wässrige Zusammensetzung von Faktor H bereitgestellt, die durch ein Verfahren hergestellt wird, welches die folgenden Schritte umfasst: (I) Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion Il+Ill-Filterkuchen, (II) optionales Ausführen eines ersten Präzipitationsschrittes zum Ausfällen von mindestens einer Verunreinigung aus der Faktor H-Zusammensetzung, (III) optionales Ausführen eines zweiten Präzipitationsschrittes, um Faktor H aus der Zusammensetzung auszufällen, (IV) optionales Ausführen von mindestens einem lonenAustauschchromatographieschritt, (V) optionales Ausführen von mindestens einem HeparinAffinitätschromatographieschritt; und (VI) Ausführen von mindestens einem Vireninaktivierungsoder -entfernungsschritt; und (VII) optional Lyophilisieren der Faktor H-Zusammensetzung, dadurch Herstellen einer pharmazeutischen Faktor H-Zusammensetzung.

[00219] In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine pharmazeutische Faktor H-Zusammensetzung bereitgestellt, die mit einem Verfahren hergestellt wird, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Ausfällen von Proteinen aus einer kryoarmen Plasmafraktion in einem ersten Präzipitationsschritt mit etwa 6 % bis etwa 10 % Alkohol bei einem pH zwischen etwa 7,0 und etwa 7,5, um ein erstes Präzipitat und einen ersten Überstand zu erhalten; (b) Ausfällen von Faktor H aus dem ersten Überstand in einem zweiten Präzipitationsschritt mit etwa 20 % bis etwa 25 % Alkohol bei einem pH zwischen etwa 6,7 und etwa 7,3, um ein zweites Präzipitat zu bilden; (c) Wiedersuspendieren des zweiten Präzipitats, um eine Suspension zu bilden; (d) Mischen von fein verteiltem Siliziumdioxid (SiO₂) mit der Suspension aus Schritt (c); (e) Filtern der Suspension mit einer Filterpresse, dadurch Bilden eines Filterkuchens und eines Überstandes; (f) Extrahieren von Faktor H aus dem Filterkuchen mit einem Faktor H-Extraktionspuffer; (g) Ausführen von mindestens einem Vireninaktivierungs- oder -entfernungsschritt; und (h) optional Lyophilisieren der Zusammensetzung und damit Herstellung einer wässrigen Zusammensetzung von Faktor H.

[00220] In bestimmten Ausführungsformen wird Faktor H aus dem Filterkuchen durch Umwälzen eines Extraktionspuffers durch die Filterpresse extrahiert, die den Filterkuchen enthält. Im allgemeinen wird der Extraktionspuffer durch den Filterkuchen für etwa 5 Minuten bis 2 Stunden umgewälzt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Extraktionspuffer durch den Filterkuchen für etwa 10 bis 60 Minuten umgewälzt. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird der Extraktionspuffer durch den Filterkuchen für etwa 20 bis 40 Minuten umgewälzt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Extraktionspuffer durch den Filterkuchen für etwa 30 Minuten umgewälzt. In anderen Ausführungsformen wird der Extraktionspuffer durch den Filterkuchen für mindestens etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120 oder mehr Minuten umgewälzt.

[00221] In einer weiteren Ausführungsform werden, pharmazeutische Zusammensetzungen von Faktor H bereitgestellt, die aus einem Fraktion I-Präzipitat hergestellt werden. In einer Ausführungsform wird eine wässrige Zusammensetzung von Faktor H bereitgestellt, die durch /75

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Patentamt ein Verfahren hergestellt wird, welches die folgenden Schritte umfasst: (I) Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion I-Präzipitat, (II) optionales Ausführen eines ersten Präzipitationsschrittes zum Ausfällen von mindestens einer Verunreinigung aus der Faktor H-Zusammensetzung, (III) optionales Ausführen eines zweiten Präzipitationsschrittes, um Faktor H aus der Zusammensetzung auszufällen, (IV) optionales Ausführen von mindestens einem lonen-Austauschchromatographieschritt, (V) optionales Ausführen von mindestens einem HeparinAffinitätschromatographieschritt; und (VI) Ausführen von mindestens einem Vireninaktivierungsoder -entfernungsschritt; und (VII) optional Lyophilisieren der Faktor H-Zusammensetzung, dadurch Herstellen einer pharmazeutischen Faktor H-Zusammensetzung.

[00222] In einer bevorzugten Ausführungsform werden, pharmazeutische Zusammensetzungen von Faktor H bereitgestellt, die aus einem Fraktion I-Präzipitat hergestellt werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Faktor H-Zusammensetzung bereitgestellt, die mit einem Verfahren hergestellt wird, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Ausfällen von Proteinen aus einer kryoarmen Plasmafraktion in einem ersten Präzipitationsschritt mit etwa 6 % bis etwa 10 % Alkohol bei einem pH zwischen etwa 7,0 und etwa 7,5, um ein erstes Präzipitat und einen ersten Überstand zu erhalten; und (b) Extrahieren von Faktor H aus dem Präzipitat mit einem Faktor H-Extraktionspuffer; und (c) Ausführen von mindestens einem Virusinaktivierungs- oder -entfernungsschritt, dadurch Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung von Faktor H.

[00223] In bestimmten Ausführungsformen wird Faktor H aus dem Fraktion I-Präzipitat durch Umwälzen eines Extraktionspuffers durch eine Filterpresse extrahiert, die das Fraktion IPräzipitat enthält. Im allgemeinen wird der Extraktionspuffer durch das Präzipitat für etwa 5 Minuten bis 2 Stunden umgewälzt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Extraktionspuffer durch das Präzipitat für etwa 10 bis 60 Minuten umgewälzt. In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Extraktionspuffer durch das Präzipitat für etwa 20 bis 40 Minuten umgewälzt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Extraktionspuffer durch das Präzipitat für etwa 30 Minuten umgewälzt. In anderen Ausführungsformen wird der Extraktionspuffer durch das Präzipitat für mindestens etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120 oder mehr Minuten umgewälzt.

[00224] In bestimmten Ausführungsformen wird Faktor H aus einem Fraktion I-Präzipitat oder Fraktion Il+lII-Filterkuchen durch Zusetzen eines Faktor H-Extraktionspuffers extrahiert, der zum Wiedersuspendieren des Fraktion I-Präzipitats oder Fraktion II+Ill-Filterkuchens bei einem Verhältnis von 1 Teil Präzipitat zu etwa 25 bis 30 Teilen Extraktionspuffer verwendet werden kann. In anderen Ausführungsformen beträgt das Wiedersuspendierungsverhältnis etwa 1:4 bis 1:40 oder zwischen etwa 1:8 und 1:30 oder zwischen etwa 1:10 und 1:20 oder zwischen etwa 1:12 und 1:18 oder zwischen etwa 1:13 und 1:17 oder zwischen etwa 1:14 und 1:16. In einer Ausführungsform beträgt das Wiedersuspendierungsverhältnis etwa 1:25. In einer weiteren Ausführungsform beträgt das Wiedersuspendierungsverhältnis etwa 1:30. In bestimmten Ausführungsformen kann das Wiedersuspendierungsverhältnis etwa 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19, 1:20, 1:21, 1:22, 1:23, 1:24, 1:25, 1:26, 1:27, 1:28, 1:29, 1:30, 1:31, 1:32, 1:33, 1:34, 1:35, 1:36, 1:37, 1:38, 1:39, 1:40 oder mehr betragen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Faktor H durch Umwälzen des Extraktionspuffers durch ein Filter oder eine Filterpresse extrahiert, die das Fraktion I-Präzipitat oder den Fraktion ll+llI-Filterkuchen enthält.

[00225] In bestimmten Ausführungsformen wird eine pharmazeutische Zusammensetzung von Faktor H bereitgestellt, wobei die Faktor H-Zusammensetzung unter Verwendung eines Reinigungsverfahrens hergestellt wird, das hierin beschrieben wird, wobei das Verfahren das Zusetzen von einer oder mehreren Lösungen umfasst, die anderenfalls in eine Plasmafraktion durch Flüssigkeitszusatz eingeführt werden würden, mit einem Verfahren, das die Lösung am Ort des Hinzufügens fein dispergiert oder schnell dispergiert. Zum Beispiel umfasst in bestimmten Ausführungsformen das Verfahren das Einführen von Alkohol (z.B. Ethanol) in eine Plasmafraktion durch Sprühen. In anderen Ausführungsformen umfassen, ohne Einschränkung, Lösungen, die einer Plasmafraktion durch Sprühen hinzugefügt werden können, eine pH-Wert modifizierende

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Lösung, eine Lösungsmittellösung, eine Detergenzienlösung, eine Verdünnungslösung, eine Leitfähigkeit modifizierende Lösung und dergleichen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein oder mehrere Alkoholpräzipitationsschritte durch Zusetzen von Alkohol zu einer Plasmafraktion durch Sprühen ausgeführt. In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform wird ein oder mehrere pH-Wert-Einstellungsschritte durch Zusetzen einer pH-Wert modifizierenden Lösung zu einer Plasmafraktion durch Sprühen ausgeführt.

[00226] In bestimmten Ausführungsformen wird eine wässrige Faktor H-Zusammensetzung bereitgestellt, die durch ein Reinigungsverfahren hergestellt wird, welches hierin beschrieben wird, wobei das Verfahren das Einstellen des pH-Wertes einer Plasmafraktion umfasst, die nach und/oder gleichzeitig mit dem Zusetzen des Fällungsmittels (z.B. Alkohol oder Polyethylenglycol) ausgefällt wird. In einigen Ausführungsformen wird für eine Prozessverbesserung gesorgt, bei der der pH-Wert einer Plasmafraktion, die aktiv ausgefällt wird, während der ganzen Präzipitationsinkubation oder des Halteschritts durch kontinuierliche Überwachung und Einstellung des pH-Wertes aufrechterhalten wird. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Einstellen des pH-Wertes durch Sprühzusatz einer pH-Wert modifizierenden Lösung ausgeführt.

[00227] In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Faktor HZusammensetzungen bereit, die eine Proteinkonzentration zwischen etwa 10 g/l und etwa 250 g/l umfassen. In bestimmten Ausführungsformen beträgt die Proteinkonzentration der Faktor HZusammensetzung zwischen etwa 50 g/l und 200 g/l oder zwischen etwa 70 g/l und 150 g/l oder zwischen etwa 90 g/l und 120 g/l oder zwischen etwa 30 g/l und 70 g/l oder zwischen etwa 40 g/l und 60 g/l oder eine geeignete Konzentration innerhalb dieser Bereiche, zum Beispiel etwa 10 g/l oder etwa 15 g/l, 20 g/l, 25 g/l, 30 g/l, 35 g/l, 40 g/l, 45 g/l, 50 g/l, 55 g/l, 60 g/l, 65 g/l, 70 g/l, 75 g/l, 80 g/l, 85 g/l, 90 g/l, 95 g/l, 100 g/l, 105 g/l, 110 g/l, 115 g/l, 120 g/l, 125 g/l, 130 g/l, 135 g/l, 140 g/l, 145 g/l, 150 g/l, 155 g/l, 160 g/l, 165 g/l, 170 g/l, 175 g/l, 180 g/l, 185 g/l, 190 g/l, 195 g/l, 200 g/l, 205 g/l, 210 g/l, 215 g/l, 220 g/l, 225 g/l, 230 g/l, 235 g/l, 240 g/l, 245 g/l, 250 g/l oder mehr. In einer bevorzugten Ausführungsform haben Faktor H-Zusammensetzungen, die hohe Proteinkonzentrationen aufweisen, auch einen hohen Reinheitsgrad. In einer Ausführungsform sind etwa 90 % des Proteins in der Zusammensetzung Faktor H. In einer bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 95 % des Proteins in der Zusammensetzung Faktor H.

[00228] In einer Ausführungsform sind mindestens 90 % des Gesamtproteins in einer Zusammensetzung, die hierin bereitgestellt wird, Faktor H. In einer bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 95 % des Gesamtproteins in einer Zusammensetzung, die hierin bereitgestellt wird, Faktor H. In anderen Ausführungsformen sind mindestens 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5% oder mehr des Gesamtproteins der Zusammensetzung Faktor H. In einer bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 96 % des Gesamtproteins in der Zusammensetzung Faktor H. In einer bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 97 % des Gesamtproteins der Zusammensetzung Faktor H. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 98 % des Gesamtproteins der Zusammensetzung Faktor H. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind mindestens 99 % des Gesamtproteins der Zusammensetzung Faktor H.

[00229] In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Präparation bereit, die als Wirkstoff eine Präparation von Faktor H, wie hierin bereitgestellt, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst. In einer Ausführungsform wird die Faktor HPräparation durch ein Verfahren hergestellt, das folgendes umfasst: (a) Ausführen der CohnFraktionierung, um Fraktion Il+Ill-Präzipitate zu erhalten, und Herstellen einer Suspension der kombinierten Präzipitate, (b) Filtern der wieder suspendierten Fraktion Il+Ill-Präzipitate, um den verworfenen Filterkuchen zu erhalten, der nach der Filtration der Fraktion Il+lII-Suspension zurückbleibt; (c) Extrahieren des Filterkuchens gemäß einem Verfahren, das folgende Schritte umfasst: (I) Auflösen des Filterkuchens in einem geeigneten Puffer von geeigneter lonenstärke über einen Zeitraum, der zum Auflösen des Proteins ausreicht, welches auf dem Filterkuchen liegt; (II) Verdünnen des aufgelösten Proteins mit zusätzlichem Puffer, (III) Entfernen von losem Material aus dem verdünnten Protein, (IV) Reinigen von Faktor H-Protein aus der verdünnten

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Proteinpräparation durch Ultrafiltration des verdünnten Proteins in einem 0,45 pm-Filter, um ein Filtrat zu erzeugen, das den Faktor H enthält; (V) Unterwerfen des Filtrats, das Faktor H enthält, einer Anionen-Austauschchromatographie unter Verwendung eines NaCI-Gradienten (50-500 mM) im laufenden Puffer, um eine gepoolte rohe Faktor H-Fraktion zu erhalten; und (VI) Reinigen von Faktor H aus der rohen Faktor H-Präparation durch Heparin Sepharose™-Chromatographie unter Verwendung eines NaCI-Gradienten (50-500 mM).

[00230] Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die hierin bereitgestellt werden, umfassen normalerweise ein oder mehrere Pufferungsmittel oder pH-Wert stabilisierende Mittel, die sich zur intravenösen, intravitrealen, subkutanen und/oder intramuskulären Verabreichung eignen. Nichteinschränkende Beispiele für Pufferungsmittel, die sich zum Formulieren einer Faktor H-Zusammensetzung, die hierin bereitgestellt wird, eignen, umfassen Glycin, Histidin oder andere Aminosäuren, Salze wie Zitrat, Phosphat, Acetat, Glutamat, Tartrat, Benzoat, Lactat, Gluconat, Malat, Succinat, Format, Propionat, Carbonat oder eine Kombination derselben, die auf einen geeigneten pH-Wert eingestellt ist. Im allgemeinen wird das Pufferungsmittel ausreichen, um einen geeigneten pH-Wert bei der Formulierung über einen erweiterten Zeitabschnitt aufrechtzuerhalten.

[00231] In einigen Ausführungsformen beträgt die Konzentration des Pufferungsmittels in der Formulierung zwischen etwa 5 mM und 500 mM. In bestimmten Ausführungsformen beträgt die Konzentration des Pufferungsmittels in der Formulierung etwa 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM, 175 mM, 200 mM, 225 mM, 250 mM, 275 mM, 300 mM, 325 mM, 350 mM, 375 mM, 400 mM, 425 mM, 450 mM, 475 mM, 500 mM oder mehr.

[00232] In bestimmten Ausführungsformen beträgt der pH-Wert der Formulierung zwischen etwa 4,0 und 8,0.

[00233] In einigen Ausführungsformen können die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die hierin bereitgestellt werden, optional ferner ein Mittel zum Einstellen der Osmolarität der Zusammensetzung umfassen. Nichteinschränkende Beispiele für Osmolaritätsmittel umfassen Mannitol, Sorbitol, Glycerol, Saccharose, Glucose, Dextrose, Lävulose, Fruktose, Laktose, Polyethylenglycole, Phosphate, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kalziumchlorid, Kalziumgluconoglucoheptonat, Dimethylsulfon und dergleichen.

[00234] In einigen Ausführungsformen haben die Formulierungen, die hierin bereitgestellt werden, Osmolaritäten, die mit der physiologischen Osmolarität vergleichbar ist, etwa 285 bis 295 mOsmol/kg (Lacy et al., Drug Information Handbook - Lexi-Comp 1999:1254). In bestimmten Ausführungsformen beträgt die Osmolarität der Formulierung zwischen etwa 200 und 350 mOsmol/kg, vorzugsweise zwischen etwa 240 und 300 mOsmol/kg. In speziellen Ausführungsformen beträgt die Osmolarität der Formulierung etwa 200 mOsmol/kg oder 210 mOsmol/kg, 220 mOsmol/kg, 230 mOsmol/kg, 240 mOsmol/kg, 245 mOsmol/kg, 250 mOsmol/kg, 255 mOsmol/kg, 260 mOsmol/kg, 265 mOsmol/kg, 270 mOsmol/kg, 275 mOsmol/kg, 280 mOsmol/kg, 285 mOsmol/kg, 290 mOsmol/kg, 295 mOsmol/kg, 300 mOsmol/kg, 310 mOsmol/kg, 320 mOsmol/kg, 330 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg, 340 mOsmol/kg oder 350 mOsmol/kg. In noch anderen Ausführungsformen ist die Osmolarität der Formulierung größer, zum Beispiel zwischen etwa 200 und 1000 mOsmol/kg oder etwa 400 mOsmol/kg, 450 mOsmol/kg, 500 mOsmol/kg, 550 mOsmol/kg, 600 mOsmol/kg, 650 mOsmol/kg, 700 mOsmol/kg, 750 mOsmol/kg, 800 mOsmol/kg, 850 mOsmol/kg, 900 mOsmol/kg, 950 mOsmol/kg, 1000 mOsmol/kg oder mehr.

[00235] Die Faktor H-Formulierungen, die hierin bereitgestellt werden, sind in flüssiger Form im allgemeinen über einen längeren Zeitabschnitt stabil. In bestimmten Ausführungsformen sind die Formulierungen für mindestens etwa 3 Monate bei Raumtemperatur oder mindestens etwa 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 Monate oder mehr bei Raumtemperatur stabil. Die Formulierung ist im allgemeinen auch stabil für mindestens etwa 18 Monate unter Kühlbedingungen (normalerweise zwischen etwa 2 °C und etwa 8 °C) oder für

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Patentamt mindestens etwa 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57, 60 Monate oder mehr unter Kühlbedingungen.

[00236] In anderen Ausführungsformen sind Faktor H-Formulierungen, die hierin bereitgestellt werden, in lyophilisierter Form im allgemeinen über einen längeren Zeitabschnitt stabil. In bestimmten Ausführungsformen sind die Formulierungen für mindestens etwa 3 Monate bei Raumtemperatur oder mindestens etwa 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47 oder 48 Monate bei Raumtemperatur stabil. Die Formulierung ist im allgemeinen auch stabil für mindestens etwa 18 Monate unter Kühlbedingungen (normalerweise zwischen etwa 2 °C und etwa 8 °C) oder für mindestens etwa 21, 24, 27, 30, 33, 36, 39, 42, 45, 48, 51, 54, 57 oder 60 Monate unter Kühlbedingungen.

[00237] In einer Erscheinungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auch auf Zusammensetzungen, die Faktor H enthalten, der gemäß der vorliegenden Erfindung gereinigt wurde, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger zur systemischen oder lokalen okulären Verabreichung an ein Säugetier, das diese benötigt. Die Zusammensetzungen können ferner zusätzliche therapeutische Verbindungen umfassen, die bei der Behandlung von AMD anwendbar sind, wie zum Beispiel VEGF-Inhibitoren, Komplementfaktor D-Inhibitor, wie zum Beispiel BCX-1470 und dergleichen. Die therapeutischen Zusammensetzungen werden gemäß den Verfahren formuliert, die im Fachgebiet für den speziellen Verabreichungsweg, der gewünscht wird, bekannt sind.

[00238] Gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Zusammensetzung, die einen Faktor H umfasst, welcher gemäß den Verfahren gereinigt wurde, die hierin beschrieben werden, und ein pharmazeutisch akzeptabler Träger zur systemischen oder lokalen Verabreichung an ein Säugetier verabreicht, das diese benötigt.

[00239] Die Zusammensetzungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verabreicht werden, umfassen eine pharmazeutisch wirksame Menge oder eine therapeutisch wirksame Menge von Faktor H, entweder allein oder in Kombination mit einem anderen therapeutischen Mittel. Wie hierin verwendet, ist eine pharmazeutisch wirksame Menge oder eine therapeutisch wirksame Menge eine Menge von Wirkstoff, die ausreicht, die Komplementaktivierung zu reduzieren und das Fortschreiten der pathologischen Vorgänge in verschiedenen Situationen, wie zum Beispiel AMD, HUS, MPGN und andere, einzuschränken. In einigen Erscheinungsformen wird die therapeutisch wirksame Menge reduziert oder verhindert AMD und/oder den Verlust der Sehschärfe, der mit AMD verbunden ist. Im allgemeinen beträgt für Zusammensetzungen, die systemisch zur Behandlung von AMD verabreicht werden sollen, die Gesamtmenge an Faktor H etwa 0,01-100 mg/kg. Zur lokalen Verabreichung ist die bevorzugte Konzentration von Faktor H in der Zusammensetzung von etwa 0,01 % bis etwa 10 % (w/v).

V. BEHANDLUNGSVERFAHREN [00240] In einer Erscheinungsform sorgt die vorliegende Erfindung für die Behandlung einer Krankheit oder Störung, die mit Faktor H-Dysfunktion oder anomaler Komplementaktivität des Alternativen Weges in einer Person verbunden ist, das diese benötigt, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis einer Faktor H-Zusammensetzung, die aus Materialien hergestellt ist, welche anderenfalls während der Herstellung anderer kommerziell wichtiger Blutprodukte durch Plasmafraktionierung verworfen werden.

[00241] In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zum Behandeln einer Krankheit oder Störung bereitgestellt, die mit einer Faktor H-Dysfunktion oder anomaler Komplementaktivität des Alternativen Weges in einer Person verbunden ist, das diese benötigt, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis einer Faktor H-Zusammensetzung, die aus einem Fraktion ll+lll- Filterkuchen oder einem Fraktion I-Präzipitat hergestellt wurde.

[00242] In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zum Behandeln einer Krankheit oder Störung bereitgestellt, die mit einer Faktor H-Dysfunktion oder anomaler Komplementaktivität

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Patentamt des Alternativen Weges in einer Person verbunden ist, das diese benötigt, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis einer Faktor H-Zusammensetzung, die durch Verfahren hergestellt wird, welches die folgenden Schritte umfasst: (I) Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion ll+lIl-Filterkuchen, (II) optionales Ausführen eines ersten Präzipitationsschrittes zum Ausfällen von mindestens einer Verunreinigung aus der Faktor H- Zusammensetzung, (III) optionales Ausführen eines zweiten Präzipitationsschrittes, um Faktor H aus der Zusammensetzung auszufällen, (IV) optionales Ausführen von mindestens einem lonen-Austauschchromatographieschritt, (V) optionales Ausführen von mindestens einem Heparin-Affinitätschromatographieschritt; und (VI) Ausführen von mindestens einem Vireninaktivierungs- oder -entfernungsschritt; und (VII) optional Lyophilisieren der Faktor H-Zusammensetzung, dadurch Herstellen einer Zusammensetzung von Faktor H, die sich zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit oder Störung eignet, welche mit einer Faktor H-Dysfunktion oder anomaler Komplementaktivität des Alternativen Weges verbunden ist.

[00243] In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Behandeln einer Krankheit oder Störung bereitgestellt, die mit einer Faktor H-Dysfunktion oder anomaler Komplementaktivität des Alternativen Weges in einer Person verbunden ist, das diese benötigt, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis einer Faktor H-Zusammensetzung, die durch Verfahren hergestellt wird, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Ausfällen von Proteinen aus einer kryoarmen Plasmafraktion in einem ersten Präzipitationsschritt mit etwa 6 % bis etwa 10 % Alkohol bei einem pH-Wert zwischen etwa 7,0 und etwa 7,5, um ein erstes Präzipitat und einen ersten Überstand zu erhalten; (b) Ausfällen von Faktor H aus dem ersten Überstand in einem zweiten Präzipitationsschritt mit etwa 20 % bis etwa 25 % Alkohol bei einem pH-Wert zwischen etwa 6,7 und etwa 7,3, um ein zweites Präzipitat zu bilden; (c) Wiedersuspendieren des zweiten Präzipitats, um eine Suspension zu bilden; (d) Mischen von fein verteiltem Siliziumdioxid (SiO₂) mit der Suspension aus Schritt (c); (e) Filtern der Suspension mit einer Filterpresse, dadurch Bilden eines Filterkuchens und eines Überstandes; und (f) Extrahieren von Faktor H aus dem Filterkuchen mit einem Faktor H-Extraktionspuffer; (g) Ausführen von mindestens einem Vireninaktivierungs- oder -entfernungsschritt; und (h) optional Lyophilisieren der Zusammensetzung, dadurch Herstellen einer Zusammensetzung von Faktor H, die sich zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit oder Störung eignet, welche mit einer Faktor H-Dysfunktion oder anomaler Komplementaktivität des Alternativen Weges verbunden ist.

[00244] In einer weiteren Ausführungsform wird ein Verfahren zum Behandeln einer Krankheit oder Störung bereitgestellt, die mit einer Faktor H-Dysfunktion oder anomaler Komplementaktivität des Alternativen Weges in einer Person verbunden ist, das diese benötigt, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis einer Faktor H-Zusammensetzung, die durch Verfahren hergestellt wird, welches die folgenden Schritte umfasst: (I) Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion I-Präzipitat, (II) optionales Ausführen eines ersten Präzipitationsschrittes zum Ausfällen von mindestens einer Verunreinigung aus der Faktor H- Zusammensetzung, (III) optionales Ausführen eines zweiten Präzipitationsschrittes, um Faktor H aus der Zusammensetzung auszufällen, (IV) optionales Ausführen von mindestens einem lonen-Austauschchromatographieschritt, (V) optionales Ausführen von mindestens einem Heparin-Affinitätschromatographieschritt; und (VI) Ausführen von mindestens einem Vireninaktivierungs- oder -entfernungsschritt; und (VII) optional Lyophilisieren der Faktor H-Zusammensetzung, dadurch Herstellen einer Zusammensetzung von Faktor H, die sich zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit oder Störung eignet, welche mit einer Faktor H-Dysfunktion oder anomaler Komplementaktivität des Alternativen Weges verbunden ist.

[00245] In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Behandeln einer Krankheit oder Störung bereitgestellt, die mit einer Faktor H-Dysfunktion oder anomaler Komplementaktivität des Alternativen Weges in einer Person verbunden ist, das diese benötigt, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis einer Faktor H-Zusammensetzung, die durch Verfahren hergestellt wird, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Ausfällen von Proteinen aus einer kryoarmen Plasmafraktion in einem ersten Präzipitationsschritt mit etwa 6 % bis etwa 10 % Alkohol bei einem pH zwischen etwa 7,0 und etwa 7,5, um ein erstes Präzipitat und einen

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Patentamt ersten Überstand zu erhalten; (b) Extrahieren von Faktor H aus dem Präzipitat mit einem Faktor H-Extraktionspuffer, (c) Ausführen von mindestens einem Vireninaktivierungs- oder -entfernungsschritt; und (d) optional Lyophilisieren der Zusammensetzung, dadurch Herstellen einer Zusammensetzung von Faktor H, die sich zur Verwendung bei der Behandlung einer Krankheit oder Störung eignet, welche mit einer Faktor H-Dysfunktion oder anomaler Komplementaktivität des Alternativen Weges verbunden ist.

[00246] In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine therapeutisch wirksame Dosis einer Faktor H-Zusammensetzung bereit, die mit einem Verfahren hergestellt ist, welches hierin offenbart wird, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung einer Krankheit, die mit einer Faktor H-Dysfunktion in einer Person verbunden ist, welche diese benötigt. In einer Ausführungsform wird die Faktor H-Zusammensetzung durch Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion I-Präzipitat hergestellt. In einer weiteren Ausführungsform wird die Faktor HZusammensetzung durch Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion ll+lIl-Filterkuchen hergestellt. In bestimmten Ausführungsformen wird ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit oder Störung, die mit einer Faktor H-Dysfunktion in einer Person verbunden ist, welches diese benötigt, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis einer Faktor H-Zusammensetzung, die hierin bereitgestellt wird, an die Person bereitgestellt. In bestimmten Ausführungsformen wird die Krankheit oder Störung mit einer Faktor H-Dysfunktion aus dem atypischen hämolytischen urämischen Syndrom (aHUS), der altersabhängigen Makuladegeneration (AMD), membranproliferativen Glomerulonephritis Typ II (MPGNII), Myokardinfarkt, Koronare Herzkrankheit / koronare Arterienkrankheit (CAD/CHD) und Alzheimer-Krankheit ausgewählt. In einer speziellen Ausführungsform ist die Krankheit das atypische hämolytische urämische Syndrom (aHUS). In einer weiteren speziellen Ausführungsform ist die Krankheit die altersabhängige Makuladegeneration (AMD). In noch einer weiteren speziellen Ausführungsform ist die Krankheit die membranproliferative Glomerulonephritis Typ II (MPGNII).

[00247] In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine therapeutisch wirksame Dosis einer Faktor H-Zusammensetzung bereit, die mit einem Verfahren hergestellt ist, welches hierin offenbart wird, zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung einer Krankheit, die mit einer anomalen Komplementaktivität des Alternativen Weges in einer Person verbunden ist, welches diese benötigt. In einer Ausführungsform wird die Faktor H-Zusammensetzung durch Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion I-Präzipitat hergestellt. In einer weiteren Ausführungsform wird die Faktor H-Zusammensetzung durch Extrahieren von Faktor H aus einem Fraktion ll+lIl-Filterkuchen hergestellt. In bestimmten Ausführungsformen wird ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit oder Störung, die mit einer anomalen Komplementaktivität des Alternativen Weges in einer Person verbunden ist, welches diese benötigt, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis einer Faktor H-Zusammensetzung, die hierin bereitgestellt wird, an die Person bereitgestellt. In bestimmten Ausführungsformen wird die Krankheit oder Störung, die mit anomaler Komplementaktivität des Alternativen Weges verbunden ist, aus einer Autoimmunkrankheit (wie zum Beispiel rheumatoider Arthritis, IgA-Nephropathie, Asthma, systemischer Lupus erythematodes, Multiple Sklerose, Anti-Phospholipidsyndrom, ANCA-assoziierte Vaskulitis, Pemphigus, Uveitis, Myasthenia gravis, Hashimoto-Thyroiditis), einer Nierenerkrankung (wie zum Beispiel IgA-Nephropathie, hämolytisches urämisches Syndrom, membranproliferative Glomerulonephritis), Asthma, Alzheimer-Krankheit, adulter Makuladegeneration, proximaler nächtlicher Hämoglobinurie, abdominalem Aortenaneurysma, Ischämie-reperfusionsverletzung und Sepsis ausgewählt.

[00248] Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die durch die Erfindung bereitgestellt werden, können allein oder in Verbindung mit anderen therapeutischen Wirkstoffen verabreicht werden. Diese Mittel können als Teil desselben Pharmazeutikums aufgenommen werden.

A. VERABREICHUNG [00249] Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Zeit, die zum Abschließen eines Behandlungsverlaufs benötigt wird, von einem Arzt bestimmt werden und kann von nur einem Tag bis zu mehr als einem Monat reichen. In bestimmten Ausführungsformen kann ein Behandlungsver

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Patentamt lauf 1 bis 6 Monate dauern.

[00250] Eine wirksame Menge einer Faktor H-Präparation wird der Person mit einem geeigneten Mittel verabreicht, um die Krankheit oder Störung zu behandeln. Zum Beispiel kann Faktor H in bestimmten Ausführungsformen durch intravenöse, intraokuläre, subkutane und/oder intramuskuläre Mittel verabreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zum Behandeln der altersabhängigen Makuladegeneration in einer Person bereitgestellt, die dieses benötigt, welches die intraokuläre Verabreichung einer Faktor H-Zusammensetzung an den Patienten umfasst.

[00251] In bestimmten Ausführungsformen können die Faktor H- Zusammensetzungen, die hierin bereitgestellt werden, entweder systemisch oder lokal verabreicht werden. Die systemische Verabreichung umfasst: oral, transdermal, subdermal, intraperitoneal, subkutan, transnasal, sublingual oder rektal. Der am stärksten bevorzugte Verabreichungsweg ist oral. Die lokale Verabreichung für die okuläre Verabreichung umfasst: topisch, intravitreal, periokulär, transskleral, retrobulbär, juxtaskleral, über Sub-Tenon oder über eine intraokuläre Vorrichtung. Bevorzugte Verfahren für die lokale Zufuhr umfassen die transsklerale Zufuhr zur Makula durch posteriore juxtasklerale Verabreichung, über intravitreale Injektion oder über Kanüle, wie zum Beispiel der im US-Patent Nr. 6,413,245 beschriebenen. Alternativ können die Inhibitoren über eine Vorrichtung zur fortwährenden Zufuhr zugeführt werden, die intravitreal oder transskleral implantiert wird, oder durch andere bekannte Mittel zur lokalen okulären Zufuhr zugeführt werden.

[00252] In bestimmten Ausführungsformen betrifft der Begriff wirksame Menge eine Menge einer Faktor H-Präparation, die zu einer Verbesserung oder Heilung der Krankheit oder Störung in der Person führt. Eine wirksame Menge, die der Person verabreicht werden soll, kann von einem Arzt unter Berücksichtigung individueller Unterschiede in Alter, Gewicht, der Krankheit oder Störung, die behandelt wird, Schwere der Krankheit und Ansprechen auf die Therapie bestimmt werden. In bestimmten Ausführungsformen kann eine Faktor H-Präparation einer Person mit einer Dosis zwischen etwa 5 mg/Kilogramm und 2000 mg/kg pro Verabreichung verabreicht werden. In bestimmten Ausführungsformen kann die Dosis mindestens etwa 5 mg/kg oder mindestens etwa 10 mg/kg oder mindestens etwa 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 50 mg/kg, 60 mg/kg, 70 mg/kg, 80 mg/kg, 90 mg/kg, 100 mg/kg, 125 mg/kg, 150 mg/kg, 175 mg/kg, 200 mg/kg, 250 mg/kg, 300 mg/kg, 350 mg/kg, 400 mg/kg, 450 mg/kg, 500 mg/kg, 550 mg/kg, 600 mg/kg, 650 mg/kg, 700 mg/kg, 750 mg/kg, 800 mg/kg, 850 mg/kg, 900 mg/kg, 950 mg/kg, 1000 mg/kg, 1100 mg/kg, 1200 mg/kg, 1300 mg/kg, 1400 mg/kg, 1500 mg/kg, 1600 mg/kg, 1700 mg/kg, 1800 mg/kg, 1900 mg/kg, oder 2000 mg/kg betragen. Die Dosierung und Häufigkeit der Faktor H-Behandlung hängen neben anderen Faktoren von der Krankheit oder Störung, die behandelt wird, und der Schwere der Krankheit oder Störung im Patienten ab.

B. ALTERSABHÄNGIGE MAKULADEGENERATION [00253] In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Behandeln der altersabhängigen Makuladegeneration in einer Person, die dieses benötigt, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis einer Faktor H-Zusammensetzung, die hierin bereitgestellt wird, an eine Person bereit.

[00254] Die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Ursache der Blindheit für ältere Menschen mit einem Alter von mehr als 60 Jahren. Es wird geschätzt, dass heute 3540 % derjenigen Personen über 75 Jahren einen gewissen Grad von AMD aufweisen. Es ist geschätzt worden, dass ca. 50 Millionen Menschen weltweit betroffen sind, allein in den USA 10 Millionen. Gegenwärtig werden etwa 155.000 Diagnosen von AMD jedes Jahr neu gestellt. Da die weltweite Bevölkerung weiter altert, wird erwartet, dass die Zahl der jährlichen Diagnosen sich bis zum Jahr 2020 verdreifacht. Es ist eine folgenschwere Krankheit, die das zentrale Sehvermögen bei den betroffenen Personen zerstört, ihnen ihre Fähigkeit raubt, Tätigkeiten auszuführen, die für das tägliche Leben notwendig sind, wie zum Beispiel Lesen und Auto fahren.

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Patentamt [00255] AMD ist eine langsam fortschreitende Krankheit, die Zellen der äußeren Netzhautschichten (einschließlich Fotorezeptoren und der retinalen Pigmentepithelzellen (RPE-Zellen), die die Fotorezeptoren stützen) sowie Zellen in der benachbarten vaskulären Schicht des Auges betreffen, die als Choroidea bekannt ist. Die Makuladegeneration wird durch den Ausfall der Makula gekennzeichnet, die ein kleiner Teil der zentralen Retina ist (etwa 2 mm im Durchmesser), welcher für das scharfe Sehen verantwortlich ist. Die spät einsetzende Makuladegeneration (d.h. AMD) wird im allgemeinen entweder als trocken oder feucht definiert. Die feuchte (exsudative) neovaskuläre Form von AMD betrifft ca. 10 % der Personen mit der Krankheit und ist durch anomale Blutgefäße gekennzeichnet, die aus der Lamina choroidocapillaris durch die RPE wachsen, was normalerweise zu Blutung, Exsudation,Narbenbildung und/oder seröser Netzhautablösung führt. Ca. 90 % der Patienten mit AMD haben die nicht-neovaskuläre oder trockene Form der Krankheit, die durch Atrophie der RPE und Verlust der Fotorezeptoren der Makula gekennzeichnet ist.

[00256] AMD ist durch das Vorhandensein von Ablagerungen von trümmerähnlichem Material gekennzeichnet, das Drusen genannt wird, die sich auf der Bruch-Membran ansammeln, einem mehrschichtigen Verbund, der die RPE (die äußerste Schicht der Retina) von der darunter liegenden Choroidea trennt. Drusen können durch funduskopische Augenuntersuchung festgestellt werden. Diese Ablagerungen sind in mikroskopischen Untersuchungen von Spenderaugen der Patienten mit AMD umfangreich charakterisiert worden. Die Ablagerungen, die im lebenden Auge bei klinischer Untersuchung festgestellt werden, werden in weiche Drusen oder harte Drusen eingeteilt, je nach mehreren Kriterien, einschließlich relativer Größe, Häufigkeit und Form der Ablagerungen. Histochemische und immunzytochemische Untersuchungen haben gezeigt, dass Drusen eine Reihe von Lipiden, Polysacchariden, Glykosaminoglykanen und Proteinen enthalten.

[00257] Gegenwärtig gibt es kein bekanntes Heilmittel für AMD, obwohl gezeigt wurde, dass mehrere Arten von Behandlungen bei der Bekämpfung der Krankheit wirksam sind. Die Laserkoagulation anomaler Gefäße in der feuchten Form der Krankheit ist die Standardbehandlung. Diese Behandlung wird durch die Tatsache eingeschränkt, dass nur gut abgegrenzte neovaskuläre Läsionen auf diese Weise behandelt werden können und dass 50 % der Patienten ein Rezidiv des Auslaufens aus den Gefäßen erleiden (Fine et al., 2000). Wegen der Energie des Lasers, die für diese Behandlung erforderlich ist, sterben die Fotorezeptoren im behandelten Bereich ebenfalls ab, und der Patient erleidet oft eine zentrale Blindheit unmittelbar nach der Behandlung. Schließlich entwickeln sich neue neovaskuläre Läsionen, die wiederholte Behandlungen erfordern. Andere Eingriffe umfassen Änderungen der Lebensweise durch Aufhören mit dem Rauchen und Beginnen der Therapie mit Antioxidantien. Antiangiogene Behandlungen, die VEGF-Inhibitoren verwenden, z.B. intravitreale Injektion von Ranibizumab oder Bevacizumab, sind ebenfalls vorgeschlagen worden.

[00258] Kürzlich wurde entdeckt, dass etwa 35 % der Personen einen risikobehafteten Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) in einer oder beiden Kopien ihres Faktor H-Gens tragen. Homozygote Personen haben ca. siebenfach erhöhte Wahrscheinlichkeit, eine altersabhängige Makuladegeneration zu entwickeln, während Heterozygote eine zwei- bis dreifach erhöhte Wahrscheinlichkeit haben, die Krankheit zu entwickeln. Dieser SNP, der sich im CCP-Modul 7 von Faktor H befindet, beeinträchtigt nachgewiesenermaßen die Wechselwirkungen zwischen Faktor H und sowohl dem C-reaktiven Protein wie auch Heparin, was eine kausale Beziehung zwischen dem SNP und der Krankheit anzeigt. Der Polymorphismus ist ein Y420H-Polymorphismus.

[00259] In einer Erscheinungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Begrenzen der Komplementaktivierung bereit, was zu einem verzögerten Fortschreiten oder Einsetzen der Entwicklung der altersabhängigen Makuladegeneration in einer Person führt; es umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer Faktor H-Präparation, die hierin bereitgestellt wird. In einer Ausführungsform wird die Faktor H-Präparation durch ein Verfahren hergestellt, das folgendes umfasst: (a) Ausführen der Cohn-Fraktionierung, um Fraktion Il+IllPräzipitate zu erhalten, und Herstellen einer Suspension der kombinierten Präzipitate, (b) Filtern

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Patentamt der neu suspendierten Fraktion II+Ill-Präzipitate, um den verworfenen Filterkuchen zu erhalten, der nach der Filtration der Fraktion Il+Ill-Suspension zurückbleibt; (c) Extrahieren des Filterkuchens gemäß einem Verfahren, das folgende Schritte umfasst: (I) Auflösen des Filterkuchens in einem geeigneten Puffer von geeigneter lonenstärke über einen Zeitraum, der zum Auflösen des Proteins ausreicht, welches auf dem Filterkuchen liegt; (II) Verdünnen des aufgelösten Proteins mit zusätzlichem Puffer, (III) Entfernen von losem Material aus dem verdünnten Protein, (IV) Reinigen von Faktor H-Protein aus der verdünnten Proteinpräparation durch Ultrafiltration des verdünnten Proteins in einem 0,45 pm-Filter, um ein Filtrat zu erzeugen, das den Faktor H enthält; (V) Unterwerfen des Filtrats, das Faktor H enthält, einer Anionen-Austauschchromatographie unter Verwendung eines NaCI-Gradienten (50-500 mM) im laufenden Puffer, um eine gepoolte rohe Faktor H-Fraktion zu erhalten; und (VI) Reinigen von Faktor H aus der rohen Faktor H-Präparation durch Heparin Sepharose™-Chromatographie unter Verwendung eines NaCI-Gradienten (50-500 mM).

[00260] In einer Ausführungsform eines Verfahrens zum Begrenzen der Komplementaktivierung, das zum verzögerten Fortschreiten oder Einsetzen der Entwicklung einer altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) in einer Person führt, hat die Person keine Symptome der AMD.

[00261] In einerweiteren Ausführungsform eines Verfahrens zum Begrenzen der Komplementaktivierung, das zum verzögerten Fortschreiten oder Einsetzen der Entwicklung einer altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) in einer Person führt, hat die Person Drusen.

[00262] In einer weiteren Ausführungsform eines Verfahrens zum Begrenzen der Komplementaktivierung, das zum verzögerten Fortschreiten oder Einsetzen der Entwicklung einer altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) in einer Person führt, ist die Person in erhöhter Gefahr, AMD zu entwickeln.

[00263] In einer weiteren Ausführungsform eines Verfahrens zum Begrenzen der Komplementaktivierung, das zum verzögerten Fortschreiten oder Einsetzen der Entwicklung einer altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) in einer Person führt, erfolgt die Verabreichung intravenös.

[00264] In einer weiteren Ausführungsform eines Verfahrens zum Begrenzen der Komplementaktivierung, die zu einem verzögerten Fortschreiten oder Einsetzen der Entwicklung einer altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) in einer Person führt, umfasst das Verfahren das Behandeln einer Person, die Anzeichen und/oder Symptome von AMD hat.

[00265] In einer weiteren Ausführungsform eines Verfahrens zum Begrenzen der Komplementaktivierung, das zum verzögerten Fortschreiten oder Einsetzen der Entwicklung einer altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) in einer Person führt, bei der AMD diagnostiziert wurde.

[00266] In einer weiteren Erscheinungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung eines Menschen bereit, der als in Gefahr befindlich angesehen wird, altersabhängige Makuladegeneration zu entwickeln; es umfasst den Schritt des Verabreichens einer prophylaktisch oder therapeutisch wirksamen Menge einer Faktor H-Präparation, die hierin bereitgestellt wird, und des regelmäßigen Wiederholens der Verabreichung. In einer Ausführungsform wird die Faktor H-Präparation durch ein Verfahren hergestellt, das folgendes umfasst: (a) Ausführen der Cohn-Fraktionierung, um Fraktion II+Ill-Präzipitate zu erhalten, und Herstellen einer Suspension der kombinierten Präzipitate, (b) Filtern der neu suspendierten Fraktion II+IllPräzipitate, um den verworfenen Filterkuchen zu erhalten, der nach der Filtration der Fraktion Il+Ill-Suspension zurückbleibt; (c) Extrahieren des Filterkuchens gemäß einem Verfahren, das folgende Schritte umfasst: (I) Auflösen des Filterkuchens in einem geeigneten Puffer von geeigneter lonenstärke über einen Zeitraum, der zum Auflösen des Proteins ausreicht, welches auf dem Filterkuchen liegt; (II) Verdünnen des aufgelösten Proteins mit zusätzlichem Puffer, (III) Entfernen von losem Material aus dem verdünnten Protein, (IV) Reinigen von Faktor H-Protein aus der verdünnten Proteinpräparation durch Ultrafiltration des verdünnten Proteins in einem 0,45 pm-Filter, um ein Filtrat zu erzeugen, das den Faktor H enthält; (V) Unterwerfen des Filt

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Patentamt rats, das Faktor H enthält, einer Anionen-Austauschchromatographie unter Verwendung eines NaCI-Gradienten (50-500 mM) im laufenden Puffer, um eine gepoolte rohe Faktor H-Fraktion zu erhalten; und (VI) Reinigen von Faktor H aus der rohen Faktor H-Präparation durch Heparin Sepharose™-Chromatographie unter Verwendung eines NaCI-Gradienten (50-500 mM).

[00267] In einer Ausführungsform eines Verfahrens zum Behandeln eines Menschen, der als in Gefahr befindlich angesehen wird, altersabhängige Makuladegeneration zu entwickeln, wird die Verabreichung über einen Zeitraum wiederholt, der für die Verzögerung des Fortschreitens oder Einsetzens der Entwicklung einer altersabhängigen Makuladegeneration in der Person wirksam ist.

[00268] In einerweiteren Ausführungsform eines Verfahrens zum Behandeln eines Menschen, der als in Gefahr befindlich angesehen wird, altersabhängige Makuladegeneration zu entwickeln, wird der Mensch als in Gefahr befindlich angesehen, altersabhängige Makuladegeneration zu entwickeln, wie dies aus dem Vorhandensein von einem oder mehreren genetischen Markern festgestellt wird, die mit der Entwicklung einer altersabhängigen Makuladegeneration verbunden sind.

[00269] In einerweiteren Ausführungsform eines Verfahrens zum Behandeln eines Menschen, der als in Gefahr befindlich angesehen wird, altersabhängige Makuladegeneration zu entwickeln, ist der genetische Marker ein Polymorphismus.

[00270] In einer weiteren Ausführungsform eines Verfahrens zum Begrenzen der Komplementaktivierung, das zum verzögerten Fortschreiten oder Einsetzen der Entwicklung einer altersabhängigen Makuladegeneration (AMD) in einer Person führt, wird bei der Person keine AMD diagnostiziert.

VI. BEISPIELE [00271] Die folgenden Beispiele werden nur zur Erläuterung und nicht zur Einschränkung angeführt. Fachleute auf diesem Gebiet werden ohne weiteres eine Reihe von nicht kritischen Parametern erkennen, die geändert oder modifiziert werden könnten, um im wesentlichen dieselben oder ähnliche Resultate zu erreichen.

BEISPIEL 1 [00272] Um ein wirtschaftlich vorteilhaftes System für die Herstellung von Faktor H aus einer Plasmaprobe zu bestimmen, das die Gewinnung von zusätzlichen Blutfaktoren aus derselben Plasmaprobe ermöglicht, wurden 3000 I von gepooltem menschlichem Plasma einer industriellen Fraktionierung gemäß dem Schema unterzogen, das im Flussdiagramm in Figur 1 umrissen ist. Die Veränderung von Faktor H im industriellen Fraktionierungsprozess wurde mittels ELISA unter Verwendung eines Antikörpers verfolgt, der spezifisch für die Variante von Faktor H mit voller Länge ist. Die Menge an Faktor H, die entsprechend der Bestimmung in jeder Fraktion vorhanden ist, wird in Tabelle 1 angegeben und wird zusammengefasst grafisch in Figur 4 dargestellt.

Tabelle 1. Relative Mengen von Faktor H, die in jeder der Hauptfraktionen einer industriellen Plasmafraktionierung gefunden werden.

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Fraktion	Flüssig keit	Feststoff	Protein	Faktor H		Präz. % Protein	Gesamt Faktor H
L	kg	mg/mL	pg/mL	% von gesamt	Gew/GewKorrek tur*	kg
CohnPool	3210		50,1	663,3	1,323		2,13
Fraktion I Susp.	3480		45,2	592,9	1,312		2,06
Fraktion I Präz.		41,1	4,1	107,7	2,602	0,17	0,18
Fraktion II + III Susp.	3880				0,004	β
Fraktion II + III Präz.		124,5	21,2	689	3,257	0,43	1,74
Filtrat (nach Aerosil®)	2340				0,02
Präz. G		58,6			0,053
Präz. G Susp.	3140				0,008
Fraktion IV-1 Susp.	3800				0,001
Fraktion IV-1 Präz.	Ml	76,8			0,031
Fraktion IV-4 Susp.	5990				0
Fraktion IV-4					0
Präz.
Roh V Präz.		229,4			0,002

* - Bestimmt durch Gefriertrocknen [00273] Wie in Tabelle 1 zu sehen ist, enthielt der 3210 I- Cohn-Pool von gepooltem menschlichem Plasma, das verwendet wurde, etwa 2,13 kg Faktor H, wie durch einen ELISA-Test festgestellt. Der größte Teil von Faktor H ist im Fraktion ll+lll- Präzipitat (1,74 kg) enthalten; unbedeutende Mengen werden jedoch im geklärten Fraktion Il+llI-Filtrat gefunden, d.h. nach Präzipitatauflösung und AerosilO-Behandlung. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass ein großer Teil des Faktors H, der im Cohn-Pool-Ausgangsmaterial vorhanden ist, sich im Fraktion ll+lllFilterkuchen sammelt. Eine zweite bedeutende Fraktion von Faktor H (180 g) findet sich auch im Fraktion I-Präzipitat, wie in Tabelle 1 zu erkennen ist.

BEISPIEL 2 [00274] Das aktuelle Beispiel beschreibt Experimente, die ausgeführt wurden, um die Machbarkeit des Extrahierens von Faktor H aus einem Fraktion Il+lII-Filterkuchen zu bestimmen. Kurz gesagt, wurde der Fraktion Il+llI-Filterkuchen aus der Plasmafraktionierung, die in Beispiel 1 ausgeführt wurde, in Faktor H-Extraktionspuffer (25 mM Tris (pH 8,0); 5 mM EDTA; 200 mM NaCI) bei einem Verhältnis von 25:1 (ml Puffer pro g Filterkuchen) aufgelöst. Die Leitfähigkeit der sich ergebenden Suspension wurde dann durch Verdünnen der Lösung 3:1 mit einem salzarmen Extraktionspuffer (25 mM Tris (pH 8,0); 5 mM EDTA) eingestellt. Unaufgelöstes Material

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Patentamt wurde aus der Suspension durch Zentrifugation entfernt, gefolgt von Filtration durch ein 0,45 pm-Filter.

[00275] Die geklärte Filterkuchen-Suspension wurde dann auf eine DEAE Sepharose™Chromatographensäule gebracht, die mit einem salzarmen Puffer (25 mM Tris (pH 8,0); 5 mM EDTA; 50 mM NaCI) abgeglichen wurde. Dann wurde ein linearer Gradient von 50 mM NaCI bis 500 mM NaCI (25 mM Tris (pH 8,0); 5 mM EDTA; NaCI) zum Eluieren von Faktor H aus der DEAE Sepharose™-Säule verwendet, das Eluat wurde fraktional gesammelt, wie durch das Chromatogramm in Figur 2 gezeigt. Proben der Eluatfraktionen wurden durch SDS-PAGE- und Western Blot-Analyse (Figur 2C) untersucht, um den Faktor H zu bestimmen, der aus der Anionen-Austauschsäule im ersten von drei Hauptpeaks eluiert wurde.

[00276] Der erste Elutionspeak aus der DEAE Sepharose™-Chromatographie-Elution, der in erster Linie Faktor H enthält, wurde auf der Grundlage der Chromatographen- und Gelanalyse, die durchgeführt wurde, gepoolt, konzentriert, und die Leitfähigkeit wurde reduziert. Die Faktor H-Lösung wurde dann auf eine DEAE Sepharose™-Chromatographiesäule gebracht, die mit einem salzarmen Puffer (25 mM Tris (pH 8,0); 5 mM EDTA; 50 mM NaCI) abgeglichen wurde. Dann wurde ein linearer Gradient von 50 mM NaCI bis 500 mM NaCI (25 mM Tris (pH 8,0); 5 mM EDTA; NaCI) zum Eluieren von Faktor H aus der DEAE Sepharose™-Säule verwendet, das Eluat wurde fraktional gesammelt, wie durch das Chromatogramm in Figur 2B gezeigt. Proben der Eluatfraktionen wurden durch SDS-PAGE- und Western Blot-Analyse untersucht. Wie in Figur 2B zu sehen ist, wurde Faktor H aus der Heparin-Sepharose™-Säule in einem einzigen Peak eluiert, was für eine reine Faktor H-Zusammensetzung sorgt (Figur 2D).

BEISPIEL 3 [00277] Das aktuelle Beispiel beschreibt Experimente, die ausgeführt wurden, um die Machbarkeit des Extrahierens von Faktor H aus einem Fraktion I-Präzipitat zu bestimmen. Kurz gesagt, wurde das Fraktion I-Präzipitat aus der Plasmafraktionierung, die in Beispiel 1 ausgeführt wurde, in Faktor H-Extraktionspuffer (25 mM Tris; 5 mM EDTA; 200 mM NaCI; pH 8,0) bei einem Verhältnis von 25:1 (ml Puffer pro g Filterkuchen) aufgelöst. Die Leitfähigkeit der sich ergebenden Suspension wurde dann durch Verdünnen der Lösung 3:1 mit einem salzarmen Extraktionspuffer (25 mM Tris (pH 8,0); 5 mM EDTA) eingestellt. Unaufgelöstes Material wurde aus der Suspension durch Zentrifugation entfernt, gefolgt von Filtration durch ein 0,45 pm-Filter. [00278] Die geklärte Fraktion I-Präzipitat-Suspension wurde dann auf eine DEAE Sepharose™Chromatographensäule gebracht, die mit einem salzarmen Puffer (25 mM Tris (pH 8,0); 5 mM EDTA; 50 mM NaCI) abgeglichen wurde. Dann wurde ein linearer Gradient von 50 mM NaCI bis 500 mM NaCI (25 mM Tris (pH 8,0); 5 mM EDTA; NaCI) zum Eluieren von Faktor H aus der DEAE Sepharose™-Säule verwendet, das Eluat wurde fraktional gesammelt.

[00279] Der Faktor H-Peak aus der DEAE Sepharose™-Chromatographiesäule wurde gepoolt, konzentriert, und die Leitfähigkeit wurde durch Pufferaustausch reduziert. Die Faktor H-Lösung wurde dann auf eine DEAE Sepharose™-Chromatographiesäule gebracht, die mit einem salzarmen Puffer (25 mM Tris (pH 8,0); 5 mM EDTA; 50 mM NaCI) abgeglichen wurde. Dann wurde ein linearer Gradient von 50 mM NaCI bis 500 mM NaCI (25 mM Tris (pH 8,0); 5 mM EDTA; NaCI) zum Eluieren von Faktor H aus der Heparin-Sepharose™-Säule verwendet, das Eluat wurde fraktional gesammelt. Fraktionen, die Faktor H enthielten, wurden dann gepoolt, und die Endzusammensetzung wurde durch SDS-PAGE-Analyse untersucht (Figur 3).

BEISPIEL 4 [00280] Reinheit und Aktivität von Faktor H, der aus den Fraktion I-Präzipitat- (Beispiel 3) und Fraktion Il+Ill-Filterkuchen- (Beispiel 2)-Fraktionen aus der Plasmafraktionierung hergestellt wurde, die in Beispiel 1 ausgeführt wurde, wurden untersucht. Wie aus Figur 3 zu erkennen ist, war Faktor H, der aus dem Fraktion I-Präzipitat (Spur 4) und Fraktion Il+Ill-Filterkuchen (Spur 6) hergestellt wurde, zumindest so rein wie eine kommerzielle Präparation von Faktor H (CompTech; Spur 2).

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Patentamt [00281] Die Aktivität der gereinigten Faktor H-Zusammensetzungen wurde mit zwei Verfahren beurteilt. Zuerst wurde eine Faktor I-Cofaktoraktivität untersucht. C3b und Faktor I, die in der Untersuchung verwendet wurden, wurden kommerziell von Comp-Tech bezogen. Kurz gesagt, wurde C3b mit Faktor I und verschiedenen Konzentrationen von Faktor H kombiniert, der entweder von einer kommerziellen Quelle bezogen (CompTech; u), gereinigt aus Fraktion IPräzipitat (Beispiel 3; s) oder gereinigt aus Fraktion Il+Ill-Filterkuchen gewonnen wurde (Beispiel 2; ). Die Reaktionsprodukte wurden bei 37 °C inkubiert, in Laemmli-Probenpuffer denaturiert und über SDS-PAGE aufgelöst. Die Intensitäten des a40-Fragmentes von C3b wurden durch Densitometrie quantitativ bestimmt, und die resultierenden Aktivitätskurven werden in Figur 6 gezeigt. Wie gezeigt, ist die Aktivität des gereinigten Faktors H, sowohl der aus dem Fraktion I-Präzipitat wie auch der aus dem Fraktion Il+Ill-Filterkuchen gewonnene, mit einer kommerziellen Präparation von Faktor H vergleichbar. In dieser Hinsicht scheinen die Faktor HPräparationen von Beispiel 2 und 3 ähnliche spezifische Aktivitäten wie die kommerzielle Faktor H- Präparation zu haben.

[00282] Zur weiteren Charakterisierung der Aktivität der gereinigten Faktor H-Zusammensetzungen wurde eine zweite Aktivitätsuntersuchung eingesetzt, um die C3- (n) und C5- (u)Konvertasehemmungsaktivität der Präparation zu bestimmen. Kurz gesagt, wurde ein Stimulator des Alternativen Weges (Sepharose 4B) mit heparinisiertem Plasma inkubiert, versetzt mit ansteigenden Mengen der Faktor H-Zusammensetzung, die aus Fraktion Il+Ill-Filterkuchen gereinigt wurde (Beispiel 2). Nach der Inkubation wurde Komplement mit EDTA abgefangen, und die Pegel von C3a und C5a wurden mit ELISA bestimmt. Wie in Figur 5 gezeigt, demonstriert die Faktor H-Präparation aus Fraktion Il+Ill-Filterkuchen eine hemmende Aktivität gegen C3a- und C5a-Konversion.

[00283] Die experimentellen Ergebnisse, die in den Beispielen 1-4 oben angeführt werden, demonstrieren, dass Faktor H sowohl aus Fraktion I-Präzipitat wie auch aus Fraktion Il+IllFilterkuchen gereinigt werden kann, um Faktor H-Zusammensetzungen zu erhalten, die Reinheit und enzymatische Aktivitäten aufweisen, welche mit aktuell erhältlichen kommerziellen Präparationen (CompTech) vergleichbar sind.

BEISPIEL 5 [00284] Da Faktor H aus einem großen Plasmapool gereinigt wurde, enthält diese Präparation viele Varianten (Isoformen), die zur Gesamtaktivität beitragen. Eine unerwartete Entdeckung betrifft den Prozentsatz der His-402-Variante in der Endpräparation von Faktor H, der aus einem Fraktion Il+Ill-Filterkuchen gereinigt wurde, welcher zu ca. 50 % durch LC-MS bestimmt wurde (Tabelle 2). Die Häufigkeit der His-402-Isoform in der allgemeinen Grundgesamtheit liegt nach Angaben im Bereich von 7 % bis 34 % (Grassi et al. Human Mutation (2006) 27:921-925), was darauf hinweist, dass das Verfahren, das oben in den Beispielen 1 - 3 zur Herstellung von Faktor H-Zusammensetzungen verwendet wird, eine ausgeprägte Zahl von Faktor H-Varianten ergibt. Es wurde auch beobachtet, dass Faktor H, der in der oben beschriebenen Weise gereinigt wurde, als zwei sequentielle Peaks eluiert wird (Figur 2). Diese zwei Peaks schienen Unterschiede in ihrer Affinität für Heparin (auf Grund der Differenz in der Elutionszeit im linearen Salzgradienten), aber eine etwas ähnliche Verteilung der Varianten H402 gegenüber Y402 zu haben (wie in Tabelle 2 gezeigt).

Tabelle 2. Relative Mengen der Faktor H-Varianten H402 und Y402, die in einer kommerziellen Präparation (CompTech) und der Fraktion Il+Ill-Filterkuchen-Reinigung von Beispiel 2 festgestellt wurden.

	Kommerzielle Präparation	Faktor H (Peak 1)	Faktor H (Peak 2)
H402	50,0%	49,9%	52,3%
Y402	50,0%	50,1%	47,7%

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BEISPIEL 6 [00285] Um die Bedingungen weiter zu erkunden, unter denen Faktor H aus einem Fraktion Il+lII-Filterkuchen extrahiert werden kann, wurden gepoolte menschliche Plasmaproben fraktioniert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach Suspendierung und Siliziumdioxid- (SiO₂)-Behandlung des Fraktion Il+Ill-Präzipitats wurde der Fraktion Il+lII-Filterkuchen in einer Filterpresse gesammelt, was ihn wirksam von der entsprechenden geklärten Fraktion Il+Ill-Suspension trennt. Der Filterkuchen, der sich immer noch in der Filterpresse befand, wurde zuerst mit einem Faktor H-Extraktionspuffer vorgespült, der unten kurz beschrieben wird, bis der pH-Wert der gespülten Lösung 7,0 erreichte, um restliches Filtrat zu verdrängen und die Filterpresse mit dem geeigneten Extraktionspuffer zu füllen. Das ist ein optionaler Arbeitsgang, um das Filtrat zu gewinnen, das die Faktor H-Ausbeute im Extrakt nicht beeinträchtigt. Faktor H wurde aus dem Filterkuchen durch kontinuierliches Umwälzen von einem von zwei Faktor H-Extraktionspuffern, Extraktionspuffer A (20 mM Tris (pH 8,0); 5 mM EDTA; 200 mM NaCI) oder Extraktionspuffer B (100 mM Natriumphosphat (pH 7.5); 150 mM Natriumchlorid), durch die Filterpresse eine Stunde lang extrahiert.

[00286] Die Analyse der sich ergebenden Fraktion Il+lII-Filterkuchenextrakte zeigte, dass die Extraktion mit Puffer A zur Gewinnung von 0,39 Faktor H/l Plasma führte, und die Untersuchung des Filterkuchens zeigte, dass 0,04 g Faktor H/l Plasma im Filterkuchen nach einer einstündigen Extraktion zurückblieben. Analog führte die Extraktion mit Puffer B zur Gewinnung von 0,44 g Faktor H/l Plasma, und die Untersuchung des Filterkuchens zeigte, dass 0,03 g Faktor H/l Plasma im Filterkuchen nach einer einstündigen Extraktion zurückblieben. Übereinstimmend damit, zeigt die SDS-PAGE-Analyse der extrahierten Fraktion, dass die Verteilung von Proteinen und die relativen Mengen von Faktor H in beiden Extraktionen ähnlich war (Figur 7; Spur 1 = Faktor H- Standard (CompTech); Spur 2 = Standardprotein-MW-Marker; Spur 3 = Puffer AExtrakt; Spur 4 = Puffer B-Extrakt). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine breite Palette von Puffern bei der Extraktion von Faktor H aus einem Fraktion ll+lIl-Filterkuchen wirksam sein kann.

BEISPIEL 7 [00287] Zum Untersuchen der Extraktionszeit, die für die effiziente Gewinnung von Faktor H aus dem Fraktion Il+Ill-Filterkuchen benötigt wird, wurden gepoolte menschliche Plasmaproben fraktioniert, wie in Beispiel 1 beschrieben. Nach Suspendierung und Siliziumdioxid- (SiO₂)Behandlung des Fraktion Il+Ill-Präzipitats wurde der Fraktion Il+Ill-Filterkuchen in einer Filterpresse gesammelt, was ihn wirksam von der entsprechenden geklärten Fraktion Il+lIISuspension trennt. Der Filterkuchen, der sich noch in der Filterpresse befand, wurde zuerst mit einem Faktor H-Extraktionspuffer vorgespült (100 mM Natriumphosphat (pH 7,5); 150 mM Natriumchlorid), bis der pH-Wert der gespülten Lösung 7,0 erreichte. Faktor H wurde dann aus dem Filterkuchen durch kontinuierliches Umwälzen des Faktor H-Extraktionspuffers zwischen 10 und 60 Minuten lang extrahiert. Der Faktor H-Gehalt wurde dann für jede der Extraktionen durch ELISA-Analyse bestimmt. Wie in Figur 8 zu erkennen ist, ist kein signifikanter Unterschied in der Menge von Faktor H, der aus den Filterkuchen extrahiert wurde, für Extraktionszeiten von 10 bis 60 Minuten zu sehen. Nachwaschen der Filterpresse mit einem Hohlvolumen von Extraktionspuffer führte jedoch zu einem Anstieg in der endgültigen Faktor H-Gewinnung aus dem Filterkuchen.

BEISPIEL 8 [00288] Um das Volumen zu reduzieren und potenziell Verunreinigungen aus dem Faktor HExtrakt zu entfernen, der aus dem Fraktion Il+Ill-Filterkuchen gewonnen wurde, wurden Präzipitationsexperimente ausgeführt, um die Bedingungen zu untersuchen, die verwendet werden können. Kurz gesagt, wurde Polyethylenglycol 4000 (PEG 4K) oder Ethanol in wechselnden Konzentrationen Proben eines Faktor H-Filterkuchenextraktes zugesetzt, der wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt wurde, und der pH-Wert der Lösung wurde entweder auf 6,0 oder 8,0 für die Ethanolproben und 7,0 für die PEG-Proben eingestellt. Die Proben, die Ethanol enthiel

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Patentamt ten, wurden dann über Nacht bei -10 °C gerührt, und die Proben, die PEG enthielten, wurden über Nacht bei 4 °C gerührt. Die resultierenden Präzipitate und Überstände wurden dann getrennt und die Präzipitate in Extraktionspuffer aufgelöst. Wie in Tabelle 3 zu sehen ist, blieb mehr Protein im Überstand der 25 %igen Ethanolpräzipitation als in den 12,5 %igen, 17,5 %igen und 20 %igen PEG-Präzipitationen. In Übereinstimmung damit enthielten die aufgelösten PEG-Präzipitate mehr Protein als das Ethanolpräzipitat, was zu trüberen Suspensionen führt, die eine zusätzliche Behandlung vor der weiteren Reinigung von Faktor H durch chromatographische Verfahren erfordern können.

Tabelle 3. Faktor H-Gehalt von Präzipitaten und Überständen, der aus über Nacht ausgeführten Ethanol- und PEG-Präzipitationsexperimenten stammt

Präzipitationsmittel	Protein im Überstand (mg/ml)	Aussehen des Überstandes	Protein im Präzipitat (mg/ml)	Menge des Präzipitats (g/g Filtrat)	Aussehen des aufgelösten Präzipitats
12,5% PEG	1,11 mg/ml	klar	10,0 mg/ml	0,034 g/g Filtrat	sehr trüb
17,5% PEG	0,5 mg/ml	klar	9,3 mg/ml	0,045 g/g Filtrat	sehr trüb
20 % PEG	0,5 mg/ml	klar	9,0 mg/ml	0,048 g/g Filtrat	sehr trüb
25 % Ethanol (pH 7,0)	1,5 mg/ml	trüb	5,3 mg/ml	0,070 g/g Filtrat	leicht trüb

[00289] Der Faktor H-Gehalt jeder Probe wurde dann durch ELISA-Analyse bestimmt, für die Werte in Tabelle 4 angeführt werden. Zur weiteren Analyse der resultierenden Fraktionen wurden Proben von jedem Überstand und aufgelöstes Präzipitat einer SDS- PAGE-Analyse unterzogen (Figur 9). Wie in Tabelle 5 zu sehen ist, ist der Großteil von Faktor H im Überstand der 15 %igen Ethanolpräzipitation vorhanden, die bei pH 8,0 ausgeführt wurde, während Faktor H mit 25 % Ethanol bei einem pH-Wert von 6,0 ausgefällt wird. In einer Ausführungsform kann ein fraktionales Präzipitationsprogramm verwendet werden, wobei einige Verunreinigungen zuerst durch Ausfällen des Faktor H-Extrakts unter Verwendung von 15 % Ethanol entfernt und dann Faktor H in einer zweiten Präzipitation unter Verwendung von 25 % Ethanol zurückgewonnen wird.

Tabelle 4. Faktor H-Gehalt von Präzipitaten und Überständen, der aus über Nacht ausgeführten Ethanol- und PEG-Präzipitationsexperimenten stammt.

Spur Nr. (Figur 9)	Probe	g Faktor H / L Plasma
Spur 1	Größenmarkierung
Spur 2	Faktor H Standard
Spur 3	PEG 10 % Präzipitat aufgelöst	0,38
Spur 4	PEG 10 % Überstand
Spur 5	PEG 12,5 % Präzipitat aufgelöst
Spur 6	PEG 12,5 % Überstand
Spur 7	PEG 17,5 % Präzipitat aufgelöst
Spur 8	PEG 17,5 % Überstand
Spur 9	PEG 20 % Präzipitat aufgelöst
Spur 10	PEG 20 % Überstand
Spur 11	PEG 12,5 % + 0,2 % Tween, Präzipitat aufgelöst
Spur 12	15 % EtOH, pH = 8, Überstand
Spur 13	25 % EtOH, pH = 6, Präzipitat aufgelöst

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Tabelle 5. Veränderung von Faktor H in Ethanolpräzipitationen, die bei 15 % Ethanol / pH 8,0 und 25 % Ethanol / pH 6,0 ausgeführt wurden.

	Ausbeute % von Faktor H in Filterkuchten
Recycelter Filterkuchen (Filterpresse)	100

EtOH Präzipitation 15 % pH = 8,0

EtOH Überstand	89
EtOH Präzipitat aufgelöst	7

EtOH Präzipitation 25 % pH = 6,0

EtOH Überstand	2
EtOH Präzipitat aufgelöst	98

BEISPIEL 9 [00290] Als Hilfe bei der industriellen Umsetzung für die Faktor H-Reinigung nach Extraktion wurde ein anderes Reinigungsprogramm entwickelt, das die Salzgradientenelution der Chromatographiesäulen durch eine Reihe von Stufenelutionen ersetzt, die einem Herstellungsprozess in großem Maßstab besser zugänglich ist. Kurz gesagt, wurde eine Faktor H-Extraktion auf eine DEAE Sepharose™-Chromatographiesäule geladen, die mit einem salzarmen Puffer (25 mM Tris; 5 mM EDTA; 65 mM NaCI; pH 8,0) abgeglichen wurde. Die Leitfähigkeit der Beladung war ähnlich der des Abgleichpuffers (etwa 9 mS/cm). Nach der Beladung wurde die Säule mit Puffer gewaschen, der 65 mM NaCI für 5 Säulenvolumina (CV) enthielt, um die ungebundenen Proteinverunreinigungen zu entfernen. Die Durchflussfraktionen enthalten sehr wenig Faktor H, wie durch die Western Blot-Ergebnisse in Figur 10C gezeigt.

[00291] In einer ersten Stufenelution wurde die Salzkonzentration des Puffers (25 mM Tris (pH 8,0); 5 mM EDTA; 65 mM NaCI) auf 100 mM NaCI (Leitfähigkeit 12,6 mS/cm) für 5 CV erhöht, um Faktor H zu eluieren, der an die Säule gebunden ist. Faktor H verließ die Säule in einem scharfen Peak, gefolgt von einer Schulter, wie in der chromatographischen Aufnahme zu sehen, die in Figur 10A gezeigt wird. Das entsprechende Coomassie-gefärbte SDS-PAGE-Gel (Figur 10B) und Western Blot (Figur 10C) zeigen den Großteil von Faktor H im Peak. Die Analyse weiterer Stufenelutionen, die mit Puffern ausgeführt wurden, welche 155 mM NaCI, 230 mM NaCI und 1 M NaCI enhielten, demonstrieren, dass sehr wenig Faktor H nach der 100 mM NaCI-Elution an das DEAE Sepharose™-Harz gebunden bleibt (Figur 10). Die größeren Faktor H-Fraktionen aus der 100 mM NaCI-Elution wurden zusammen gepoolt.

[00292] Zum Reduzieren der Salzkonzentration der gepoolten Faktor H-Fraktionen wurde die Probe gegen salzarmen Puffer dialysiert, um die Leitfähigkeit auf etwa 8 mS/cm (etwa 50 mM NaCI) zu reduzieren. Die Probe wurde dann durch ein 0,45 pm-Filter geschickt, um alle feinen Teilchen zu entfernen. Die gefilterte Probe wurde dann auf eine DEAE Sepharose™Chromatographiesäule gebracht, die mit einem salzarmen Puffer (25 mM Tris (pH 8,0); 5 mM EDTA; 50 mM NaCI) abgeglichen wurde. Nach der Beladung wurde die Säule mit Puffer gewaschen, der 50 mM NaCI für 5 Säulenvolumina (CV) enthielt, um die ungebundenen Proteinverunreinigungen zu entfernen. Die Durchflussfraktionen enthalten sehr wenig Faktor H, wie durch die Western Blot-Ergebnisse in Figur 11C gezeigt.

[00293] In einer ersten Stufenelution wurde die Salzkonzentration des Puffers (25 mM Tris (pH 8,0); 5 mM EDTA; NaCI) auf 98 mM NaCI erhöht, um Faktor H aus der Säule zu eluieren. SDSPAGE- (Figur 11B) und Western Blot- (Figur 11C)Analyse zeigt, dass der resultierende Faktor H-Pool ganz rein ist. Es gibt einige niedermolekulare Verunreinigungen, die durch einen Größenausschlusspolier- oder äquivalenten Schritt entfernt werden können. Ein zweiter Elutionsschritt wurde mit Puffer ausgeführt, der 204 mM NaCI enthielt, und ein weiterer Faktor H-Peak wurde aus der Säule eluiert. Diese Fraktion hatte keine nachgewiesenen Verunreinigungen. Anschließende Elutionsschritte bei 288 mM und 1 M NaCI zeigten keine zusätzlichen Protein

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Patentamt peaks (Figur 10A), was anzeigt, dass der gesamte Faktor H aus der Säule bei den Elutionsschritten eluiert wurde, die 98 mM und 204 mM NaCI enthalten. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um den Prozess zu optimieren. In einer Ausführungsform kann der gesamte Faktor H in einem einzigen Schritt eluiert werden, zum Beispiel mit einer einzigen Elution mit Puffer, der mehr als 98 mM NaCI enthält. Die Beladung und das Waschen können bei 50 mM NaCI ausgeführt werden, und die Faktor H-Elution kann zum Beispiel mit Puffer ausgeführt werden, der 204 mM NaCI enthält. Eine erweiterte Waschung bei 50 mM NaCI oder bei einer Salzkonzentration von unter 98 mM NaCI kann nach dem Beladen in einem Versuch angehängt werden, mehr schwach gebundene Verunreinigungen aus dem Faktor H-Pool zu entfernen.

[00294] Die obigen Chromatographieschritte können modifiziert werden, um andere Puffersysteme als Tris/EDTA bei pH 8 zu verwenden. Diese Prozesse können an Puffer und Lösungen angepasst werden, die häufig bei der Herstellung von Biopharmazeutika verwendet werden. Ein Beispiel ist ein Reinigungssystem, das Phosphatpuffer bei etwa pH 7,5 verwendet. Der Schlüsselparameter zur erfolgreichen Reinigung ist die Manipulation der Leitfähigkeit oder lonenstärke, um das Abtrennen der gewünschten Verbindung zu erreichen. Wenn der pH-Wert des Puffersystems geändert wird, ist eine gewisse Einstellung der lonenstärke erforderlich, die mit Standardverfahren erfolgen kann, welche bei der Optimierung von chromatographischen Prozessen verwendet werden.

BEISPIEL 10 [00295] Um zu demonstrieren, dass aus Plasma gewonnener Faktor H in vivo wirksam ist, wurde ein Experiment unter Verwendung des Choroidealen Neovaskularisations- (CNV)Modells in Mäusen (einem Modell für AMD beim Menschen) ausgeführt. Menschlicher Faktor H wurde bis zur Homogenität isoliert, wie oben beschrieben (Beispiel 2) und es wurde gezeigt, dass er niedrige Endotoxinpegel hat. CNV wurde durch Laserkoagulation in männlichen C57/B1 Mäusen mit einem Argonlaser (50 μm große Spots, 0,05 s Dauer, 250 mW) induziert, wie beschrieben (N.S.Bora, S. Kaliappan, P. Jha, Q.Xu, B. Sivasankar, C.L.Harris, B.P.Morgan und P.S.Bora. J. Immunol. 178:1783-1790 (2007)).

[00296] Zwei Gruppen von 8 Tieren wurden behandelt, Gruppe I (Kontrollen) erhielt 2 μΙ intravitreale Injektion von PBS innerhalb 1 Stunde nach der Laserbehandlung, während Gruppe 2 (Test) 2 μΙ intravitreale Injektion von menschlichem FH innerhalb 1 Stunde nach Laserbehandlung erhielt. Die Tiere wurden 7 Tage nach der Laserbehandlung geopfert. Vor der Opferung wurden die Mäuse mit 0,5 ml FITC-Dextran (Sigma, Molekulargewicht ca. 2 x 10⁶) durch das Herz perfundiert. Die Augen wurden in normalem gepuffertem Formalin 2 Stunden bei 25 °C fixiert, und der hintere Teil der Augen (mit den Spots) wurde seziert und zusätzlich für Elastin unter Verwendung der Immunhistochemie angefärbt. Primäre polyklonale Ziegen-Antikörper gegen Elastin (C-21, SC-1751, Lot#J0505, Santa Cruz) in Arbeitsverdünnung 1:200 und sekundäre Esel-Antiziegen-Alexia Fluor 594 konjugierte Antikörper (Invitrogen) in Arbeitsverdünnung 1:400 wurden verwendet.

[00297] Proben wurden flach in ProLong Antifade-Reagens (Invitrogen) gehaltert. Konfokale Lasermikroskopie wurde unter Verwendung eines LSM 510 Zeiss-Mikroskops ausgeführt. Es wurden Einzelbilder von CNV in jedem lasergeschädigten Bereich eingefangen, und Stellen mit hämorrhagischen Veränderungen wurden von der Untersuchung ausgeschlossen. Die Fläche von CNV in μm² wurde unter Verwendung des ImageJ-Programms (NIH) gemessen. Die Fläche von Laserspots (interessierende Fläche, AOI) wurde manuell bestimmt, und die Fläche der grünen Fluoreszenz (Schwellwerte 33255) in der interessierenden Fläche wurde gemessen. Der Mittelwert der CNV-Fläche und Standardfehler für jede Gruppe wurde unter Verwendung des EXEL-Programms berechnet.

[00298] Die Ergebnisse dieser Analyse werden unten in Tabelle 6 gezeigt. Die Behandlung der Mäuse mit Faktor H nach Laserablation der Rückseite des Auges reduzierte den Grad der neovaskulären Reaktion, gemessen an Tag 7 nach Behandlung, beträchtlich (p = 0,04).

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Tabelle 6. Effekt von Faktor H auf die Größe von mit FITC-Dextran perfundierten Gefäßen im Murinen CNV-Modell

Gruppe	Anzahl der Spots	CNV-Fläche	Prozent der Kontrolle
1 (PBS)	47	3618±561	-
2 (Faktor H)	43	2298±316	63,5

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Patentamt

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Herstellen einer angereicherten Faktor H- Zusammensetzung aus Plasma, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

(a) Ausfällen von Proteinen aus einer kryoarmen Plasmafraktion in einem ersten Präzipitationsschritt mit 6 % bis 10 % Alkohol bei einem pH-Wert zwischen 7,0 und 7,5, um ein erstes Präzipitat und einen ersten Überstand zu erhalten; und (b) Extrahieren von Faktor H aus dem Präzipitat mit einem Faktor H-Extraktionspuffer, dadurch Herstellen einer angereicherten Faktor H-Zusammensetzung.
2. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner den folgenden Schritt umfasst:

(c) Ausfällen von Verunreinigungen aus der angereicherten Faktor H-Zusammensetzung in einem zweiten Präzipitationsschritt, dadurch Bilden eines Überstandes, der Faktor H enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei Faktor H weiter gereinigt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Schritt des weiteren Reinigens von Faktor H umfasst:

(d) Ausfällen von Faktor H in einem dritten oder vierten Präzipitationsschritt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei Faktor H mit 20 % bis 25 % Alkohol bei einem pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0 ausgefällt ist.
6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei Faktor H weiter gereinigt ist durch:

(e) Binden von Faktor H an ein Anionen-Austauschharz; und (f) Eluieren von Faktor H aus dem Anionen-Austauschharz mit einem Elutionspuffer, dadurch Bilden eines ersten Eluats, das Faktor H enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 6, das ferner die folgenden Schritte umfasst:

(g) Binden von Faktor H aus dem Eluat, welches in Schritt (f) gebildet ist, an ein HeparinAffinitätsharz; und (h) Eluieren von Faktor H aus dem Heparin-Affinitätsharz mit einem Elutionspuffer, dadurch Bilden eines zweiten Eluats, das Faktor H enthält.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei Faktor H weiter aus dem zweiten Eluat gereinigt wird, welches in Schritt (h) gebildet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, wobei Faktor H weiter gereinigt wird durch:

(i) Binden von Verunreinigungen an ein Anionen-Austauschharz unter derartigen Bedingungen, dass Faktor H sich an das Harz bindet und in der Durchflussfraktion gesammelt wird;

(ii) Binden von Faktor H aus der Durchflussfraktion an ein Heparin-Affinitätsharz;

(iii) Eluieren von Faktor H aus dem Heparin-Affinitätsharz, um ein Eluat zu bilden;

(iv) Binden von Faktor H aus dem Eluat an ein Anionen-Austauschharz; und (V) Eluieren von Faktor H aus dem Anionen-Austauschharz, dadurch weiteres Reinigen von Faktor H.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei mindestens einer aus dem ersten Präzipitationsschritt, zweiten Präzipitationsschritt oder dritten Präzipitationsschritt den Sprühzusatz von Alkohol umfasst.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei alle aus dem ersten Präzipitationsschritt, zweiten Präzipitationsschritt und dritten Präzipitationsschritt den Sprühzusatz von Alkohol umfassen.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der pH-Wert der Lösung nach den Zusetzen von Alkohol in mindestens einem aus dem ersten Präzipitationsschritt, zweiten Präzipitationsschritt oder dritten Präzipitationsschritt durch Zusetzen eines pH-Wert modifizierenden Mittels modifiziert ist.

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13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der pH-Wert der Lösung nach den Zusetzen von Alkohol in allen aus dem ersten Präzipitationsschritt, zweiten Präzipitationsschritt oder dritten Präzipitationsschritt durch Zusetzen eines pH-Wert modifizierenden Mittels modifiziert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei das Zusetzen eines pH-Wert modifizierenden Mittels den Sprühzusatz einer pH- Wert modifizierenden Lösung umfasst.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei der pH-Wert eines Präzipitationsschritts vor und nach dem Zusetzen von Alkohol, während und nach dem Zusetzen von Alkohol oder vor, während und nach dem Zusetzen von Alkohol modifiziert wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der pH-Wert eines Präzipitationsschritts für den ganzen Präzipitationsschritt durch kontinuierliches Einstellen des pHWertes aufrechterhalten wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Schritt des Extrahierens von Faktor H aus dem Filterkuchen das Umwälzen eines Faktor H-Extraktionspuffers durch eine Filterpresse, die den Faktor H-Filterkuchen enthält, über mindestens 10 Minuten umfasst.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Faktor H-Extraktionspuffer durch die Filterpresse über mindestens 10 Minuten umgewälzt wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei der Faktor H-Extraktionspuffer einen pH-Wert hat, der sich um mindestens 0,3 Einheiten vom isoelektrischen Punkt von Faktor H unterscheidet.
20. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der zweite Präzipitationsschritt die Präzipitation mit 10 % bis 19 % Alkohol bei einem pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0 umfasst.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die angereicherte Faktor H-Zusammensetzung ferner mindestens einem Vireninaktivierungsschritt unterzogen wird.
22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Vireninaktivierungsschritt die Behandlung mit einem Lösungsmittel und/oder Detergens, Nanofiltration, Wärmebehandlung oder Inkubation bei niedrigem pH-Wert umfasst.