CN113045634B - 一种补体h因子制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种补体H因子制备方法,属于血液制品领域。本发明公开的方法包括,以ATⅢ洗涤洗脱废液为起始原料制备补体H因子。包括使ATⅢ洗涤洗脱废液经过PEG沉淀富集H因子的步骤。本发明公开的技术方案中,PEG沉淀富集H因子的方法不影响后续层析步骤的试验条件,并且通过PEG预先沉淀ATIII洗涤洗脱废液可以去除一部分杂蛋白,因此可以获得纯度更高、稳定性更高的H因子。
Description
技术领域
本发明涉及血液制品技术领域,具体涉及一种补体H因子制备方法。
背景技术
H因子(又称补体H因子,因子H),是一个多结构和多功能的单链蛋白,分子量150kD,是H因子蛋白家族中最具特征性的一员,由20个独立的能折叠的结构域(shortconsensus repeats,SCRs)组成,而每个SCR由大约60个氨基酸组成,形成球状结构,含有四个保守的半胱氨酸残基(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),在Ⅰ~Ⅲ和Ⅱ~Ⅳ间形成二硫键。
H因子作为补体系统的负调控因子之一,在早期的补体活化过程中起重要的调控作用。有研究表明,H因子一方面可作为I因子的共轭辅助因子促进C3b的降解(Complementfactor I:a susceptibility gene for atypical haemolytic uraemicsyndrome.Journal of Medical Genetics(2004).41(6):e84);而另一方面可竞争性同Bb结合至C3b上,抑制C3转化酶(C3bBb)的生成,进而负调控补体系统的活化(Functionaldomains,structural variations and pathogen interactions of MCP,DAF andCR1.Atkinson.2000,49:103-116.)。除此之外,H因子包含多个结合位点的特性决定了它具有补体调控因子之外的功能,如可以作为黏附蛋白,成为细胞整合素受体CR3(CD11b/CD18)的配体,显示趋化活性(补体H因子研究进展,Foreign Medical Sciences Section ofPediatrics.2005.32(3))。
目前的研究揭示,H因子的缺陷与多种疾病的发生以及进程显著相关,比如溶血尿毒综合征(HUS)、膜增殖性肾小球肾炎(MPGN)和年龄相关性黄斑变性(ARMD)等疾病。对由于基因缺陷造成H因子减少或缺失如果施用功能性H因子可能对治疗疾病有帮助,例如:WO2014206414A1公开了H因子还可用于预防或治疗骨丢失和促进间充质细胞分化为成骨细胞;US 9248162公开了H因子还可用于预防或抑制同种异体移植物接受者的同种异体移植物排斥;KR 1020150058836A公开了H因子可用于预防或治疗含有替代途径抑制剂的肾病。尽管临床上对H因子治疗药物需求迫切,但是迄今为止尚未有H因子及其类似物的药物上市。
血浆来源的H因子或包含其的药物组合物被认为可以用作患有H因子缺陷相关疾病的患者的治疗药物;同时人血浆因为含有丰富的H因子常被来制备商业化H因子或H因子组合物。血源补体H因子纯化起始原料通常选自血液或血浆及它们的衍生部分。从血浆及它们的衍生部分分离纯化H因子的工艺陆续被公开,比如US10183976公开了一种从血浆乙醇沉淀组分Ⅰ上清中用乙醇沉淀并富集H因子的方法。US20140275496A1公开了一种从血浆乙醇沉淀组分Ⅰ沉淀中提取并用PEG沉淀的方法富集H因子的方法。US 9109044公开了一种从血浆乙醇沉淀组分沉淀物和/或级分II+III沉淀物中提取并用乙醇沉淀的方法富集H因子的工艺。CN 103153333B公开了一种从血液或血浆辛酸沉淀中纯化H因子的方法。这些方法都有一个共同的特点:改变现有血液制品比如静丙或人血白蛋白的生产工艺,开发适宜H因子生产的工艺路线,这势必对静丙或人血白蛋白的质量或者产率产生影响,进而影响吨血浆收益。血制品企业无动机牺牲高经济价值的静丙或人血白蛋白的收益转而开发H因子,因此现有技术公开的H因子工艺扩大到生产规模较困难。因此,在不显著改变现有血液制品制备工艺的情况下,开发规模化制备H因子的工艺具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种从ATⅢ洗涤洗脱废液中制备补体H因子的方法。
本发明是采用如下方案实现的:
一种补体H因子制备方法,起始原料为ATⅢ洗涤洗脱废液。
上述“ATⅢ洗涤洗脱废液”指直接从血浆中经肝素亲和层析分离纯化ATⅢ浓缩液的过程中产生的洗涤液和/或不收集的洗脱液。
优选的,所述洗涤液是直接从血浆中经肝素亲和层析分离纯化ATⅢ浓缩液的过程中产生的500mM盐洗涤液,优选150-300mM盐洗涤液。
进一步地,所述盐优选NaCl。
优选的,所述不收集的洗脱液是直接从血浆中经肝素亲和层析分离纯化ATⅢ浓缩液的过程中产生的500mM-2M盐洗脱ATⅢ过程中不收集的洗脱液部分。
进一步地,所述盐优选NaCl。
进一步地,所述分离纯化ATⅢ浓缩液的过程包括或不包括阴离子层析吸附丝氨酸酶类凝血因子杂质的步骤。
进一步地,所述补体H因子制备方法包括使ATⅢ洗涤洗脱废液经过一次或多次PEG沉淀富集H因子的步骤。
进一步地,包括使ATⅢ洗涤洗脱废液经过不同浓度的PEG分级沉淀富集H因子的步骤。
优选的,包括:第一沉淀步骤,向含有H因子的ATⅢ洗涤洗脱废液中加入PEG至PEG的终浓度为较低浓度,沉淀后得上清液;第二沉淀步骤,向第一沉淀步骤获得的上清液中加入PEG至PEG的终浓度为较高浓度,所得沉淀即为富含H因子的富集物。
可选的,所述较低浓度为PEG终浓度小于等于7%;所述较高浓度为PEG终浓度大于或等于12%。
优选的,所述较低浓度为PEG终浓度优选小于等于5%,更优选终浓度为3-5%;所述较高浓度为PEG终浓度未12%-20%,更优选12%-17%。
优选的,上述沉淀步骤中,溶液的pH为5.5~6.5,优选pH为5.7~6.0。
在一些具体的实施方式中,第一沉淀步骤中,ATⅢ洗涤洗脱废液中蛋白浓度不低于0.2%,优选蛋白浓度为0.2%-0.8%。
在一些具体的实施方式中,使用的PEG的分子量范围为4000~20000。
更进一步地,还包括以下步骤:将获得的富含H因子的富集物溶解后,通过阳离子层析和/或阴离子层析和/或肝素亲和层析得到纯化补体H因子的步骤。
另一方面,本发明还提供上述补体H因子制备方法在制备低蛋白酶含量的补体H因子中的用途。
再一方面,本发明还提供通过上述补体H因子制备方法制备的H因子产品。
本发明意外发现ATIII洗涤洗脱废液可作为H因子纯化的起始原料,从而在不影响现有血液制品工艺的基础上,为进一步获得H因子产品指明了方向,对于提高吨血浆收益具有重要意义。通常意义上,ATIII洗涤洗脱废液直接按生产废液处理,因此少有厂商关注其附加的经济价值。即使凝胶层析因存在非特异性吸附,理论上推断有少量H因子分布,也因为H因子含量少富集难从而导致从其商业化价值不高。本发明公开了一种简单有效地,并且操作简便的从ATⅢ洗涤洗脱废液中经过一次或多次PEG沉淀富集H因子的方法,使其商业化成为可能。
进一步地,本发明公开的PEG沉淀富集H因子的方法不影响后续层析步骤的试验条件,并且通过PEG预先沉淀ATIII洗涤洗脱废液可以去除一部分杂蛋白,尤其是蛋白水解酶,因此可以获得纯度更高、稳定性更高的H因子。
附图说明
图1是实施例1各富集纯化步骤H因子的分布情况;
图2是实施例1、实施例2制得高纯H因子的SDS-PAFE检测结果;
图3是实施例3~5中补体H因子分布情况;
图4A是实施例6~10中补体H因子分布情况;
图4B是实施例6~10PEG4000沉淀上清SDS-PAGE;
图5是实施例11中补体H因子分布情况;
图6是实施例12中补体H因子分布情况;
图7是实施例13阳离子层析前后补体H因子的分布情况;
图8是实施例14各富集纯化步骤H因子的分布情况。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
人抗凝血酶Ⅲ(AntithrombinⅢ,以下简称“ATⅢ”)具有凝血作用,既可抑制凝血酶,又可抑制因子IXa、Xa、XIa及其它丝氨酸蛋白酶,是参与生理性凝血机制并控制凝血的首要因子,是血液抗凝血系统中的主要成份,占总抗凝活性的60%~70%,其对维持机体正常血液循环,防止血栓发生有重要作用,临床应用深受重视。早在1974年,国外已将ATⅢ作为药物试用于临床,其疗效肯定,且适应症日益增多,主要适用于预防和治疗遗传性和获得性ATⅢ缺失、术后血栓、弥漫性血管内凝血(DIC)、再发性凝血疾病、外伤、肝肾疾病等症。从血浆及它们的衍生部分分离纯化ATⅢ的工艺在上世纪60~70年代即开始有人报道。现有技术公开的ATⅢ纯化工艺起始原料主要以血浆低温乙醇工艺中的组分IV-Ⅰ或直接从血浆中经肝素亲和层析与其他蛋白质分离。国内最早报道制备ATⅢ浓缩物的专家为中国医学科学院输血所的刘文芳教授,她也是采用肝素亲和层系的方法,直接用血浆进行制备,采用巴氏病毒灭活法进行病毒灭活,最终收率大约在13~25%,比活可达7.5IU/mg左右。近十年,血制品企业更倾向于以血浆低温乙醇工艺中的组分IV-Ⅰ为原料分离纯化ATⅢ,如CN103059129B、CN102977207B均以血浆低温乙醇工艺中的组分IV为原料,经过进一步处理然后用肝素亲和层析纯化制备ATⅢ。
如本领域技术人员所知,从血浆中经肝素亲和层析分离纯化ATⅢ,一般采用的工艺路线如下:去冷沉淀的人血浆经阴离子层析吸附丝氨酸酶类凝血因子初步除杂蛋白,收集阴离子层析流穿血浆过肝素亲和层析,经平衡、吸附、洗涤、洗脱等步骤得到ATⅢ浓缩液,进一步经病毒灭活、超滤、纳滤、冻干等工艺步骤制备得到ATⅢ制剂。上述肝素亲和层析的流穿液可进一步进入低温乙醇工艺用于制备静丙、人血白蛋白等产品。一方面,上述肝素亲和层析的流穿液也可以进一步用于制备H因子,但是如背景技术部分所述,这将显著改变现有血液制品比如静丙、人血白蛋白等高价值产品的制备工艺,进而影响吨血浆收益。发明人曾尝试将上述肝素亲和层析的流穿液经离子层析富集H因子,比如XL、SP-650M;或将上述肝素亲和层析的流穿液再经一次肝素亲和层析,比如Heparin6FF进一步富集H因子。多次试验结果显示:大量H因子目标蛋白经流穿丢失,很难通过离子层析或二次肝素亲和层析进一步实现有效富集H因子的目的。另一方面,上述肝素亲和层析通过NaCl分段洗脱或线性洗脱获得纯度提高的ATⅢ洗脱液从而实现ATⅢ的精细纯化。比如先用低浓度NaCl溶液,例如不超过500mM的NaCl溶液洗脱以除去杂质蛋白,再用高浓度NaCl溶液比如2MNaCl溶液洗脱目标蛋白ATⅢ。上述2M NaCl溶液洗脱液(也可称为ATⅢ浓缩液)用于进一步制备ATⅢ蛋白产品,不超过500mM的NaCl溶液洗脱液按生产废液处理。但是发明人意外发现,阴离子层析吸附后的流穿血浆经过肝素亲和层析,获得ATⅢ浓缩液之前的盐洗涤液(通常是500mM NaCl,优选150-300mM NaCl)以及不收集的洗脱液(500mM NaCl-2M NaCl)中分布有一定量的H因子。进一步检测结果显示,其中H因子的蛋白含量约0.501mg/mL(ELISA检测结果,Abcam),约占血浆H因子总量的20%-35%。
在本发明实施例中,“ATⅢ洗涤洗脱废液”指直接从血浆中经肝素亲和层析分离纯化ATⅢ浓缩液的过程中产生的洗涤液和/或不收集的洗脱液。ATⅢ浓缩液的纯化工艺包括或不包括阴离子层析吸附丝氨酸酶类凝血因子杂质的步骤。
进一步研究发现,上述ATⅢ洗涤洗脱废液仍旧无法通过离子层析或二次肝素亲和层析实现富集H因子的目的。经过大量试验摸索和理论研究,发明人发现ATⅢ洗涤洗脱废液无法通过层析方法有效富集的原因在于:一方面因为不同批次、不同研究者试验条件、试验参数和试验习惯等存在非一致性,这些因素综合起来导致ATⅢ洗涤洗脱废液的离子强度、pH和蛋白浓度无法保持一致,另一方面因为ATⅢ洗涤洗脱废液蛋白成分复杂,可能存在一种或一类特定的杂质蛋白,其占位层析介质的H因子结合位点从而导致H因子无法有效吸附。因此,ATⅢ洗涤洗脱废液无法直接通过常规层析方法实现有效富集H因子。
而乙醇浓度、pH、离子强度、蛋白浓度及温度等因素对低温乙醇沉淀结果影响显著,加之不同的研究者获得的ATⅢ洗涤洗脱废液离子强度、pH和蛋白浓度都不同,因此也不宜选用低温乙醇沉淀法富集ATⅢ洗涤洗脱废液中的H因子。
而PEG沉淀法富集ATⅢ洗涤洗脱废液中的H因子的工艺也存在障碍。PEG沉淀虽然受温度、蛋白浓度分子量等因素影响较小,但是必须从最终成品中将其除去,迄今为止还未找到去除PEG的简便方法。PEG分子量虽然比蛋白质小,但卷曲的构型使它具有较大的排阻半径,所以也很难用透析或凝胶过滤等现有方法将其去除。另外,理论上,调控PEG浓度和影响溶液状态的各种因素,可将不同的蛋白质成分分离成若干组分。但是如本领域技术人所知,血浆及其衍生物或血浆的低温乙醇沉淀物及其衍生物成分复杂,且相对蛋白浓度较高,非常容易发生几种蛋白质共沉的现象;加之溶液pH、溶液温度、溶液离子强度、PEG分子量以及PEG浓度等多种因素整体影响PEG分离沉淀效果,因此PEG沉淀法很难获得单一的成分,即使是分级PEG沉淀法。因此仅仅有不多的几种血液制品的制备方法曾有研究者采用了PEG沉淀法,比如Wickerhauser等研究者采用PEG沉淀-亲和层析法大量制备ATⅢ,也有报道用PEG沉淀制备无导致血栓形成副作用的PCC。进一步地,PEG沉淀法分辨率较低,大规模应用作为系统分离多种蛋白质不够成熟;如果应用于本发明“ATⅢ洗涤洗脱废液”中H因子的富集,可能进一步造成H因子收率降低等不期望得到的试验结果,不具备工业应用价值。
经多方论证及试验摸索,发明人尝试将PEG沉淀与层析方法结合起来,在层析步骤前设置PEG沉淀步骤或PEG分级沉淀步骤,预期通过PEG沉淀实现H因子的富集及初步纯化的目的,PEG沉淀处理后的样品再经离子层析或肝素亲和层析进一步吸附H因子以获得纯度显著提高的H因子样品,同时PEG因不带电荷而不被层析介质吸附从而除去。
另发明人感到欣喜的是,ATⅢ洗涤洗脱废液通过低、高浓度的PEG分级沉淀处理后,再经离子层析和./或肝素亲和层析可实现H因子的有效富集,并且通过恰当的试验条件优化,可获得纯度显著提高的H因子浓缩物。
发明人研究发现,在众多影响PEG分级沉淀效果的因素中,PEG的浓度、pH对ATⅢ洗涤洗洗脱废液PEG分级沉淀的效果影响较大。其中,在一些实施例中,PEG的较低终浓度7%,PEG的较高终浓度高于12%。更进一步的,PEG的较低终浓度低于7%,PEG的较高终浓度高于12%。再进一步的,PEG的较低终浓度的范围,可取值3%~5%,PEG的较高终浓度的范围,可以取值12~20%。
pH的范围应控制在5.5-6.5范围内较佳,最佳的范围是5.7-6.5。如果是多步PEG沉淀,每一步待沉淀溶液的pH可以相同,也可以不同。
本领域人员通常认为溶液的介电常数对PEG沉淀作用无显著影响,故PEG沉淀可以盐析、低温乙醇法联合应用而不需要除净其他沉淀剂。但是为了获得更理想的ATⅢ洗涤洗洗脱废液PEG分级沉淀的效果,控制溶液的介电常数也是有益的。同时在PEG沉淀ATⅢ洗涤液的过程中,需要不停的搅拌,以提高H因子的纯化富集效果。每次往ATⅢ洗涤洗脱废液中加入PEG母液额度时间控制在30-120min。
同时,本发明公开的方法PEG的分子量适宜的范围是4000-20000。为了使沉淀效果达到最优,通常选择沉淀作用最强而溶液密度又不太高的分子量,比如PEG4000。分子量小于4000的PEG沉淀作用太弱不建议选择,分子量超过20000的PEG因为不易溶解,也不推荐使用。
本发明公开的PEG分级沉淀法对温度的要求不高,室温操作即可。PEG分级沉淀完成后,进一步完成富集后H因子的沉淀固液分离后,用冷的溶液洗涤沉淀可以进一步地除去沉淀中的PEG。
本发明公开的PEG沉淀法可以在不同的蛋白浓度下进行,优选蛋白浓度在1%(W/V)及以下,优选不低于0.2%(W/V)。优选地,溶液蛋白浓度可选范围为0.2%-0.8%。溶液蛋白浓度高于1%,则极易发生几种蛋白质共沉的现象,溶液蛋白浓度过低,蛋白分子与蛋白分子接触机会减少,影响沉淀效果,因此维持在上述蛋白浓度下是较佳的选择,本领域技术人员可以很容易的测定并调整蛋白的浓度,使其符合上述较佳条件。
为了提高PEG沉淀效果,优选地,应向ATⅢ洗涤洗脱废液中缓慢加入50% PEG母液直至ATⅢ洗涤洗脱废液PEG浓度达到目标终浓度,同时边加入PEG母液溶液边搅拌,该过程控制在30-120min之内较好。
综上所述,本发明首先基于一个意外发现,即ATIII洗涤洗脱废液可作为H因子纯化的原料,从而为在现有血液制品工艺的基础上进一步获得H因子产品指明了方向。在这一发现的基础上,发明人又进一步摸索了优化的制备工艺,比如在层析步骤前设置了PEG沉淀步骤,以及通过不同浓度的PEG分级沉淀获得更纯化的H因子的步骤。通过对PEG分级沉淀条件的摸索,意外获得了一个能实现H因子有效富集且不影响后续层析步骤的试验条件。其中PEG的浓度、pH对沉淀效果也具有作用。PEG分子量在4000-2000的可选范围内,优选沉淀作用最强而溶液密度又不太高分子量,比如PEG4000。PEG分级沉淀试验温度对沉淀效果影响不大。
以下结合实施例的形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
在本发明实施例中,补体H因子富集纯化工艺,其工艺中第一关键因素,是确定血液制品制备工艺中,作为常规废弃的ATIII洗涤洗脱废液,可以获得富含H因子的富集物。
通常来讲,在从血浆中纯化ATⅢ的过程中,包括去除冷沉淀的人血浆层析步骤,其中,具体的方法为,将冷沉淀血浆预过滤后,会经过肝素亲和层析柱中层析,以及平衡、吸附、洗涤、洗脱等步骤得到ATⅢ浓缩液,而在洗脱步骤中也同时得到了ATⅢ洗涤洗脱废液。
如未特殊说明,本发明实施例所采用的ATⅢ洗涤液,即为上述在获得ATⅢ浓缩液过程中收集得到的ATⅢ洗涤洗脱废液。
实施例1
向同一批次获得的ATⅢ洗涤液废液中缓慢加入50% PEG4000母液直至ATⅢ洗涤液溶液PEG4000目标终浓度为14%,边加入PEG母液溶液边搅拌,该过程控制在30-120min之内,且控制溶液的pH为6.0;8000rpm离心取沉淀,即为补体H因子的富集物。
将所得补体H因子的富集物进一步层析纯化。
将所得补体H因子富集物用阳离子层析平衡液进行超滤,所得超滤溶液经阳离子层析SP-650M、阴离子层析XL、肝素亲和层析Heparin6FF制备得到高纯度H因子。并采用UPLC法测定各层析步骤纯化样品H因子含量。
其中,阳离子层析缓冲液如下:
平衡液:20mM柠檬酸三钠,15mM EDTA-2Na,20mM NaCl,pH6.0(电导约为8.00ms/cm)
洗涤液:以平衡液为基础,使用4M NaCl调节电导约为11ms/cm,用0.5M柠檬酸调节pH约为6.0。
洗脱液:以平衡液为基础,使用4M NaCl调节电导约为30ms/cm,用0.5M柠檬酸调节pH约为6.0。
阴离子层析缓冲液组成:
平衡液:20mM Tris-HCl,15mM EDTA-2Na,20mM NaCl,pH8.6。
洗脱液:以平衡液为基础,使用4M NaCl调节电导约为24ms/cm,用0.5M氢氧化钠调节pH约为8.6。
肝素亲和层析缓冲液组成:
平衡液/洗涤液1:20mM柠檬酸三钠,15mM EDTA-2Na,pH6.0(电导约为6.22ms/cm)。
洗涤液1:以平衡液为基础,使用4M NaCl调节电导约为11ms/cm,用0.5M柠檬酸调节pH约为6.0。
洗涤液2:以平衡液为基础,使用4M NaCl调节电导约为20ms/cm,用0.5M柠檬酸调节pH约为6.0。
洗脱液:以平衡液为基础,使用4M NaCl调节电导约为30ms/cm,用0.5M柠檬酸调节pH约为6.0。
图1是实施例1经一步PEG沉淀及多步层析后的H因子分布情况。
从图1可以看出,在ATIII洗涤洗脱废液中,存在大量的H因子,而且经过PEG沉淀和多步层析后可以制备得到纯化的H因子,证明了ATIII洗涤洗脱废液可作为H因子纯化的起始物。
实施例2
进一步的,研究了ATIII洗涤洗脱废液不经PEG沉淀步骤,经层析工艺,补体H因子的富集纯化的制备方法。
如图2所示,SDS-PAGE检测结果表明:ATIII洗涤洗脱废液层析工艺也可以实现H因子的富集纯化。
但是发明人经过比较实施例1和实施例2制备的H因子发现,虽然这两种方法均能获得纯化的H因子,但实施例2的方法获得的H因子降解片段更多,原因在于未经PEG沉淀处理的纯化中间品蛋白水解酶活性较高,可将部分H因子降解成多个片段,而经PEG处理后的纯化中间品的蛋白水解活性显著降低。虽然不经过PEG处理也能得到纯度较高的H因子,但是由于H因子的部分水解产物与H因子分子量类似,因此在终产物中难以去除,而通过SDS-PAGE电泳检测比较难发现水解产物的存在,但其功能性蛋白含量降低,无法得到高品质的产品。
因此,优选的技术方案是ATIII洗涤洗脱废液经过PEG预先沉淀以减少杂蛋白,比如蛋白水解酶等的影响,以利于获得纯度更高、稳定性更高的H因子。
实施例3~10
实施例3~5:分别采用3%、5%、7% PEG4000沉淀ATⅢ洗涤液洗脱废液。
实施例6~10:分别采用12%、13%、15%、17%、20% PEG4000沉淀ATⅢ洗涤液洗脱废液。
实施例3~10的方法为,同一批次获得的ATⅢ洗涤液废液缓慢加入50%PEG4000母液直至ATⅢ洗涤液溶液PEG4000目标终浓度,边加入PEG母液溶液边搅拌,该过程控制在30-120min之内;蔡氏50P滤板深层过滤取滤液备用。SDS-PAGE凝胶电泳检测沉淀和滤液H因子分布情况。
表1实施例3~10PEG沉淀浓度(W/W)
测得实验结果如图3和图4。图3是实施例3~5的SDS-PAGE凝胶电泳检测沉淀和滤液H因子分布情况。图4A为实施例6~10的SDS-PAGE凝胶电泳检测沉淀和滤液H因子分布情况,图4B为实施例6~10PEG4000沉淀上清经丙酮沉淀后的SDS-PAGE凝胶电泳检测结果。
如图3SDS-PAGE凝胶电泳结果显示:当PEG4000浓度在3%-5%时,H因子几乎都存在于上清中;而当PEG4000浓度增加至7%时,大量的H因子存在于上清中,沉淀中存在有少量的H因子。因此,该发现证明可以使用不同浓度的PEG对H因子进行梯度纯化和富集,如用较低浓度的PEG初步纯化H因子,PEG的终浓度可以选择不高于7%,优选范围是3%~5%。
如图4A SDS-PAGE凝胶电泳结果显示:当PEG4000浓度提高至12%及以上,随着PEG浓度的升高,上清中几乎不存在蛋白,血浆蛋白被富集至沉淀中。因此,可用较高浓度的PEG沉淀H因子,如用PEG沉淀富集H因子,PEG的终浓度最好不低于12%,优选范围是12~20%。
如图4B SDS-PAGE凝胶电泳结果显示:高浓度PEG沉淀富集H因子,仍然具有一定的纯化效果。该发现进一步证明可以利用不同浓度PEG对H因子进行梯度纯化和富集,如用较高浓度的PEG初步富集H因子,更优选的范围是12~17%。
当然本领域技术人员可以预期,上述不同浓度的富集和沉淀不限于两步PEG沉淀,还可以多级进行,以获得纯度更高的PEG富集物。
实施例11、实施例12
为了能够使得H因子更好的富集,使用PEG分级沉淀富集H因子的效果更为优秀。以下提供实施例11和实施例12,对PEG分级沉淀富集H因子的步骤加以说明。
实施例11和实施例12的方法为:
第一沉淀步骤,将同一批次获得的ATⅢ洗涤液废液缓慢加入50%PEG4000母液直至ATⅢ洗涤液溶液PEG4000目标终浓度为较低浓度,边加入PEG母液溶液边搅拌,该过程控制在30-120min之内,且控制溶液的pH为6.0;蔡氏50P滤板深层过滤取滤液备用。
第二沉淀步骤:获取第一沉淀步骤得到的滤液,在其中缓慢加入50%PEG4000母液直至溶液PEG4000目标终浓度为较高浓度,边加入PEG母液溶液边搅拌,该过程控制在30-120min之内,且控制溶液的pH为5.8;8000rpm离心取沉淀,即为补体H因子的富集物。
其中,实施例11和实施例12中,所提到的PEG的目标浓度的较低浓度和较高浓度,其浓度含量如表2所示。
表2实施例11~12PEG分级沉淀浓度(W/W)
PEG浓度 | 实施例11 | 实施例12 |
溶液中加入PEG的较低终浓度 | 5% | 3% |
滤液中加入PEG的较高终浓度 | 14% | 17% |
对实施例11获得的沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳和ELISA试剂盒检测PEG分级沉淀H因子分布和含量情况。如图4是实施例11SDS-PAGE凝胶电泳测得H因子分布情况,表3为实施例11PEG分级沉淀前后H因子含量ELISA检测结果。
表3实施例11PEG分级沉淀前后H因子含量ELISA检测结果
对实施例12进行SDS-PAGE凝胶电泳和ELISA试剂盒检测PEG分级沉淀H因子分布和含量情况。如图6为实施例12SDS-PAGE凝胶电泳测得H因子分布情况,表4为实施例12PEG沉淀前后H因子含量ELISA检测结果。
表4实施例12PEG分级沉淀前后H因子含量ELISA检测结果
由表3和表4可以得知,实施例11和实施例12中经过PEG的分级沉淀步骤,H因子的富集回收率高达95%以上。
并且,图5~图6和图1相比,采用两步PEG分级沉淀得到的H因子富集物,其H因子在富集物中的浓度更高,杂质蛋白更少,更有利于进一步的纯化。
实施例13
为了获得纯度更高的H因子,可以将经过PEG分级沉淀后获得的富含H因子的富集物,经生理盐水溶解后,通过阳离子层析平衡液进行超滤,得到超滤液,所述超滤液经阳离子层析,得到纯化补体H因子。实施例13通过对实施例11中获得的富含H因子的富集物进行层析纯化以获得纯度显著提高的H因子。
阳离子层析缓冲液如下:
平衡液:20mM柠檬酸三钠,15mM EDTA-2Na,20mM NaCl,pH6.0(电导约为8.05ms/cm)
洗涤液:以平衡液为基础,使用4M NaCL调节电导约为11ms/cm,用柠檬酸调节pH约为6.0。
洗脱液:以平衡液为基础,使用4M NaCL调节电导约为30ms/cm,用柠檬酸调节pH约为6.0。
如图7,是实施例13阳离子层析SP-650M后补体H因子的分布情况(图7M表示不同分子量的蛋白质Marker。在本说明书中,术语“蛋白质Marker”等同于“蛋白Marker”或“Marker”,表示不同分子量的蛋白质Marker。如未特别说明,本申请实施例中所用Marker分子量大小从上到下,依次是180kDa、130kDa、100kDa、70kDa、55kDa、40kDa、35kDa、25kDa)。
实施例14
进一步的,补体H因子富集纯化工艺,还可以做进一步的工艺优化,即,对富含H因子的富集物,经生理盐水溶解后,通过阳离子层析平衡液进行超滤,得到超滤液,所述超滤液依次经过阳离子层析、阴离子层析、肝素亲和层析,得到高纯补体H因子。以实施例14为例,对上述方案做更进一步的阐述。
将实施例11所得的富含H因子的富集物用阳离子平衡液进行超滤,所得超滤溶液经阳离子层析SP-650M、阴离子层析XL、肝素亲和层析Heparin6FF制备得到高纯度H因子。并采用UPLC法测定各层析步骤纯化样品H因子含量。
其中,阳离子层析缓冲液如下:
平衡液:20mM柠檬酸三钠,15mM EDTA-2Na,20mM NaCl,pH6.0(电导约为8.00ms/cm)
洗涤液:以平衡液为基础,使用4M NaCL调节电导约为11ms/cm,用0.5M柠檬酸调节pH约为6.0。
洗脱液:以平衡液为基础,使用4M NaCL调节电导约为30ms/cm,用0.5M柠檬酸调节pH约为6.0。
阴离子层析缓冲液组成:
平衡液:20mM Tris-HCl,15mM EDTA-2Na,20mM NaCl,pH8.6。
洗脱液:以平衡液为基础,使用4M NaCL调节电导约为24ms/cm,用0.5M氢氧化钠调节pH约为8.6。
肝素亲和层析缓冲液组成:
平衡液/洗涤液1:20mM柠檬酸三钠,15mM EDTA-2Na,pH6.0(电导约为6.22ms/cm)。
洗涤液1:以平衡液为基础,使用4M NaCL调节电导约为11ms/cm,用0.5M柠檬酸调节pH约为6.0。
洗涤液2:以平衡液为基础,使用4M NaCL调节电导约为20ms/cm,用0.5M柠檬酸调节pH约为6.0。
洗脱液:以平衡液为基础,使用4M NaCL调节电导约为30ms/cm,用0.5M柠檬酸调节pH约为6.0。
SDS-PAGE电泳结果(图8)及UPLC测定结果(表5)表明:经PEG分级沉淀的ATIII洗涤液进一步经阳离子层析SP-650M、阴离子层析XL、肝素亲和层析Heparin6FF,可制备得到纯度超过90%的高纯H因子。
表5实施例14UPLC法测定各层析步骤纯化样品H因子纯度(%)
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (7)
1.一种补体H因子制备方法,其特征在于,起始原料为ATⅢ洗涤洗脱废液;
包括使ATⅢ洗涤洗脱废液经过不同浓度的PEG分级沉淀富集H因子的步骤,其步骤包括:
第一沉淀步骤,向含有H因子的ATⅢ洗涤洗脱废液中加入PEG至PEG的终浓度为3%~5%,沉淀后得上清液;
第二沉淀步骤,向第一沉淀步骤获得的上清液中加入PEG至PEG的终浓度为12%~20%,所得沉淀即为富含H因子的富集物;
其中,沉淀步骤中,溶液的pH为5.5~6.5;
使用的PEG的分子量范围为4000~20000;
所述ATⅢ洗涤洗脱废液指直接从血浆中经肝素亲和层析分离纯化ATⅢ浓缩液的过程中产生的洗涤液和/或不收集的洗脱液。
2.根据权利要求1所述的补体H因子制备方法,其特征在于,在第二沉淀步骤中,PEG的终浓度为12%-17%。
3.根据权利要求1所述的补体H因子制备方法,其特征在于,沉淀步骤中,溶液的pH为5.7~6.0。
4.根据权利要求1所述的补体H因子制备方法,其特征在于,第一沉淀步骤中,ATⅢ洗涤洗脱废液中蛋白浓度不低于0.2%。
5.根据权利要求1所述的补体H因子制备方法,其特征在于,第一沉淀步骤中,ATⅢ洗涤洗脱废液中蛋白浓度为0.2%-0.8%。
6.根据权利要求1所述的补体H因子制备方法,其特征在于,还包括以下步骤:将获得的富含H因子的富集物溶解后,通过阳离子层析和/或阴离子层析和/或肝素亲和层析得到纯化补体H因子的步骤。
7.权利要求1~6任一所述的补体H因子制备方法在制备低蛋白酶含量的补体H因子中的用途。
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