WO2011058285A1 - Procede de fabrication d'une preparation de facteur h - Google Patents

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WO2011058285A1
WO2011058285A1 PCT/FR2010/052425 FR2010052425W WO2011058285A1 WO 2011058285 A1 WO2011058285 A1 WO 2011058285A1 FR 2010052425 W FR2010052425 W FR 2010052425W WO 2011058285 A1 WO2011058285 A1 WO 2011058285A1
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WO
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factor
fraction
exchange chromatography
subjecting
chromatography
Prior art date
Application number
PCT/FR2010/052425
Other languages
English (en)
Inventor
Bernadette Cauvin
Chantal Fleurynck
Michel Poulle
Original Assignee
Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies
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Filing date
Publication date
Application filed by Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies filed Critical Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to a method for producing a therapeutically useful Factor H preparation from human blood plasma.
  • Complement plays a vital role in the defense of the body against infectious agents and in the inflammatory process. It represents an auxiliary system of immunity, in particular of the humoral response and the innate response.
  • the complement comprises a set of approximately 30 plasma and sometimes membrane proteins, synthesized essentially by the liver and macrophages and which can be activated by proteolytic cascades. It includes both plasma proteins, many different cell surface receptors, some present on inflammatory cells and others on immune system cells, as well as regulating membrane proteins that protect host cells from autoattacking. . Plasma complement proteins function either as enzymes, as binding proteins, or as regulators (inhibitors or activators).
  • Factor H is the main regulator of the alternative complement pathway. It acts in the liquid phase as on the surface of the cells. Originally referred to as "beta 1H globulin", this serum 155 kDa glycoprotein is also referred to as the H1, FH, CFH, or HF1 factor. Factor H is synthesized in the liver, macrophages, fibroblasts, endothelial cells and platelets. The secreted form of the protein is composed of 20 repetitive units (or "short consensus repeats", SCRs) of 60 amino acids.
  • Factor H The anti-complementary activity of Factor H is reflected in the regulation of the rate of immune complexes in the blood, it therefore contributes to the balance between process resulting in their generation or degradation.
  • Factor H reduces the half life of C3 convertase (C3bBb) alternately by binding C3b and dissociating Bb and serves as a cofactor for Factor I in C3b proteolysis, free or bound to cell surface, in C3bi.
  • C3bBb C3 convertase
  • immune complexes composed of an antigen-antibody complex associated with the complement component C3b can no longer activate the subsequent cascade of complement (C5-C9 components).
  • Factor H has been proposed in the treatment of Atypical Hemolytic Uremic Syndrome (aHUS) associated with a hereditary anomaly of the complement system (patent application FR2894145). Moreover, the Factor H is indicated for the treatment of chronic nephropathies (WO2007 / 038995).
  • aHUS Atypical Hemolytic Uremic Syndrome
  • FR2894145 a hereditary anomaly of the complement system
  • a suitable source for the preparation of a Therapeutic Factor H preparation is blood plasma.
  • Blood plasma has long been used for the preparation of albumin-like blood products, immunoglobulin preparations, clotting factor concentrates (Factor VIII, Factor IX etc.), etc.
  • Plasma fractionation methods are known, making it possible to enrich certain fractions with the desired products.
  • Simplified schematics of the modified Cohn / Oncley industrial plasma fractionation and Kistler / Nitschmann industrial plasma fractionation are presented in patent application WO2008 / 1 13589, which relates to a preparation of a H-factor formulation from an ethanolic fraction. .
  • Patent application WO2007 / 066017 describes a method for purifying Factor H comprising anion exchange chromatography, followed by two stages of heparin-type affinity chromatography, then, in order, cation exchange chromatography. , and anion exchange chromatography.
  • the patent application WO2008 / 1 13589 describes obtaining a purified factor H by affinity chromatography with heparin from an ethanolic fraction of blood plasma, followed by anion exchange chromatography, and a cation exchange chromatography.
  • the invention provides a method of making a therapeutic H-Factor preparation comprising the steps of:
  • step (ii) subjecting the fraction obtained in step (i) to a single heparin affinity chromatography
  • step (iii) subjecting the fraction enriched in Factor H obtained in step (ii) to cation exchange chromatography;
  • said method not comprising an additional heparin affinity chromatography step.
  • said fraction subjected to heparin chromatography is adjusted to a pH of 6.
  • the method may further comprise at least one viral inactivation treatment, preferably by the action of solvent and detergent, and / or at least one viral elimination treatment, preferably by nanofiltration.
  • the method of the invention has many advantages: it is industrializable, makes it possible to purify Factor H from various production intermediates, and with a high degree of purity, namely with very little C3 component of the complement, whose presence may decrease the effectiveness of the formulation, very little or no Factor B, which is a competitor of Factor H.
  • Factor H obtained is weakly proteolyzed, retains its functional activity, and this without the need to add protease inhibitors in the course of purification.
  • the invention also relates to a preparation of factor H obtainable by the process described here.
  • said preparation is in freeze-dried form.
  • FIG. 1 shows a diagram showing the steps of the purification process followed in Example 1. Detailed description of the invention
  • Factor H any protein having the amino acid sequence of native Human Factor H.
  • the term “Factor H” further includes naturally occurring allelic variations and / or naturally occurring Factor H isoforms, and any form or degree of glycosylation or other post-translational modification. Also included are homologues or derivatives of Factor H which exhibit the same or higher biological activity with respect to the activity of the wild form and / or which have a sequence identity of at least 80%, preferably at least 85%. %, more preferably at least 90%.
  • biological activity of Factor H includes the ability to inhibit C3 convertase and / or to act as a factor I cofactor, resulting in the inhibition of complement cascade activation. The activity of the factor H can be measured in various ways, well known to those skilled in the art. In general, a chromatography consists in putting the Factor H in contact with the solution
  • the starting material used is the supernatant of a cryoprecipitate of blood plasma, optionally mixed with a plasma fraction not retained on anion exchange chromatography, DEAE-Sephadex type, or a fraction not retained on anion exchange chromatography. , type DEAE-Sephadex. It is also possible to use the supernatant resulting from an ethanolic precipitation.
  • Heparin-type affinity chromatography uses a matrix or a support, which is most often an agarose gel, on which heparin or derivatives are grafted. or mimetics of heparin.
  • heparin-type ligands mention may in particular be made of the following ligands: chondroitin sulfate, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, or synthetic oligomers, for example the cellubiosis sulfate ester (Matrex TM Celluline Sulfate), or therapeutic analogs of the invention.
  • heparin for example sulfated oligosaccharides.
  • the pH is adjusted to a value of 6, for example by equilibrating the column with a 20 mM sodium phosphate buffer solution, with an osmolality of 60 ⁇ 5 mOsm / kg, and a pH of 6.0 ⁇ 0, 1.
  • Example 1 An example of a particular protocol is presented in Example 1.
  • This step makes it possible to fix the factor H and the antithrombin III (AT III), and to elute them separately.
  • a cation exchange chromatography uses a matrix, most often of the agarose or polymeric type, on which are grafted ligands such as carboxymethyl (CM), sulfopropyl (SP) or methyl sulfonate (S).
  • Cation exchange supports are commercially available, for example CM-Sepharose, SP-Sepharose and S-Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl CM-650, Toyopearl SP-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD carriers.
  • Example 1 An example of a particular protocol is presented in Example 1.
  • This step essentially eliminates the C3 component of the complement (C3), immunoglobulin M (IgM), and apolipoprotein B (Apo B).
  • Factor H can under certain conditions bind to anion exchange resins, and be desorbed by high ionic strength buffer systems.
  • Anion exchange chromatography uses a matrix, most often of the agarose or polymeric type, on which are grafted ligands such as diethylaminoethyl (DEAE), quaternary aminoethyl (QAE) or quaternary ammonium (Q).
  • DEAE diethylaminoethyl
  • Q quaternary aminoethyl
  • Q quaternary ammonium
  • Anion exchange supports are commercially available, for example DEAE-Sepharose, Q-Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl DEAE-650, Toyopearl Super Q-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD DEAE, Fractogel EMD TMAE (Merck KGaA), Macro-Prep DEAE Support, Macro-Prep High Q Support (BioRad), DEAE HyperD, Q HyperD, DEAE Trisacryl, DEAE Sperodex (all Pall).
  • Q-Sepharose FF is used.
  • Example 1 An example of a particular protocol is presented in Example 1.
  • This step essentially eliminates Factor B and Factor I.
  • the pH of the fraction of blood plasma containing Factor H and obtained in step (i) is adjusted to be in the range of pH 5.5 to pH 6.5 and preferably to be equal to pH 6.0.
  • the pH of the fraction eluted from step (ii) and then diluted before step (iii) is adjusted to be in the range from pH 6.0 to pH 7.5, preferably 6.0 at 7.0 preferably to be about pH 6.5.
  • the pH of the fraction eluted from step (iii) and then diluted before step (iv) is adjusted to be in the range from 6.0 to 7.0 and preferably to be equal to 6. 5.
  • the purification comprises the steps of:
  • obtaining a fraction of plasma containing Factor H for example (a) the supernatant of a blood plasma cryoprecipitate optionally mixed with a plasma fraction not retained on anion exchange chromatography or (b) a non-plasma fraction. retained on anion exchange chromatography;
  • step (iii) (a) subjecting the fraction obtained in step (ii) to cation exchange chromatography, for example on SP-Sepharose;
  • step (iv) subjecting the factor H-enriched fraction obtained in step (iii) (a) or (b) to anion exchange chromatography, for example on Q-Sepharose.
  • the process generally continues with steps of formulation, concentration, and then filtration of the Factor H concentrate.
  • the method of manufacturing a Factor H preparation according to the invention can comprise the following steps: (i) obtaining a fraction of plasma containing Factor H, for example (a) the supernatant of a blood plasma cryoprecipitate optionally mixed with a plasma fraction not retained on anion exchange chromatography or (b) a non-plasma fraction. retained on anion exchange chromatography;
  • the method further comprises a nanofiltration step, preferably on a 20-15 nm filter.
  • the method of the invention contains no chromatography other than those provided in steps (ii) to (iv) defined above.
  • process of the invention may optionally comprise additional steps, for example other anion or cation exchange chromatographies, but also optionally one or more hydrophobic interaction chromatographies.
  • Factor H can, under certain conditions, bind to hydrophobic interaction chromatography resins, and be desorbed by low ionic strength buffer systems.
  • a chromatography uses a matrix, most often of agarose or polymeric type, on which are grafted ligands such as phenyl, octyl, butyl, methyl, or hexylamine, phenylpropylamine, 4-mercapto-ethyl-pyridine.
  • chromatography supports for this type of chromatography are commercially available, for example phenyl sepharose, octyl sepharose, butyl sepharose, Capto TM MMC (GE Healthcare garlic), Toyopearl Phenyl-650, Toyopearl Butyl-650, Toyopearl Hexyl carriers. - 650 (garlic Tosoh Biosciences), Macro-Prep Methyl HIC Support, Macro-Prep t-Butyl HIC Support (Bio-Rad), HEA HyperCel; HyperCel PPA, HyperCel MEP (Pall garlic).
  • the process of the invention may also comprise a chromatography of hydroxyapatite type.
  • the factor H can be purified using calcium phosphate, fluoroapatite and hydroxyapatite composites as the solid phase.
  • the commercially available carriers there may be mentioned, for example, Bio-Gel Hydroxyapatite HT (Bio-Rad), Ceramic Fluoroapatite, Ceramic Hydroxyapatite (Bio-Rad), HA Ultrogel (Pall).
  • the method of the invention may also comprise immunoaffinity chromatography, which uses, for example, antibodies or aptamers immobilized on a chromatography matrix.
  • the matrices are generally pre-activated resins, for example by epoxy (Sepharose 6B1 EAH Sepharose 4B, Amino Sepharose 6 FF, 6-AKS Sepharose 4FF, Toyopearl AF Epoxy, Toyopearl AF Amino, Toyopearl AF Tresyl).
  • the unbound impurities are washed using suitable buffer systems (citrate buffer, phosphate buffer, or HEPES for example), and the Factor H is then eluted using, for example, high concentrations of chaotropic salts (thiocyanate type, lithium bromide). ), buffer systems with low pH (glycine pH 2-3) or high pH (TRIS pH 9).
  • the method of the invention may also include other treatments, such as delipidation.
  • Delipidation consists in eliminating, preferably upstream or as soon as possible in the process, lipid impurities from the protein solutions by means of, for example, precipitation or adsorption.
  • Suitable precipitating agents include, for example, polyethylene glycols (PEG) or ammonium sulfate, while silica powders ("fumed silica", Aerosil 200, Aerosil 380), dextran sulfates or fluorocarbons (Freon-13) are suitable adsorbents.
  • proteolytic impurities ie enzymes, for example proteases or glycosidases, which would be capable of cleaving the Factor H molecule into inactive truncated forms.
  • This elimination or inhibition is preferably carried out as soon as possible, preferably further upstream of the purification process.
  • a filter which retains a part of the proteolytic impurities (Sartoclear® filter type).
  • protease inhibitors may be for example benzamidine, 4-aminobenzamidine, benzamidine hydrochloride and its derivatives, lysine and its derivatives, 6-aminohexanoic acid ( ⁇ -aminocaproic acid) and its derivatives, trans-4-aminomethylcyclohexanecarboxylic acid (acid tranexamic) and its derivatives, 4- (2-aminoethyl) benzenesulfonylfluoride (AEBSF) and its derivatives, (4-Amidino-Phenyl) -methane-Sulfonyl Fluoride (APMSF) and its derivatives, 3,4-dichloroisocoumarin (DCI) and its derivatives, acetyl-leucyl-leucyl-arginal (Leupeptin) and its derivatives, aprotinin and its derivatives, trypsin inhibitor of soya, and its derivatives, ⁇ 2-anti
  • proteolytic impurities can be inhibited by adding one or more protease inhibitors of the above-mentioned group, particularly antithrombin III and C1 inhibitor, and then eliminating the enzyme / inhibitor complex by subsequent purification steps.
  • immobilized dyes such as Cibacron Blue F3GA or its derivatives, other triazine dyes such as Procion Red HE-3B and its derivatives, or Procion Green H-4G and its derivatives, Reactive Red 120 and its derivatives, Reactive Green 19 and its derivatives, Reactive Yellow 86 and its derivatives, Reactive Orange 14 and its derivatives, immobilized on agarose matrices or polymeric matrix.
  • the H-factor preparation useful in the invention has generally undergone at least one step of removing or inactivating at least one infectious agent.
  • Infectious agents include viruses and NCTAs (unconventional transmissible agents) such as prions.
  • Viral inactivation often includes treatment with chemicals, for example solvent, detergent and / or heat, for example by UVC, gamma irradiation, and / or pasteurization.
  • Nanofiltration is also useful for removing an infectious agent, including viruses.
  • the process comprises at least a solvent and detergent treatment, and a nanofiltration.
  • Pasteurization refers to methods exposing the liquid compositions of Factor H at a temperature of 60 ° C for at least 10 hours.
  • Solvent and / or detergent treatment comprises, in particular, treatment with tri-n-butyl phosphate and / or a detergent which is chosen from Triton X-100, Tween (preferably Tween 80) and cholate. sodium.
  • Nanofiltration generally refers to the filtration of a Factor H solution through a filter with a pore size of less than 80 nm.
  • Available filters include BioEx, Planova TM 75nm, Planova TM 35nm, Planova TM 20nm or Planova TM 15nm (Asahi corporation), Ultipor DV 50 or DV 20 (Pall Corporation), Virosart CPV (Sartorius), Viresolve NFR or NFP (Millipore).
  • nanofiltration is carried out after step (iv) of anion exchange chromatography.
  • the purified Factor H fraction is filtered on a filter sequence with a pore size of 20 nm and 15 nm.
  • the obtained Factor H preparation is formulated with suitable excipients and stabilizers. They may be diluents, agents, cryoprotectants, lyoprotectants, etc.
  • sugars sucrose, trehalose, glucose, lactose, etc.
  • polyols mannitol, sorbitol
  • amino acids glycine, arginine, histidine, alanine
  • Polysorbate surfactants Teween 20 or Tween 80 for example
  • polyoxamer for example poloxamer 188
  • polyethylene glycol can also be added.
  • Antioxidants eg, methionine, monothioglycerol, glutathione, citric acid, ascorbic acid, sodium metabisulfite, and sodium sulfite
  • Buffer substances may be further used, for example in the form of carbonate, phosphate, citrate, acetate, borate, trimethamine [(2-amino-2-hydroxymethyl-1, 3-propanediol), TRIS], glycine and lysine.
  • the liquid formulation of Factor H before lyophilization comprises arginine, preferably in the form of its hydrochloride, sodium citrate dihydrate, and optionally also isoleucine, glycine, and lysine or one of its salts. desiccation
  • the liquid formulation of Factor H can be desiccated if necessary, to obtain a solid form.
  • Desiccation is a method of removing water at a high stage. It is a dehydration to remove as much water as possible. This phenomenon can be natural or forced. This desiccation can be carried out using freeze-drying, atomization and cryoatomization techniques.
  • the preferred mode of obtaining the solid form of the composition for pharmaceutical use according to the invention is lyophilization.
  • Lyophilization methods are well known to those skilled in the art, see, for example, Wang et al, Lyophilization and Development of Solid Protein Pharmaceuticals, International Journal of Pharmaceutics, Vol 203, p 1 -60, 2000.
  • the degree of humidity is less than or equal to 3% by weight, preferably less than or equal to 2.5%, preferably less than or equal to 2%, preferably less than or equal to 1.5%.
  • the solid composition may be dissolved in water for injection (WFI) or in a reconstitution solvent to provide a therapeutic formulation.
  • WFI water for injection
  • a Factor H concentrate is prepared by following the steps shown in the attached figure. Adjustment of the starting material
  • a solution A was used as the starting material, obtained in the following manner: Thawed plasma was cryoprecipitated. After centrifugation, part of the cryosurnant was subjected to DEAE Sephadex chromatography, which sets vitamin K-dependent factors. The fraction not retained on DEAE-Sephadex is mixed with the remaining cryosurnant to form Solution A. This was adjusted to a pH of 6.0 ⁇ 0.1 with 0.5N HCl solution. Several lots were prepared from Solution A.
  • the adjusted solution A is subjected to a BP column chromatography containing 1500 ml of Heparin-Sepharose Fast Flow (FF) gel (15 cm ⁇ 10 cm) equilibrated in a 20 mM sodium phosphate buffer, an osmolality of 60 ⁇ 5 mOsm / kg, pH 6.0 ⁇ 0.1.
  • the same buffer solution was used to wash the gel until it returned to the baseline optical density (OD) measured at 280 nm.
  • the protein loading applied was 320 mg, 560 and 720 mg protein / ml gel for lots 1, 2, and 3, respectively.
  • a buffer solution of 20mM sodium phosphate, 60mM sodium chloride, osmolality of 165110 mOsm / kg, pH 7.4 ⁇ 0.1 was injected into the column to elute the proteins that were weakly adsorbed on the gel.
  • the gel was re-equilibrated by passing 2 to 3 volumes of equilibrated buffer solution at pH 6.5.
  • Factor H was then eluted by the injection of a buffer solution containing 20mM sodium phosphate, 250mM sodium chloride, 4.5g / L arginine-HCl, osmolality of 550110 mOsm / kg, pH 6.5 ⁇ 0 , 1.
  • the fraction containing the Factor H eluted from the Heparin-Sepharos FF column was thawed in a regulated water bath at 30 ° C. and then adjusted to the equilibration conditions of the SP-Sepharose FF column by dilution with water. purified to reach an osmolality of 95 ⁇ 5 mOsm / kg, and if necessary addition of a 0.5N HCl solution to obtain a pH of 6.5 ⁇ 0.1.
  • the adjusted fraction was subjected to two parallel columns K50 columns, each containing 137mL of SP-Sepharose FF gel (7cm x 5cm) and equilibrated with a buffer solution containing 20mM sodium phosphate, 4.5g / L arginine -HCl, osmolality of 95 ⁇ 5 mOsm / kg, pH 6.5 ⁇ 0.1.
  • the same buffer solution was used to wash the gel until it returned to the baseline optical density (OD) measured at 280 nm.
  • Factor H was then eluted by injection of a buffer solution containing 20mM sodium phosphate, 165mM sodium chloride, 4.5g / L arginine-HCl, osmolality of 40015 mOsm / kg, pH 6.510.1.
  • the fraction of Factor H eluted from the SP-Sepharose FF column was thawed in a regulated water bath at 30 ° C. It was then subjected to Solvent-Detergent treatment in the presence of 1% polysorbate 80 (Tween 80) (w / v) and 0.3% tri-n-butyl phosphate (TnBP) (v / v) at 25 ° C. +1 ° C.
  • the Solvent-Detergent treated Factor H fraction was adjusted to the equilibration conditions for the Q-Sepharose FF column by dilution with purified water to reach an osmolality of 140 + 10 mOsm / kg, and addition of a 1 N NaOH solution to obtain a pH of 7.5 + 0.1 for lots 1 and 2 and using a 0.5M HCl solution if necessary to obtain a pH of 6.5 + 0.1 for batch 3.
  • the adjusted fraction was chromatographed on a K50 column containing 190mL of Q-Sepharose FF gel (9.5cm x 5cm) and equilibrated with a buffer solution containing 20mM sodium phosphate, 25mM sodium chloride, 4mg.
  • a buffer solution containing 20mM sodium phosphate, 55mM sodium chloride, 4.5g / L arginine-HCl, osmolality of 200 + 10 mOsm / kg, pH 7.5 + 0.1 for lots 1 and 2, and pH 6.5 + 0.1 for batch 3 was then injected into the column to elute proteins that were weakly adsorbed to the gel.
  • Factor H was then eluted by injection of a buffer solution containing 20mM sodium phosphate, 165mM sodium chloride, 4.5g / L arginine-HCl, osmolality of 390 + 10mOsm / kg, pH 7.5 + 0, 1 for lots 1 and 2, and pH 6.5 + 0.1 for batch 3.
  • a final washing of the column was carried out by injecting a 2M sodium chloride solution to elute the proteins which were strongly adsorbed on the gel.
  • the linear flow of chromatography was 150cm / h for all stages of chromatography.
  • the fraction of eluted Factor H was frozen at -80 ° C until the next step.
  • the fraction eluted at the Q-Sepharose FF column was adjusted to a pH of 6.5 ⁇ 0.1 for lots 1 and 3, and pH 7.5 ⁇ 0.1 for batch 2, and was then clarified on a filter with a pore size of 0.1 ⁇ and stored overnight at 4 ° C.
  • the clarified fraction was filtered through a sequence of PLANOVA 20N and 15N filters previously equilibrated with a buffer solution containing 20mM sodium phosphate, 165mM sodium chloride, 4.5g / L arginine-HCl, osmolality of 390 ⁇ 10mOsm / kg pH 7.5 for batch 2, and pH 6.5 for batches 1 and 3.
  • the inlet filtration pressure applied to the 15nm filter was 300 ⁇ 50mbar and was kept constant. Filtration was performed at laboratory temperature.
  • the filtered Factor H fraction was concentrated and formulated by diafiltration on an ultrafiltration module equipped with a membrane with a molecular weight cut-off of 100kD.
  • a buffer solution composed of 12 g / L arginine HCl, 3 g / L isoleucine, 0.6 g / L glycine, 0.6 g / L, lysine HCI, 0, was used.
  • 75 g / l Trisodium citrate, osmolality 150 ⁇ 10mOsm / kg, pH 7.5 ⁇ 0.1.
  • the final protein concentration in Factor H was 5g / L.
  • the concentrated and formulated product was filtered through a 0.22 ⁇ m Millipak 20 filter under a laminar flow hood and conditioned.
  • the Factor H assay is conventionally performed by immunoenzymatic method (ELISA) with commercial reagents (Diagnostica Stago). Briefly, the Factor H to be assayed is captured by a human anti-Factor H antibody immobilized on a solid phase. The fixed Factor H is then recognized by a peroxidase immunoconjugate. The level of bound peroxidase is measured by its activity on the ortho-phenylenediamine substrate in presence of hydrogen peroxide. The intensity of the staining, after stopping the reaction with a strong acid, is a function of the amount of factor H present initially in the sample. Factor H thus measured is called "Antigen Factor" or "Ag". The purification results from solution A are shown in the tables below.
  • Table 1 C Purity of Factor H for Lot 3 Step Factor H Factor H Concentration Purity in (Mg / mL) (mg) total protein Factor H
  • Chromatography on heparin-Sepharose FF effectively eliminates albumin, immunoglobulin G, Factor I, Apolipoprotein A, C1-inhibitor, Immunoglobulin A Alpha 1 -antitrypsin, Fibrinogen and Antithrombin III.
  • Q-Sepharose FF chromatography preferentially removes low molecular weight proteins, such as Factor B and Residual Factor I, while further reducing the amounts in other proteins.
  • the calculated rate corresponds to the amount of factor H which makes it possible to dissociate 50% of the preformed C3 convertase, it is also called EC 50 (effective concentration to have 50% of the activity).
  • EC 50 effective concentration to have 50% of the activity.
  • a plasma pool sample is passed to each analysis for reference. The higher the percentage, the more H factor is needed to dissociate the same amount of C3 convertase so the lower the factor H is active. Any increase in the rate reflects a denaturation of the protein.
  • batches 1 and 2 above were produced from cryoprecipitation supernatants.
  • the results show that there is no loss of functional activity of the factor H during purification and that it remains comparable to that of a reference plasma.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de fabrication d'une préparation de Facteur H à usage thérapeutique comprenant les étapes consistant à : (i) obtenir une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur H; (ii) soumettre la fraction obtenue à l'étape (i) à une unique chromatographie d'affinité de type héparine; (iii) soumettre la fraction enrichie en Facteur H obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations; (iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur H obtenue à l'étape (iii) à une chromatographie échangeuse d'anions, ledit procédé ne comprenant pas d'étape supplémentaire de chromatographie d'affinité de type héparine.

Description

Procédé de fabrication d'une préparation de Facteur H
L'invention concerne un procédé de fabrication d'une préparation de Facteur H à usage thérapeutique, à partir de plasma sanguin humain.
Arrière-plan technologique de l'invention :
Le complément joue un rôle essentiel dans la défense de l'organisme contre des agents infectieux et dans le processus inflammatoire. Il représente un système auxiliaire de l'immunité, en particulier de la réponse humorale et de la réponse innée.
Le complément comprend un ensemble d'environ 30 protéines plasmatiques et parfois membranaires, synthétisées essentiellement par le foie et les macrophages et qui peuvent être activées par des cascades protéolytiques. Il comprend à la fois des protéines plasmatiques, de nombreux récepteurs cellulaires de surface différents, certains présents sur les cellules inflammatoires et d'autres sur les cellules du système immunitaire, ainsi que des protéines membranaires de régulation qui protègent les cellules hôte d'une autoattaque. Les protéines plasmatiques du complément fonctionnent soit comme des enzymes, soit comme des protéines de liaison, soit comme des régulateurs (inhibiteurs ou activateurs).
Il existe 3 voies de déclenchement de la cascade du complément : la voie classique déclenchée par les anticorps, la voie alterne déclenchée par des substances bactériennes en absence d'anticorps, la voie dépendante des lectines qui reconnaissent certains polysaccharides bactériens. Ces deux dernières voies sont mises en jeu dans la réponse innée et sont extrêmement importantes dans la défense de l'hôte contre les infections bactériennes.
Le Facteur H est le principal régulateur de la voie alterne du complément. Il agit en phase liquide comme à la surface des cellules. Initialement désignée « bêta 1 H globuline », cette glycoprotéine sérique de 155 kDa est également appelée Facteur H 1 , FH, CFH, ou HF1 . Le Facteur H est synthétisé dans le foie, les macrophages, les fibroblastes, les cellules endothéliales et les plaquettes. La forme sécrétée de la protéine est composée de 20 unités répétitives (ou « short consensus repeats », SCR) de 60 acides aminés.
L'activité anti-complémentaire du Facteur H se traduit par la régulation du taux de complexes immuns dans le sang, il participe par conséquent à l'équilibre entre les processus résultant en leur génération ou en leur dégradation. Le facteur H réduit la demi- vie de la C3 convertase (C3bBb) alterne en liant le C3b et en dissociant le Bb et sert de cofacteur au Facteur I dans la protéolyse du C3b, libre ou lié à la surface des cellules, en C3bi. Ainsi, les complexes immuns composés d'un complexe antigène-anticorps associé au composant du complément C3b ne peuvent plus activer la cascade subséquente du complément (composants C5-C9).
Le Facteur H a été proposé dans le traitement du Syndrome Hémolytique et Urémique atypique (SHUa) associé à une anomalie héréditaire du système du complément (demande de brevet FR2894145). Par ailleurs, le Facteur H est indiqué pour le traitement de néphropathies chroniques (WO2007/038995).
Une source appropriée pour la préparation d'une préparation de Facteur H à usage thérapeutique est du plasma sanguin. Le plasma sanguin est utilisé depuis longtemps pour la préparation de produits dérivés du sang de type albumine, préparations d'immunoglobulines, concentrés de facteur de la coagulation (Facteur VIII, Facteur IX etc.), etc. Des méthodes de fractionnement du plasma sont connues, permettant d'enrichir certaines fractions en produits désirés. Des schémas simplifiés du fractionnement plasmatique industriel Cohn/Oncley modifié, et du fractionnement plasmatique industriel Kistler/Nitschmann sont présentés dans la demande de brevet WO2008/1 13589, qui concerne une préparation d'une formulation de facteur H à partir d'une fraction éthanolique.
La demande de brevet WO2007/066017 décrit un procédé de purification du Facteur H comprenant une chromatographie par échange d'anions, suivie par deux étapes de chromatographie d'affinité de type héparine, puis, dans l'ordre, une chromatographie par échange de cations, et une chromatographie par échange d'anions.
La demande de brevet WO2008/1 13589 décrit l'obtention d'un Facteur H purifié par une chromatographie d'affinité avec héparine à partir d'une fraction éthanolique de plasma sanguin, suivie d'une chromatographie par échange d'anions, et une chromatographie par échange de cations.
Ces procédés restent imparfaits, soit parce qu'ils consomment trop d'héparine, qui est un produit cher (WO2007/066017), soit parce qu'ils ne parviennent pas à un niveau de pureté du Facteur totalement satisfaisant pour un usage thérapeutique (WO2008/1 13589). L'invention vise à résoudre ces problèmes.
Résumé de l'invention :
L'invention fournit un procédé de fabrication d'une préparation de Facteur H à usage thérapeutique comprenant les étapes consistant à :
(i) obtenir une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur H ;
(ii) soumettre la fraction obtenue à l'étape (i) à une unique chromatographie d'affinité de type héparine;
(iii) soumettre la fraction enrichie en Facteur H obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations ;
(iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur H obtenue à l'étape (iii) à une chromatographie échangeuse d'anions,
ledit procédé ne comprenant pas d'étape supplémentaire de chromatographie d'affinité de type héparine.
De manière préférentielle, ladite fraction soumise à la chromatographie de type héparine est ajustée à un pH de 6. Le procédé peut comprendre en outre au moins un traitement d'inactivation virale, de préférence par l'action de solvant et détergent, et/ou au moins un traitement d'élimination virale, de préférence par nanofiltration.
Le procédé de l'invention présente de nombreux avantages : il est industrialisable, permet de purifier du Facteur H à partir de divers intermédiaires de production, et avec un degré de pureté élevé, à savoir avec très peu de composant C3 du complément, dont la présence pourrait diminuer l'efficacité de la formulation, très peu ou pas de Facteur B, qui est un compétiteur de Facteur H. Le Facteur H obtenu est faiblement protéolysé, conserve son activité fonctionnelle, et cela sans nécessité d'ajouter des inhibiteurs de protéase en cours de purification.
L'invention a également pour objet une préparation de Facteur H susceptible d'être obtenue par le procédé décrit ici. De préférence, ladite préparation est sous forme lyophilisée. Légende de la Figure :
La Figure 1 montre un schéma représentant les étapes du procédé de purification suivies dans l'exemple 1 . Description détaillée de l'invention :
Par « Facteur H » on entend toute protéine ayant la séquence en acides aminés du Facteur H natif humain. Le terme « Facteur H » comprend en outre les variations alleliques naturelles et/ou les isoformes du Facteur H trouvées naturellement, et toute forme ou degré de glycosylation ou autre modification post-traductionnelle. Sont aussi compris les homologues ou dérivés du Facteur H qui présentent la même ou une activité biologique supérieure par rapport à l'activité de la forme sauvage et/ou qui présentent une identité de séquence d'au moins 80%, de préférence au moins 85%, de préférence encore d'au moins 90%. Le terme « activité biologique » du Facteur H inclut la capacité à inhiber la C3 convertase et/ou à servir de co-facteur du Facteur I, résultant à l'inhibition de l'activation de la cascade du complément. L'activité du Facteur H peut être mesurée de différentes manières, bien connues de l'homme du métier. De manière générale, une chromatographie consiste à mettre en contact le Facteur H en solution
avec une matrice à laquelle le Facteur H se lie, éventuellement laver la matrice dans des conditions appropriées pour que le Facteur H reste lié, puis appliquer à la matrice une solution qui provoque l'élution du Facteur H de la matrice,
- ou de manière alternative avec une matrice qui lie les impuretés mais pas le Facteur H
Etape (i) obtention d'une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur H :
De préférence on utilise comme matériau de départ le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions, type DEAE-Séphadex ou encore une fraction non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions , type DEAE-Séphadex. On peut encore utiliser le surnageant issu d'une précipitation éthanolique. Etape (ii) chromatographie d'affinité de type héparine :
La chromatographie d'affinité de type héparine met en œuvre une matrice ou un support, qui est le plus souvent un gel d'agarose, sur lequel est greffé de l'héparine ou des dérivés ou mimétiques de l'héparine. Parmi les ligands de type héparine on peut citer notamment les ligands suivants : chondroitin sulfate, heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, ou des oligomères synthétiques, par exemple le cellubiose sulfate ester (Matrex™ Cellufine Sulfate), ou des analogues thérapeutiques de l'héparine, par exemple des oligosaccharides sulfatés.
De préférence le pH est ajusté à une valeur de 6, par exemple en équilibrant la colonne avec une solution tampon de phosphate de sodium à 20 mM, avec une osmolalité de 60±5 mOsm/kg, et un pH 6,0±0,1 .
Un exemple de protocole particulier est présenté dans l'exemple 1.
Cette étape permet de fixer le Facteur H et l'antithrombine III (AT III), et de les éluer séparément.
Etape (iii) chromatographie échangeuse de cations :
Une chromatographie échangeuse de cations met en oeuvre une matrice, le plus souvent de type agarose ou polymérique, sur laquelle sont greffés des ligands tels que carboxymethyl (CM), sulfopropyl (SP) ou methyl sulfonate (S). Des supports échangeurs de cations sont disponibles dans le commerce: on peut citer par exemple des supports CM-Sepharose, SP-Sepharose et S-Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl CM-650, Toyopearl SP-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD S03", Fractogel EMD COO" (Merck KGaA), Macro-Prep CM Support, Macro-Prep High S Support (BioRad), CM HyperD, S HyperD, CM Trisacryl, SP Trisacryl, SP Sperodex (ail Pall). De préférence, on utilise la SP-Sepharose FF.
Un exemple de protocole particulier est présenté dans l'exemple 1.
Cette étape permet d'éliminer essentiellement le composant C3 du complément (C3), les immunoglobulines M (IgM), et l'apolipoprotéine B (Apo B).
Etape (iv) chromatographie échangeuse d'anions :
Le Facteur H peut dans certaines conditions se lier à des résines échangeuses d'anions, et en être désorbé par des systèmes tampons à force ionique élevée.
Une chromatographie échangeuse d'anions met en oeuvre une matrice, le plus souvent de type agarose ou polymérique, sur laquelle sont greffés des ligands tels que diethylaminoethyle (DEAE), aminoethyle quaternaire (QAE) ou ammonium quaternaire (Q). Des supports échangeurs d'anions sont disponibles dans le commerce: on peut citer par exemple des supports DEAE-Sepharose, Q- Sepharose (GE Healthcare), Toyopearl DEAE-650, Toyopearl Super Q-650 (Tosoh Biosciences), Fractogel EMD DEAE, Fractogel EMD TMAE (Merck KGaA), Macro- Prep DEAE Support, Macro-Prep High Q Support (BioRad), DEAE HyperD, Q HyperD, DEAE Trisacryl, DEAE Sperodex (all Pall).
De préférence, on utilise la Q-Sepharose FF.
Un exemple de protocole particulier est présenté dans l'exemple 1.
Cette étape permet d'éliminer essentiellement le Facteur B et le Facteur I.
Avantageusement, le pH de la fraction de plasma sanguin contenant du Facteur H et obtenue à l'étape (i) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de pH 5,5 à pH 6,5 et de préférence pour être égal à pH 6,0. Avantageusement, le pH de la fraction éluée de l'étape (ii) puis diluée avant l'étape (iii) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de pH 6,0 à pH 7,5, de préférence de 6,0 à 7,0 de préférence pour être égal à pH 6,5 environ. Avantageusement encore, le pH de la fraction éluée de l'étape (iii) puis diluée avant l'étape (iv) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de 6,0 à 7,0 et de préférence pour être égal à 6,5. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la purification comprend les étapes consistant à :
(i) obtenir une fraction de plasma contenant du Facteur H, par exemple (a) le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ou (b) une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ;
(ii) soumettre ledit surnageant ou ladite fraction non retenue sur chromatographie échangeuse d'anions à une chromatographie d'affinité de type héparine, par exemple sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine, par ce en quoi on obtient une fraction enrichie en Facteur H;
(iii) (a) soumettre la fraction obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations, par exemple sur SP-Sépharose ;
(iii) (b) suivie le cas échéant par un traitement par solvant et détergent ;
(iv) soumettre la fraction enrichie en facteur H obtenue à l'étape (iii) (a) ou (b) à une chromatographie échangeuse d'anions, par exemple sur Q-Sépharose.
Le procédé se poursuit généralement par des étapes de formulation, concentration, puis filtration du concentré de Facteur H. Plus précisément, le procédé de fabrication d'une préparation de Facteur H selon l'invention peut comprendre les étapes suivantes : (i) obtenir une fraction de plasma contenant du Facteur H, par exemple (a) le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ou (b) une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ;
(ii) soumettre ledit surnageant ou ladite fraction non retenue sur chromatographie échangeuse d'anions à une chromatographie d'affinité de type héparine, par exemple sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine, par ce en quoi on obtient une fraction enrichie en Facteur H;
laver puis éluer le facteur H par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatrographie d'affinité de type héparine, diluer la fraction éluée, puis
(iii) (a) la soumettre à une chromatographie échangeuse de cations, par exemple sur SP- Sépharose ;
laver puis éluer le facteur H par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatrographie échangeuse de cations, diluer la fraction éluée, puis
(iii) (b) le cas échéant la soumettre à un traitement par solvant et détergent ;
(iv) puis la soumettre à une chromatographie échangeuse d'anions, par exemple sur Q- Sépharose ;
(v) laver et éluer le Facteur H, généralement par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatographie échangeuse d'anions ;
(vi) préparer un concentré de Facteur H.
De préférence le procédé comprend en outre une étape de nanofiltration, de préférence sur un filtre de 20-15nm.
Autres étapes possibles :
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention ne contient aucune autre chromatographie que celles prévues aux étapes (ii) à (iv) définies plus haut.
Toutefois, le procédé de l'invention peut éventuellement comprendre des étapes supplémentaires, par exemple d'autres chromatographies d'échanges d'anions ou de cations, mais aussi le cas échéant une ou plusieurs chromatographies par interaction hydrophobe.
Le Facteur H peut dans certaines conditions se lier à des résines de chromatographie par interaction hydrophobe, et en être désorbé par des systèmes tampons à force ionique faible. Une telle chromatographie met en oeuvre une matrice, le plus souvent de type agarose ou polymérique, sur laquelle sont greffés des ligands tels que phenyl, octyl, butyl, methyl, ou encore hexylamine, phenylpropylamine, 4-mercapto-ethyl-pyridine. Des supports pour ce type de chromatographie sont disponibles dans le commerce: on peut citer par exemple des supports phenyl sepharose, octyl sepharose, butyl sepharose, Capto™ MMC (ail GE Healthcare), Toyopearl Phenyl-650, Toyopearl Butyl-650, Toyopearl Hexyl- 650 (ail Tosoh Biosciences), Macro-Prep Methyl HIC Support, Macro-Prep t-Butyl HIC Support (Bio-Rad), HEA HyperCel; PPA HyperCel, MEP HyperCel (ail Pall). Le procédé de l'invention peut aussi comprendre une chromatographie de type Hydroxyapatite. En effet, le Facteur H peut être purifié en utilisant des composites de phosphate de calcium, fluoroapatite, hydroxyapatite comme phase solide. Parmi les supports disponibles commercialement, on peut citer par exemple Bio-Gel Hydroxyapatite HT (Bio- Rad), Ceramic Fluoroapatite, Ceramic Hydroxyapatite (Bio-Rad), HA Ultrogel (Pall).
Le procédé de l'invention peut encore comprendre une chromatographie par immunoaffinité, qui met en oeuvre par exemple des anticorps ou des aptamères immobilisés sur une matrice de chromatographie. Les matrices sont généralement des résines pré-activées, par exemple par époxy (Sepharose 6B1 EAH Sepharose 4B, Amino Sepharose 6 FF, 6-AKS Sepharose 4FF, Toyopearl AF Epoxy, Toyopearl AF Amino, Toyopearl AF Tresyl). Les impuretés non liées sont lavées en utilisant des systèmes tampon adaptés (tampon citrate, tampon phosphate, ou HEPES par exemple), et le Facteur H est ensuite élué en utilisant par exemple de fortes concentrations en sels chaotropiques (de type thiocyanate, bromure de lithium), des systèmes tampons à faible pH (glycine pH 2-3) ou à pH élevé (TRIS pH 9).
Le procédé de l'invention peut également inclure d'autres traitements, tels qu'une délipidation. La délipidation consiste à éliminer, de préférence en amont ou le plus tôt possible dans le procédé, des impuretés lipidiques des solutions de protéines au moyen par exemple d'une précipitation ou d'une adsorption. Des agents précipitants adaptés incluent par exemple des polyéthylèneglycols (PEG) ou du sulfate d'ammonium, tandis que des poudres de silice ("silice fumée"; Aerosil 200, Aerosil 380), dextran sulfates ou fluorocarbones (Freon-1 13) sont des adsorbants adaptés.
Il peut aussi être avantageux d'éliminer ou inhiber les impuretés protéolytiques, à savoir les enzymes, par exemple les protéases ou glycosydases, qui seraient capables de cliver la molécule de Facteur H en des formes tronquées inactives. Cette élimination ou inhibition est de préférence réalisée le plus tôt possible, de préférence encore en amont du procédé de purification. Pour cela on peut utiliser une méthode chromatographique dans laquelle des inhibiteurs de protéases sont immobilisés sur des matrices de type agarose ou matrice polymérique. On peut aussi utiliser un filtre qui retient une partie des impuretés protéolytiques (type filtre Sartoclear®).
De tels inhibiteurs de protéase peuvent être par exemple benzamidine, 4- aminobenzamidine, benzamidine chlorhydrate et ses dérivés, lysine et ses dérivés, acide 6-aminohexanoïque (acide ε-aminocaproïque) et ses dérivés, acide trans-4-aminomethyl- cyclohexanecarboxylique (acide tranexamique) et ses dérivés, 4-(2- Aminoéthyl)benzènesulfonylfluorure (AEBSF) et ses dérivés, (4-Amidino-Phenyl)- Methane-Sulfonyl Fluorure (APMSF) et ses dérivés, 3,4-dichloroisocoumarine (DCI) et ses dérivés, Acétyl- leucyl-leucyl-arginal (Leupeptine) et ses dérivés, aprotinine et ses dérivés, inhibiteur trypsique du soja, et ses dérivés, a2-antiplasmine et ses dérivés, inhibiteurs de la thrombine (notamment antithrombine III) et ses dérivés. Des supports de chromatographie disponibles commercialement sont par exemple ECH Lysine Sepharose 4 B, Benzamidine Sepharose 6B (GE Healthcare), p-Aminobenzamidine Agarose 6XL (Prometic).
Plutôt que de les éliminer, les impuretés protéolytiques peuvent être inhibées en ajoutant un ou plusieurs inhibiteurs de protéases du groupe mentionné ci-dessus, en particulier de l'antithrombine III et du Ci -inhibiteur, puis en éliminant le complexe enzyme/inhibiteur au moyen des étapes subséquentes de purification.
Une autre approche pour éliminer les impuretés protéolytiques est d'utiliser des colorants immobilisés tels que Cibacron Blue F3GA ou ses dérivés, d'autres colorants triazines tels que Procion Red HE-3B et ses dérivés, ou Procion Green H-4G et ses dérivés, Reactive Red 120 et ses dérivés, Reactive Green 19 et ses dérivés, Reactive Yellow 86 et ses dérivés, Reactive Orange 14 et ses dérivés, immobilisés sur des matrices de type agarose ou matrice polymérique.
Inactivation des virus
La préparation de Facteur H utile dans l'invention a généralement subi au moins une étape d'élimination ou d'inactivation d'au moins un agent infectieux. Parmi les agents infectieux, on peut citer les virus et les ATNC (agents transmissibles non conventionnels) comme le prion. Une inactivation virale comprend souvent un traitement avec des produits chimiques, par exemple par solvant, détergent et/ou par la chaleur, par exemple par UVC, irradiation Gamma, et/ou pasteurisation. Une nanofiltration est aussi utile pour éliminer un agent infectieux, notamment les virus. De préférence le procédé comprend au moins un traitement par solvant et détergent, et une nanofiltration. La pasteurisation se réfère à des méthodes exposant les compositions liquides de Facteur H à une température de 60°C pendant au moins 10h.
Le traitement par solvant et/ou détergent (appelé généralement traitement solvant/détergent) comprend notamment le traitement par tri-n-butylphosphate et/ou un détergent qui est choisi parmi le Triton X-100, Tween (de préférence Tween 80) et cholate sodium.
La nanofiltration se réfère généralement à la filtration d'une solution de Facteur H à travers un filtre avec une taille de pores inférieure à 80 nm. Des filtres disponibles sont par exemple BioEx, Planova™ 75 nm, Planova™ 35 nm, Planova™ 20 nm ou Planova ™ 15 nm (Asahi corporation), Ultipor DV 50 or DV 20 (Pall corporation), Virosart CPV (Sartorius), Viresolve NFR ou NFP (Millipore). De préférence une nanofiltration est réalisée après l'étape (iv) de chromatographie échangeuse d'anions. Dans un mode de réalisation particulier, la fraction de Facteur H purifiée est filtrée sur une séquence de filtres avec une taille de pores de 20nm et 15nm.
Formulation
De manière à obtenir des préparations de Facteur H à usage thérapeutique, qui soient stables, la préparation de Facteur H obtenue est formulée avec des excipients et agents stabilisants appropriés. Il peut s'agir de diluants, d'agents, cryoprotecteurs, lyoprotecteurs, etc.
Parmi les lyoprotecteurs classiques, on peut citer les sucres (saccharose, tréhalose, glucose, lactose etc.), les polyols (mannitol, sorbitol) et les acides aminés (glycine, arginine, histidine, alanine) qui peuvent être utilisés à une concentration entre 0 et 10%. Des tensio-actifs de type polysorbate (Tween 20 ou Tween 80 par exemple), polyoxamer (par exemple poloxamer 188), polyéthylèneglycol peuvent être ajoutés également.
On peut encore ajouter des antioxydants (par exemple méthionine, monothioglycérol, glutathion, acide citrique, acide ascorbique, sodium métabisulfite, et sodium sulfite). Des substances tampon peuvent être encore utilisées, par exemple sous forme de carbonate, phosphate, citrate, acétate, borate, triméthamine [(2-amino-2-hydroxyméthyl- 1 ,-3- propanediol),TRIS], glycine et lysine.
Selon un mode de réalisation préféré, la formulation liquide de Facteur H avant lyophilisation comprend de l'arginine, de préférence sous forme de son chlorhydrate, du citrate de sodium dihydraté, ainsi qu'éventuellement aussi de l'isoleucine, de la glycine, et de la lysine ou l'un de ses sels. Dessication
La formulation liquide de Facteur H peut subir une dessiccation si nécessaire, pour l'obtention d'une forme solide.
La dessiccation est un procédé d'élimination de l'eau à un stade poussé. Il s'agit d'une déshydratation visant à éliminer autant d'eau que possible. Ce phénomène peut être naturel ou forcé. Cette dessiccation peut être réalisée à l'aide des techniques de lyophilisation, d'atomisation et de cryoatomisation. Le mode préféré d'obtention de la forme solide de la composition à usage pharmaceutique selon l'invention est la lyophilisation.
Les méthodes de lyophilisation sont bien connues de l'homme du métier, voir par exemple Wang et al, Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals, International Journal of Pharmaceutics, Vol 203, p 1 -60, 2000.
D'autres procédés appropriés pour réduire le degré d'humidité ou la teneur en eau de la composition sont envisageables. De préférence le degré d'humidité est inférieur ou égal à 3% en poids, de préférence inférieur ou égal à 2,5%, de préférence inférieur ou égal à 2%, de préférence inférieur ou égal à 1 ,5%.
La composition solide peut être dissoute dans de l'eau pour préparations injectables (ou « water for injection ou WFI ») ou dans un solvant de reconstitution, pour obtenir une formulation à usage thérapeutique.
La figure et les exemples illustrent l'invention sans en limiter la portée.
Exemples :
Exemple 1 : Purification du Facteur H
Un concentré de Facteur H est préparé en suivant les étapes représentées à la Figure jointe. Ajustement du matériau de départ
On a utilisé comme matériau de départ une solution A, obtenue de la manière suivante : Du plasma décongelé a subi une cryoprécipitation. Après centrifugation, une partie du cryosurnageant a été soumis à une chromatographie sur DEAE Sephadex, qui fixe les facteurs vitamine K-dépendants. La fraction non retenue sur DEAE-Sephadex est mélangée avec le cryosurnageant restant pour constituer la Solution A. Celle-ci a été ajustée à un pH de 6.0 ± 0,1 avec une solution de HCI à 0,5N. Plusieurs lots ont été préparés à partir de la Solution A.
Chromatographie sur colonne Héparine -Sépharose FF
La solution A ajustée est soumise à une chromatographie sur colonne BP 1 13 contenant 1500 mL de gel Héparine-Sépharose Fast Flow (FF) (15cm x 10 cm) équilibrée dans un tampon de phosphate de sodium à 20 mM, une osmolalité de 60±5 mOsm/kg, pH 6,0±0,1. La même solution tampon a été utilisée pour laver le gel jusqu'au retour à la densité optique (DO) basale mesurée à 280nm. La charge protéique appliquée était de 320mg, 560 et 720 mg de protéines/mL de gel pour les lots 1 , 2, et 3, respectivement. Une solution tampon de phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 60mM, osmolalité de 165110 mOsm/kg, pH 7,4±0,1 a été injectée dans la colonne pour éluer les protéines qui étaient adsorbées faiblement sur le gel. Le gel a été ré-équilibré par passage de 2 à 3 volumes de solution tampon d'équilibrage ajustée à pH 6,5. Le Facteur H a ensuite été élué par l'injection d'une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 250mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 550110 mOsm/kg, pH 6,5±0,1 . Un lavage final de la colonne a été réalisé en injectant une solution de chlorure de sodium 2M pour éluer les protéines qui étaient fortement adsorbés au gel, en particulier l'Antithrombine III. Le débit linéaire était de 50cm/h pour toutes les étapes de chromatographie. La fraction de Facteur H éluée a été congelée à -80°C jusqu'à l'étape suivante.
Chromatographie sur colonne SP -Sépharose FF
La fraction contenant le Facteur H éluée à partir de la colonne Héparine-Sepharos FF a été décongelée dans un bain marie régulé à 30°C et ensuite ajustée aux conditions d'équilibrage de la colonne SP-Sépharose FF par dilution par de l'eau purifiée pour atteindre une osmolalité de 95±5 mOsm/kg, et si nécessaire ajout d'une solution d'HCI à 0,5N pour obtenir un pH de 6,5±0,1 . La fraction ajustée a été soumise à une chromatographie sur deux colonnes K50 montées en parallèle, chacune contenant 137mL de gel SP-Sépharose FF (7cm x 5cm) et équilibrée avec une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 95±5 mOsm/kg, pH 6,5±0,1 . La même solution tampon a été utilisée pour laver le gel jusqu'au retour à la densité optique (DO) basale mesurée à 280nm. Une solution contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 60mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 200±10mOsm/kg, pH 6,5±0,1 , a ensuite été injectée dans chaque colonne pour éluer les protéines qui étaient adsorbées faiblement au gel. Le Facteur H a ensuite été élué par injection d'une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 165mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 40015 mOsm/kg, pH 6,510,1.
Un lavage final de la colonne a été réalisé en injectant une solution de chlorure de sodium 2M pour éluer les protéines qui étaient fortement adsorbées sur le gel. Le débit linéaire de chromatographie était de 100cm/h pour toutes les étapes de chromatographie. La fraction de Facteur H éluée a été congelée à -80°C jusqu'à l'étape suivante. Traitement par Solvant- Détergent
La fraction de Facteur H éluée de la colonne de SP-Sépharose FF a été décongelée dans un bain marie régulé 30°C. Elle a été ensuite soumise à un traitement par Solvant- Détergent en présence de 1 % polysorbate 80 (Tween 80) (p/v) et 0,3% de tri-n-butyl phosphate (TnBP) (v/v) à 25+1 °C.
Chromatographie sur colonne Q-Sépharose FF
La fraction de Facteur H traitée par Solvant-Détergent a été ajustée aux conditions d'équilibrage pour la colonne Q-Sépharose FF par dilution avec de l'eau purifiée pour atteindre une osmolalité de 140+10 mOsm/kg, et ajout d'une solution de NaOH à 1 N pour obtenir un pH de 7,5+0,1 pour les lots 1 et 2 et en utilisant une solution HCI à 0,5M si nécessaire pour obtenir un pH de 6,5+0,1 pour le lot 3. La fraction ajustée a été soumise à une chromatographie sur une colonne K50 contenant 190mL de gel Q-Sépharose FF (9,5cm x 5cm) et équilibrée avec une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 25mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 140+10 mOsm/kg, pH 7,5+0,1 pour les lots 1 et 2, et pH de 6,5+0,1 pour le lot 3. La même solution tampon a été utilisée pour laver le gel jusqu'au retour à la densité optique (DO) basale mesurée à 280nm. Le gel a été lavé pour éliminer les protéines non adsorbées sur le gel et le TnBP et Tween 80. Une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 55mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 200+10 mOsm/kg, pH 7,5+0,1 pour les lots 1 et 2, et pH 6,5+0,1 pour le lot 3 a ensuite été injectée dans la colonne pour éluer les protéines qui étaient adsorbées faiblement au gel. Le Facteur H a ensuite été élué par injection d'une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 165mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 390+10mOsm/kg, pH 7,5+0,1 pour les lots 1 et 2, et pH 6,5+0,1 pour le lot 3. Un lavage final de la colonne a été réalisé en injectant une solution de chlorure de sodium 2M pour éluer les protéines qui étaient fortement adsorbées sur le gel. Le débit linéaire de chromatographie était de 150cm/h pour toutes les étapes de chromatographie. La fraction de Facteur H éluée a été congelée à -80°C jusqu'à l'étape suivante.
Filtration à 20-15n m
La fraction éluée e la colonne de Q-Sépharose FF a été ajustée à un pH de 6,5±0,1 pour les lots 1 et 3, et pH 7,5±0,1 pour le lot 2, et a ensuite été clarifiée-sur un filtre avec une taille de pores de 0,1 μηη et conservée une nuit à 4°C. La fraction clarifiée a été filtrée sur une séquence de filtres PLANOVA 20N et 15N au préalable équilibrée avec une solution tampon contenant du phosphate de sodium 20mM, chlorure de sodium 165mM, 4,5g/L arginine-HCI, osmolalité de 390±10mOsm/kg, pH 7,5 pour le lot 2, et pH 6,5 pour les lots 1 et 3. La pression de filtration à l'entrée, appliquée au filtre de 15nm était de 300±50mbar et était maintenue constante. La filtration a été réalisée à la température du laboratoire.
Concentration/Formulation
La fraction de Facteur H filtrée a été concentrée et formulée par diafiltration sur un module d'ultrafiltration équipé d'une membrane avec un seuil de coupure de poids moléculaire de 100kD.
Selon un exemple de formulation, pour les lots 2 et 3, on a utilisé une solution tampon composée de 12g/L arginine HCI, 3g/L isoleucine, 0,6g/L glycine, 0,6g/L, lysine HCI, 0,75 g/IL trisodium citrate, osmolalité 150±10mOsm/kg, pH 7,5±0,1 . La concentration protéique finale en Facteur H était de 5g/L.
Filtration 0,22μπι
Le produit concentré et formulé a été filtré sur un filtre de 0,22μηΊ Millipak 20 sous hotte à flux laminaire et conditionné.
Exemple 2 : Tests de pureté
Des échantillons des fractions de Facteur H en cours de purification ont été prélevés à la fin de chacune des étapes indiquées à l'exemple 1 .
Tests de purification
Le dosage du Facteur H est réalisé classiquement par méthode immunoenzymatique (ELISA) avec des réactifs commerciaux (Diagnostica Stago). Brièvement, le Facteur H à doser est capté par un anticorps anti-Facteur H humain immobilisé sur une phase solide. Le Facteur H fixé est ensuite reconnu par un immuno-conjugué à la peroxydase. Le taux de peroxydase liée est mesuré par son activité sur le substrat ortho-phénylènediamine en présence d'eau oxygénée. L'intensité de la coloration, après arrêt de la réaction par un acide fort, est fonction de la quantité de facteur H présente initialement dans l'échantillon. Le Facteur H ainsi dosé est appelé « Facteur H antigène » ou « Ag ». Les résultats de purification à partir de solution A sont indiqués dans les tableaux ci- dessous.
Tableau 1A : Pureté du Facteur H pour le Lot 1
Figure imgf000016_0001
Tableau 1 C : Pureté du Facteur H pour le Lot 3 Etape Facteur H Facteur H Concentration Pureté en (Mg/mL) (mg) protéique totale Facteur H
(mg/mL) (Ag/protéines totales)
Matériau de 360 5436 53,7 0,006
départ
Après l'élution de 1500 1 125 1 , 1 1 ,36
la colonne Q- Sepharose FF
Après la 9000 1080 6 1 ,5
concentration et la
formulation
Après la filtration 7300 905 5,5 1 ,33
à 0,22μιη (produit
fini)
Ces résultats montrent que les trois lots sont reproductibles. Les valeurs de pureté supérieures à 1 ,0 sont données à titre indicatif seulement. Evaluation des impuretés protéiques
La chromatographie sur Héparine-Sepharose FF élimine efficacement Albumine, Immunoglobulines G, Facteur I, Apolipoprotéines A, Ci -inhibiteur, Immunoglobulines A Alpha 1 -antitrypsine, Fibrinogène et Antithrombine III.
La chromatographie sur SP-Sépharose FF réduit les quantités de protéines de haut poids moléculaire telles que C3, Immunoglobulines M, et Apolipoprotéines B présentes dans l'éluat issu de la chromatographie sur Héparine-Sepharose FF.
La chromatographie sur Q-Sépharose FF élimine préférentiellement les protéines de bas poids moléculaire, telles que le Facteur B et le Facteur I résiduel, tout en réduisant encore les quantités dans les autres protéines.
Il a en outre été montré que le procédé de l'invention permettait la purification de Facteur H pas ou peu protéolysé. Dosage de l'activité anti-convertase du facteur H.
Le taux calculé correspond à la quantité de facteur H qui permet de dissocier 50% de la C3 convertase préformée, on l'appelle aussi EC 50 (concentration effective pour avoir 50% de l'activité). Un échantillon de pool de plasma est passé à chaque analyse pour servir de référence. Plus le pourcentage est élevé, plus il faut de facteur H pour dissocier la même quantité de C3 convertase donc moins le facteur H est actif. Toute augmentation du taux traduit une dénaturation de la protéine.
Tableau 2 : Activité fonctionnelle du Facteur H en cours de purification
Figure imgf000018_0001
Dans cet exemple, les lots 1 et 2 ci-dessus ont été produits à partir de surnageants de cryoprécipitation. Les résultats montrent qu'il n'y a pas de perte d'activité fonctionnelle du Facteur H en cours de purification et que celle-ci reste comparable à celle d'un plasma pris en référence.

Claims

Revendications
1 . Procédé de fabrication d'une préparation de Facteur H à usage thérapeutique comprenant les étapes consistant à :
(i) obtenir une fraction de plasma sanguin contenant du Facteur H ;
(ii) soumettre la fraction obtenue à l'étape (i) à une unique chromatographie d'affinité de type héparine;
(iii) soumettre la fraction enrichie en Facteur H obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations ;
(iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur H obtenue à l'étape (iii) à une chromatographie échangeuse d'anions,
ledit procédé ne comprenant pas d'étape supplémentaire de chromatographie d'affinité de type héparine.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que ladite fraction soumise à la chromatographie de type héparine est ajustée à un pH de 6.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un traitement d'inactivation virale, de préférence par l'action de solvant et détergent.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un traitement d'élimination virale, de préférence par nanofiltration.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, comprenant les étapes consistant à :
(i) obtenir (a) le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ou (b) une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions;
(ii) soumettre ledit surnageant ou ladite fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions, à une chromatographie d'affinité sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine, par ce en quoi on obtient une fraction enrichie en facteur H ;
(iii) (a) soumettre la fraction enrichie en Facteur H obtenue à l'étape (ii) à une chromatographie échangeuse de cations sur SP-Sépharose ; (iii) (b) soumettre la fraction enrichie en Facteur H obtenue à l'étape (iii) (a) à un traitement par solvant et détergent ;
(iv) soumettre la fraction enrichie en Facteur H obtenue à l'étape (iii) (b) à une chromatographie échangeuse d'anions sur Q-Sépharose.
6. Procédé selon la revendication 5, comprenant en outre des étapes de formulation, concentration, puis filtration du concentré de Facteur H.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, comprenant les étapes consistant à : (i) obtenir une fraction de plasma contenant du Facteur H, par exemple a) le surnageant d'un cryoprécipité de plasma sanguin éventuellement mélangé avec une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions ou (b) une fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions;
(ii) soumettre ledit surnageant ou ladite fraction plasmatique non retenue sur une chromatographie échangeuse d'anions, à une chromatographie d'affinité de type héparine, par exemple sur gel de sépharose sur lequel est greffée de l'héparine;
laver puis éluer le facteur H par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatrographie d'affinité de type héparine, diluer la fraction éluée, puis
(iii) (a) la soumettre à une chromatographie échangeuse de cations, par exemple sur SP- Sépharose ;
laver puis éluer le facteur H par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatrographie échangeuse de cations, diluer la fraction éluée, puis
(iii) (b) le cas échéant la soumettre à un traitement par solvant et détergent ;
(iv) puis la soumettre à une chromatographie échangeuse d'anions, par exemple sur Q- Sépharose ;
(v) laver et éluer le Facteur H, généralement par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage de la chromatographie échangeuse d'anions ;
(vi) préparer un concentré de Facteur H.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, comprenant en outre une étape de nanofiltration, de préférence sur un filtre de 20-15nm.
9. Préparation de Facteur H susceptible d'être obtenue par le procédé de l'une des revendications 1 à 8.
10. Préparation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite préparation est sous forme lyophilisée.
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