EA030251B1 - Способ снижения тромбоэмболического потенциала композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин - Google Patents

Abstract

В изобретении предлагаются способы снижения содержания амидолитической активности и активности против комплемента (АПК) в композиции, содержащей иммуноглобулин, путем применения катионообменной хроматографии. В конкретном варианте изобретения предлагаются способы уменьшения содержания фактора XI и/или фактора XIa и/или АПК в композиции, содержащей иммуноглобулин, путем сбора ранней фракции элюата катионообменной колонки. В изобретении также предлагается композиция, содержащая иммуноглобулин, которая содержит сниженные уровни амидолитической активности, фактора XI и/или фактора XIa и/или АПК.

Description

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере, частично на неожиданном открытии того факта, что значительные количества активности амидолитической (например, РΧI и/или ΡΧΡι) и/или активности против комплемента (АПК) могут быть удалены из композиции, содержащей иммуноглобулин, путем сбора только ранней фракции элюата катионообменной колонки. Таким образом, в данном описании предложены способы уменьшения концентрации серинпротеаз и проферментов серинпротеаз в ходе производства композиций, содержащих полученный из плазмы белок.

В одном из аспектов изобретение основано на открытии того факта, что в ходе постадийной элюации из катионообменной смолы, иммуноглобулины ^О высвобождаются из смолы до элюации значительной части амидолитической активности (например, которой способствует, по меньшей мере, РХ1 и/или ΡΧΡι) и/или АПК. Конкретно, было обнаружено, что при контакте катионообменной смолы, со связанными с ней иммуноглобулинами ^О и белками, способствующими амидолитической активности, с буфером элюации, рН которого больше чем по меньшей мере 7,0, начальная часть элюата, выходящая из колонки, обладает низким рН (например, рН ниже 5,0). Через некоторое время рН элюата, выходящего из колонки, сдвигается выше 7,0. Неожиданно было обнаружено, что начальная часть элюата с низким рН содержит низкие уровни амидолитической активности, РΧI и/или ΡΧΡι. и/или АПК, в то время как элюат, выходящий после сдвига рН, содержит значительно более высокие уровни амидолитической активности, ΡΧI и/или РХРк и/или АПК.

Соответственно в одном из аспектов настоящее изобретение основано на способе отделения значительной части амидолитической активности (например, фактор XI и/или фактор ΧΡι) и/или АПК от композиции, содержащей иммуноглобулин ^О, путем связывания иммуноглобулинов ^О, амидолитической активности и/или АПК с катионообменной смолой, элюации иммуноглобулинов ^О, амидолитической активности и/или АПК в ходе постадийной элюации, и сбор ранней фракции элюата, характеризующейся высоким выходом ^О, низкой амидолитической активностью и/или низким содержанием АПК, отдельно от поздней фракции элюата, характеризующейся низким выходом ^О, высокой амидолитической активностью и/или высоким содержанием АПК.

Среди других преимуществ способы по изобретению предлагают (1) простые способы удаления амидолитической активности из композиций, содержащих иммуноглобулин ^О, катионообменной хроматографией с постадийной элюацией; (2) простые способы быстрой идентификации фракций иммуноглобулина ^О в элюате катионообменной колонки, обладающих высокой амидолитической активностью (т.е. высокое содержание ΡXI и/или ΡΧΡι), на основании мониторинга рН элюата; (3) способы удаления амидолитической активности из композиции, содержащей иммуноглобулин ^О, на которые не влияет

- 3 030251

концентрация белка, загруженного на катионообменную смолу, что позволяет простое масштабирование производственных процессов в больших масштабах; (4) способы, которые позволяют быстро определить, какие фракции элюата иммуноглобулина 1дС из катионообменной колонки следует использовать для дальнейшей обработки, на основании мониторинга рН; (5) способы, которые позволяют значительно уменьшить амидолитическую активность (например, содержание РХ1 и/или РХ1а) с минимальной потерей выхода иммуноглобулина 1дС; (6) способы производства композиций, содержащих иммуноглобулин 1дС. со сниженной концентрацией агрегатов 1дС. сниженной активностью ПКА, сниженной амидолитической активностью по данным анализа с использованием хромогенных субстратов (в том числе, не ограничиваясь им, субстрата РЬ-1), повышенной концентрацией мономера 1дС и более желательным распределением подкласса 1дС; (7) способы, которые позволяют быстро определить, какие фракции элюата иммуноглобулина 1дС из катионообменной колонки следует использовать для дальнейшей обработки, на основании объема элюации на хроматографической стадии; (8) способы, которые позволяют быстро определить, какие фракции элюата иммуноглобулина 1дС из катионообменной колонки следует использовать для дальнейшей обработки, на основании оптической плотности белка в конкретной фракции; (9) возможность использовать преимущественные признаки изобретения в крупномасштабных производственных процессах; (10) обогащение амидолитической активности для целей идентификации и количественного определения; (11) простые способы удаления активности против комплемента (АПК) из композиций, содержащих иммуноглобулин 1дС, методом катионообменной хроматографии с постадийной элюацией; (12) простые способы быстрой идентификации фракций элюата иммуноглобулина 1дС из катионообменной колонки с высокой активностью против комплемента (АПК) на основании мониторинга рН элюата; (13) способы удаления активности против комплемента (АПК) из композиции, содержащей иммуноглобулин 1дС, на которые не влияет концентрация белка, загруженного на катионообменную смолу, позволяющие простое масштабирование для производственных процессов в больших масштабах; (14) способы, которые позволяют значительно уменьшить активность против комплемента (АПК) с минимальной потерей выхода иммуноглобулина 1дС; (15) способы производства композиций, содержащих иммуноглобулин 1дС, со сниженной концентрацией агрегата 1дС, сниженной активностью против комплемента (АПК), повышенной концентрацией мономера 1дС и более желательным распределением подкласса 1дС; и (16) обогащение активности против комплемента (АПК) для целей идентификации и количественного определения.

II. Определения.

В данном описании термин лечение "внутривенным введением 1дО" или "1УЮ", в общем, обозначает терапевтический способ внутривенного, подкожного или внутримышечного введения композиции, содержащей иммуноглобулины 1дС, больному для лечения целого ряда состояний, таких как иммунодефициты, воспалительные заболевания и аутоиммунные заболевания. Иммуноглобулины 1дС обычно объединены в пул и получены из плазмы. Могут применяться цельные антитела или фрагменты. Иммуноглобулины 1дС могут быть введены в препараты в более высоких концентрациях (например, более 10%) для подкожного введения, или введены в препараты для внутримышечного введения. Это особенно распространено среди препаратов 1дС, специфичных в отношении конкретных антигенов (например, фактор КНо Ό, токсин коклюша, токсин столбняка, токсин ботулизма, бешенство, и т.п.), которые получают с титрами выше средних. Для легкости обсуждения, такие препараты композиций, содержащих 1дС, для подкожного или внутримышечного введения также включены в термин "1УЮ" в данной заявке.

В данном описании термин "амидолитическая активность" обозначает способность полипептида катализировать гидролиз по меньшей мере одной пептидной связи в другом полипептиде. Профиль амидолитической активности для композиции, содержащей иммуноглобулин 1дС, может быть определен с помощью анализа с применением различных хромогенных субстратов, обладающих различной специфичностью для протеаз, найденных в человеческой плазме, в том числе, не ограничиваясь ими: РЬ-1 (широкий спектр), δ-2288 (широкий спектр), δ-2266 (РХ1а, железистые калликреины), δ-2222 (РХа, трипсин), δ-2251 (плазмин) и δ-2302 (калликреин, РХ1а, и РХПа). Способы определения амидолитической активности композиции хорошо известны в данной области, например, как описано в М. ЕЩсНеИ с1 а1. (Иепййсайоп оГ ка1Пкге1п апй РХ1а ак шрштйек ίη 1йегареийс шшшподкЬиПпк: ппрПсаЕопк Гог 1йе каГе1у апй соп1го1 оГ шйауепоик Ыоой ргойисК Уох 8апд 2011; содержание которой, таким образом, явно объединено путем ссылки в полном объеме и для всех целей.)

В данном описании термины "активность против комплемента", "антикомплементарная активность" и "АПК" используются равнозначно и обозначают способность композиции, содержащей белок, например композиции, содержащей иммуноглобулин 1дС, потреблять потенциал комплемента в анализе комплемента, например способ, в значительной мере основанный на методе, описанном в "РиЪИс НеаЙН МоподгарН" Ыо. 74; 5>1апйагй1/ей И1адпо8Йс Сотр1етеп1 Ихайоп Мейюй апй Айарййоп Ю МюгоЮкЕ ХУакНшдТоп, 1965, и Е.А. КаЬа1 апй М. Мауег, Ехрейтейа1 1ттипосНет151гу; 2^пй Ей. ТНотак 8ргшдйе1й 1961, содержание которых, таким образом, явно включено путем ссылки в полном объеме и для всех целей. Типичная единица активности комплемента представляет собой количество комплемента, которое будет вызывать лизис 2,5х10⁸, из общего количества 5х10⁸ оптимально сенсибилизированных эритроцитов в анализе активности комплемента, описанном в данном описании.

- 4 030251

В одном из вариантов АПК измеряют с использованием стандартизированной суспензии антителосенсибилизированных овечьих эритроцитов, которые инкубируют с различными разведениями сыворотки морской свинки, служащей источником комплемента. Степень гемолиза измеряют спектрофотометрически. Например, для определения активности против комплемента продукта иммуноглобулина, готовят тестовые растворы, которые содержат различные количества продукта иммуноглобулина и 2 С'Н₅₀единицы сыворотки морской свинки на 1 мл. В конкретном варианте активность против комплемента измеряют, инкубируя определенное количество испытуемого материала (например, 10 мг иммуноглобулина 1§О) с определенным количеством комплемента (например, 20 С'Н₅₀) морской свинки, и остаток комплемента титруют. Активность против комплемента выражают, как процент потребления комплемента относительно контроля комплемента, принятого за 100%. В одном из вариантов АПК измеряют в соответствии со стандартами, сформулированными в Европейской фармакопее: Нормальный человеческий иммуноглобулин для внутривенного введения. Европейская фармакопея 6,3, монография 2,6,17, 4166-4168. Совет Европы, Страсбург ГСП, Франция, содержание которой, таким образом, явно включено в данное описание путем ссылки в полном объеме и для всех целей.

Способы уменьшения активности против комплемента композиций, предназначенных для внутривенного введения, описаны в литературе (5>е1ш11/. Н.Е. апб 8ск№1ск, О., Этск. теб. ХУоскетскпП 87 (1962), 1643; Вагапбип, 8. е! а1., Уох 8апд. 28 (1957), 157; Вагапбип, δ. е! а1., Уох 8апд. 7 (1962), 187 и 81еркеп, ΚΙίπ Ζ. Скет. К1ш. Вюскет. 7 (1969), 282, содержание которых, таким образом, явно включено в данное описание путем ссылки в полном объеме и для всех целей).

В данном описании "криообедненная плазма" обозначает супернатант, образованный после холодного осаждения (криопреципитации) плазмы или объединенной в пул плазмы при температурах, приближающихся к температуре замерзания, например при температуре ниже приблизительно 10°С. В контексте настоящего изобретения плазма может равнозначно обозначать выделенную плазму (т.е. плазму, которая отделена от цельной крови ех νίνο) или исходную плазму (т.е. плазму, собранную посредством плазмафереза). Криопреципитацию обычно выполняют, например, путем размораживания ранее замороженной, объединенной в пул плазмы, для которой уже проведены анализа на безопасность и качество, хотя свежая плазма также может использоваться. Размораживание обычно осуществляют при температуре не выше 6°С. После полного размораживания замороженной плазмы при низкой температуре, проводят центрифугирование на холоде (например, <6°С), чтобы отделить твердый криоосадок от жидкого супернатанта. Альтернативно, стадия отделения может выполняться с помощью фильтрации вместо центрифугирования.

В данном описании "пул Коэна" обозначает исходный материал, используемый для фракционирования образца плазмы или пула образцов плазмы. Пулы Коэна включают цельную плазму, образцы криообедненной плазмы и пулы образцов криообедненной плазмы, которые могут проходить или не проходить стадию предварительной обработки. В некоторых вариантах пул Коэна представляет собой образец криообедненной плазмы, из которой один или более факторов крови удалены на стадии предварительной обработки, например, адсорбцией на твердую фазу (такую как гидроксид алюминия, тонко измельченный кремния диоксид, и т.п.) или хроматографией (например, ионообменной или хроматографией аффинности гепарина). Различные факторы крови, в том числе, но, не ограничиваясь ими, обходная активность ингибитора фактора VIII (ОАИФВ), комплекс фактора IX, концентрат фактора VII или комплекс антитромбина III, могут быть выделены из образца криообедненной плазмы, с образованием пула Коэна.

В данном описании термин "ранняя фракция элюата" обозначает первую фракцию композиции, содержащей иммуноглобулин, элюирующуюся из катионообменной смолы, причем данная фракция характеризуется высоким выходом иммуноглобулина и сниженной амидолитической активностью по сравнению с общей амидолитической активностью, связанной со смолой до элюации. Ранняя фракция элюата представляет собой первую фракцию элюата, выходящую из катионообменной колонки, которая появляется до выхода (т.е. элюации) второй фракции композиции, содержащей иммуноглобулин (обозначается как "поздняя фракция элюата"). Поздняя фракция элюата содержит только небольшое количество иммуноглобулинов (обычно не более 25, предпочтительно не более 10% иммуноглобулина, связанного с колонкой) и характеризуется более высокой концентрацией амидолитической активности по сравнению с ранней фракцией элюата. В различных вариантах ранняя и поздняя фракции элюата могут быть определены по различным характеристикам, в том числе, не ограничиваясь ими, рН элюата, выход белка (например, выраженный как процент от белка, связанного со смолой), концентрация белка в элюате (например, по данным оптической плотности), объем элюата, и т.п.

В данном описании термин "ультрафильтрация (УТФ)" включает множество способов мембранной фильтрации, в которых гидростатическое давление вынуждает жидкость двигаться против полупроницаемой мембраны. Суспендированные твердые вещества и растворенные высокомолекулярные вещества удерживаются, тогда как вода и растворенные низкомолекулярные вещества проходят сквозь мембрану. Такой способ разделения часто применяется для очистки и концентрации растворов макромолекулярных веществ (10³-10⁶ Да), особенно растворов белка. Доступен целый ряд мембран для ультрафильтрации, в зависимости от размера молекул, которые они удерживают. Ультрафильтрация обычно характеризуется

- 5 030251

размером пор мембраны от 1 до 1000 кДа и рабочим давлением от 0,01 до 10 бар, и особенно пригодна для отделения белков от молекул небольшого размера, таких как сахара и соли.

В данном описании термин "диафильтрация" применяется в связи с такими же мембранами, как ультрафильтрация, и процесс может быть осуществлен как тангенциальная фильтрация потока, так и режим фильтрации с глухим концом. В ходе диафильтрации, буфер вводят в рециклизационный резервуар, в то время как фильтрат удаляют из рабочего модуля. В процессах, где продукт находится в удерживаемой части (например, иммуноглобулины 1дС), диафильтрация вымывает компоненты из пула продукта в фильтрат, таким образом, обменивая буферы и снижая концентрации нежелательных молекул.

В данном описании термин "поверхностно активное вещество" используется равнозначно с термином "детергент" или "поверхностно-активный агент". Поверхностно-активные вещества обычно представляют собой органические соединения, которые являются амфифильными, т.е. содержат как гидрофобные группы ("хвосты"), так и гидрофильные группы ("головы"), что делает поверхностно-активные вещества растворимыми как в органичных растворителях, так и воде. Поверхностно-активное вещество может быть классифицировано по присутствию формально заряженных групп в его голове. Неионное поверхностно-активное вещество не содержит заряженных групп в голове, тогда как ионное поверхностно-активное вещество несет чистый заряд на голове. Цвиттер-ионное поверхностно-активное вещество содержит голову с двумя противоположно заряженными группами. Некоторые примеры распространенных поверхностно-активных веществ включают анионные (основанные на анионах сульфата, сульфоната или карбоксилата): перфтороктаноат (ПФОА или ПФО), перфтороктансульфонат (ПФОС), натрий додецилсульфат (НДС), аммоний лаурилсульфат и другие соли алкилсульфатов, натрия лаурилсульфат (также известный как натрий лаурилсульфатный эфир или НЛСЭ), сульфонат алкилбензола; катионные (основанные на четвертичных катионах аммония): триметиламмоний цетилбромид (ЦТАБ) или гексадецилтриметиламмония бромид и другие алкилтриметиламмониевые соли, цетилпиридиния хлорид (ЦПХ), полиэтоксилированный амин (ПОЭА) жира, бензалкония хлорид (БАХ), бензэтония хлорид (БЭХ); длинноцепочечные жирные кислоты и их соли: в том числе, каприлат, каприловая кислота, гептаноат, гексановая кислота, гептановая кислота, нановая кислота, декановая кислота, и т.п.; цвиттер-ионные (амфотерные): додецилбетаин; кокамидопропилбетаин; кокоамфоглицинат; неионные: алкил поли(этиленоксид), алкилфенол поли(этиленоксид), сополимеры поли(этиленоксида) и поли(пропиленоксид) (коммерчески известные как полоксамеры или полоксамины), алкилполигликозиды, в том числе, октилгликозид, децилмальтозид, жирные спирты (например, цетиловый спирт и олеиловый спирт), кокамид МЭА, кокамид ДЭА, полисорбаты (Твин 20, Твин 80 и т.п.), поверхностно-активные вещества Тритон и додецил диметиламиноксид.

В данной заявке термин "распыление (обрызгивание)" обозначает средство доставки жидкой субстанции в систему, например, в ходе стадии осаждения спиртом, такой как стадия осаждения модифицированной фракции Коэна I или ΙΙ+ΙΙΙ, в форме мелких капель или тумана жидкой субстанции. Распыление может производиться любым герметизируемым устройством, таким как емкость (например, бутыль для распыления), оборудованная головкой или насадкой для распыления, которое управляется вручную или автоматически, чтобы генерировать тонкий туман из жидкости. Обычно распыление проводят, пока система, в которую поступает жидкая субстанция, беспрерывно перемешивается, или происходит перемешивание другим способом, чтобы гарантировать быстрое и равномерное распределение жидкости в пределах системы.

"Терапевтически эффективное количество или доза" или "достаточное/эффективное количество или доза" обозначает дозу, которая оказывает воздействие, для которого ее водили. Точная доза будет зависеть от цели лечения и сможет быть определена специалистом в данной области с применением известных методик (см., например, ЫеЬегтап, Рйагтасеийса1 Эохаде Рогтк (νοίδ. 1-3, 1992); Ь1оуй, Тйе Ай, δοίепсе апй Тесйио1оду о£ Рйагтасеийса1 Сотроиийшд (1999); Рюкаг, Эохаде Са1си1айои8 (1999); и Репипд1оп: Тйе 8с1еисе апй Ргасйсе о£ Рйагтасу, 20'¹'Еййюп, 2003, Сепиаго, Ей., Ырртсой, Аййатк & АПкнъ).

ΙΙΙ. Снижение амидолитической активности.

В одном из аспектов настоящего описания предлагаются хроматографические способы уменьшения амидолитической активности (например, путем снижения содержания ΡΧΙ/ΡΧΡι и/или ΡΧΙΙ/РХПа) композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин Ι§Η Дополнительно, в описании предлагаются композиции, содержащие полученный из плазмы иммуноглобулин Ι§Η которые содержат низкие уровни амидолитической активности (например, низкие уровни ΡΧΙ/ΡΧΡι и/или ΡΧΙΙ/РХПа), полученные в соответствии со способами, предложенными в данном описании. Преимущественно способы, описанные в данном описании, обеспечивают композиции, содержащие полученный из плазмы иммуноглобулин Ι§Η с улучшенными профилями безопасности. Конкретно, композиции, которые обеспечивают данные способы, обладают сниженным потенциалом индуцирования побочных тромбоэмболических осложнений, по сравнению с производимыми в настоящее время композициями, содержащими иммуноглобулин Ι§Η

А. Способы фракционирования.

Настоящее изобретение частично основано на открытии того факта, что большая часть амидолитической активности, присутствующей в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобу- 6 030251

лин, элюируется из катионообменной смолы в поздней фракции элюата, образованной на стадии элюации, в то время как большая часть фракции иммуноглобулина элюируется в ранней фракции указанного элюата. Соответственно путем сбора ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, значительно снижается амидолитическая активность полученного препарата иммуноглобулина. Конкретно, в данном описании показано, что содержание фактора Х1а, и, таким образом, амидолитическая активность, связанная с содержимым фактора Х1а, значительно снижены в композициях, содержащих иммуноглобулин, полученных в соответствии со способами, предложенными в данном описании.

Соответственно в одном из вариантов настоящего изобретения предлагается способ уменьшения количества амидолитической активности в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) связывание иммуноглобулинов 1§С и амидолитической активности (т.е. загрязняющих компонентов белка, обладающих амидолитической активностью) на катионообменной смоле; (б) необязательное промывание катионообменной смолы, со связанным на ней белком, буфером для промывания, с целью удаления несвязанных загрязняющих компонентов; (в) проведение одностадийной элюации иммуноглобулинов 1§С и амидолитической активности и (г) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата содержит композицию, содержащую иммуноглобулин 1дС. со сниженной амидолитической активностью, по сравнению с исходной композицией, и поздняя фракция элюата содержит высокую концентрацию амидолитической активности. В конкретном варианте амидолитическая активность представляет собой активность фактора Х1а, присутствующего в композиции. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

В конкретном варианте изобретения предлагается способ уменьшения количества фактора XI (РХ1) и/или фактора Х1а (РХ1а) в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) контакт композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, которая содержит иммуноглобулины 1§С и РХ1 и/или РХ1а, с катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, включающих рН не более 6,0 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов и по меньшей мере части РХ1 и/или РХ1а с катионообменной смолой; (б) элюация иммуноглобулинов из катионообменной смолы путем контакта катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет по меньшей мере 7,5 и проводимость по меньшей мере 15 мСм/см, с получением элюата; и (в) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата содержит композицию, содержащую иммуноглобулин 1§С, со сниженной амидолитической активностью, по сравнению с исходной композицией, и поздняя фракция элюата содержит высокую концентрацию амидолитической активности. В другом конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 20 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 22 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 25 мСм/см. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

В одном из конкретных вариантов изобретение включает следующие стадии: (а) контакт композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, которая содержит иммуноглобулины 1§С и РХ1 и/или РХ1а, с катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, которые включают рН от 4,8 до 5,6 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов и по меньшей мере части РХ1 и/или РХ1а с катионообменной смолой; (б) элюация иммуноглобулинов из катионообменной смолы путем контакта катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет по меньшей мере 7,5 и проводимость по меньшей мере 15 мСм/см, с получением элюата; и (в) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата содержит композицию, которая содержит иммуноглобулин 1§С, со сниженной амидолитической активностью, по сравнению с исходной композицией, и поздняя фракция элюата содержит высокую концентрацию амидолитической активности. В конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,3. В другом конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,2. В другом конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,1. Еще в одном конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2. В других вариантах условия первого раствора включают рН 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 или 6,0. В другом конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 20 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 22 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 25 мСм/см. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

В одном из конкретных вариантов изобретение включает следующие стадии: (а) контакт композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, которая содержит иммуноглобулины 1§С и

- 7 030251

ΡΧΙ и/или РХ1а, с катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, включающих рН не более 6,0 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов и по меньшей мере части ΡΧΙ и/или РХ1а с катионообменной смолой; (б) промывание смолы со связанными иммуноглобулинами и ΡΧΙ и/или РХ1а буфером, обладающим достаточно низкой проводимостью, таким образом, что иммуноглобулины не элюируются из смолы, с рН от 5,1 до 5,9; (в) элюация иммуноглобулинов из катионообменной смолы путем контакта катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет по меньшей мере 7,5 и проводимость по меньшей мере 15 мСм/см, с получением элюата; и (г) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата содержит композицию, содержащую иммуноглобулин 1§О, со сниженной амидолитической активностью, по сравнению с исходной композицией, и поздняя фракция элюата содержит высокую концентрацию амидолитической активности. В конкретном варианте рН буфера для промывания составляет 5,5±0,3. В другом конкретном варианте рН буфера для промывания составляет 5,5±0,2. В другом конкретном варианте рН буфера для промывания составляет 5,5±0,1. В другом конкретном варианте рН буфера для промывания составляет 5,5. В других вариантах рН буфера для промывания составляет 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 или 6,0. В другом конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 20 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 22 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 25 мСм/см. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

В одном из конкретных вариантоизобретение включает следующие стадии: (а) контакт композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, которая содержит иммуноглобулины 1§О и ΡΧΙ и/или РХ1а, с катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, включающих рН не более 6,0 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов и по меньшей мере части ΡΧΙ и/или РХ1а с катионообменной смолой; (б) элюация иммуноглобулинов из катионообменной смолы путем контакта катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет 7,8±0,4 и проводимость по меньшей мере 20 мСм/см, с получением элюата; и (в) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата содержит композицию, содержащую иммуноглобулин Ι§Ο, со сниженной амидолитической активностью, по сравнению с исходной композицией, и поздняя фракция элюата содержит высокую концентрацию амидолитической активности. В конкретном варианте рН буфера элюации составляет 7,8±0,3. В другом конкретном варианте рН буфера элюации составляет 7,8±0,2. В другом конкретном варианте рН буфера элюации составляет 7,8±0,1. В другом конкретном варианте рН буфера элюации составляет 7,8. В других вариантах рН буфера элюации составляет 7,0, 7,1, 7,2, 7,36, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 или 8,5. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 22 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 25 мСм/см. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

В общем, исходный материал, используемый для способов, предложенных в данном описании, содержит любую фракцию плазмы или композицию, содержащую иммуноглобулин Ι§Ο и амидолитическую активность. Таким образом, в одном из вариантов плазма частично или полностью фракционирована в соответствии с любой из схем очистки, известных в данной области. В конкретном варианте плазму фракционируют таким образом, чтобы получить осадок фракции Ι, осадок фракции ΙΙ, осадок фракции Ι+ΙΙ+ΙΙΙ, осадок фракции ΙΙ+ΙΙΙ, фракцию Ιν-1, осадок А Кистлера-Нитшманна, осадок В КистлераНитшманна или модифицированный осадок любого из указанного выше, который может использоваться в качестве исходного материала для способов, предложенных в данном описании.

В предпочтительном варианте плазму фракционируют с помощью одной или более стадий осаждения этанолом. Стадии осаждения этанолом могут применяться для осаждения желательных иммуноглобулинов из раствора, при сохранении по меньшей мере одного неиммуноглобулинового белка в супернатанте, или осаждения по меньшей мере одного неиммуноглобулинового белка из раствора, при сохранении желательного иммуноглобулина в супернатанте. Способы фракционирования иммуноглобулинов, таким образом, хорошо известны в данной области. Примеры этанольных осадков включают, не ограничиваясь ими, осадок фракции Ι, осадок фракции Ι+ΙΙ+ΙΙΙ, осадок фракции ΙΙ+ΙΙΙ, фракцию Ιν-1, осадок А Кистлера-Нитшманна, осадок В Кистлера-Нитшманна и модифицированный осадок любого из указанного выше. В особенно предпочтительном варианте иммуноглобулины, присутствующие в криообедненной плазме, обогащены с помощью четырехстадийного этанольного процесса, включающего стадию осаждения фракции Ι+ΙΙ+ΙΙΙ, стадию осаждения А, стадию осаждения В и стадию осаждения фракции ΙΙ.

В одном из вариантов исходный материал для способов уменьшения амидолитической активности, предложенных в данном описании, получают путем фракционирования этанолом объединенной в пул человеческой плазмы (например, криообедненная плазма). В одном из конкретных вариантов фракцио- 8 030251

нирование этанолом включает осаждение фракции Ι+ΙΙ+ΙΙΙ криообедненной плазмы, осаждение фракции А суспендированного осадка фракции Ι+ΙΙ+ΙΙΙ, осаждение фракции В суспендированного осадка фракции А, и осаждение фракции II супернатанта фракции А, как описано ниже. В другом конкретном варианте фракционирование этанолом включает осаждение фракции I криообедненной плазмы, осаждение фракции ΙΙ+ΙΙΙ супернатанта фракции Ι и осаждение фракции ΙΙ суспендированного осадка фракции ΙΙ+ΙΙΙ.

Как продемонстрировано в данном описании, преимущественные признаки способов, предложенных в данном описании, сохраняются в производственных методиках большого масштаба. Относительно получения композиций, содержащих иммуноглобулин Ι§0, крупномасштабное производство обозначает процессы, которые обогащают иммуноглобулины по меньшей мере из 100 л объединенного в пул исходного материала плазмы (например, криообедненная плазма). В общем, крупномасштабные производственные процессы иммуноглобулина фракционируют от 100 до 20000 л объединенной в пул плазмы на серию. В некоторых вариантах крупномасштабный процесс производства иммуноглобулина ΙβΟ обозначает фракционирование по меньшей мере 100 л объединенной в пул плазмы (например, криообедненная плазма). В другом варианте процесс крупномасштабного производства иммуноглобулина ΙβΟ обозначает фракционирование по меньшей мере 500 л объединенной в пул плазмы (например, криообедненная плазма). В другом варианте процесс крупномасштабного производства иммуноглобулина ΙβΟ обозначает фракционирование по меньшей мере 1000 л объединенной в пул плазмы (например, криообедненная плазма). В другом варианте процесс крупномасштабного производства иммуноглобулина ΙβΟ обозначает фракционирование по меньшей мере 5000 л объединенной в пул плазмы (например, криообедненная плазма). Еще в одном варианте процесс крупномасштабного производства иммуноглобулина ΙβΟ обозначает фракционирование по меньшей мере 10000 л объединенной в пул плазмы (например, криообедненная плазма).

В общем, предусмотрены способы, включающие все комбинации условий загрузки, условий промывания и условий элюации, описанных выше. К тому же, способы, содержащие все комбинации конкретных хроматографических условий, предусмотрены со всеми возможными схемами для определения и сбора ранней фракции элюата, как описано ниже.

Ранние и поздние фракции элюата катионообменной колонки.

В одном из аспектов настоящего изобретения предлагаются способы уменьшения амидолитической активности, и, конкретно, амидолитической активности, возникающей из примесей ΡΧΙα. присутствующей в препаратах иммуноглобулина, путем сбора ранней фракции элюата катионообменной колонки. Преимущественно в данном описании показано, что ранняя фракция элюата, полученная путем одностадийной элюации в рамках стадии катионообменной хроматографии, содержит большую часть желательного иммуноглобулина, в то время как поздняя фракция элюата содержит большую часть нежелательной амидолитической активности. Поскольку элюация иммуноглобулинов и амидолитической активности не может быть полностью разделена, необходимо определить разделение между ранней и поздней фракциями элюата. Два основных фактора могут быть приняты во внимание при формировании такого определения, а именно: (ί) в зависимости от того, каким образом определяют раннюю и позднюю фракции элюата, большая или меньшая часть амидолитической активности будет извлекаться в ранней фракции т.е. большая часть амидолитической активности может быть отделена от содержания иммуноглобулина, если раннюю фракцию элюата определить как меньшую часть всего элюата, и наоборот; и (ίί) в зависимости от того, каким образом определяют раннюю и позднюю фракции элюата, большие или меньшие выходы иммуноглобулина будут присутствовать в ранней фракции -т.е. более низкий выход иммуноглобулина будет достигаться, если ранняя фракция элюата определена как меньшая часть всего элюата, и наоборот.

Соответственно квалифицированный специалист будет принимать решение относительно того, где проводить границу между ранней и поздней фракцией элюата катионообменной колонки, на основании индивидуальных потребностей. Например, при получении небольшой очищенной партии для исследовательских целей или специализированной терапевтической цели, квалифицированный специалист мог бы максимизировать мощность способа разделения, собирая меньшую раннюю фракцию элюата, и при этом жертвуя конечным выходом иммуноглобулина. И, наоборот, при осуществлении крупномасштабного производства (например, обработка более 500 л криообедненной плазмы), цена выбора может диктовать необходимость сбора ранней фракции элюата большего размера, чтобы увеличить выход иммуноглобулина за счет более скромного уменьшения в амидолитической активности композиции.

В различных вариантах ранняя и поздняя фракции элюата могут быть определены по различным характеристикам, в том числе, не ограничиваясь ими, рН элюата, выход белка (например, выраженный, как процент белка, связанного со смолой), концентрация белка (например, определенная по данным оптической плотности) в элюате, объем элюата и т.п.

а. рН элюата.

Как продемонстрировано в примерах, приведенных в данном описании, начало стадии элюации из катионообменной колонки характеризуется снижением рН раствора, выходящего из колонки, до рН ниже 5,0, несмотря на буфер элюации с более высоким рН (в общем, > 7,0), по сравнению со стадиями загрузки и промывания колонки (в общем, 5,0-6,0). Такое снижение рН соответствует элюации композиции,

- 9 030251

содержащей иммуноглобулин 1§О, с низкой амидолитической активностью и низким содержанием фактора Х1а (см., например, табл. 4 и 11 соответственно). В более поздней точке элюации, рН раствора, выходящего из колонки, резко повышается, до значений выше 6,0-8,0. Такой сдвиг рН сопровождается значительным увеличением амидолитической активности и содержания фактора Х1а в элюате (см., например, табл. 4 и 11 соответственно). Поэтому, хотя стадия элюации выполняется с применением одного и того же буфера элюации с высоким рН (в общем, выше 7,0), профиль элюации показывает двухфазйную элюацию, в ходе которой иммуноглобулины 1§О элюируются из колонки первыми, после чего следует сопроводительная амидолитическая активность (например, фактор XI и/или фактор Х1а). Поэтому, в некоторых вариантах раннюю и позднюю фракции элюата определяют на основании рН элюата на выходе колонки.

Соответственно в одном из аспектов настоящего изобретения предлагается способ уменьшения количества амидолитической активности в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) связывание иммуноглобулинов 1§О и амидолитической активности (т.е. загрязняющих компонентов белка, обладающих амидолитической активностью) на катионообменной смоле; (б) необязательное промывание катионообменной смолы, со связанным на ней белком, буфером для промывания, с целью удаления несвязанных загрязняющих компонентов; (в) проведение одностадийной элюации иммуноглобулинов 1§О и амидолитической активности и (г) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 7,0. В конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 6,5. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 6,0. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 5,5. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 5,0. В других вариантах ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0 или менее. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

В конкретном варианте изобретения предлагается способ уменьшения количества фактора XI (РХ1) и/или фактора Х1а (РХ1а) в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) контакт композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, которая содержит иммуноглобулины 1§О и РХ1 и/или РХ1а, с катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, включающих рН не более 6,0 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов и по меньшей мере части РХ1 и/или РХ1а с катионообменной смолой; (б) элюация иммуноглобулинов из катионообменной смолы путем контакта катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет по меньшей мере 7,5 и проводимость по меньшей мере 15 мСм/см, с получением элюата; и (в) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 7,0. В конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 6,5. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 6,0. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 5,5. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 5,0. В других вариантах, В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, или менее. В другом конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 20 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 22 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 25 мСм/см. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

б. Оптическая плотность элюата.

Еще в одном варианте, особенно пригодном для крупномасштабного производства композиций, содержащих иммуноглобулин, раннюю и позднюю фракции элюата определяют на основе концентрации иммуноглобулина, элюирующегося из катионообменной колонки. Например, в ходе крупномасштабного производства, композиция, содержащая иммуноглобулин, может быть загружена на катионообменную смолу с достаточно высоким содержанием белка (например, > 80 мг белка на 1 мл смолы), таким образом, что пик элюата показывает высокую концентрацию. В таких образцах, ранняя фракция элюата может быть определена как часть элюата, которая элюировалась до точки, в которой ΟΌ₂₈₀ снижается ниже порогового значения. Таким образом, грубо говоря, одинаковый выход иммуноглобулинов может быть воспроизводимым образом получен от одного препарата к другому, независимо от незначительных вариаций между производственными циклами. Как продемонстрировано в примере 9, применение данной схемы сбора для крупномасштабного производственного процесса приводит к получению высокого вы- 10 030251

хода композиции, содержащей иммуноглобулин 1§С, со значительно сниженным значением в анализе образования тромбина (АОТ) и амидолитической активностью.

Соответственно в одном из аспектов настоящего изобретения предлагается способ уменьшения количества амидолитической активности в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) связывание иммуноглобулинов 1§С и амидолитической активности (т.е. загрязняющих компонентов белка, обладающих амидолитической активностью) на катионообменной смоле; (б) необязательное промывание катионообменной смолы, со связанным на ней белком, буфером для промывания, с целью удаления несвязанных загрязняющих компонентов; (в) проведение одностадийной элюации иммуноглобулинов 1§С и амидолитической активности и (г) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением ОО₂₈₀ по меньшей мере 0,5 ОЕ. В конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением ΟΌ₂₈₀ по меньшей мере 1,0 ОЕ. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением ΟΌ₂₈₀ по меньшей мере 1,5 ОЕ. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением ΟΌ₂₈₀ по меньшей мере 2,0 ОЕ. В других конкретных вариантах ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением ΟΌ₂₈₀ по меньшей мере

0,1 ОЕ, 0,2 ОЕ, 0,3 ОЕ, 0,4 ОЕ, 0,5 ОЕ, 0,6 ОЕ, 0,7 ОЕ, 0,8 ОЕ,

0,9 ОЕ, 1,0 ОЕ, 1,1 ОЕ, 1,2 ОЕ, 1,3 ОЕ, 1,4 ОЕ, 1,5 ОЕ, 1,6 ОЕ, 1,7 ОЕ, 1,8 ОЕ, 1,9 ОЕ, 2,0 ОЕ или более. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

В конкретном варианте изобретения предлагается способ уменьшения количества фактора XI (РХ1) и/или фактора Х1а (РХ1а) в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) контакт композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, которая содержит иммуноглобулины 1§С и РХ1 и/или РХ1а, с катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, включающих рН не более 6,0 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов и по меньшей мере части ΡΧΙ и/или РХ1а с катионообменной смолой; (б) элюация иммуноглобулинов из катионообменной смолы путем контакта катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет по меньшей мере 7,5 и проводимость по меньшей мере 15 мСм/см, с получением элюата; и (в) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением ОО₂₈₀ по меньшей мере 2,0 ОЕ. В конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением ОО₂₈₀ по меньшей мере 1,5 ОЕ. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением ОО₂₈₀ по меньшей мере 1,0 ОЕ. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением ОО₂₈₀ по меньшей мере 0,5 ОЕ. В других конкретных вариантах ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением ОО₂₈₀ по меньшей мере

0,1 ОЕ, 0,2 ОЕ, 0,3 ОЕ, 0,4 ОЕ, 0,5 ОЕ, 0,6 ОЕ, 0,7 ОЕ, 0,8 ОЕ, 0,9 ОЕ, 1,0 ОЕ, 1,1 ОЕ, 1,2 ОЕ, 1,3 ОЕ, 1,4 ОЕ, 1,5 ОЕ, 1,6 ОЕ, 1,7 ОЕ, 1,8 ОЕ, 1,9 ОЕ, 2,0 ОЕ

или более. В другом конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 20 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 22 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 25 мСм/см. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

в. Процент от всего элюата.

Еще в одном варианте, особенно пригодном для крупномасштабного производства композиций, содержащих иммуноглобулин, раннюю и позднюю фракции элюата определяют как процент от общего содержания белка в элюате (например, по объему или общего белка). Путем предварительного определения процента элюата для сбора в ранней фракции, можно тщательно контролировать выход иммуноглобулина. Данный способ определения ранней и поздней фракций элюата особенно пригоден для производственных процессов, которые требуют минимального выхода стадии, и для процессов, в которых решение принимается на основе соотношения стоимости сниженных выходов иммуноглобулина и преимущества получения композиции со сниженной амидолитической активность и содержанием фактора XI и/или фактора Х1а. Таким образом, грубо говоря, одинаковый выход иммуноглобулинов может быть воспроизводимым образом получен от одного препарата к другому, независимо от незначительных вариаций между производственными циклами. Как продемонстрировано в примере 8, применение данной схемы сбора может приводить к получению высокого выхода композиции, содержащей иммуноглобулин 1§С, со значительно сниженным АОТ и амидолитической активностью.

Соответственно в одном из аспектов настоящего изобретения предлагается способ уменьшения количества амидолитической активности в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобу- 11 030251

лин, включающий следующие стадии: (а) связывание иммуноглобулинов 1дС и амидолитической активности (т.е. загрязняющих компонентов белка, обладающих амидолитической активностью) на катионообменной смоле; (б) необязательное промывание катионообменной смолы, со связанным на ней белком, буфером для промывания, с целью удаления несвязанных загрязняющих компонентов; (в) проведение одностадийной элюации иммуноглобулинов 1дС и амидолитической активности и (г) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата составляет не более 80% всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 70 до 80% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 60 до 80% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 80% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 70 до 75% всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 75 до 80% всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80% всего элюата. В другом варианте ранняя фракция элюата (т.е. собранная или объединенная в пул целевая фракция) составляет не более 70% всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 60 до 70% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 70% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 60 до 65% всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 65 до 70% всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 или 70% всего элюата. В другом варианте ранняя фракция элюата (т.е. собранная или объединенная в пул целевая фракция) составляет не более 60% всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 60% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 55% всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 55 до 60% всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60% всего элюата. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

В конкретном варианте изобретения предлагается способ уменьшения количества фактора XI (ΡΧΙ) и/или фактора Х1а (РХ1а) в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) контакт композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, которая содержит иммуноглобулины 1дС и ΡΧΙ и/или РХ1а, с катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, включающих рН не более 6,0 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов и по меньшей мере части ΡΧΙ и/или РХ1а с катионообменной смолой; (б) элюация иммуноглобулинов из катионообменной смолы путем контакта катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет по меньшей мере 7,5 и проводимость по меньшей мере 15 мСм/см, с получением элюата; и (в) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата составляет не более 80% всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 70 до 80% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 60 до 80% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 80% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 70 до 75% всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 75 до 80% всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80% всего элюата. В другом варианте ранняя фракция элюата (т.е. собранная или объединенная в пул целевая фракция) составляет не более 70% всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 60 до 70% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 70% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 60 до 65% всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 65 до 70% всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 или 70% всего элюата. В другом варианте ранняя фракция элюата (т.е. собранная или объединенная в пул целевая фракция) составляет не более 60% всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 60% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 55% всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 55 до 60% всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60% всего элюата. В другом конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 20 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 22 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 25 мСм/см. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

г. Объем всего элюата.

В другом варианте, особенно пригодном для крупномасштабного производства композиций, содержащих иммуноглобулин, раннюю и позднюю фракции элюата определяют, как объемы пика элюата от- 12 030251

носительно размера катионообменной колонки (например, по установленному количеству объемов колонки). Путем предварительного определения объема элюата для сбора в ранней фракции, выход иммуноглобулина может быть тщательно контролируемым и воспроизводимым. Данный способ определения ранней и поздней фракций элюата особенно пригоден для производственных процессов, которые требуют минимального выхода стадии, и для процессов, в которых решение принимается на основании соотношения стоимости сниженного выхода иммуноглобулина и преимуществ получения композиции со сниженной амидолитической активностью и содержанием фактора XI и/или фактора Х1а. Таким образом, грубо говоря, одинаковый выход иммуноглобулинов может быть воспроизводимым образом получен от одного препарата к другому, независимо от незначительных вариаций между производственными циклами. Как продемонстрировано в примерах 11-13, применение данной схемы сбора может приводить к получению высокого выхода композиции, содержащей иммуноглобулин 1§С, со значительно сниженным АОТ и амидолитической активностью.

В одном из вариантов начало ранней фракции определяют по базовому значению оптической плотности. В некоторых вариантах, сбор ранней фракции начинается, как только поглощение пика элюата переходит через первый порог. В одном из вариантов сбор ранней фракции начинается, когда ОЭ₂8о элюата достигает по меньшей мере 2,0 ОЕ. В конкретном варианте сбор ранней фракции начинается, когда ОЭ₂₈₀ элюата достигает по меньшей мере 1,5 ОЕ. В другом конкретном варианте сбор ранней фракции начинается, когда ОЭ₂₈₀ элюата достигает по меньшей мере 1,0 ОЕ. В другом конкретном варианте сбор ранней фракции начинается, когда ОЭ₂₈₀ элюата достигает по меньшей мере 0,5 ОЕ. В других конкретных вариантах сбор ранней фракции начинается, когда ОЭ₂₈₀ элюата достигает по меньшей мере

0,1 ОЕ, 0,2 ОЕ, 0,3 ОЕ, 0,4 ОЕ, 0,5 ОЕ, 0,6 ОЕ, 0,7 ОЕ, 0,8 ОЕ, 0,9 ОЕ, 1,0 ОЕ, 1,1 ОЕ, 1,2 ОЕ,

1,3 ОЕ, 1,4 ОЕ, 1,5 ОЕ, 1,6 ОЕ, 1,7 ОЕ, 1,8 ОЕ, 1,9 ОЕ, 2,0 ОЕ

или более.

В некоторых вариантах, как только начат сбор ранней фракции, собирают предварительно определенное количество объемов колонки до переключения на сбор (или утилизацию) поздней фракции элюата. В одном из вариантов не более 5 объемов колонки (ОК) элюата собирают в ранней фракции. В другом варианте не более 4 ОК элюата собирают в ранней фракции. В другом варианте не более 3 ОК элюата собирают в ранней фракции. В другом варианте не более 2,7 ОК элюата собирают в ранней фракции. В другом варианте не более 2,5 ОК элюата собирают в ранней фракции. В другом варианте не более 2 ОК элюата собирают в ранней фракции. В другом варианте не более 1 ОК элюата собирают в ранней фракции. В других вариантах не более

1,2 ОК, 1,3 ОК, 1,4 ОК, 1,5 ОК, 1,6 ОК, 1,7 ОК, 1,8 ОК, 1,9 ОК, 2,0 ОК, 2,1 ОК, 2,2 ОК, 2,3 ОК, 2,4 ОК, 2,5 ОК, 2,6 ОК, 2,7 ОК, 2,8 ОК, 2,9 ОК, 3,0 ОК, 3,1 ОК, 3,2 ОК, 3,3 ОК, 3,4 ОК,

3,5 ОК, 3,6 ОК, 3,7 ОК, 3,8 ОК, 3,9 ОК, 4,0 ОК, 4,1 ОК, 4,2 ОК, 4,3 ОК, 4,4 ОК, 4,5 ОК, 4,6 ОК, 4,7 ОК, 4,8 ОК, 4,9 ОК, 5,0 ОК, 5,1 ОК, 5,2 ОК, 5,3 ОК, 5,4 ОК, 5,5 ОК, 5,6 ОК, 5,7 ОК,

5,8 ОК, 5,9 ОК, 6,0 ОК

или больше объемов колонки элюата собирают в ранней фракции.

Соответственно в одном из аспектов настоящего изобретения предлагается способ уменьшения количества амидолитической активности в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) связывание иммуноглобулинов 1§С и амидолитической активности (т.е. загрязняющих компонентов белка, обладающих амидолитической активностью) на катионообменной смоле; (б) необязательное промывание катионообменной смолы, со связанным на ней белком, буфером для промывания, с целью удаления несвязанных загрязняющих компонентов; (в) проведение одностадийной элюации иммуноглобулинов 1§С и амидолитической активности и (г) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата состоит не более чем из 4 объемов колонки (ОК) всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,5 и 3,0 ОК всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,0 и 3,0 ОК всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,0 и 3,5 ОК всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,0 и 4,0 ОК всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,5 и 3,5 ОК всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет

0,5 ок, 0,6 ок,

0,7 ОК, 0,8 ОК, 0,9 ОК, 1,0 ОК, 1,1 ОК, 1,2 ОК, 1,3 ОК, 1,4 ОК, 1,5 ОК, 1,6 ОК, 1,7 ОК, 1,8 ОК, 1,9 ОК, 2,0 ОК, 2,1 ОК, 2,2 ОК, 2,3 ОК, 2,4 ОК, 2,5 ОК, 2,6 ОК, 2,7 ОК, 2,8 ОК, 2,9 ОК,

3,0 ОК, 3,1 ОК, 3,2 ОК, 3,3 ОК, 3,4 ОК, 3,5 ОК, 3,6 ОК, 3,7 ОК, 3,8 ОК, 3,9 ОК, 4,0 ОК, 4,1 ОК, 4,2 ОК, 4,3 ОК, 4,4 ОК, 4,5 ОК, 4,6 ОК, 4,7 ОК, 4,8 ОК, 4,9 ОК, 5,0 ОК, 5,1 ОК, 5,2 ОК,

5,3 ОК, 5,4 ОК, 5,5 ОК, 5,6 ОК, 5,7 ОК, 5,8 ОК, 5,9 ОК

или 6,0 ОК всего элюата. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет со- 13 030251

бой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

В конкретном варианте изобретения предлагается способ уменьшения количества фактора XI (ΡΧΙ) и/или фактора Х1а (РХ1а) в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) контакт композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, которая содержит иммуноглобулины Ι§Θ и ΡΧΙ и/или РХ1а, с катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, включающих рН не более 6,0 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов и по меньшей мере части ΡΧΙ и/или РХ1а с катионообменной смолой; (б) элюация иммуноглобулинов из катионообменной смолы путем контакта катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет по меньшей мере 7,5 и проводимость по меньшей мере 15 мСм/см, с получением элюата; и (в) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата состоит не более чем из 4 объемов колонки (ОК) всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,5 и 3,0 ОК всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,0 и 3,0 ОК всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,0 и 3,5 ОК всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,0 и 4,0 ОК всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,5 и 3,5 ОК всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет

0,5 ок, 0,6 ок,

0,7 ОК, 0,8 ОК, 0,9 ОК, 1,0 ОК, 1,1 ОК, 1,2 ОК, 1,3 ОК, 1,4 ОК, 1,5 ОК, 1,6 ОК, 1,7 ОК, 1,8 ОК, 1,9 ОК, 2,0 ОК, 2,1 ОК, 2,2 ОК, 2,3 ОК, 2,4 ОК, 2,5 ОК, 2,6 ОК, 2,7 ОК, 2,8 ОК, 2,9 ОК,

3,0 ОК, 3,1 ОК, 3,2 ОК, 3,3 ОК, 3,4 ОК, 3,5 ОК, 3,6 ОК, 3,7 ОК, 3,8 ОК, 3,9 ОК, 4,0 ОК, 4,1 ОК, 4,2 ОК, 4,3 ОК, 4,4 ОК, 4,5 ОК, 4,6 ОК, 4,7 ОК, 4,8 ОК, 4,9 ОК, 5,0 ОК, 5,1 ОК, 5,2 ОК,

5,3 ОК, 5,4 ОК, 5,5 ОК, 5,6 ОК, 5,7 ОК, 5,8 ОК, 5,9 ОК или 6,0 ОК

всего элюата. В другом конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 20 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 22 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 25 мСм/см. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

IV. Снижение активности против комплемента (АПК).

В одном из аспектов настоящего описания предлагаются хроматографические способы уменьшения содержания активности против комплемента (АПК) в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин Ι§Θ. Дополнительно, в описании также предложены композиции, содержащие полученный из плазмы иммуноглобулин Ι§Θ, которые содержат низкие уровни активности против комплемента (АПК), приготовленные в соответствии со способом, предложенным в данном описании. Преимущественно способы, описанные в данном описании, обеспечивают композиции, содержащие полученный из плазмы иммуноглобулин Ι§Θ, с улучшенными профилями безопасности. Конкретно, композиции, обеспечиваемые данными способами, обладают сниженным потенциалом индуцирования побочных эффектов, связанных с активностью против комплемента, по сравнению с производимыми в настоящий момент композициями, содержащими иммуноглобулин Ι§Θ (см., например, ВисРасРег А. е! а1., νοχ 8ап§. 2010 Арг; 98(3 Р! 1):е209-18, содержание которой, таким образом, явно объединено путем ссылки в полном объеме и для всех целей.

А. Способы фракционирования.

Настоящее изобретение частично основано на открытии того факта, что большая часть присутствующей активности против комплемента (АПК) в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, элюируется из катионообменной смолы в поздней фракции элюата на стадии элюации, в то время как большая часть иммуноглобулина, содержащегося во фракции, элюируется в ранней фракции указанного элюата. Соответственно путем сбора ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, активность против комплемента полученного препарата иммуноглобулина значительно снижается. Конкретно, в данном описании показано, что АПК значительно снижена в композициях, содержащих иммуноглобулин, полученных в соответствии со способами, предложенными в данном описании.

Соответственно в одном из вариантов настоящего изобретения предлагается способ уменьшения количества активности против комплемента (АПК) в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) связывание иммуноглобулинов Ι§Θ и активности против комплемента (т.е. загрязняющих веществ, обладающих активностью против комплемента) на катионообменной смоле; (б) необязательное промывание катионообменной смолы, со связанным на ней белком, буфером для промывания, с целью удаления несвязанных загрязняющих компонентов; (в) проведение одностадийной элюации иммуноглобулинов Ι§Θ и АПК и (г) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата содержит композицию, содер- 14 030251

жащую иммуноглобулин 1дС. которая содержит сниженное количество АПК по сравнению с исходной композицией, и поздняя фракция элюата содержит высокую концентрацию активности АПК. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

В конкретном варианте изобретения предлагается способ уменьшения количества активности против комплемента (АПК) в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) контакт композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, которая содержит иммуноглобулины 1дС и первое количество АПК, с катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, включающих рН не более 6,0 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов и по меньшей мере части первого количества АПК с катионообменной смолой; (б) элюация иммуноглобулинов из катионообменной смолы путем контакта катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет по меньшей мере

7,5 и проводимость по меньшей мере 15 мСм/см, с получением элюата; и (в) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата содержит композицию, содержащую иммуноглобулин 1§С, которая содержит сниженную концентрацию АПК, относительно концентрации иммуноглобулина 1§С, по сравнению с исходной композицией, и поздняя фракция элюата содержит высокую концентрацию АПК, относительно концентрации иммуноглобулина 1дС. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ). В другом конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 20 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 22 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 25 мСм/см.

В одном из конкретных вариантов изобретение включает следующие стадии: (а) контакт композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, которая содержит иммуноглобулины 1дС и первое количество АПК, с катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, включающих рН от 4,8 до 5,6 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов и по меньшей мере части первого количества АПК с катионообменной смолой; (б) элюация иммуноглобулинов из катионообменной смолы путем контакта катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет по меньшей мере 7,5 и проводимость по меньшей мере 15 мСм/см, с получением элюата; и (в) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата содержит композицию, содержащую иммуноглобулин 1§С, которая содержит сниженное количество АПК, относительно количества иммуноглобулина 1§С, по сравнению с исходной композицией, и поздняя фракция элюата содержит высокое количество АПК, относительно количества иммуноглобулина 1дС. В конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,3. В другом конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,2. В другом конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,1. Еще в одном конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2. В других вариантах условия первого раствора включают рН 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 или 6,0. В другом конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 20 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 22 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 25 мСм/см. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

В одном из конкретных вариантов изобретение включает следующие стадии: (а) контакт композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, которая содержит иммуноглобулины 1дС и первое количество АПК, с катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, включающих рН не более 6,0 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов и по меньшей мере части первого количества АПК с катионообменной смолой; (б) промывание смолы, со связанными с ней иммуноглобулинами и АПК, буфером, обладающим достаточно низкой проводимостью, таким образом, что иммуноглобулины не элюируются из смолы, и рН между 5,1 и 5,9; (в) элюация иммуноглобулинов из катионообменной смолы путем контакта катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет по меньшей мере 7,5 и проводимость по меньшей мере 15 мСм/см, с получением элюата; и (г) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата содержит композицию, содержащую иммуноглобулин 1§С, со сниженной концентрацией АПК, относительно концентрации иммуноглобулина 1§С, по сравнению с исходной композицией, и поздняя фракция элюата содержит высокую концентрацию АПК, относительно концентрации иммуноглобулина 1дС. В конкретном варианте рН буфера для промывания составляет 5,5±0,3. В другом конкретном варианте рН буфера для промывания составляет 5,5±0,2. В другом конкретном варианте рН буфера для промывания составляет 5,5±0,1. В другом конкретном варианте

- 15 030251

рН буфера для промывания составляет 5,5. В других вариантах рН буфера для промывания составляет 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 или 6,0. В другом конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 20 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 22 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 25 мСм/см. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

В одном из конкретных вариантов изобретение включает следующие стадии: (а) контакт композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, которая содержит иммуноглобулины Ι§Ο и первое количество АПК, с катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, включающих рН не более 6,0 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов и по меньшей мере части первого количества АПК с катионообменной смолой; (б) элюация иммуноглобулинов из катионообменной смолы путем контакта катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет 7,8±0,4 и проводимость по меньшей мере 20 мСм/см, с получением элюата; и (в) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата содержит композицию, содержащую иммуноглобулин Ι§Ο, которая содержит уменьшенную концентрацию АПК, относительно концентрации иммуноглобулина ΙβΟ. по сравнению с исходной композицией, и поздняя фракция элюата содержит высокую концентрацию АПК, относительно концентрации иммуноглобулина Ι§Ο. В конкретном варианте рН буфера элюации составляет 7,8±0,3. В другом конкретном варианте рН буфера элюации составляет 7,8±0,2. В другом конкретном варианте рН буфера элюации составляет 7,8±0,1. В другом конкретном варианте рН буфера элюации составляет 7,8. В других вариантах рН буфера элюации составляет 7,0, 7,1, 7,2, 7,36, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2,

8,3, 8,4 или 8,5. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 22 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 25 мСм/см. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

В общем, исходный материал, используемый для способов, предложенных в данном описании, включает любую фракцию плазмы или композицию, содержащую иммуноглобулин Ι§Ο и активность против комплемента. Таким образом, в одном из вариантов плазма частично или полностью фракционируется в соответствии с любой из схем очистки, известных в данной области. В конкретном варианте плазму фракционируют таким образом, чтобы получить осадок фракции I, осадок фракции II, осадок фракции Ι+ΙΙ+ΙΙΙ, осадок фракции ΙΙ+ΙΙΙ, фракцию Ιν-1, осадок А Кистлера-Нитшманна, осадок В Кистлера-Нитшманна и модифицированный осадок любого из указанного выше, которые могут быть использованы в качестве исходного материала для способов, предложенных в данном описании.

В предпочтительном варианте плазму фракционируют одной или более стадий осаждения этанолом. Стадии осаждения этанолом могут применяться, чтобы осадить желательные иммуноглобулины из раствора, при сохранении по меньшей мере одного неиммуноглобулинового белка в супернатанте или осаждении по меньшей мере одного неиммуноглобулинового белка из раствора, при сохранении желательного иммуноглобулина в супернатанте. Способы фракционирования иммуноглобулинов, таким образом, хорошо известны в данной области. Примеры этанольных осадков включают, не ограничиваясь ими, осадок фракции Ι, осадок фракции Ι+ΙΙ+ΙΙΙ, осадок фракции ΙΙ+ΙΙΙ, фракцию Ιν-1, осадок А Кистлера-Нитшманна, осадок В Кистлера-Нитшманна и модифицированный осадок любого из указанного выше. В особенно предпочтительном варианте иммуноглобулины, присутствующие в криообедненной плазме, обогащены с помощью четырехстадийного этанольного процесса, включающего стадию осаждения фракции Ι+ΙΙ+ΙΙΙ, стадию осаждения А, стадию осаждения В и стадию осаждения фракции ΙΙ.

Как продемонстрировано в данном описании, преимущественные признаки способов, предложенных в данном описании, сохраняются в производственных методиках большого масштаба. Относительно получения композиций, содержащих иммуноглобулин Ι§Ο, крупномасштабное производство обозначает процессы, которые обогащают иммуноглобулины как минимум из 100 л объединенного в пул исходного материала плазмы (например, криообедненная плазма). В общем, крупномасштабные производственные процессы иммуноглобулина фракционируют от 100 до 20000 л объединенной в пул плазмы на серию. В некоторых вариантах крупномасштабный процесс производства иммуноглобулина ΙβΟ обозначает фракционирование как минимум 100 л объединенной в пул плазмы (например, криообедненная плазма). В другом варианте процесс крупномасштабного производства иммуноглобулина ΙβΟ обозначает фракционирование как минимум 500 л объединенной в пул плазмы (например, криообедненная плазма). В другом варианте процесс крупномасштабного производства иммуноглобулина ΙβΟ обозначает фракционирование как минимум 1000 л объединенной в пул плазмы (например, криообедненная плазма). В другом варианте процесс крупномасштабного производства иммуноглобулина ΙβΟ обозначает фракционирование как минимум 5000 л объединенной в пул плазмы (например, криообедненная плазма). Еще в одном варианте процесс крупномасштабного производства иммуноглобулина ΙβΟ обозначает фракционирование как

- 16 030251

минимум 10 000 л объединенной в пул плазмы (например, криообедненная плазма).

В одном из вариантов исходный материал для способов уменьшения активности против комплемента (АПК), предложенных в данном описании, получают путем фракционирования этанолом объединенной в пул человеческой плазмы (например, криообедненная плазма). В одном из конкретных вариантов фракционирование этанолом включает осаждение фракции Ι+ΙΙ+ΙΙΙ криообедненной плазмы, осаждение фракции А суспендированного осадка фракции Ι+ΙΙ+ΙΙΙ, осаждение фракции В суспендированного осадка фракции А, и осаждение фракции ΙΙ супернатанта фракции А, как описано ниже. В другом конкретном варианте фракционирование этанолом включает осаждение фракции Ι криообедненной плазмы, осаждение фракции ΙΙ+ΙΙΙ супернатанта фракции Ι и осаждение фракции ΙΙ суспендированного осадка фракции ΙΙ+ΙΙΙ.

В общем, предусмотрены способы, включающие все комбинации условий загрузки, условий промывания и условий элюации, описанных выше. К тому же, способы, содержащие все комбинации конкретных хроматографических условий, предусмотрены со всеми возможными схемами для определения и сбора ранней фракции элюата, как описано ниже.

1. Ранняя и поздняя фракции элюата катионообменной колонки.

В одном из аспектов настоящего изобретения предлагаются способы уменьшения активности против комплемента (АПК), присутствующей в препаратах иммуноглобулина, путем сбора ранней фракции элюата катионообменной колонки. Преимущественно в данном описании показано, что ранняя фракция элюата, полученная путем одностадийной элюации в рамках стадии катионообменной хроматографии, содержит большую часть желательного иммуноглобулина, в то время как поздняя фракция элюата содержит большую часть нежелательной АПК. Поскольку элюация иммуноглобулинов и АПК не может быть полностью разделена, необходимо определить разделение дивизия между ранней и поздней фракциями элюата. Два основных фактора могут быть приняты во внимание при формировании такого определения, а именно: (ί) в зависимости от того, каким образом определяют раннюю и позднюю фракции элюата, большая или меньшая часть АПК будет извлекаться в ранней фракции - т.е. большая часть АПК может быть отделена от содержания иммуноглобулина, если раннюю фракцию элюата определить как меньшую часть всего элюата, и наоборот; и (ίί) в зависимости от того, каким образом определяют раннюю и позднюю фракции элюата, большие или меньшие выходы иммуноглобулина будут присутствовать в ранней фракции - т.е. более низкий выход иммуноглобулина будет достигаться, если ранняя фракция элюата определена как меньшая часть всего элюата, и наоборот.

Соответственно квалифицированный специалист будет принимать решение относительно того, где проводить границу между ранней и поздней фракцией элюата катионообменной колонки, на основании индивидуальных потребностей. Например, при получении небольшой очищенной партии для исследовательских целей или специализированной терапевтической цели квалифицированный ремесленник мог бы максимизировать мощность способа разделения, собирая меньшую раннюю фракцию элюата, и при этом жертвуя конечным выходом иммуноглобулина. И, наоборот, при осуществлении крупномасштабного производства (например, обработка более 500 л криообедненной плазмы), цена выбора может диктовать необходимость сбора большей ранней фракции элюата, чтобы увеличить выход иммуноглобулина за счет менее выраженного уменьшения АПК композиции.

В различных вариантах ранняя и поздняя фракции элюата могут быть определенным по различным характеристикам, в том числе, не ограничиваясь ими, рН элюата, выход белка (например, выраженный, как процент белка, связанного со смолой), концентрация белка (например, определенная по данным оптической плотности) в элюате, объем элюата и т.п.

а. рН элюата.

Как продемонстрировано в примерах, приведенных в данном описании, начало стадии элюации из катионообменной колонки характеризуется снижением рН раствора, выходящего из колонки, до рН ниже 5,0, несмотря на буфер элюации с более высоким рН (в общем, > 7,0), по сравнению со стадиями загрузки и промывания колонки (в общем, 5,0-6,0). Такое снижение рН соответствует элюации композиции, содержащей иммуноглобулин Ι§Ο, с низкой АПК (см., например, табл. 3, 11 и 15). В более поздней точке элюации, рН раствора, выходящего из колонки, резко повышается, до значений выше 6,0-8,0. Такой сдвиг рН сопровождается значительным увеличением АПК элюата (см., например, табл. 3, 11 и 15). Поэтому, хотя стадия элюации выполняется с применением одного и того же буфера элюации с высоким рН (в общем, выше 7,0), профиль элюации показывает двухстадийную элюацию, в ходе которой иммуноглобулины Ι§Ο элюируются из колонки первыми, после чего следует сопроводительная активность против комплемента. Поэтому, в некоторых вариантах раннюю и позднюю фракции элюата определяют на основании рН элюата на выходе колонки.

Соответственно в одном из аспектов настоящего изобретения предлагается способ уменьшения количества активности против комплемента (АПК) в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) связывание иммуноглобулинов Ι§Ο и активности против комплемента (т.е. загрязняющих веществ, обладающих активностью против комплемента) на катионообменной смоле; (б) необязательное промывание катионообменной смолы, со связанными с ней иммуноглобулином Ι§Ο и АПК, буфером для промывания, чтобы удалить несвязанные загрязняющие

- 17 030251

вещества; (в) проведение одностадийной элюации иммуноглобулинов 1дС и АПК и (г) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 7,0. В конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 6,5. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 6,0. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 5,5. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 5,0. В других вариантах ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, или менее. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

В конкретном варианте изобретения предлагается способ уменьшения количества активности против комплемента (АПК) в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) контакт композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, которая содержит иммуноглобулины 1дС и первое количество АПК, с катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, включающих рН не более 6,0 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов и по меньшей мере части АПК с катионообменной смолой; (б) элюация иммуноглобулинов из катионообменной смолы путем контакта катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет по меньшей мере 7,5 и проводимость по меньшей мере 15 мСм/см, с получением элюата; и (в) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 7,0. В конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 6,5. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 6,0. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 5,5. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 5,0. В других вариантах ранняя фракция элюата состоит из части элюата, рН которой составляет не более 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4,

6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, или менее. В конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,3. В другом конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,2. В другом конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,1. Еще в одном конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2. В других вариантах условия первого раствора включают рН 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 или 6,0. В другом конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 20 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 22 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 25 мСм/см. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

б. Оптическая плотность элюата.

Еще в одном варианте, особенно пригодном для крупномасштабного производства композиций, содержащих иммуноглобулин, раннюю и позднюю фракции элюата определяют на основе концентрации иммуноглобулина, элюирующегося из катионообменной колонки. Например, в ходе крупномасштабного производства, композиция, содержащая иммуноглобулин, может быть загружена на катионообменную смолу с достаточно высоким содержанием белка (например, > 80 мг белка на 1 мл смолы), таким образом, что пик элюата показывает высокую концентрацию. В таких образцах, ранняя фракция элюата может быть определена как часть элюата, которая элюировалась до точки, в которой ΟΌ₂₈₀ снижается ниже порогового значения. Таким образом, грубо говоря, одинаковый выход иммуноглобулинов может быть воспроизводимым образом получен от одного препарата к другому, независимо от незначительных вариаций между производственными циклами. Как продемонстрировано в примере 9, применение данной схемы сбора для крупномасштабного производственного процесса приводит к получению высокого выхода композиции, содержащей иммуноглобулин 1дС. со значительно сниженной активностью против комплемента (АПК).

Соответственно в одном из аспектов настоящего изобретения предлагается способ уменьшения количества активности против комплемента (АПК) в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) связывание иммуноглобулинов 1дС и активности против комплемента (т.е. загрязняющих веществ, обладающих активностью против комплемента) на катионообменной смоле; (б) необязательное промывание катионообменной смолы, со связанным на ней белком, буфером для промывания, с целью удаления несвязанных загрязняющих компонентов; (в) проведение одностадийной элюации иммуноглобулинов 1дС и АПК и (г) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением ΘΌ₂₈₀ по меньшей мере 0,5 ОЕ. В конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением ΟΌ₂₈₀ по меньшей мере 1,0 ОЕ. В другом конкретном варианте ранняя фракция

- 18 030251

элюата состоит из части элюата со значением ОЭ₂₈₀ по меньшей мере 1,5 ОЕ. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением Οϋ₂₈₀ по меньшей мере 2,0 ОЕ. В других конкретных вариантах ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением О1)₂₈₀ по меньшей мере

0,1 ОЕ, 0,2 ОЕ, 0,3 ОЕ, 0,4 ОЕ, 0,5 ОЕ, 0,6 ОЕ, 0,7 ОЕ, 0,8 ОЕ, 0,9 ОЕ, 1,0 ОЕ, 1,1 ОЕ,

1,2 ОЕ, 1,3 ОЕ, 1,4 ОЕ, 1,5 ОЕ, 1,6 ОЕ, 1,7 ОЕ, 1,8 ОЕ, 1,9 ОЕ, 2,0 ОЕ или более. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

В конкретном варианте изобретения предлагается способ уменьшения количества активности против комплемента (АПК) в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) контакт композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, которая содержит иммуноглобулины 1дО и первое количество АПК, с катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, включающих рН не более 6,0 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов и по меньшей мере части первого количества АПК с катионообменной смолой; (б) элюация иммуноглобулинов из катионообменной смолы путем контакта катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет по меньшей мере

7,5 и проводимость по меньшей мере 15 мСм/см, с получением элюата; и (в) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением ОО₂₈₀ по меньшей мере 0,5 ОЕ. В конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением ОО₂₈₀ по меньшей мере 1,0 ОЕ. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением ОО₂₈₀ по меньшей мере 1,5 ОЕ. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением ОО₂₈₀ по меньшей мере 2,0 ОЕ. В других конкретных вариантах ранняя фракция элюата состоит из части элюата со значением ОО₂₈₀ по меньшей мере

0,1 ОЕ, 0,2 ОЕ, 0,3 ОЕ, 0,4 ОЕ, 0,5 ОЕ, 0,6 ОЕ, 0,7 ОЕ, 0,8 ОЕ, 0,9 ОЕ, 1,0 ОЕ, 1,1 ОЕ, 1,2 ОЕ, 1,3 ОЕ, 1,4 ОЕ, 1,5 ОЕ, 1,6 ОЕ, 1,7 ОЕ, 1,8 ОЕ, 1,9 ОЕ, 2,0 ОЕ

или более. В конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,3. В другом конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,2. В другом конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,1. Еще в одном конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2. В других вариантах условия первого раствора включают рН 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3,

5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 или 6,0. В другом конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 20 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 22 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 25 мСм/см. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

в. Процент от всего элюата.

Еще в одном варианте, особенно пригодном для крупномасштабного производства композиций, содержащих иммуноглобулин, раннюю и позднюю фракции элюата определяют как процент от общего содержания белка в элюате (например, по объему или общего белка). Путем предварительного определения процента элюата для сбора в ранней фракции, можно тщательно контролировать выход иммуноглобулина. Данный способ определения ранней и поздней фракций элюата особенно пригоден для производственных процессов, которые требуют минимального выхода стадии, и для процессов, в которых решение принимается на основе соотношения стоимости сниженных выходов иммуноглобулина и преимущества получения композиции со сниженной активностью против комплемента (АПК). Таким образом, грубо говоря, одинаковый выход иммуноглобулинов может быть воспроизводимым образом получен от одного препарата к другому, независимо от незначительных вариаций между производственными циклами. Как продемонстрировано в примере 8, применение данной схемы сбора может приводить к получению высокого выхода композиции, содержащей иммуноглобулин 1дО, со значительно сниженной активностью против комплемента (АПК).

Соответственно в одном из аспектов настоящего изобретения предлагается способ уменьшения количества активности против комплемента (АПК) в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) связывание иммуноглобулинов 1дО и активности против комплемента (т.е. загрязняющих веществ, обладающих активностью против комплемента) на катионообменной смоле; (б) необязательное промывание катионообменной смолы, со связанным на ней белком, буфером для промывания, с целью удаления несвязанных загрязняющих компонентов; (в) проведение одностадийной элюации иммуноглобулинов 1дО и АПК и (г) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата составляет не более 80% всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 70 до 80% всего элюата. В другом

- 19 030251

конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 60 до 80% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 80% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 70 до 75% всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 75 до 80% всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80% всего элюата. В другом варианте ранняя фракция (т.е. собранная или объединенная в пул целевая фракция) элюата составляет не более 70% всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 60 до 70% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 70% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 60 до 65% всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 65 до 70% всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 или 70% всего элюата. В другом варианте ранняя фракция (т.е. собранная или объединенная в пул целевая фракция) элюата составляет не более 60% всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 60% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 55% всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 55 до 60% всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60% всего элюата. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

В конкретном варианте изобретения предлагается способ уменьшения количества активности против комплемента (АПК) в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) контакт композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, которая содержит иммуноглобулины Ι§Ο и первое количество активности против комплемента (АПК) с катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, включающих рН не более 6,0 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов и по меньшей мере части первого количества АПК с катионообменной смолой; (б) элюацию иммуноглобулинов из катионообменной смолы путем контакта катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет по меньшей мере 7,5 и проводимость по меньшей мере 15 мСм/см, с получением элюата; и (в) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата составляет не более 80% всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 70 до 80% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 60 до 80% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 80% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 70 до 75% всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 75 до 80% всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80% всего элюата. В другом варианте ранняя фракция (т.е. собранная или объединенная в пул целевая фракция) элюата составляет не более 70% всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 60 до 70% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 70% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 60 до 65% всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 65 до 70% всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 или 70% всего элюата. В другом варианте ранняя фракция (т.е. собранная или объединенная в пул целевая фракция) элюата составляет не более 60% всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 60% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50% до 55% всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 55 до 60% всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60% всего элюата. В конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,3. В другом конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,2. В другом конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,1. Еще в одном конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2. В других вариантах условия первого раствора включают рН 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 или 6,0. В другом конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 20 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 22 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 25 мСм/см. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

г. Объем всего элюата.

В другом варианте, особенно пригодном для крупномасштабного производства композиций, содержащих иммуноглобулин, раннюю и позднюю фракции элюата определяют как объемы пика элюата относительно размера катионообменной колонки (например, по установленному количеству объемов колонки). Путем предварительного определения объема элюата для сбора в ранней фракции, выход имму- 20 030251

ноглобулина может быть тщательно контролируемым и воспроизводимым. Данный способ определения ранней и поздней фракций элюата особенно пригоден для производственных процессов, которые требуют минимального выхода стадии, и для процессов, в которых решение принимается на основании соотношения стоимости сниженного выхода иммуноглобулина и преимуществ получения композиции со сниженной активностью против комплемента (АПК). Таким образом, грубо говоря, одинаковый выход иммуноглобулинов может быть воспроизводимым образом получен от одного препарата к другому, независимо от незначительных вариаций между производственными циклами. Как продемонстрировано в примерах 11-13, применение данной схемы сбора может приводить к получению высокого выхода композиции, содержащей иммуноглобулин Ι§Θ, со значительно сниженной активностью против комплемента.

В одном из вариантов начало ранней фракции определяют по базовому значению оптической плотности. В некоторых вариантах, сбор ранней фракции начинается, как только поглощение пика элюата переходит через первый порог. В одном из вариантов сбор ранней фракции начинается, когда ОЭ₂₈₀ элюата достигает по меньшей мере 0,5 ОЕ. В конкретном варианте сбор ранней фракции начинается, когда ОЭ₂₈₀ элюата достигает по меньшей мере 1,0 ОЕ. В другом конкретном варианте сбор ранней фракции начинается, когда ОЭ₂₈₀ элюата достигает по меньшей мере 1,5 ОЕ. В другом конкретном варианте сбор ранней фракции начинается, когда ОЭ₂₈₀ элюата достигает по меньшей мере 2,0 ОЕ. В других конкретных вариантах сбор ранней фракции начинается, когда ОЭ₂₈₀ элюата достигает по меньшей мере

0,1 ОЕ, 0,2 ОЕ, 0,3 ОЕ, 0,4 ОЕ, 0,5 ОЕ, 0,6 ОЕ, 0,7 ОЕ, 0,8 ОЕ, 0,9 ОЕ, 1,0 ОЕ, 1,1 ОЕ, 1,2 ОЕ,

1,3 ОЕ, 1,4 ОЕ, 1,5 ОЕ, 1,6 ОЕ, 1,7 ОЕ, 1,8 ОЕ, 1,9 ОЕ, 2,0 ОЕ

или более.

В некоторых вариантах, как только начат сбор ранней фракции, собирают предварительно определенное количество объемов колонки до переключения на сбор (или утилизацию) поздней фракции элюата. В одном из вариантов не более 5 объемов колонки (ОК) элюата собирают в ранней фракции. В другом варианте не более 4 ОК элюата собирают в ранней фракции. В другом варианте не более 3 ОК элюата собирают в ранней фракции. В другом варианте не более 2,7 ОК элюата собирают в ранней фракции. В другом варианте не более 2,5 ОК элюата собирают в ранней фракции. В другом варианте не более 2 ОК элюата собирают в ранней фракции. В другом варианте не более 1 ОК элюата собран в ранней фракции. В других вариантах не более

0,5 ОК, 0,6 ОК, 0,7 ОК, 0,8 ОК, 0,9 ОК, 1,0 ОК, 1,1 ОК,

1,2 ОК, 1,3 ОК, 1,4 ОК, 1,5 ОК, 1,6 ОК, 1,7 ОК, 1,8 ОК, 1,9 ОК, 2,0 ОК, 2,1 ОК, 2,2 ОК, 2,3 ОК, 2,4 ОК, 2,5 ОК, 2,6 ОК, 2,7 ОК, 2,8 ОК, 2,9 ОК, 3,0 ОК, 3,1 ОК, 3,2 ОК, 3,3 ОК, 3,4 ОК,

3,5 ОК, 3,6 ОК, 3,7 ОК, 3,8 ОК, 3,9 ОК, 4,0 ОК, 4,1 ОК, 4,2 ОК, 4,3 ОК, 4,4 ОК, 4,5 ОК, 4,6 ОК, 4,7 ОК, 4,8 ОК, 4,9 ОК, 5,0 ОК, 5,1 ОК, 5,2 ОК, 5,3 ОК, 5,4 ОК, 5,5 ОК, 5,6 ОК, 5,7 ОК,

5,8 ОК, 5,9 ОК, 6,0 ОК

или больше объемов колонки элюата собирают в ранней фракции.

Соответственно в одном из аспектов настоящего изобретения предлагается способ уменьшения количества амидолитической активности в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) связывание иммуноглобулинов Ι§Θ и активности против комплемента (т.е. загрязняющих веществ, обладающих активностью против комплемента) на катионообменной смоле; (б) необязательное промывание катионообменной смолы, со связанным на ней белком, буфером для промывания, с целью удаления несвязанных загрязняющих компонентов; (в) проведение одностадийной элюации иммуноглобулинов Ι§Θ и АПК и (г) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата состоит не более чем из 4 объемов колонки (ОК) всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,5 до 3,0 ОК всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,0 до 3,0 ОК всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,0 до 3,5 ОК всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,0 до 4,0 ОК всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,5 до 3,5 ОК всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет

0,5 ОК, 0,6 ОК, 0,7 ОК, 0,8 ОК, 0,9 ОК, 1,0 ОК,

1,1 ОК, 1,2 ОК, 1,3 ОК, 1,4 ОК, 1,5 ОК, 1,6 ОК, 1,7 ОК, 1,8 ОК, 1,9 ОК, 2,0 ОК, 2,1 ОК, 2,2 ОК, 2,3 ОК, 2,4 ОК, 2,5 ОК, 2,6 ОК, 2,7 ОК, 2,8 ОК, 2,9 ОК, 3,0 ОК, 3,1 ОК, 3,2 ОК, 3,3 ОК,

3,4 ОК, 3,5 ОК, 3,6 ОК, 3,7 ОК, 3,8 ОК, 3,9 ОК, 4,0 ОК, 4,1 ОК, 4,2 ОК, 4,3 ОК, 4,4 ОК, 4,5 ОК, 4,6 ОК, 4,7 ОК, 4,8 ОК, 4,9 ОК, 5,0 ОК, 5,1 ОК, 5,2 ОК, 5,3 ОК, 5,4 ОК, 5,5 ОК, 5,6 ОК,

5,7 ОК, 5,8 ОК, 5,9 ОК или 6,0 ОК

всего элюата. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

- 21 030251

В конкретном варианте изобретения предлагается способ уменьшения количества активности против комплемента (АПК) в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, включающий следующие стадии: (а) контакт композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, которая содержит иммуноглобулины НО и первое количество АПК, с катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, включающих рН не более 6,0 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов и по меньшей мере части первого количества АПК с катионообменной смолой; (б) элюация иммуноглобулинов из катионообменной смолы путем контакта катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет по меньшей мере

7,5 и проводимость по меньшей мере 15 мСм/см, с получением элюата; и (в) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата, притом, что ранняя фракция элюата состоит не более чем из 4 объемов колонки (ОК) всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,5 до 3,0 ОК всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,0 до 3,0 ОК всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,0 до 3,5 ОК всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,0 до 4,0 ОК всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 2,5 до 3,5 ОК всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет

0,5 ОК, 0,6

ОК, 0,7 ОК, 0,8 ОК, 0,9 ОК, 1,0 ОК, 1,1 ОК, 1,2 ОК, 1,3 ОК, 1,4 ОК, 1,5 ОК, 1,6 ОК, 1,7 ОК,

1,8 ОК, 1,9 ОК, 2,0 ОК, 2,1 ОК, 2,2 ОК, 2,3 ОК, 2,4 ОК, 2,5 ОК, 2,6 ОК, 2,7 ОК, 2,8 ОК, 2,9 ОК, 3,0 ОК, 3,1 ОК, 3,2 ОК, 3,3 ОК, 3,4 ОК, 3,5 ОК, 3,6 ОК, 3,7 ОК, 3,8 ОК, 3,9 ОК, 4,0 ОК,

4,1 ОК, 4,2 ОК, 4,3 ОК, 4,4 ОК, 4,5 ОК, 4,6 ОК, 4,7 ОК, 4,8 ОК, 4,9 ОК, 5,0 ОК, 5,1 ОК, 5,2 ОК, 5,3 ОК, 5,4 ОК, 5,5 ОК, 5,6 ОК, 5,7 ОК, 5,8 ОК, 5,9 ОК или 6,0 ОК

всего элюата. В конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,3. В другом конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,2. В другом конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,1. Еще в одном конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2. В других вариантах условия первого раствора включают рН 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 или 6,0. В другом конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 20 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 22 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 25 мСм/см. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

V. Приготовление криообедненной плазмы.

Исходный материал, который используют для приготовления концентрированных композиций, содержащих 1§О, в общем, состоит из отделенной плазмы (т.е. плазма, которая отделена от цельной крови ех νΐνο) или исходной плазмы (т.е. плазма, собранная посредством плазмафереза). Процесс очистки обычно начинается с размораживания ранее замороженной, объединенной в пул плазмы, для которой уже проведены анализы на безопасность и качество. Размораживание обычно проводят при температуре не выше 6°С, предпочтительно от -1 до 6°С. После полного размораживания замерзшей плазмы при низкой температуре, проводят центрифугирование на холоде (например, <6°С, предпочтительно 2,5±3,5°С), чтобы отделить твердый криоосадок от жидкости супернатанта. Альтернативно, стадию отделения можно выполнять путем фильтрации вместо центрифугирования. Жидкость супернатанта (также носит название "криообедненной плазмы", после удаления нерастворимых белков из свежеразмороженной плазмы центрифугированием) далее обрабатывают на следующей стадии. Различные дополнительные стадии могут быть проведены в этот момент для изолирования фактора обходной активности ингибитора VIII (ОАИФВ), комплекса фактора IX, концентрата фактора VII или комплекса антитромбина-Ш. Например, один или более факторов крови могут быть адсорбированы из криообедненной плазмы пред дальнейшим обогащением содержащего иммуноглобулин раствора.

VI. Фракционирование криообедненной плазмы.

Для приготовления композиции, содержащей иммуноглобулин ^О, криообедненную плазму обычно фракционируют, чтобы отделить желательные иммуноглобулины от других белков и присутствующих примесей. Множество способов фракционирования плазмы известно в данной области, в том числе спиртовое фракционирование (например, этанолом), осаждение полимером (например, ПЭГ), осаждение жирной кислотой и эфиром (например, каприлатом), хроматография и т.п. Примеры таких способов фракционирования включают, не ограничиваясь ими, фракционирование по Коэну (I. Ат. Сйет. 8ос, 1946, 68(3): 459-475; I. Ат. Сйет. 8ос. 72:465-474 (1950)), фракционирование по Онклею (I. Ат. Сйет. 8ос, 1949, 71(2): 541-550), очистку по Дейчу (I. Βΐοί. Сйет. 164:109-118), очистку по Хоппе (Мипсй Меб Аосйепзсйг 1967 (34): 1749-1752), очистку по Фолкшведену (патент Швеции № 348942), очистку по Фолкшведену_и Лундбледу (МеТИобз о£ Р1азта РгоГет Ргасйопайоп 1980), очистку Либинга (Уох 8ап§ 2003 (84): 193-201), очистку Танака (Вга/ I Меб Вю1 Кез 2000 (33)37-30)), очистку Тешнера ^ох 8ап§,

- 22 030251

2007 (92):42-55), фракционирование по Нитшманну (Не1у. СЫт. Ас1а 37:866-873), фракционирование по Кистлеру/Нитшманну (Уох 8ап§. 7:414-424 (1962)), очистку Барундерна (Уох 8ап§. 7:157-74 (1962)), очистку Коблета (Уох 8ап§. 13:93-102 (1967)), методику очистки, раскрытую в патентах США 5122373 или 5177194, модификации указанных методик, и подобные или эквивалентные методики очистки, известные в данной области, содержание, которых, таким образом, включено путем ссылки в полном объеме и для всех целей.

В общем, способы, предложенные в данном описании, совместимы с любой из схем очистки, упомянутых выше. Таким образом, в одном из вариантов криообедненную плазму частично или полностью фракционируют в соответствии с любой из схем очистки, упомянутых выше. В конкретном варианте криообедненную плазму фракционируют в соответствии с одной или более стадий фракционирования, раскрытых в приведенном выше описании, для получения промежуточной фракционированной композиции. В более конкретном варианте криообедненную плазму фракционируют таким образом, чтобы получить осадок фракции I, осадок фракции II, осадок фракции ЫНШ, осадок фракции П+Ш, фракцию ГУ-1, осадок А Кистлера-Нитшманна, осадок В Кистлера-Нитшманна или модифицированный осадок любого из указанного выше.

В предпочтительном варианте криообедненную плазму фракционируют с помощью одной или более стадий осаждения этанолом. Стадии осаждения этанолом могут применяться, чтобы осадить желательные иммуноглобулины из раствора, при сохранении по меньшей мере одного неиммуноглобулинового белка в супернатанте, или осаждении по меньшей мере одного неиммуноглобулинового белка из раствора, при сохранении желательного иммуноглобулина в супернатанте. Способы фракционирования иммуноглобулинов, таким образом, хорошо известны в данной области. Примеры этанольных осадков включают, не ограничиваясь ими, осадок фракции I, осадок фракции 1+П+Ш, осадок фракции П+Ш, фракцию БУ-1, осадок А Кистлера-Нитшманна, осадок В Кистлера-Нитшманна или модифицированный осадок любого из указанного выше. В особенно предпочтительном варианте иммуноглобулины, присутствующие в криообедненной плазме, обогащены с помощью четырехстадийного этанольного процесса, включающего стадию осаждения фракции 1+П+Ш, стадию осаждения А, стадию осаждения В и стадию осаждения фракции II, как описано ниже.

УП. Примеры схем фракционирования.

Хотя квалифицированному специалисту будет понятно, что множество различных исходных материалов (например, различные фракции плазмы) может использоваться для осуществления способов, предложенных в данном описании, с целью снижения амидолитической активности (например, содержание фактора XI и/или фактора ΧΡι) и/или активности против комплемента (АПК), пример схемы фракционирования предложен ниже. В примере схемы фракционирования присутствуют четыре реакции осаждения этанолом, чтобы получить осадок фракции II, который может быть ресуспендирован и впоследствии использован в качестве исходного материала для способов, предложенных в данном описании. Полученная обогащенная композиция, содержащая иммуноглобулин [дО, может быть дополнительно обогащена последующей обработкой с применением таких методов, как анионообменная хроматография, ультра-/диафильтрация, стадии инактивации и/или удаления вирусов и другие стадии обогащения, хорошо известные в данной области.

Соответственно в одном из вариантов настоящего изобретения предлагается способ производства композиции, содержащей иммуноглобулин ^О, включающий следующие стадии: (а) обеспечение фракции криообедненной плазмы; (б) осаждение иммуноглобулинов из фракции криообедненной плазмы в первой реакции осаждения, предварительное смешивание этанола с фракцией криообедненной плазмы в конечной концентрации от 17 до 23% (об./об.) при рН от 6,5 до 7,3 и температуре от -8 до -2°С, с образованием таким образом первого осадка и первого супернатанта; (в) ресуспендирование иммуноглобулинов, присутствующих в первом осадке, с получением таким образом первой суспензии; (г) осаждение иммуноглобулинов из первой суспензии во второй реакции осаждения путем смешивания этанола с фракцией криообедненной плазмы в конечной концентрации от 17 до 23% (об./об.) при рН от 6,8 до 7,6 и температуре от -8 до -2°С, с образованием таким образом второго осадка и второго супернатанта; (д) ресуспендирование иммуноглобулинов, присутствующих во втором осадке, с образованием таким образом второй суспензии; (е) осаждение иммуноглобулинов из второй суспензии в третьей реакции осаждения, путем предварительного смешивания этанола с фракцией криообедненной плазмы в конечной концентрации от 14 до 20% (об./об.) при рН от 5,0 до 5,8 и температуре от -8 до -2°С, с образованием таким образом третьего осадка и третьего супернатанта; (ж) осаждение иммуноглобулинов из третьего супернатанта в четвертой реакции осаждения, путем предварительного смешивания этанола с фракцией криообедненной плазмы в конечной концентрации от 22 до 28% (об./об.) при рН от 6,7 и 7,5 и температуре от -8 до -2°С, с образованием таким образом четвертого осадка и четвертого супернатанта; (з) ресуспендирование четвертого осадка с получением третьей суспензии; (и) контакт третьей суспензии с катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, включающих рН не более 6,0 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов ^О и по меньшей мере одного из: (ί) фракции ΡXI и/или ΡΧΡι, и (ίί) первого количества активности против комплемента (АПК), с катионообменной смолой; (к) элюацию иммуноглобулинов !§О из катионообменной смо- 23 030251

лы путем контакта катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет по меньшей мере 7,5 и проводимость по меньшей мере 15 мСм/см, с получением элюата, содержащего раннюю фракцию и позднюю фракцию; и (л) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата. В конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,3. В другом конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,2. В другом конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2±0,1. Еще в одном конкретном варианте условия первого раствора включают рН 5,2. В других вариантах условия первого раствора включают рН 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 или 6,0. В другом конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 20 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 22 мСм/см. Еще в одном конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 25 мСм/см. В предпочтительном варианте катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. В конкретном варианте слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную смолу (КМ).

А. Предшествующая схема фракционирования I.

В первом примере предшествующие схемы очистки, плазму, содержащую иммуноглобулин ^О, подвергают спиртовому фракционированию (например, фракционирование этанолом), как описано ниже. В одном из вариантов данная первая предшествующая схема фракционирования включает стадию осаждения фракции ММП, стадию осаждения фракции А и стадию осаждения фракции В перед стадией осаждения фракции II, которая в конечном счете обеспечивает исходный материал для методов катионообменной хроматографии, предложенных в данном описании для снижения амидолитической активности (например, фактор ХПХЫ) и/или активности против комплемента (АПК).

Предусмотрены способы, включающие все комбинации условий осаждения (например, концентрация этанола, рН, температура, методика разделения) для каждой из стадий осаждения фракции ММП, фракции А, фракции В и фракции II, описанных ниже. Дополнительно, способы, включающие все комбинации конкретных условий осаждения, предусмотрены со всеми возможными схемами определения и сбора ранней фракции элюата, как описано ниже.

1. Осаждение фракции ММП.

В одном из вариантов осаждение фракции ММП проводят, добавляя этанол к криообедненной плазме в конечной концентрации от 17 до 23% (об./об.) при рН от 6,5 до 7,3. Далее смесь инкубируют при перемешивании и температуре от -8 до -2°С. Полученный осадок фракции ММП может быть отделен от супернатанта фракции ММП центрифугированием или фильтрацией смеси, которую, в общем, проводят на холоде. Большая часть содержащегося иммуноглобулина присутствует в осадке фракции ММП, который может быть ресуспендирован и дополнительно обогащен.

В одном из конкретных вариантов конечная концентрация этанола на стадии осаждения фракции ММП составляет 20±3% (об./об.). В другом варианте конечная концентрация этанола составляет 20±2% (об./об.). В другом варианте конечная концентрация этанола составляет 20±1% (об./об.). Еще в одном варианте конечная концентрация этанола составляет 20% (об./об.). Еще в одном варианте конечная концентрация этанола составляет 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23% (об./об.).

В одном из конкретных вариантов рН на стадии осаждения фракции ММП составляет 6,9±0,4. В другом варианте рН на стадии осаждения фракции ММП составляет 6,9±0,3. В другом варианте рН на стадии осаждения фракции ММП составляет 6,9±0,2. В другом варианте рН на стадии осаждения фракции ММП составляет 6,9±0,1. Еще в одном варианте рН на стадии осаждения фракции ММП составляет 6,9. В других вариантах рН на стадии осаждения фракции ММП составляет 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2 или 7,3.

В одном из конкретных вариантов температура стадии осаждения фракции ММП составляет -5±3°С. В другом варианте температура стадии осаждения фракции ММП составляет -5±2°С. В другом варианте температура стадии осаждения фракции ММП составляет -5±1°С. Еще в одном варианте температура стадии осждения фракции ММП составляет -5°С. В других вариантах температура стадии осждения фракции ММП составляет -8, -7, -6, -5, -4, -3 или -2°С.

В конкретном варианте рН криообедненной плазмы доводят до 6,9±0,2, и концентрацию спирта вычисляют как 20% (об./об.) путем добавления буфера ресуспендирования, содержащего натрия ацетат тригидрат, ледяную уксусную кислоту и воду для инъекций (рН 4,0), а также денатурированный этиловый спирт (формула δΌΆ-3Ά). Буфер добавляют с необходимым количеством спирта при тщательном перемешивании. Спирт охлаждают до температуры -15°С или менее перед добавлением к криообедненной плазме. Буфер и спирт добавляют к плазме, в то время как резервуар суспензии охлаждают до температуры -5±2°С. После кончания добавления, рН раствора проверяют и корректируют до 6,9±0,2, при необходимости, с помощью буфера рН 4,0 или раствора натрия бикарбоната. Полученную суспензию фракции ММП далее центрифугируют для отделения осадка от супернатанта.

2. Осаждение фракции А.

Для дополнительного обогащения содержания и чистоты ^О в одном из вариантов осадок фракции ММП ресуспендируют и проводят вторую стадию осаждения (осаждение фракции А). Осаждение

- 24 030251

фракции А выполняют путем добавления этанола к суспензии фракции Μί+Ш до конечной концентрации от 17 до 23% (об./об.) при рН от 6,8 до 7,6. Далее смесь инкубируют при перемешивании и температуре от -8 до -2°С. Полученный осадок фракции А может быть отделен от супернатанта фракции А центрифугированием или фильтрацией смеси, которую, в общем, проводят на холоде. Большая часть иммуноглобулина присутствует в осадке фракции А, который может быть ресуспендирован и дополнительно обогащен.

В одном из конкретных вариантов конечная концентрация этанола на стадия осаждения фракции А составляет 20±3% (об./об.). В другом варианте конечная концентрация этанола составляет 20±2% (об./об.). В другом варианте конечная концентрация этанола составляет 20±1% (об./об.). Еще в одном варианте конечная концентрация этанола составляет 20% (об./об.). Еще в одном варианте конечная концентрация этанола составляет 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23% (об./об.).

В одном из конкретных вариантов рН на стадии осаждения фракции А составляет 7,2±0,4. В другом варианте рН на стадии осаждения фракции А составляет 7,2±0,3. В другом варианте рН на стадии осаждения фракции А составляет 7,2±0,2. В другом варианте рН на стадии осаждения фракции А составляет 7,2±0,1. Еще в одном варианте рН на стадии осаждения фракции А составляет 7,2. В других вариантах рН на стадии осаждения фракции А составляет 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5 или 7,6.

В одном из конкретных вариантов температура стадии осаждения фракции А составляет -5±3°С. В другом варианте температура стадии осаждения фракции А составляет -5±2°С. В другом варианте температура стадии осаждения фракции А составляет -5±1°С. Еще в одном варианте температура стадии осаждения фракции А составляет -5°С. В других вариантах температура стадии осаждения фракции А составляет -8, -7, -6, -5, -4, -3 или -2°С.

В одном из конкретных вариантов осадок фракции Г+П+Ш суспендируют в холодном буфере ресуспендирования, содержащем натрия ацетат тригидрат, ледяную уксусную кислоту и воду для инъекций (рН 4,0) и перемешивают. Суспензию разбавляют водой для инъекций (ВДИ), чтобы достичь вычисленной концентрации белка 1,0±0,3% (мас./об.). Перемешивание продолжают до тех пор, пока суспензия не станет однородной. рН раствора доводят до 7,2±0,2 с помощью буфера (рН 4,0) или 0,25 М раствора динатрия фосфата и доводят концентрацию спирта до вычисленной 20% (об./об.). Спирт охлаждают до температуры -15°С или менее перед добавлением к раствору. Добавляют охлажденный спирт, в то время как резервуар охлаждают до -5±2°С. После окончания добавления, рН суспензии проверяют и, при необходимости, корректируют до 7,2±0,2. Затем полученный осадок (который называют осадком фракции А) отфильтровывают, чтобы отделить осадок от супернатанта.

3. Осаждение фракции В.

Для дополнительного обогащения содержания и чистоты ЦС в одном из вариантов осадок фракции А ресуспендируют и проводят третью стадию осаждения (осаждение фракции В). Осаждение фракции В выполняют путем добавления этанола к суспензии фракции А до конечной концентрации от 14% до 20% (об./об.) при рН от 5,0 до 5,8. Далее смесь инкубируют при перемешивании и температуре от -8°С до 2°С. Полученный осадок фракции В может быть отделен от супернатанта фракции В центрифугированием или фильтрацией смеси, которую, в общем, проводят на холоде. Большая часть иммуноглобулина присутствует в супернатанте фракции В, который может быть выделен и дополнительно обогащен.

В одном из конкретных вариантов конечная концентрация этанола на стадии осаждения фракции В составляет 17±3% (об./об.). В другом варианте конечная концентрация этанола составляет 17±2% (об./об.). В другом варианте конечная концентрация этанола составляет 17±1% (об./об.). Еще в одном варианте конечная концентрация этанола составляет 17% (об./об.). Еще в одном варианте конечная концентрация этанола составляет 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20% (об./об.).

В одном из конкретных вариантов рН на стадии осаждения фракции В составляет 5,4±0,4. В другом варианте рН на стадии осаждения фракции В составляет 5,4±0,3. В другом варианте рН на стадии осаждения фракции В составляет 5,4±0,2. В другом варианте рН на стадии осаждения фракции В составляет 5,4±0,1. Еще в одном варианте рН на стадии осаждения фракции В составляет 5,4. В других вариантах рН на стадии осаждения фракции В составляет 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7 или 5,8.

В одном из конкретных вариантов температура стадии осаждения фракции А составляет -5±3°С. В другом варианте температура стадии осаждения фракции А составляет -5±2°С. В другом варианте температура стадии осаждения фракции А составляет -5±1°С. Еще в одном варианте температура стадии осаждения фракции А составляет -5°С. В других вариантах температура стадии осаждения фракции А составляет -8, -7, -6, -5, -4, -3 или -2°С.

В конкретном варианте осадок фракции А суспендируют в холодной воде для инъекций (ВДИ) и перемешивают по меньшей мере в течение 1 ч. После тщательного суспендирования осадка, добавляют буфер, содержащий натрия ацетат. Перемешивание продолжают до тех пор, пока суспензия не становится гомогенной. рН доводят до 5,4±0,2 с помощью буфера рН 4,0 (109 г/л натрия ацетата тригидрата, 240 г/л ледяной уксусной кислоты и ВДИ) или 0,25 М раствора динатрия фосфата. Суспензию разбавляют холодной ВДИ, чтобы достичь вычисленной концентрации белка 1,2±0,3% (мас./об.). Перемешивание

- 25 030251

продолжают до тех пор, пока суспензия не станет однородной. Содержание спирта доводят до концентрации, вычисленной как 17% (об./об.), путем добавления спирта, предварительно охлажденного до -15°С или менее. Добавляют охлажденный спирт, в то время как резервуар охлаждают до-5±2°С. При необходимости, рН доводят до 5,4±0,2 с помощью буфера рН 4,0 или 0,25 М раствора динатрия фосфата. Полученный осадок, осадок фракции В, отделяют фильтрацией с использованием фильтрующего элемента глубинного типа. Фильтрат (т.е. супернатант) фракции В выделяют для дальнейшего обогащения.

Б. Предшествующая схема фракционирования II.

Во втором примере предшествующей схемы очистки, плазму, содержащую иммуноглобулин ЦС. подвергают спиртовому фракционированию (например, фракционирование этанолом), как описано ниже. В одном из вариантов данная первая предшествующая схема фракционирования включает стадию осаждения фракции I и стадию осаждения фракции П+Ш перед стадией осаждения фракции II, которая в конечном счете обеспечивает исходный материал для методом катионообменной хроматографии, предложенных в данном описании для снижения амидолитической активности (например, фактор XI/XIа) и/или активности против комплемента (АПК).

Предусмотрены способы, включающие все комбинации условий осаждения (например, концентрация этанола, рН, температура, методика разделения) для каждой из стадий осаждения фракции I, фракции П+Ш и фракции II, описанных ниже. Дополнительно, способы, включающие все комбинации конкретных условий осаждения, предусмотрены со всеми возможными схемами определения и сбора ранней фракции элюата, как описано ниже.

1. Осаждение фракции I.

В одном из вариантов осаждение фракции I проводят, добавляя этанол к криообедненной плазме в конечной концентрации от 6 до 10% (об./об.) при рН от 6,7 до 7,3. Далее смесь инкубируют при перемешивании и температуре от -4 до 2°С. Полученный осадок фракции I может быть отделен от супернатанта фракции I центрифугированием или фильтрацией смеси, которую, в общем, проводят на холоде. Большая часть содержащегося иммуноглобулина присутствует в супернатанте фракции I, который может быть выделен и дополнительно обогащен.

В одном из конкретных вариантов конечная концентрация этанола на стадии осаждения фракции I составляет 8±2% (об./об.). В другом варианте конечная концентрация этанола составляет 8±1% (об./об.). Еще в одном варианте конечная концентрация этанола составляет 8% (об./об.). Еще в одном варианте конечная концентрация этанола составляет 6, 7, 8, 9 или 10% (об./об.).

В одном из конкретных вариантов рН на стадии осаждения фракции I составляет 7,0±0,4. В другом варианте рН на стадии осаждения фракции I составляет 7,0±0,3. В другом варианте рН на стадии осаждения фракции I составляет 7,0±0,2. В другом варианте рН на стадии осаждения фракции I составляет 7,0±0,1. Еще в одном варианте рН на стадии осаждения фракции I составляет 7,0. В других вариантах рН на стадии осаждения фракции I составляет 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2 или 7,3.

В одном из конкретных вариантов температура стадии осаждения фракции I составляет -1±3°С. В другом варианте температура стадии осаждения фракции I составляет -1±2°С. В другом варианте температура стадии осаждения фракции I составляет -1±1°С. Еще в одном варианте температура стадии осаждения фракции I составляет -1°С. В других вариантах температура стадии осаждения фракции I составляет -4, -3, -2, -1, 0, 1 или 2°С.

В конкретном варианте рН криообедненной плазмы доводят до 7,0±0,1, и вычисленная концентрация спирта составляет 8% (об./об.). Растворы, используемые для коррекции рН и концентрации спирта, добавляют при тщательном перемешивании. Температуру реакции осаждения снижают и поддерживают в интервале -1±1°С. Полученную суспензию фракции I далее центрифугируют или фильтруют, чтобы отделить осадок от супернатанта.

2. Осаждение фракции П+Ш.

Для дополнительного обогащения содержания и чистоты ЦС в одном из вариантов супернатант фракции I используется в качестве материала для второй стадии осаждения (осаждение фракции П+Ш). Осаждение фракции П+Ш выполняют путем добавления этанола к супернатанту фракции I до конечной концентрации от 22 до 28% (об./об.) при рН от 6,7 до 7,3. Далее смесь инкубируют при перемешивании и температуре от -10°С до -4°С. Полученный осадок фракции П+Ш может быть отделен от супернатанта фракции П+Ш центрифугированием или фильтрацией смеси, которую, в общем, проводят на холоде. Большая часть иммуноглобулина присутствует в осадке фракции П+Ш, который может быть ресуспендирован и дополнительно обогащен.

В одном из конкретных вариантов конечная концентрация этанола на стадии осаждения фракции П+Ш составляет 25±3% (об./об.). В другом варианте конечная концентрация этанола составляет 25±2% (об./об.). В другом варианте конечная концентрация этанола составляет 25±1% (об./об.). Еще в одном варианте конечная концентрация этанола составляет 25% (об./об.). Еще в одном варианте конечная концентрация этанола составляет 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28% (об./об.).

В одном из конкретных вариантов рН на стадии осаждения фракции П+Ш составляет 7,0±0,4. В другом варианте рН на стадии осаждения фракции П+Ш составляет 7,0±0,3. В другом варианте рН на

- 26 030251

стадии осаждения фракции ΙΙ+ΙΙΙ составляет 7,0±0,2. В другом варианте рН на стадии осаждения фракции ΙΙ+ΙΙΙ составляет 7,0±0,1. Еще в одном варианте рН на стадии осаждения фракции ΙΙ+ΙΙΙ составляет 7,0. В других вариантах рН на стадии осаждения фракции ΙΙ+ΙΙΙ составляет 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 или 7,4.

В одном из конкретных вариантов температура стадии осаждения фракции ΙΙ+ΙΙΙ составляет -7±3°С. В другом варианте температура стадии осаждения фракции ΙΙ+ΙΙΙ составляет -7±2°С. В другом варианте температура стадии осаждения фракции ΙΙ+ΙΙΙ составляет -7±1°С. Еще в одном варианте температура стадии осаждения фракции ΙΙ+ΙΙΙ составляет -7°С. В других вариантах температура стадии осаждения фракции ΙΙ+ΙΙΙ составляет -10, -9, -8, -7, -6, -5 или -4°С.

В конкретном варианте рН супернатанта фракции Ι доводят до 7,0±0,1, и вычисленная концентрация спирта составляет 25% (об./об.). Растворы, используемые для коррекции рН и концентрации спирта, добавляют при тщательном перемешивании. Температуру реакции осаждения снижают и удерживают в интервале -6±2°С. Затем полученную суспензию фракции ΙΙ+ΙΙΙ центрифугируют или фильтруют, чтобы отделить осадок от супернатанта.

В. Осаждение фракции ΙΙ.

Для дополнительного обогащения содержания и чистоты Ι§Ο, в одном из вариантов выполняют четвертую (после предшествующей схемы фракционирования Ι) или третью (после предшествующей схемы фракционирования ΙΙ) стадию осаждения спиртом (осаждение фракции ΙΙ). Осаждение фракции ΙΙ выполняют путем коррекции рН фильтрата фракции В или суспензии осадка фракции ΙΙ+ΙΙΙ до интервала 6,7-7,5 и добавления этанола до конечной концентрации от 22 до 28% (об./об.). Далее смесь инкубируют при перемешивании и температуре от -13 до -2°С. Полученный осадок фракции ΙΙ может быть отделен от супернатанта фракции В центрифугированием или фильтрацией смеси, которую, в общем, проводят на холоде. Большая часть иммуноглобулина присутствует в осадке фракции ΙΙ, который может быть ресуспендирован и дополнительно обогащен.

В одном из конкретных вариантов конечная концентрация этанола на стадии осаждения фракции ΙΙ составляет 25±3% (об./об.). В другом варианте конечная концентрация этанола составляет 25±2% (об./об.). В другом варианте конечная концентрация этанола составляет 25±1% (об./об.). Еще в одном варианте конечная концентрация этанола составляет 25% (об./об.). Еще в одном варианте конечная концентрация этанола составляет 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28% (об./об.).

В одном из конкретных вариантов рН на стадии осаждения фракции ΙΙ составляет 7,1±0,4. В другом варианте рН на стадии осаждения фракции ΙΙ составляет 7,1±0,3. В другом варианте рН на стадии осаждения фракции ΙΙ составляет 7,1±0,2. В другом варианте рН на стадии осаждения фракции ΙΙ составляет 7,1±0,1. Еще в одном варианте рН на стадии осаждения фракции ΙΙ составляет 7,1. В других вариантах рН на стадии осаждения фракции ΙΙ составляет 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 или 7,5.

В одном из конкретных вариантов температура стадии осаждения фракции ΙΙ составляет -5±3°С. В другом варианте температура стадии осаждения фракции ΙΙ составляет -5±2°С. В другом варианте температура стадии осаждения фракции ΙΙ составляет -5±1°С. Еще в одном варианте температура стадии осаждения фракции ΙΙ составляет -5°С. В другом конкретном варианте температура стадии осаждения фракции ΙΙ составляет -10±3°С. В другом варианте температура стадии осаждения фракции ΙΙ составляет 10±2°С. В другом варианте температура стадии осаждения фракции ΙΙ составляет -10±1°С. Еще в одном варианте температура стадии осаждения фракции ΙΙ составляет -10°С. В других вариантах температура стадии осаждения фракции ΙΙ составляет -13, -12, -11, -10, -9, -8, -7, -6, -5, -4, -3 или -2°С.

В конкретном варианте рН фильтрата фракции В доводят до 7,1±0,2 с помощью 1,0 М раствора бикарбоната натрия. Дополнительное количество спирта добавляют при перемешивании, до вычисленной концентрации 25% (об./об.). рН проверяют и доводят, при необходимости, до 7,3±0,2 с помощью 1 М раствора натрия бикарбоната или буфера рН 4,0. Суспензию перемешивают по меньшей мере в течение 2 ч при температуре -5±2°С после окончания добавления спирта. После окончания перемешивания рН доводят до 7,3±0,2, при необходимости. Суспензию центрифугируют и осадок, т.е. осадок фракции ΙΙ отделяют.

Г. Катионообменная хроматография.

Для дополнительного обогащения композиции, содержащей иммуноглобулин, в одном из вариантов осадок фракции ΙΙ может быть ресуспендирован в воде или буфере с низкой ионной силой и обработан катионообменной хроматографией. В одном из вариантов осадок фракции ΙΙ ресуспендируют в воде или буфере с низкой ионной силой при рН ниже 6,0. Обычно, рН ресуспендированного осадка фракции ΙΙ составляет 5,2±0,2 и проводимость суспензии низкая, обычно не более 1 мСм/см. Далее суспензию фракции ΙΙ фильтруют, чтобы удалить несолюбилизированный материал до помещения на катионообменную смолу, уравновешенную при рН ниже 6,0. После загрузки иммуноглобулинов на катионообменную смолу (например, катионообменная колонка), смолу можно промыть буфером для промывания с рН ниже 6,0. Для элюации иммуноглобулинов, обеспечивают контакт катионообменной смолы с буфером элюации, обладающим проводимостью по меньшей мере 15 мСм/см (например, с концентрацией соли по

- 27 030251

меньшей мере 150 мМ ЫаС1 или эквивалентной соли) и рН выше 7,0. В конкретном варианте суспендированный осадок фракции ΙΙ обрабатывают растворителем и поверхностно-активным веществом (Р/П) перед проведением катионообменной хроматографии. Хотя ресуспендированный осадок фракции ΙΙ из примера схемы фракционирования, представленной в данном описании, используется в качестве исходного материала для катионообменных способов, предложенных в данном описании, следует понимать, что любая композиция, содержащая полученный из плазмы иммуноглобулин (т.е. фракция), которая содержит иммуноглобулины Ι§0 и амидолитическую активность (например, ΡΧΙ и/или ΡΧΙα) и/или активность против комплемента (АПК), может использоваться в способах, предложенных в данном описании.

Было обнаружено, что высокие уровни амидолитической активности (например, ΡΧΙ и/или ΡΧΙα) и/или активности против комплемента (АПК) со-элюируются с ΙβΟ из катионообменной смолы. Неспособность отделить значительные количества этих примесей от желательных иммуноглобулинов приводит к конечной композиции, содержащей Ι§0, с высокой амидолитической активностью и/или высокой активностью против комплемента. С учетом повышенного риска тромбоэмболических событий, которые отнесены на счет высокой амидолитической активности в фармацевтических препаратах иммуноглобулина, и побочных реакций, которые связаны с активностью против комплемента, в данной области попрежнему существует потребность в удалении примесей, которые способствуют амидолитической активности (например, ΡΧΙ/ΡΧΙα) и/или активности против комплемента (АПК), присутствующим во многих продуктах ЦС. Преимущественно было обнаружено, что при использовании буфера с рН выше 7,0 для элюации иммуноглобулинов из катионообменной смолы, амидолитическая активность и активность против комплемента (АПК) элюируется только в поздней фракции элюата. Следует отметить, что элюация амидолитической активности и АПК в поздней фракции элюата соответствует сдвигу рН элюата, от значений ниже 6,0 до значений выше 7,0. Таким образом, ранняя фракция элюата содержит высокую концентрацию иммуноглобулинов и небольшое количество амидолитической активности и АПК, в то время как поздняя фракция элюата содержит более низкую концентрацию иммуноглобулина и большее количество амидолитической активности и АПК. Соответственно в предпочтительных вариантах способов, предложенных в данном описании, раннюю фракцию элюата катионообменной колонки собирают отдельно от поздней фракции элюата.

В некоторых вариантах катионообменная смола представляет собой слабую катионообменную смолу. Примеры слабой катионообменной смолы включают содержащие лиганд карбоновой кислоты, например, карбоксиметильные смолы (КМ). В предпочтительном варианте катионообменная смола, используемая в способах, предложенных в данном описании, представляет собой карбоксиметильную смолу, например КМ-сефарозу.

В одном из вариантов осадок фракции ΙΙ ресуспендируют в холодной воде или буфере с низкой ионной силой при рН от 4,8 до 5,6. В конкретном варианте рН воды или буфера, используемого для ресуспендирования, составляет 5,2±0,3. В другом конкретном варианте рН воды или буфера, используемого для ресуспендирования, составляет 5,2±0,2. В другом конкретном варианте рН воды или буфера, используемого для ресуспендирования, составляет 5,2±0,1. Еще в одном конкретном варианте рН воды или буфера, используемого для ресуспендирования, составляет 5,2. В других вариантах рН воды или буфера, используемого для ресуспендирования, составляет 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 или 6,0.

В одном из вариантов катионообменную смолу предварительно уравновешивают до рН от 4,6 до

5,6. В конкретном варианте смолу предварительно уравновешивают до рН от 4,6 до 5,5. В другом конкретном варианте смолу предварительно уравновешивают до рН 5,0±0,4. В другом конкретном варианте смолу предварительно уравновешивают до рН 5,0±0,3. В другом конкретном варианте смолу предварительно уравновешивают до рН 5,0±0,2. В другом конкретном варианте смолу предварительно уравновешивают до рН 5,0±0,1. В другом конкретном варианте смолу предварительно уравновешивают до рН 5,0. В других вариантах смолу предварительно уравновешивают до рН 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 или 6,0.

В одном из вариантов после загрузки осветленной суспензии фракции ΙΙ на катионообменную смолу, смолу промывают буфером с достаточно низкой проводимостю, таким образом, что иммуноглобулины не элюируются из смолы, и рН от 5,1 до 5,9. В конкретном варианте рН буфера для промывания составляет 5,5±0,3. В другом конкретном варианте рН буфера для промывания составляет 5,5±0,2. В другом конкретном варианте рН буфера для промывания составляет 5,5±0,1. В другом конкретном варианте рН буфера для промывания составляет 5,5. В других вариантах рН буфера для промывания составляет 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 или 6,0.

В одном из вариантов рН буфера элюации выше 7,5. В другом варианте рН буфера элюации составляет от 7,4 и 8,2. В конкретном варианте рН буфера элюации составляет 7,8±0,3. В другом конкретном варианте рН буфера элюации составляет 7,8±0,2. В другом конкретном варианте рН буфера элюации составляет 7,8±0,1. В другом конкретном варианте рН буфера элюации составляет 7,8. В других вариантах рН буфера элюации составляет 7,0, 7,1, 7,2, 7,36, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 или 8,5.

В одном из конкретных вариантов проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 10

- 28 030251

мСм/см. В предпочтительном варианте проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 15 мСм/см. В другом предпочтительном варианте, проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 20 мСм/см. В конкретном варианте проводимость буфера элюации составляет от 10 до 40 мСм/см. В другом варианте проводимость буфера элюации составляет от 15 до 30 мСм/см. В другом варианте проводимость буфера элюации составляет от 20 до 30 мСм/см. В другом варианте проводимость буфера элюации составляет от 25 до 30 мСм/см. В других вариантах проводимость буфера элюации составляет приблизительно 5 мСм/см или приблизительно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 мСм/см или выше.

В одном из вариантов ранняя фракция (т.е. собранная или объединенная в пул целевая фракция) элюата составляет не более 80% всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 70 до 80% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 60 до 80% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 80% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 70 до 75% всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 75 до 80% всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80% всего элюата.

В другом варианте ранняя фракция (т.е. собранная или объединенная в пул целевая фракция) элюата составляет не более 70% всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 60 до 70% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 70% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 60 до 65% всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 65 до 70% всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 или 70% всего элюата.

В другом варианте ранняя фракция (т.е. собранная или объединенная в пул целевая фракция) элюата составляет не более 60% всего элюата. В конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 60% всего элюата. В другом конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 50 до 55% всего элюата. Еще в одном конкретном варианте ранняя фракция элюата составляет от 55 до 60% всего элюата. В других вариантах ранняя фракция элюата составляет 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 или 60% всего элюата.

В другом варианте раннюю и позднюю фракции элюата определяют по рН раствора. В одном из вариантов ранняя фракция представляет собой элюат, рН которого составляет не более 7,0. В другом варианте ранняя фракция представляет собой элюат, рН которого составляет не более 6,5. В другом варианте ранняя фракция представляет собой элюат, рН которого составляет не более 6,0. В другом варианте ранняя фракция представляет собой элюат, рН которого составляет не более 5,5. В другом варианте ранняя фракция представляет собой элюат, рН которого составляет не более 5,0. В других вариантах ранняя фракция представляет собой элюат, рН которого составляет не более 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0 или менее.

В одном из вариантов раннюю фракцию элюата определяют как порцию элюата, которая элюируется из катионообменной смолы до точки, в которой ОЭ₂₈₀ капель элюата ниже 2,0 ОЕ. В другом варианте раннюю фракцию элюата определяют как порцию элюата, которая элюируется из катионообменной смолы до точки, в которой ОЭ₂₈₀ капель элюата ниже 1,5 ОЕ. В другом варианте раннюю фракцию элюата определяют как порцию элюата, которая элюируется из катионообменной смолы до точки, в которой ОЭ₂₈₀ капель элюата ниже 1,0 ОЕ. В другом варианте раннюю фракцию элюата определяют как порцию элюата, которая элюируется из катионообменной смолы до точки, в которой ОЭ₂₈₀ капель элюата ниже 0,5 ОЕ. В других вариантах раннюю фракцию элюата определяют как порцию элюата, которая элюируется из катионообменной смолы до точки, в которой ОЭ₂₈₀ капель элюата ниже

2,0 ОЕ, 1,9 ОЕ, 1,8 ОЕ, 1,7 ОЕ, 1,6 ОЕ, 1,5 ОЕ, 1,4 ОЕ, 1,3 ОЕ, 1,2 ОЕ, 1,1 ОЕ, 1,0 ОЕ,

0,9 ОЕ, 0,8 ОЕ, 0,7 ОЕ, 0,6 ОЕ, 0,5 ОЕ, 0,4 ОЕ, 0,3 ОЕ, 0,2 ОЕ, 0,1 ОЕ или менее. В некоторых вариантах ранняя фракция элюата дополнительно определяется как порция

элюата, которая элюируется из катионообменной смолы после того, как ОЭ₂₈₀ элюата поднимается выше порога, например,

0,1 ОЕ, 0,2 ОЕ, 0,3 ОЕ, 0,4 ОЕ, 0,5 ОЕ, 0,6 ОЕ, 0,7 ОЕ, 0,8 ОЕ, 0,9 ОЕ, 1,0

ОЕ, 1,1 ОЕ, 1,2 ОЕ, 1,3 ОЕ, 1,4 ОЕ, 1,5 ОЕ, 1,6 ОЕ, 1,7 ОЕ, 1,8 ОЕ, 1,9 ОЕ, 2,0 ОЕ или более.

Д. Ультрафильтрация/диафильтрация (УТФ/ДФ).

Композиции, содержащие 1дС, дополнительно могут быть концентрированы ультрафильтрацией/диафильтрацией. В одном из вариантов композиция, содержащая 1дС, может быть концентрирована ультрафильтрацией до концентрации белка от 2 до 10% (мас./об.). В некоторых вариантах ультрафильтрацию осуществляют в кассете с мебраной с открытым дренажем, и номинальный порог молекулярной массы мембраны для ультрафильтрации (НПММ) составляет не более 100 кДа или не более 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или менее кДа. В предпочтительном варианте НПММ мембраны для ультрафильтрации со- 29 030251

ставляет не более 50 кДа.

Как описано в публикации патентной заявки США № 2010/0330071, содержание которой, таким образом, включено путем ссылки в полном объеме и для всех целей, мембрана с открытым дренажем может использоваться с применением специально разработанной процедуры и рецептуры для вторичного промывания ближе к концу производственного процесса, чтобы удержать концентрацию белка в полученной композиции, содержащей ПС. приблизительно в 2 раза выше (200 мг/мл), по сравнению с заявленной в уровне техники для внутривенных препаратов Ι§ (например, ГАММАГАРД® ЖИДКОСТЬ) без воздействия на выход и стабильность при хранении. В случае большинства коммерческих доступных мембран для ультрафильтрации концентрация 200 мг/мл ПС не может быть достигнута без значительных потерь белка. Такие мембраны будут блокироваться на ранней стадии, и, таким образом, сложно выполнить надлежащее вторичное промывание. Таким образом, следует использовать конфигурации мембран с открытым дренажем. Даже в случае мембран с открытым дренажем следует применять специально разработанную методику вторичного промывания, чтобы получить необходимую концентрацию без значительной потери белка (потеря менее 2%). Даже более удивительным является тот факт, что более высокая концентрация белка 200 мг/мл не влияет на способность к инактивации вирусов на стадии хранения при низком значении рН.

После завершения стадии ультрафильтрации концентрат может быть дополнительно концентрирован посредством диафильтрации против раствора, пригодного для внутривенного или внутримышечного введения. В некоторых вариантах раствор для диафильтрации может содержать стабилизирующий и/или буферизующий агент. В предпочтительном варианте стабилизирующий и буферизующий агент представляет собой глицин в подходящей концентрации, например от 0,20 до 0,30 М, или от 0,22 до 0,28 М, или от 0,24 до 0,26 мМ, или в концентрации 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 или 3,0. В предпочтительном варианте буфер диафильтрации содержит 0,25 М глицина.

Обычно минимальный объем обмена составляет по меньшей мере приблизительно 3-начальный объем концентрата или по меньшей мере в 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более раз превышает начальный объем концентрата. Раствор ПС может быть концентрирован до конечной концентрации белка от 3 до 25% (мас./об.), или от 3 до 7%, или от 6 до 18% (мас./об.), или от 7 до 16% (мас./об.), или от 8 до 14% (мас./об.), или от 9 до 12%, или до конечной концентрации 5, или 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25% или выше. В одном из вариантов конечная концентрация белка по меньшей мере 23% достигается без добавления фракции вторичного промывания к концентрированному раствору. В другом варианте конечная концентрация белка по меньшей мере 24% достигается без добавления фракции вторичного промывания к концентрированному раствору. Еще в одном варианте конечная концентрация белка по меньшей мере 25% достигается без добавления фракции вторичного промывания к концентрированному раствору. Обычно, в конце процесса концентрации рН раствора будет составлять от приблизительно 4,6 до 5,1.

В примерном варианте рН композиции, содержащей ПС, доводят до 5,2±0,2 с использованием 1 М хлористо-водородной кислоты и концентрируют до 5±1 г % белка ультрафильтрацией (номинальный порог молекулярной массы 100 кДа или менее). Концентрат затем обрабатывают диафильтрацией с раствором для диафильтрации (0,02 М ЫаС1, 0,05% (мас./об.) ПЭГ). Диафильтрат охлаждают до 5±2°С. Концентрацию буфера Трис в растворе доводят до 0,025 М с помощью 2,0 М Трис и рН доводят до 7,8±0,2.

Е. Анионообменная хроматография.

В одном из вариантов белок далее загружают на уравновешенную колонку АОХ 8ерйагоке® 4 Рак! Р1о\у для удаления загрязняющих веществ плазмы. После окончания загрузки, колонку промывают с буфером уравновешивания (25 мМ Трис, 20 мМ ЫаС1, рН 7,8±0,2). Выход колонки (раствор Ι§Ο) со стадий загрузки и промывания объединяют в пул.

Ж. Инактивация и/или удаление вирусов.

В некоторых вариантах данного описания предложены способы получения обогащенной композиции, содержащей иммуноглобулин, которые будут дополнительно включать по меньшей мере одну, предпочтительно по меньшей мере две, наиболее предпочтительно по меньшей мере три стадии инактивации или удаления вирусов. Неограничивающие примеры стадий инактивации или удаления вирусов, которые могут применяться со способами, предложенными в данном описании, включают обработку растворителем и поверхностно-активным веществом (Ного\\й/ е! а1., В1оой Соади1 РФппоЕкЕ 1994 (5 8ирр1 3):821-828 и КгеП е! а1., ТгапкГикюп 2003 (43): 1023-1028, оба из которых явно включены путем ссылки в данное описание в полном объеме и для всех целей), нанофильтрацию (Натато!о е! а1., Уох 8апд 1989 (56)230-236 и Уиака е! а1., 1 Сеп Уио1. 1991 (72 (р! 8)):2021-2024, оба из которых явно включены путем ссылки в данное описание в полном объеме и для всех целей) и инкубацию при низких значениях рН и высоких температурах (КетрГ е! а1., ТгапкГикюп 1991 (31)423-427 и Ьоше е! а1., Вю1одюаЕ 1994 (22): 13-19).

Стадии инактивации или удаления вирусов могут выполняться на любых промежуточных фракциях иммуноглобулина, генерируемых в течение производственного процесса. Например, в одном из вариантов стадия удаления или инактивации вирусов может выполняться на суспензии фракции Ι+ΙΙ+ΙΙΙ, сус- 30 030251

пензии фракции А, фильтрате фракции В, суспензии фракции ΙΙ, элюате катионообменной колонки, элюате анионообменной колонки, и т.п.

В одном из вариантов стадия удаления или инактивации вирусов выполняется на суспензии фракции ΙΙ. В предпочтительном варианте суспензию фракции ΙΙ обрабатывают растворителем и поверхностно-активным веществом (Р/П).

1. Обработка растворителем и поверхностно-активным веществом (Р/П).

Для инактивации различных загрязнителей вирусной природы, которые могут присутствовать в полученных из плазмы продуктах, один или более промежуточных продуктов производства иммуноглобулина могут быть обработаны растворителем и поверхностно-активным веществом (Р/П). В предпочтительном варианте осадок фракции ΙΙ ресуспендируют и обрабатывают Р/П. Способы обработки полученных из плазмы фракций поверхностно-активным веществом хорошо известны в данной области (обзор см. в РеПеИег РР. е! а1., Век! Ргас! Кек С1ш Наета!о1. 2006; 19(1):205-42). В общем, любая стандартная обработка Р/П может применяться в сочетании со способами, предложенными в данном описании. Например, ниже предложен примерный протокол обработки Р/П.

Если коротко, Тритон Х-100, Твин-20 и три(н-бутил)фосфат (ТНБФ) добавляют к осветленному фильтрату РрЮ в конечных концентрациях приблизительно 1,0, 0,3 и 0,3% соответственно. Далее смесь перемешивают при температуре от приблизительно 18 до приблизительно 25°С по меньшей мере около 1 ч.

В одном из вариантов реактивы Р/П (например, Тритон Х-100, Твин-20 и ТНБФ) добавляют путем распыления вместо доливания. В других вариантах, поверхностно-активные реактивы могут быть добавлены в твердой форме к промежуточному раствору иммуноглобулина, который перемешивают, чтобы обеспечить быстрое распределение компонентов Р/П. В некоторых вариантах предпочтительным является добавление реактивов в твердой форме путем распыления твердых веществ над делокализованной площадью поверхности фильтрата таким образом, что не происходит местного превышения концентрации, как, например, при добавлении жидкости. В другом варианте улучшение способа реализовано путем нагнетания содержащего иммуноглобулин раствора, в концентрированной или разбавленной форме, в резервуар, в котором уже присутствуют реактивы Р/П.

2. Нанофильтрация.

Для того чтобы способствовать снижению вирусной нагрузки в композиции, содержащей иммуноглобулин, предложенной в данном описании, промежуточная фракция иммуноглобулина может быть обработана нанофильтрацией с использованием подходящего устройства для нанофильтрации. В некоторых вариантах средний размер пор устройства для нанофильтрации будет составлять точно или приблизительно от 15 до 200 нм. Примеры нанофильтров, пригодных для такого применения, включают, не ограничиваясь ими, Όνο, Όν 50, Όν 20 (Ра11), ^текоКе №Р, ^текоКе ΝΡΚ (МППроге), Р1аиоуа 15Ν, 20Ν, 35Ν и 75Ν (Р1аиоуа). В конкретном варианте средний размер пор нанофильтра может составлять точно или приблизительно от 15 до 72 нм, или точно или приблизительно от 19 до 35 нм, или точно или приблизительно 15, 19, 35 или 72 нм. В предпочтительном варианте средний размер пор нанофильтра будет составлять точно или приблизительно 35 нм, например фильтр ЛкаЫ Р^ΑNΟVΑ 35Ν или эквивалентный.

Необязательно, ультрафильтрация/диафильтрация может быть проведена для дополнительной концентрации нанофильтрата. В одном из вариантов мембрана с открытым дренажем используется со специально разработанной методикой и рецептурой для вторичного промывания ближе к концу производственного процесса, что дает композицию с высокой концентрацией иммуноглобулина.

После нанофильтрации фильтрат можно дополнительно концентрировать ультрафильтрацией и/или диафильтрацией с корректирующей буферной композицией. В одном из вариантов нанофильтрат можно концентрировать ультрафильтрацией до концентрации белка точно или приблизительно от 0,5 до 10% (мас./об.). В некоторых вариантах ультрафильтрация осуществляется в кассете с мембраной с открытым дренажем, и номинальный порог молекулярной массы (НПММ) мембраны для ультрафильтрации составляет менее чем точно или приблизительно 150 кДа или менее чем точно или приблизительно 140, 130, 120, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 или менее кДа. В одном из вариантов НПММ мембраны для ультрафильтрации составляет не более 50 кДа.

3. Инкубация при низких значениях рН.

В некоторых вариантах раствор, содержащий иммуноглобулин, может быть обработан с целью снижения или инактивации вирусной нагрузки в композиции. В одном из вариантов это обеспечивается коррекцией рН композиции до низких значений рН, например менее чем точно или приблизительно 6,0, и инкубированием по меньшей мере в течение приблизительно 1 недели до выпуска композиции. В предпочтительном варианте рН нерасфасованного раствора перед инкубацией доводят до менее чем точно или приблизительно 5,5. В более предпочтительном варианте рН раствора перед инкубацией снижают до менее чем точно или приблизительно 5,0. В некоторых вариантах рН раствора перед инкубацией снижают до менее чем точно или приблизительно 6,0 или менее чем точно или приблизительно 5,9, 5,8, 5,7,

5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0 или ниже.

В некоторых вариантах раствор далее инкубируют по меньшей мере в течение 1 недели, или по меньшей мере 2, 3, 4 или более недель, или по меньшей мере в течение 1, 2, 3 или более месяцев. В пред- 31 030251

почтительных вариантах композицию инкубируют при температуре выше 20, или выше 25, или выше 30°С. В конкретных вариантах композицию инкубируют при температуре 20 или 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40°С или выше.

4. Лиофилизация и термическая обработка.

В других вариантах настоящего изобретения предлагаются лиофилизированные композиции, содержащие иммуноглобулин, которые лиофилизированы в соответствии со способами, известными в данной области. Вирусная активность таких лиофилизированных композиций, которые могут быть предварительно обработаны с помощью других стадий инактивации или удаления вируса, например обработкой Р/П или нанофильтрацией, может быть дополнительно снижена термической обработкой лиофилизированных композиций. Термическая обработка для инактивации вирусной нагрузки в факторах крови хорошо известна в данной области (см., например, РЕ/к1е\\зс/ е! а1., ТЬготЪ Кек. 1987 1и1 15; 47(2):235-41; РЕ/к1е\\зс/ е! а1., Сигг δΐιιά Нета!о1 Βίοοά Тгапккик. 1989; (56):44-54; ЕрЦет ;·ιηά Рпске, АгсЬ Ра!Ро1 ЬаЪ Ме0. 1990 Маг; 114(3):335-40).

3. Препарат.

После завершения стадии диафильтрации концентрацию белка в растворе корректируют с помощью буфера диафильтрации до конечной концентрации от приблизительно 3 до приблизительно 20% (мас./об.), или от 3 до 7%, или от приблизительно 6 до приблизительно 18% (мас./об.), или от приблизительно 7 до приблизительно 16% (мас./об.), или от приблизительно 8 до приблизительно 14% (мас./об.), или от приблизительно 9 до приблизительно 12%, или до конечной концентрации приблизительно 5 или 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25% или выше. В предпочтительном варианте конечная концентрация белка в растворе составляет от приблизительно 9 до приблизительно 11%, более предпочтительно приблизительно 10%.

Полученный нерасфасованный раствор дополнительно стерилизуют фильтрацией через фильтровальные мембраны с абсолютным размером пор не более приблизительно 0,22 мкм, например приблизительно 0,2 мкм. Затем раствор в асептических условиях фасуют в конечные емкости для надлежащей герметизации, и отбирают образцы для проверки.

В одном из вариантов концентрацию композиции, содержащей Ι§Ο, дополнительно корректируют до приблизительно 10,2±0,2% (мас./об.) с помощью буфера диафильтрации. При необходимости, рН доводят до значения от приблизительно 4,4 до приблизительно 4,9. В конце, раствор стерилизуют фильтрацией и инкубируют в течение трех недель при точно или приблизительно 30°С.

В примерном варианте полученный раствор Ι§Ο стабилизируют с помощью ЫаС1 (не более 0,15 М), глицина (не более 0,3 М), глюкозы (не более 0,11 М) и человеческого альбумина (не более 3 мг/мл). рН доводят до 7,0±0,2 с помощью 1 М хлористо-водородной кислоты. Затем раствор концентрируют ультрафильтрацией до желательной концентрации и рН доводят до 7,15±0,1 с помощью 1 М хлористоводородной кислоты или 1 М раствора гидроксида натрия. Нерасфасованный раствор стерилизуют фильтруемый, используя фильтр с размером пор 0,2 мкм или эквивалентный.

Стерильный раствор Ι§Ο в асептических условиях может быть расфасован в емкость, закупорен пробкой для лиофилизации, заморожен, лиофилизирован, герметично закупорен в асептических условиях и укупорен колпачком под обкатку.

νΙΙΙ. Примеры.

Среди других преимуществ примеры 1-7 демонстрируют следующее: (1) стадия элюации иммуноглобулинов из катионообменной смолы (например, КМ-сефароза), дает двухфазное распределение белка, при котором амидолитическая активность (РЬ-1) элюируется позже, чем Ι§Ο, делая возможным удаление амидолитической активности с минимальной потерей выхода Ι§Ο; (2) элюация амидолитической активности (РЬ-1) из катионообменной смолы (например, КМ-сефароза) коррелирует с и, вероятно, вызывается сдвигом рН на КМ колонке в ходе элюации в соответствии со способами, предложенными в данном описании; (3) количество белка, загруженного на катионообменную смолу (например, КМ-сефароза), не влияет на устранение амидолитической активности (РЬ-1), по меньшей мере, в интервале 60-120 мг белка на 1 мл смолы; (4) мониторинг рН на выходе колонки и остановка элюации при возрастании ведет к частичному удалению амидолитической активности (РЬ-1), вероятно, вследствие того, что равновесие рН вверху колонки уже нарушено; (5) амидолитическая активность может быть значительно уменьшена с минимальной потерей выхода Ι§Ο (<10%) путем сбора начального пула элюации менее чем 3 ОК, и, таким образом, мониторинг объема на стадии элюации из КМ-сефарозы представляет собой простой способ значительного уменьшения амидолитической активности композиции, содержащей иммуноглобулин, полученной в соответствии со способами, предложенными в данном описании; и (6) путем сбора "первого пики" на стадии элюации из КМ-сефарозы может быть получена композиция со сниженной концентрацией агрегата Ι§Ο. сниженной активностью ПКА, сниженной активностью РЬ-1, более высокой концентрацией мономера Ι§Ο и более желательным распределением подкласса Ι§Ο.

К тому же, примеры 8 и 9 демонстрируют, по меньшей мере, что (1) белки, вызывающие повышение значений ΕΧΙ;·ι и АОТ, могут быть отделены в ходе КМ-хроматографии путем отделения последних 25% элюата; (2) преимущества, описанные выше, могут быть воспроизведены в производственных про- 32 030251

цессах большого масштаба; и (3) элюаты катионообменной колонки (т.е. КМ-сефароза), полученные в ходе крупномасштабных производственных процессов, могут быть объединены в пул путем мониторинга ΘΌ, например элюат можно собирать в первый пул до тех пор, пока ΘΌ элюата не снизится ниже 2,0, что обеспечивает значительную степень отделения нежелательных белков, вызывающих повышение значений РХ1а и АОТ.

Пример 1.

В данном примере описано распределение нежелательных белков, вызывающих повышение АОТ, РХ1а, и снижение значений времени преобразования неактивированного частичного тромбопластина (ВПНЧТ) из фракции II композиции, содержащей иммуноглобулин, полученной в соответствии с модифицированным спиртовым фракционированием Кистлера-Нитшманн. Указанные примеси могут быть отделены в ходе стадии элюации методом катионообменной хроматографии (например, хроматография на КМ-сефарозе с высокой скоростью потока).

Данный пример демонстрирует значительное уменьшение содержания амидолитической активности (например, РХ1 и/или РХ1а) в ходе элюации методом катионообменной хроматографии. Способ дает конечный продукт иммуноглобулина, содержащий значительно меньшую активность АОТ и РХ1а. Такое снижение достигается специфическим фракционированием элюата на стадии КМ, которое эффективно отделяет амидолитическую активность (присутствующую в поздней фракции элюата) от основной фракцци 1дС (найденной в ранней фракции элюата). Данный пример иллюстрирует, что при разделении элюата катионообменной колонки на раннюю и позднюю фракции, нежелательные следовые белки отделяются от большей части 1дС. Кроме того, приведенные примеры демонстрируют, что, с экономической точки зрения, данный процесс эффективен и пригоден для крупномасштабного производства.

Если коротко, осадок фракции II получают, как показано ниже. После криопреципитации объединенной в пул человеческой плазмы, осадок фракции ПП+Ш получают осаждением с помощью 20% спирта при рН 6,9. После ресуспендирования осадка ПП+Ш, добавляют спирт до конечной концентрации 20% при рН 7,2, для образования осадка. Отделение осадка проводят центрифугированием. Фракции МП (также носит название осадка суспензии В), образованной осаждением суспендированного осадка А с помощью 17% спирта. Осадок отделяют фильтрацией или центрифугированием. Фильтрат суспензии В далее обрабатывают с получением фракции II, которая содержит частично очищенную фракцию гаммаглобулинового белка плазмы (например, !дС).

Далее осветленную суспензию фракции II обрабатывают смесью растворителя/поверхностно активного вещества (Р/П) и загружают на колонку КМ-сефарозы ВСП. После вымывания остаточных реактивов Р/П, фракцию !дС, связанную со смолой, элюируют. Впоследствии раствор иммуноглобулина обрабатывают ультра-/диафильтрацией, а затем загружают на анионообменник, чтобы удалить следовые примеси. После другой стадии концентрации готовая композиция может быть обработана лиофилизацией.

Далее осадок фракции II растворяют в холодной воде при 4°С и рН 5,2±0,2. После очистки фильтрацией СА88, раствор корректируют для обработки Р/П. Концентрацию белка доводят до 2%, и температуру в ходе инкубации Р/П поддерживают в интервале от 20 до 25°С. Затем раствор белка загружают на уравновешенную колонку КМ-сефарозы с высокой скоростью потока (буфер для уравновешивания: ацетат натрия 0,025 М, рН 5,0±0,2). После загрузки, колонку промывают 30 объемами колонки ацетатного буфера (0,01 М ацетата натрия, рН 5,5±0,2) для вымывания реактивов Р/П, после чего адсорбированный белок элюируют буфером элюации (0,25 М ЫаС1, 0,2 М глицина, 0,1% ПЭГ 3350, 25 мМ Трис, рН 8,00). Сбор первой части элюата (Е1) начинают при ΘΌ 400 мОЕ и останавливают точно после 2,7 объемов колонки (фиг. 1). Вторую фракцию (Е2) пика элюации собирают до тех пор, пока ΘΌ не снизится снова до 400 мОЕ. Далее элюированные фракции обрабатывают по отдельности в ходе остальной части процесса.

Затем рН композиций Е1 и Е2 доводят до 5,2 и осуществляют ультра-/диафильтрацию против буфера диафильтрации (0,02 М ЫаС1, 0,05% ПЭГ 3350) для концентрирования до 5% белка (мас./об.). 0,025 М Трис добавляют к композициям, и рН доводят до 7,7. Фракции !дС далее загружают на уравновешенную колонку с высокой скоростью потока АОХ-сефарозы, уравновешенную буфером (0,025 М Трис, 0,02 М №Ск рН 7,7). Полученный проходящий поток АОХ собирают и добавляют 8,5 г/л ЫаС1, 16,5 г/л глицина, 21,7 г/л безводной глюкозы и 1 г/л альбумина (20%). Затем рН корректируют, и композиции Е1 и Е2 концентрируют ультрафильтрацией до 10% (мас./об.) белка. После концентрирования, к концентрированным растворам снова добавляют ЫаС1 и глицин (но не альбумин), и, при необходимости, рН доводят до 7,1 перед стерилизующей фильтрацией.

Хроматограф, показывающий оптическую плотность (мОЕ), проводимость и рН на стадии хроматографии, предложен на фиг. 1. Как можно видеть, одинарная стадия, элюации с помощью буфера элюации, описанного выше, приводит к элюации двух пиков. Следует отметить, что при добавлении буфера элюации, рН элюата значительно снижается по мере выхода первого пика из колонки, а затем резко повышается с элюацией второго пика. Как описано, пики элюации разделяли, собирая 2,7 объема колонки в первой фракции Е1 (слева от вертикальной линии на фиг. 1) и второй фракции (вправо от вертикальной

- 33 030251

линии на фиг. 1).

Элюированные фракции (Е1 и Е2) обрабатывали по отдельности, чтобы получить конечный препарат иммуноглобулина, как описано ниже. Для этого, рН фракций Е1 и Е2 доводят до 5,2, и образцы обрабатывают диафильтрацией против буфера диафильтрации (0,02 М КаС1, 0,05% ПЭГ 3350), чтобы концентрировать композицию до конечной концентрации белка 5%. После диафильтрации, 0,025 М Трис добавляют к каждому раствору белка, и рН доводят до 7,7. Далее фракции 1§О загружают на уравновешенную колонку АОХ-сефарозы с высокой скоростью потока (буфер для уравновешивания 0,025 М Трис, 0,02 М №С1, рН 7,7), и фракцию выхода собирают. Затем к выходящему потоку АОХ добавляют 8,5 г/л КаС1, 16,5 г/л глицина, 21,7 г/л безводной глюкозы и 1 г/л альбумина (20%). Затем рН раствора доводят до 7,00, и образец иммуноглобулина концентрируют ультрафильтрацией до 10% белка. После концентрирования, снова добавляют КаС1, ангидрид глицина и глюкозу, и рН доводят до 7,1, при необходимости, перед стерилизующей фильтрацией.

Чтобы характеризовать хроматографическую стадию, был определен баланс массы, и результаты представлены в табл. 1. Грубо говоря, 10% общего белка было обнаружено во второй части пика элюации. Это потеря выхода, которая возникает, если сбор объединенной в пул композиции останавливают после выхода 2,7 объемов колонки элюата.

Таблица 1

Баланс массы для КМ-хроматографической стадии обогащения

	ТПУФ (%)	Белок (г)	Выход (%)	Выход (г/л плазмы)
Фракция II раствор.	6,99	150,07	100,00	3,93
С\\88	6,33	149,74	99,78	3,92
КМЕ1	2,97	136,27	90,80	3,57
КМ Е2	1,04	16,40	10,93	0,43
Е1 АОХ Ό/Ν	2,56	92,96	61,94	2,43
Е1 АОХ 2М	0,87	11,25	7,50	0,29
Е1ЕВ	4,76	76,31	50,85	2,00
Е2 АОХ Ρ/Ν	2,71	12,56	8,37	0,33
Е2 АОХ 2М	0,78	1,02	0,68	0,03
Е2ЕВ	4,77	8,21	5,47	0,21

Конечные емкости, полученные из двух фракций КМ элюации, в дальнейшем были проанализированы на предмет распределения размера молекул, активности против комплемента, амидолитической активности, с использованием как РБ-1, так и АОТ в качестве субстратов, активности РХ1а и активности ВПНЧТ. Результаты приведены в табл. 2 и 3. Биохимическая характеристика конечных емкостей, полученных из первой и второй части элюированной фракции 1§О, выявила, что первая часть элюата в существенной мере свободна от РХ1а и других нежелательных белков, вызывающих повышение АОТ и снижение значений ВПНЧТ. И наоборот, РХ1а и амидолитическая активность обогащались во второй части, причем содержание агрегата и олиго-/димера также было выше. Интересно, что значение АПК в первой части элюата очень низкое, в то время как вторая часть элюата демонстрирует намного более высокое

значение.

Таблица 2

Сравнение распределения размера молекул в двух конечных емкостях Е1 и Е2

ВЭЖХ	Полимеры	Олиго/Димеры	Мономеры	Фрагменты
Конечная емкость Е1	0,20 %	4,66 %	93,13 %	2,01 %
Конечная емкость Е2	2,82 %	9,09 %	85,95 %	2,15 %

Таблица 3

Сравнение биохимических характеристик двух конечных емкостей Е1 и Е2

Конечная емкость Е1

Конечная емкость Е2

ПКА	АОТ	РХ1а	АПК	РЬ-1	ВПНЧТ
ПКА МЕ/мл	% нормальной плазмы	мЕд/мл РХ1а	Израсходованные Ед С'Н50/%	мЕд/мл РХ1а	(ΡΧΙ плазмы)
< 4	96,87	<0,04	16,9/16,6 %	< 10	> 5 мг
5,9	256,41	2,14	48,2/58,7 %	< 10	> 5 мг

В заключение, разделение элюата из колонки КМ-сефарозы ВСП дает две фракции и позволяет производить в значительной мере свободные от РХ1а композиции, содержащие 1§О.

Пример 2.

Для того чтобы уменьшить количество амидолитической активности, присутствующей в препаратах иммуноглобулина производственного масштаба, были изучены условия, применяемые для элюации и фракционирования методом катионообменной хроматографии. Детали этих исследований приведены

- 34 030251

ниже.

Серию экспериментов выполняли, чтобы найти подходящие растворы для уменьшения/устранения амидолитической активности в ходе последующего процесса согласно способу производства Оаштадагй 8ГО, описанному в данном описании. Если коротко, пасту фракции Коэна растворяли в холодной воде при температуре 4°С и рН 5,2±0,2. После осветления фильтрацией СЖ88, образцы дополнительно стерилизовали фильтрацией и хранили при 4°С или разбавляли водой до концентрации белка 2% для немедленной обработки. Затем температуру раствора доводили до 20-25°С и инкубировали в течение 1 чсо смесью растворитель/поверхностно-активное вещество (1% Тритона Х-100, 0,3% Твина 80; 0,3% ТНБФ), после чего раствор белка загружали на уравновешенную колонку КМ-сефарозы с высокой скоростью потока (буфер для уравновешивания: 25 мМ Ыа-ацетата, рН 5,0±0,2). После загрузки, колонку промывали ацетатным буфером (0,01 М Ыа-ацетата, рН 5,5±0,2), и адсорбированный !дС элюировали с помощью буфера элюации (0,25 М ЫаС1, 0,2 М глицина, 0,1% ПЭГ 3350, 25 мМ Трис, рН 7,8). В ходе хроматографирования на КМ-сефарозе ВСП, следующие параметры контролировали для фракционирования элюат КМ (в определенной точке): ОЭ 280; рН; и объем элюации в объемах колонки (ОК). Далее элюаты обрабатывали ультра-/диафильтрацией с буфером диафильтрации (0,02 М ЫаС1, 0,05% ПЭГ 3350) или немедленно использовали для анализа. Данную стадию концентрирования выполняли для измерения амидолитической активности в значениях белка, также соответствующих 10% композиции конечной емкости.

В ходе элюации проводимость элюата быстро достигала значения буфера элюации КМ. Однако, как проиллюстрировано на фиг. 2, значение рН элюата, измеренное на выходе колонки, вначале снижалось с 5,5, как в буфере для промывания, до уровня ниже 5,0 (4,3-4,8) и оставалось неизмененным для первых 4 ОК, несмотря на тот факт, что рН буфера элюации составляло 7,8. Возрастание рН приблизительно до 7,8 наблюдалось в конце сбора элюата. Мониторинг ОЭ 280 на выходе колонки демонстрирует, что данный сдвиг рН соответствует выходу второго пика, в котором обнаружено большинство амидолитической активности (по данным анализа РЬ-1).

Пример 3.

Для дальнейшего исследования феномена двухфазной элюации на КМ-сефарозе и сдвига рН, наблюдаемых в примерах 1 и 2, индивидуальные фракции элюата были собраны в ходе другого эксперимента хроматографии на КМ-сефарозе с высокой скоростью потока. Если коротко, хроматографию на КМ-сефарозе с высокой скоростью потока выполняли, как изложено выше, с индивидуальным сбором и анализом фракций перед объединением фракций А-Ν в пул и концентрацией исходного материала путем ультрафильтрации. Исходный материал для хроматографической стадии представлял собой пасту фракции II Коэна (Р2500ПуЬЕ; адсорбированные ПХ и АТ-Ш). Колонку КМ-сефарозы уравновешивали буфером с рН 5,2, и промывание выполняли при рН 5,7. Скорость потока на хроматографической стадии поддерживали на уровне 0,64 см/мин.

После сдвига рН повышенное количество амидолитической активности (РЬ-1) найдено во фракциях. Даже в концентрированном пуле наблюдается уменьшение амидолитической активности. Тот факт, что активность РЬ1 может быть обнаружена после ультра-/диафильтрации, является следствием разбавления в элюате КМ или его генерации в ходе концентрирования.

Как показано в табл. 4, фракции, которые элюируются при с рН ниже 5,5 (фракции А-Ν), содержат намного меньшие концентрации амидолитической активности, по сравнению с фракциями, которые элюируются при более высоких значениях рН (фракции О и Р). Количественная оценка амидолитической активности иллюстрирует, что большее количество активности было элюировано во фракциях О и Р, чем во всех объединенных фракциях А-Ν. После сдвига рН повышенное количество амидолитической активности (РЬ-1) было найдено во фракциях. Даже в концентрированном пуле наблюдается уменьшение амидолитической активности. Тот факт, что активность РЬ1 была обнаружимой после ультра-/диафильтрации, является следствием разбавления элюата КМ или его генерации в ходе концентрации.

- 35 030251

Таблица 4

Результаты анализа фракций элюата КМ-сефарозы ВСП

Образец	Элюат в	рН	Объем	Конц.	Белок	Выдел	Амидо-	Амидо-
	объемах колонки (ОК)		(скоррект.) (г)	белка (%)	(скорре кт.) (г)	ение белка на стадии (%)	литическа я активност ь (РЬ-1) нмоль/мл. мин	литическа я активност ь (РЬ-1) нмоль/мин на г белка
Паста ресусп.			1349	5,4	73,00	100,0	14,5	288
Фильтрат С\У88			1480	4,7	68,97	94,5	14,4	309
Фракция А	0,26	5,6	245	0,04	0,10	0,1	< 10
Фракция В	0,26	4,8	247	2,17	5,36	7,3	< 10
Фракция С	0,27	4,6	255	6,69	17,09	23,4	< 10
Фракция ϋ	0,27	4,6	256	5,55	14,22	19,5	< 10
Фракция Е	0,27	4,6	256	4,21	10,78	14,8	< 10
Фракция Р	0,28	4,7	270	2,99	8,08	П,1	< 10
Фракция О	0,26	4,6	252	2,15	5,41	7,4	< 10
Фракция Н	0,26	4,7	245	1,49	3,65	5,0	< 10
Фракция I	0,29	4,7	278	0,99	2,75	3,8	< 10
Фракция 1	0,30	4,7	287	0,67	1,92	2,6	< 10
Фракция К	0,27	4,7	258	0,51	1,32	1,8	< 10
Фракция Ь	0,26	4,7	251	0,43	1,08	1,5	< 10
Фракция М	0,27	4,7	257	0,37	0,95	1,3	< 10
Фракция N	0,28	4,9	267	0,39	1,04	1,4	< 10
Фракция О	0,34	5,5	324	0,52	1,69	2,3	28,2	5423
Фракция Р	0,29	7,5	276	0,34	0,94	1,3	29,6	8706
Фракция 0	0,28	7,8	270	0,01	0,03	9,0	< 10
КМ элюат Α-Ν			3616	1,91	69,06	94,6	< 10
А-Ν после УТФ/ДФ			996	7,00	69,70	95,5	12,7	181

Пример 4.

Для дополнительного определения границ элюации амидолитической активности из смолы КМсефарозы ВСП, проводили другой эксперимент, как изложено выше, за исключением того, что проводили сбор КМ-элюата во фракции, определенные граничным значением рН. Конкретно, КМ-элюаты собирали вплоть до предварительно определенного значения рН (4,3, 4,8, 6,0, 7,5), которое контролировали на выходе колонки. В данном эксперименте, исходный материал для хроматографической стадии представлял собой пасту фракции ΙΙ Коэна (Р2500ПуЬЕ; адсорбированные ΡΙΧ и ΑΤ-ΙΙΙ), как в примере 3. Колонку КМ-сефарозы уравновешивали при рН 4,8 и промывали при рН 5,3. Фракции элюата обрабатывали ультра-/диафильтрацией, и рН корректировали с помощью Трис до проведения анализа. В данном эксперименте, рН элюата снижалось до 4,1 в начале стадии элюации. Результаты анализа собранных фракций элюата показаны в табл. 5.

Таблица 5

Результаты анализа фракций элюата КМ-сефарозы ВСП

Образец	Элюат в объемах колонки (ОК)	Конц, белка (%)	Амидолитическая активность (РЬ-1) нмоль/мл.мин	Амидолитическая активность (РЬ-1) нмоль/мин на г белка
Паста ресусп.		5,7	14,4	251
Фильтрат СЛУ85		4,9	14,1	287
КМ-элюат (рН 4,3)	4,88 (4,38	2,29	< 10
после УТФ/ДФ		7,42	12,0	162
КМ-элюат (рН 4,8)	4,49	2,66	< 10
после УТФ/ДФ		6,57	12,7	193
КМ-элюат (рН 6,0)	5,21	2,11	< 10
после УТФ/ДФ		7,20	14,1	196
КМ-элюат (рН 7,5)	6,43	1,71	< 10
после УТФ/ДФ		6,71	15,8	235

- 36 030251

Пример 5.

Дополнительно было определено, будет ли уменьшение количества белка на единицу смолы КМсефарозы дополнительно усиливать отделение пика, проиллюстрированное на фиг. 2. Чтобы проверить это, выполняли серию хроматографических циклов на КМ-сефарозе ВСП с уменьшением нагрузки белком, которая варьировала от 118 мг белка/мл смолы до 57 мг белка/мл смолы. Как и в примере 2, исходный материал для эксперимента представлял собой путь II пасты фракции II Коэна; Р2470ИУ; что включало удаление ИХ, РУН и ЛТШ из криообедненной плазмы адсорбцией (табл. 6). Смолу уравновешивали при рН 5,2, и стадию промывания выполняли при рН 5,7. Элюаты КМ-сефарозы объединяли в пул, как в примере 2, в первую часть (первый пик) и вторую часть (второй пик). На фиг. 2 проиллюстрирован пример хроматограммы, на которой первый пул заканчивается, и второй пул начинается, когда УФпоглощение элюата снижается ниже приблизительно ΟΌ₂₈₀ = 1,6±0,2 между двумя пиками.

Таблица 6

Анализ исходного материала (путь II пасты фракции II Коэна; Р2470ПУ)

Образец	Объем (скоррект.) (г)	Белок (скоррект.) (г)	Выход (%)	Амидолитическая активность (РЬ-1) нмоль/мл.мин	Амидолитическая активность (РЬ-1) нмоль/мин на г белка
Коэна II ресусп.	1001	75	100	24,3	325
Фильтрат С XV 8 8	1083	74	98	22,5	331
После стерилизующей фильтрации	1067	72	96	22,5	335

Как показано в табл. 7, уменьшение нагрузки смолы белком не оказывало влияния на отделение пика, но влияло на выход. В соответствии с результатами, представленными в предыдущих примерах, очень низкие уровни амидолитической активности присутствуют в первых пулах элюата каждого хроматографического цикла.

Таблица 7

Результаты анализа хроматографического очищения на КМ-сефарозе, выполненного с варьирующей нагрузкой белком

мг белка/ мл среды	Образец	Элюат в объемах колонки (θκ)	Конц, белка (%)	Выход (%)	Амидолитическая активность (РЬ-1) нмоль/мл.мин
118	КМ-элюат первая часть	2,7	3,5	81,5	< 10
	КМ-элюат вторая часть	4,8	0,3	13,5
	после УТФ/ДФ		8,49		< 10
110	КМ-элюат первая часть	2,3	4,0	78,1	< 10
	КМ-элюат вторая часть	5,1	0,5	19,6
	после УТФ/ДФ		7,18		< 10
80	КМ-элюат первая часть	2,8	2,25	72,4	< 10
	КМ-элюат вторая часть	3,5	0,6	24,7
	после УТФ/ДФ		7,06		< 10
72	КМ-элюат первая часть	2,7	2,05	76,7	< 10
	КМ-элюат вторая часть	4,4	0,4	23,1
	после УТФ/ДФ		5,62		< 10
57	КМ-элюат первая часть	2,3	1,71	67,0	< 10
	КМ-элюат вторая часть	4,8	0,4	27,9
	после УТФ/ДФ		3,88		< 10

Пример 6.

Для дополнительной валидации экспериментально полученных данных, описанных выше, выполняли хроматографическую очистку на КМ-сефарозе с варьирующей скоростью потока и схемами объединения элюатов в пул. Если коротко, пасту фракции II Коэна с высоким содержанием амидолитической активности (100 нмоль/мл-мин в 6% белка) обрабатывали, как описано в данном описании, до получения фракции, предшествующей хроматографии АОХ. Для всех циклов КМ-сефарозы, элюат собирали, когда значение УФ начинало возрастать, и останавливали после 3 или 4 ОК.

Три цикла хроматографической очистки на КМ-сефарозе выполняли, как указано ниже. Собранные фракции элюата концентрировали, как описано в данном описании, а затем дополнительно концентрировали, чтобы избежать значений РЬ-1 ниже предела обнаружения для анализа РЬ-1.

Первый цикл. Смолу КМ-сефарозы промывали и уравновешивали при скорости потока 1 см/мин. Скорость потока для стадий загрузки белка, промывания и элюации поддерживали на постоянной уровне 0,64 см/мин. 3 объема колонки (3 ОК) элюата собирали в основной пул.

- 37 030251

Второй цикл. Смолу КМ-сефарозы промывали и уравновешивали при скорости потока 1,2 см/мин. Скорость потока для стадии загрузки белка составила 0,64 см/мин. Скорость потока для стадии промывания составила 0,64 см/мин для первых 1,2 объемов колонки (ОК) и 1,8 см/мин для следующих 28,8 ОК. Стадию элюации выполняли при скорости 0,64 см/мин. 3 объема (3 ОК) колонки элюата собирали в основной пул.

Третий цикл. Смолу КМ-сефарозы промывали и уравновешивали при скорости потока 1,2 см/мин. Скорость потока для стадии загрузки белка составила 0,64 см/мин. Скорость потока для стадии промывания составила 0,64 см/мин для первых 1,2 объемов колонки (ОК) и 1,8 см/мин для следующих 28,8 ОК. Стадию элюации выполняли при скорости 0,64 см/мин. 4 объема колонки элюата собирали в основной пул.

Основной пул каждого цикла хроматографии на КМ-сефарозе концентрировали и анализировали на предмет амидолитической активности (РЬ-1), концентрации общего белка и профиля ВЭЖХ. Как показано в табл. 8, увеличение скорости потока на стадии промывания приводило к уменьшению количеств амидолитической активности в основном пуле (сравните цикл 1 и цикл 2). Сбор 4 ОК вместо 3 ОК обеспечивал номинальный общий выход белка (2,55 г/л плазмы против 2,5 г/л плазмы; сравните цикл 3 и цикл 2), однако это более чем в 2 раза увеличивало количество амидолитической активности в конечной композиции (384,7 нмоль РЬ-1/мин-г белка против 188,5 нмоль РЬ-1/мин-г белка). Объединение в пул 4 ОК также увеличивало содержание агрегата в конечной композиции, содержащей иммуноглобулин (0,52% против 0,12%; сравните цикл 3 и цикл 2). Следует отметить, что окончательное содержание амидолитической активности и агрегата в композиции, полученной в результате цикла 2, согласуется с наблюдаемыми выше (см. табл. 2, 4 и 5).

Таблица 8

Результаты анализа хроматографической очистки на КМ-сефарозе, проведенной с варьирующей скоростью потока на стадии промывания и объемами сбора элюата

	Цикл 1	Цикл 2	Цикл 3
Выход белка (г/л плазмы)	2,36	2,5	2,55
Значение белка, %	8,12	7,48	9,28
РЬ-1 нмоль/мл.мин	27,5	14,1	35,7
РЬ-1 нмоль/мин.г белка	338,7	188,5	384,7
ВЭЖХ	Агрегаты	0,18	0,12	0,52
	Олиго/Димеры	5,84	5,74	6,38
	Мономеры	93,88	94,10	92,98
	Фрагменты	0,09	0,04	0,12

Пример 7.

Для демонстрации того, что приведенные выше результаты могут быть масштабированы до масштабов промышленного производства, 360 г исходного материала фракции II Коэна обрабатывали, как в описанных выше экспериментах. 2,9 ОК КМ-сефарозы были собраны в первый пул, и остальную часть элюата собирали во второй пул. Полученные пулы элюата далее обрабатывали до конечного состава емкости, как описано в данном описании, пригодного для введения индивидууму. Такая дополнительная обработка включала хроматографию АОХ, ультра-/диафильтрацию и лиофилизацию окончательного препарата. Далее биохимические характеристики каждого из конечных препаратов анализировали, и результаты представлены в табл. 9.

- 38 030251

Таблица 9

Сравнение биохимической характеристики двух конечных емкостей

Е1 (первая часть элюата; 2,9 ОК) и Е2	(вторая часть элюата; > 2,9 ОК)
	КМ-элюат после обработки на следующих стадиях
1-я часть элюата	2-я часть элюата
Значение белка, %	4,90	3,95
1дО г/л	48,3	38,3
1дА г/л	0,006	0,0002
Подклассы 1дСг	1§О1	71,9	71,4
1§О2	21,0	16,4
1§θ3	4,6	10,8
1§θ4	2,5	1,4
ВЭЖХ	Агрегаты	0,07	0,06
	Олиго/Димеры	4,59	10,76
	Мономеры	94,81	87,86
	Фрагменты	0,52	1,32
КА электрофорез
	Альбумин	1,2	2,3
	α/β глобулин		0,2
	γ глобулин	98,8	97,5
АПК (С’Н 50)	25,4	26,5
ПКА МЕ/мл	<0,6	41,2
РЬ-1 нмоль/мл.мин	19,7	728,6
РЬ-1 нмоль/мин.г белка	402,0	18446,6

Как показано в табл. 9, конечная композиция, полученная из первой части элюата КМ-сефарозы, содержала в 50 раз меньшее количество амидолитической активности, чем конечная композиция, полученная из второй части элюата КМ-сефарозы (402 нмоль РЬ-1/мин-г белка против 18446,6 нмоль РЬ1/мин-г белка). Дополнительно, конечная композиция, полученная из первой части элюата КМ-сефарозы, содержала меньше альбумина (1,2% против 2,3%), α/β глобулина (не определялся против 0,2%), ПКА активности (< 0,6 МЕ/мл против 41,2 МЕ/мл) и ΙβΘ 3 (4,6% против 10,8%) по сравнению с конечной композицией, полученной из второй части элюата КМ-сефарозы. К тому же, композиция, полученная из первой части элюата КМ-сефарозы, содержала намного большее количество мономера ΙβΘ (94,81% против 87,86%), чем конечная композиция, полученная из второй части элюата КМ-сефарозы.

Пример 8.

Для дополнительной валидации приведенных выше результатов, часть пасты фракции ΙΙ (ΡΙ10ΧΌ142; центрифугированный осадок А) готовили в соответствии со способами, предложенными в данном описании. Далее пасту ресуспендировали и загружали на катионообменную колонку КМсефарозы, как описано в данном описании, и элюировали, как изложено выше. Элюат (общий объем: 4743 мл) делили на первую фракцию, содержащую 75% всего элюата (3530 мл) и вторую фракцию, содержащую 25% всего элюата (1213 мл). Как первую, так и вторую фракции элюата КМ-сефарозы далее обрабатывали до конечной емкости, как описано в данном описании, и анализировали на предмет РХЫ, АОТ, ВПНЧТ и амидолитической активности (РЕ-1), агрегата ΙβΘ и содержания АПК. Результаты приведены в табл. 10. В соответствии с результатами, приведенными выше, разделение элюата КМ-сефарозы на первый и второй пул приводит к уменьшению активности ЕХЫ и АОТ в конечном препарате иммуноглобулина.

- 39 030251

Таблица 10

Биохимическая характеристика первых и вторых фракций элюата КМ-сефарозы

Анализ	Единицы	Первая фракция КМ-элюата	Вторая фракция КМ-элюата
АОТ	% нормальной плазмы	96,87	256,41
Специфичный Р-Х1а	мЕд/мл	<0,04	2,14
впнчт	мг	< 5	<5
Амидолитическая активность (РН)	нмоль/мл мин	< 10	< 10
ПКА	МЕ/мл	<4	5,9
МСД	% агрегата	0,20	2,82
АПК	%	16,6	58,7

Пример 9.

Для дополнительной оценки осуществимости масштабирования предложенных в данном описании способов, элюат КМ-сефарозы, полученный в результате производственного процесса большого масштаба, контролировали на предмет содержания белка, рН и активности БХН. Если коротко, приблизительно 19000 л криообедненной плазмы обрабатывали, как описано в данном описании, с получением приблизительно 220 кг из пасты фракции II, содержащей приблизительно 70 кг белка. Пасту фракции II ресуспендировали, загружали на промытую колонку КМ-сефарозы производственного масштаба и элюировали, как изложено выше. Образец элюата отбирали и анализировали после элюации каждого ОК (приблизительно 350 л). Как показано в табл. 11, повышенные значения БХН были обнаружены только в конце элюации КМ-сефарозы, после сдвига рН элюата. Концентрацию белка в элюате контролировали по ОЭ₂₈₀, и первую часть элюата собирали и объединяли в пул до тех пор, пока ОЭ₂₈₀ не снижалась ниже 2,0. Далее вторую часть элюата отдельно собирали и объединяли в пул до тех пор, пока ОЭ₂₈₀ не снижалась ниже 0,2. Затем первые и вторые пулы элюата анализировали и сравнивали, как показано в табл. 12. Следует отметить, что 98% выхода НО было найдено в первой части элюата КМ, и 2% выхода ^О было найдено во второй части элюата КМ. Таким образом, путем завершения сбора пула элюата КМ-сефарозы после снижения ОЭ₂₈₀ элюата ниже 2,0, значительное количество АОТ и активности БХН может быть удалено из препарата, при минимизации потери выхода ^О.

Таблица 11

Биохимическая характеристика образцов элюата КМ-сефарозы, отобранных после элюации каждого объема колонки

Образец (колонка КМ-Сефарозы 1)	Объем элюата (л)	Οϋ	рН на выходе колонки*	ТПУФ (г/дл)	РХ1а (мЕд/г)
ЬЕ08Ь008 ЮК	355	>2	4,37	6,57	0,61
ЕЕ08Ь008 2ОК	706	>2	4,28	1,67	2,40
ЕЕ08Ь008 ЗОК	1069	>2	4,27	0,90	4,44
ЕЕ08Ь008 4ОК	1408	>2	7,48	0,65	86,55
ЕЕ08Ь008 5ОК	1753	>2	8,18	0,19	101,07
ЕЕ08Ь008 6ОК	2106	0,85	8,28	0,06	86,24
ЕЕ08Ь008 7ОК	2451	0,26	8,34	0,00	н/о

Таблица 12

Биохимическая характеристика первых и вторых пулов элюата КМ-сефарозы

Анализ	Единицы	Первая часть КМэлюата	Вторая часть КМ-элюата (после Οϋ 2)
АОТ	% референтной плазмы при скорости 2,4 мг/мл	144,64	366,65
Р-Х1а	мЕд/г 1дО	12,53	Очень высокая Фактор Х1а-подобная активность; не может быть оценена количественно, поскольку продукт также содержит активность РХа и/или Р1Ха

- 40 030251

Пример 10.

Для дополнительной оценки раскрытых способов уменьшения содержания амидолитической активности в композиции, содержащей иммуноглобулин, проводили второй крупномасштабный эксперимент, с использованием осадка фракции II в качестве исходного материала. Если коротко, осадок фракции II получали, как описано в примере 1, за исключением того, что отделение осадка осуществляли фильтрацией вместо центрифугирования.

Осадок фракции II обрабатывали катионообменной хроматографией КМ, как описано в примере 1. Как и в примере 1, элюата КМ собирали в два пула, раннюю фракцию (Е1), содержащую большую часть ^О, и позднюю фракцию (Е2), содержащую большую часть амидолитической активности. Сбор первой части элюата (Е1) начинали при ОГ) 400 мОЕ и останавливали точно через 2,7 объемов колонки. Вторую часть (Е2) элюата пика собирали до тех пор, пока ОГ) не снижалась снова до 400 мОЕ. Затем элюированные фракции обрабатывали по отдельности на остальных стадиях процесса. Баланс массы для процесса очистки приведен в табл. 13.

Таблица 13

Баланс массы для второй крупномасштабной очистки осадка фракции II

	ТПУФ (%)	Белок (г)	Выход (%)	Выход (г/л плазмы)
Фракция II раствор.	6,14	126,72	100,00	3,02
СА88	5,50	124,50	98,24	2,96
КМЕ1	2,96	108,73	85,80	2,59
КМ Е2	0,90	16,02	12,64	0,38
Ε1 Л()\1)\	2,74	94,82	74,82	2,26
Е1АОХ 2М	0,94	10,20	8,05	0,24
Е1 ЕВ	4,99	96,20	75,92	2,29
Е2 АОХ Ρ/Ν	2,70	13,26	10,46	0,32
Е2 АОХ 2М	0,95	1,20	0,94	0,03
Е2 ЕВ	5,42	11,81	9,32	0,28

Как и в примере 1, 10% общего белка, по грубым оценкам, найдено во второй части пика элюации. Это представляет собой подтвержденную потерю выхода, если элюацию останавливают через 2,7 объемов колонки.

Конечные емкости, полученные из двух фракций КМ элюата (Е1 и Е2), были проанализированы на предмет распределения размера молекул, активности против комплемента, амидолитической активности с субстратом 8Ы13а, а также с помощью анализов АОТ, ΡΧ^ и ВПНЧТ. Результаты приведены в табл. 14 и 15.

Таблица 14

Сравнение распределения размера молекул в двух конечных емкостях

ВЭЖХ	Полимеры	Олиго/Димеры	Мономеры	Фрагменты
Конечная емкость Е1	0,24 %	5,18%	93,21 %	1,36%
Конечная емкость Е2	4,42 %	9,60 %	84,55 %	1,44%

Таблица 15

Сравнение дополнительных характеристик двух конечных емкостей

Конечная емкость Е1

Конечная емкость Е2

ПКА	АОТ	РХ1а	АПК	8ШЗа	ВПНЧТ
ПКА МЕ/мл	% нормальной плазмы	мЕд/мл РХ1а	Израсходованные Ед С'Н50/%	мЕд/мл РХ1а	(ΡΧΙ плазмы)
<4	102,76	<0,04	7,9 / 9,7 %	<0,375	> 5 мг
<4	119,75	0,09	52,4 / 63,7 %	3,23	> 5 мг

Биохимическая характеристика конечных емкостей, полученных из первой и второй части элюированной фракции ^О, выявила, что первая часть элюата в существенной мере свободна от ΡΧΗ^ и других нежелательных белков, вызывающих повышение АОТ и снижение значений ВПНЧТ. И наоборот, вторая часть обогащена ΡΧΡι и амидолитической активностью, причем содержание агрегата и олиго-/димера также повышено, даже если суспензию А отделяют фильтрацией. Интересно, что значение АПК в первой части элюата даже ниже, в то время как во второй части элюата значение АПК выше.

В данном эксперименте, в котором применяется фильтрация для отделения суспензии А на предыдущих стадиях процесса, содержание остаточного ΡΧ^ во второй части элюата намного меньше, и значение АОТ для конечной емкости из данной части элюата находится в пределах нормы.

С учетом примера 1, расщепление элюации колонки КМ-сефарозы ВСП на две фракции (Е1 и Е2)

- 41 030251

позволяет производить композицию, содержащую Σ^Ο, которая в значительной мере свободна от НХ!а. Это справедливо для обоих вариантов разделения фракции А (т.е. центрифугирование и фильтрация), хотя содержание РХЫ значительно ниже, если отделение осадка А осуществляют фильтрацией.

Пример 11.

Данный пример демонстрирует пригодность настоящих способов для отделения прокоагулянтной активности катионообменной хроматографией в крупномасштабных производственных процессах, разработанных для производства композиций, содержащих иммуноглобулин, для подкожного введения. Исходным материалом для данного эксперимента был осадок фракции II, полученный из объединенной в пул человеческой исходной плазмы, собранной в Европе, которая была обработана криопреципитацией и использована для выделения анти-тромбина III (АТШ) посредством адсорбции.

Если коротко, после криопреципитации и адсорбции АТШ, фракционирование холодным спиртом начинают с отделения фибриногена и остаточных факторов коагуляции (например, фактора XIII) осаждением осадка фракции I при 8% спирта и рН 7,0. Концентрацию спирта в супернатанте доводят до 25% с целью осаждения фракции П+Ш и отделения альбумина. После ресуспендирования осадка П+Ш, добавляют спирт до 12% при рН ~5,2 с образованием осадка III. После отделения осадка III, добавляют 0,04 г ДЭАЭ 8еркабех/г белка, раствор фильтруют через фильтрующие элементы глубинного типа Сипо 90, и фракцию II Коэна, содержащую очищенную фракцию гаммаглобулина, осаждают 25% спирта при нейтральном значении рН.

Осадок фракции II растворяют в холодной воде при 4°С и рН 5,2±0,2. После очистки фильтрацией СА88, осуществляют коррекцию раствора до концентрации белка 2% для обработки Р/П. Температуру в ходе инкубации Р/П поддерживают в интервале 20-25°С. Раствор белка загружают на уравновешенную колонку КМ-сефарозы с высокой скоростью потока (буфер уравновешивания: 0,025 М натрия ацетата, рН 5,0±0,2). После загрузки, колонку промывают 30 объемами колонки ацетатного буфера (0,01 М натрия ацетата, рН 5,5±0,2) для вымывания реактивов Р/П перед элюацией адсорбированного белка буфером элюации (0,25 М ХаС1, 0,2 М глицина, 0,1% ПЭГ 3350, 25 мМ Трис, рН 8,00). Сбор первой части элюата (Е1) начинали при ОО 400 мОЕ и останавливали точно через 2,7 объемов колонки. Вторую фракцию (Е2) пика элюации собирали до тех пор, пока ОО снова не снижалась до 400 мОЕ опять. Элюированные фракции обрабатывали по отдельности до получения конечного нерасфасованного препарата в соответствии со следующими стадиями.

рН фракции элюата доводили до 5,2, после чего концентрировали до 5% диафильтрацией против буфера диафильтрации (0,02 М ХаС1, 0,05% ПЭГ 3350), и проводилось последующее концентрирование до 10% белка. 0,055 г глицина/г белка добавляли к раствору, и рН доводили до 7,0 перед стерилизующей фильтрацией.

Хроматограмма стадий промывания и элюации на катионообменной смоле показана на фиг. 3. Строка 1 иллюстрирует УФ-поглощение, строка 2 - проводимость, и строка 3 - рН на выходе колонки. Оптическая плотность на длине волны 280 нм показывает частичное разделение двух фракций в ходе элюации белка из колонки КМ-сефарозы ВСП. рН на выходе колонки начинает возрастать непосредственно после начала повторного возрастания УФ-поглощения в ходе элюации. В этой точке разделяют две фракции элюата (Р4 и Р5, в данном описании носят название Е1 и Е2). Баланс массы для последующего цикла очистки приведен в табл. 16.

Таблица 16

Баланс массы для крупномасштабной очистки !ηΟ из осадка фракции II

Фракция П раствор.	4,94	179,45	100,00	3,58
С\У88	2,70	169,46	94,43	3,38
КМЕ1	2,78	148,05	82,50	2,95
КМ Е2	0,85	21,04	11,72	0,42
Нерасфасованная Е1	13,25	127,60	71,11	2,54
Нерасфасованная Е2	13,15	20,32	11,32	0,41

Грубо говоря, 15% общего белка найдено во второй части пика элюации (Е2). Такая потеря выхода происходит за счет остановки сбора Е1 через 2,7 объемов колонки. Конечные емкости, полученные из двух фракций КМ элюации (Е1 и Е2) были проанализированы на предмет распределения размера молекул, активности против комплемента, амидолитической активности с использованием субстрата 8\13а, и были проведены анализы АОТ, РХЫ и ВПНЧТ. Результаты приведены в табл. 17 и 18.

- 42 030251

Таблица 17

Сравнение распределения размера молекул для двух конечных емкостей.

Таблица 18

Сравнение дополнительных характеристик двух конечных емкостей

Первая часть КМ-элюата (Е1) дает конечный нерасфасованный препарат с более низким содержанием агрегата, димера и фрагмента, с низким содержанием РХ1а, с результатом АОТ, близким к нормальной плазме, с ПКА и амидолитической активностью ниже лимита обнаружения, по данным 5Ν-13, и без снижения ВПНЧТ. РХ1а, ПКА и РХ1а-подобная активность обогащены во второй части, в которой содержание полимера Ι§Θ, фрагмента и олиго-/димера также выше. Интересно, что значение АПК в ранней фракции элюата (Е1) ниже, чем в поздней фракции элюата (Е2).

Пример 12.

Для дополнительной оценки раскрытых способов уменьшения содержания амидолитической активности в композиции, содержащей иммуноглобулин, проводили другой крупномасштабный эксперимент с использованием осадка фракции ΙΙ в качестве исходного материала. Если коротко, осадок фракции ΙΙ получали, как описано в примере 11, за исключением того, что исходный материал для данного эксперимента представлял собой осадок фракции ΙΙ, образованный из объединенной в пул человеческой исходной плазмы, собранной в Европе, которая была обработана криопреципитацией и использована для выделения ОАИФВ и анти-тромбина ΙΙΙ (ΑΤΙΙΙ) путем адсорбции. Катионообменную хроматографию на КМ-сефарозе и последующие стадии обработки во всех других отношениях проводили так, как описано в примере 11.

Хроматограмма стадий промывания и элюации на катионообменной смоле показана на фиг. 4. Строка 1 иллюстрирует УФ-поглощение, строка 2 - проводимость и строка 3 - рН на выходе колонки. Оптическая плотность на длине волны 280 нм показывает частичное разделение двух фракций в ходе элюации белка из колонки КМ-сефарозы ВСП. рН на выходе колонки начинает возрастать непосредственно после начала повторного возрастания УФ-поглощения в ходе элюации. В этой точке разделяют две фракции элюата (Р4 и Р5, в данном описании носят название Е1 и Е2). Баланс массы для последующего цикла очистки приведен в табл. 19.

Таблица 19

Баланс массы для крупномасштабной очистки Ι§Θ из осадка фракции ΙΙ

Фракция П раствор.	5,09	174,15	100,00	4,03
СУУ88	2,98	168,81	96,93	3,91
КМЕ1	2,69	143,69	82,51	3,33
КМ Е2	0,94	21,28	12,22	0,49
Нерасфасованная Е1	9,28	127,68	73,32	2,96
Нерасфасованная Е2	9,63	19,95	11,46	0,46

Как и в примере 11, грубо говоря, 15% общего белка найдено во второй части пика элюации. Такая потеря выхода происходит за счет остановки сбора Е1 через 2,7 объемов колонки. Конечные емкости, полученные из двух фракций КМ элюации (Е1 и Е2) были проанализированы на предмет распределения размера молекул, активности против комплемента, амидолитической активности с использованием субстрата 8Ν13π. и были проведены анализы АОТ, РХЫ и ВПНЧТ. Результаты приведены в табл. 20 и 21.

Таблица 20

Сравнение распределения размера молекул для двух конечных емкостей

ВЭЖХ	Полимеры	Олиго/Димер	Мономеры	Фрагменты
Нерасфасованная Е1	0,54 %	4,95 %	94,49 %	0,02 %
Нерасфасованная Е2	6,49 %	6,71 %	85,18%	1,62%

- 43 030251

Таблица 21

Сравнение дополнительных характеристик двух конечных емкостей

Нерасфасованная Е1 Нерасфасованная Е2

ПКА	АОТ	РХ1а	АПК	8ШЗа	ВПНЧТ
ПКА МЕ/мл	% нормальной плазмы	нг/мл РХ1а	%	мЕд/мл РХ1а	(ΡΧΙ плазмы)
<4	114,34	0,081	57	1Д5	> 10 мг
34,2	157,18	3,208	59	276	> 10 мг

Биохимическая характеристика стабилизированных нерасфасованных препаратов, полученных из первой и второй части элюированной фракции ^С, выявила, что первая часть элюата в существенной мере свободна от РХЫ и других нежелательных белков, вызывающих повышение АОТ и снижение значения ВПНЧТ, в то время как вторая часть обогащена ПКА, РХЫ и РХ1а-подобной активностью, причем содержание в ней фрагмента ^С, полимера и олиго-/димера также выше. Значения АПК не отличаются значительно в нерасфасованных препаратах из первой части и второй части элюата. В общем, результаты подтверждают данные, полученные в примере 11.

Пример 13.

Для дополнительной оценки раскрытых способов уменьшения содержания амидолитической активности в композиции, содержащей иммуноглобулин, проводили другой крупномасштабный эксперимент с использованием осадка фракции ΙΙ в качестве исходного материала. Если коротко, осадок фракции ΙΙ получали, как описано в примере 11, за исключением того, что исходный материал для данного эксперимента представлял собой осадок фракции ΙΙ, образованный из объединенной в пул человеческой исходной плазмы, собранной в Соединенных Штатах, которая была обработана криопреципитацией и использована для выделения ОАИФВ и анти-тромбина ΙΙΙ (ΑΤΙΙΙ) путем адсорбции. Катионообменная хроматография на КМ-сефарозе и последующие стадии обработки во всех других отношениях проводили так, как описано в примере 11.

Хроматограмма стадий промывания и элюации на катионообменной смоле показана на фиг. 5. Строка 1 иллюстрирует УФ-поглощение, строка 2 - проводимость и строка 3 - рН на выходе колонки. Оптическая плотность на длине волны 280 нм показывает частичное разделение двух фракций в ходе элюации белка из колонки КМ-сефарозы ВСП. рН на выходе колонки начинает возрастать непосредственно после начала повторного возрастания УФ-поглощения в ходе элюации. В этой точке разделяют две фракции элюата (Р4 и Р5, в данном описании носят название Е1 и Е2). Баланс массы для последующего цикла очистки приведен в табл. 22.

Таблица 22

Баланс массы для крупномасштабной очистки ^С из осадка фракции ΙΙ

	ТПУФ (%)	Белок (г)	Выход (%)	Выход (г/л плазмы)
Фракция П раствор.	4,02	125,70	100,00	3,09
С\¥88	2,31	120,19	95,62	2,95
КМЕ1	2,73	104,01	82,74	2,55
КМ Е2	0,85	18,20	14,48	0,45
Нерасфасованная Е1	9,33	91,11	72,49	2,24
Нерасфасованная Е2	9,01	16,35	13,00	0,40

Как и в примере 11, грубо говоря, 15% общего белка найдено во второй части пика элюации. Такая потеря выхода происходит за счет остановки сбора Е1 через 2,7 объемов колонки. Конечные емкости, полученные из двух фракций КМ элюации (Е1 и Е2) снова были проанализированы на предмет распределения размера молекул, активности против комплемента, ПКА, РХЫ-подобной активности с использованием субстрата 8Ы13а, и были проведены анализы АОТ, РХЫ и ВПНЧТ. Результаты приведены в табл. 23 и 24.

Таблица 23

Сравнение распределения размера молекул для двух конечных емкостей

ВЭЖХ	Полимеры	Олиго/Димеры	Мономеры	Фрагменты
Нерасфасованная Е1	0,67 %	5,29 %	94,03 %	-
Нерасфасованная Е2	6,48 %	8,92 %	83,74 %	0,86 %

- 44 030251

Нерасфасованная Е1 Нерасфасованная Е2

Таблица 24

Сравнение дополнительных характеристик для двух конечных емкостей

ПКА	АОТ	РХ1а	АПК	8ШЗа	ВПНЧТ
ПКА МЕ/мл	% нормальной плазмы	нг/мл РХ1а	%	мЕд/мл РХ1а	(ΡΧΙ плазмы)
<4	109,53	0,080	44	1,23	> 10 мг
54,6	148,17	1,652	60	203	> 10 мг

Биохимическая характеристика конечных нерасфасованных препаратов, подтвердила результаты примеров 11 и 12. Первая часть элюата (Е1) в существенной мере свободна от РХ1а и других нежелательных белков, вызывающих повышение АОТ и сниженные значения ВПНЧТ, в то время как вторая часть (Е2) обогащена РХ1а и амидолитической активностью, причем содержание в ней фрагмента, полимера и олиго-/димера также выше, даже если разделение суспензии А осуществляют фильтрацией. Интересно, что значение АПК для стабилизированного нерасфасованного препарата из первой части элюата снова ниже, чем для нерасфасованного препарата из второй части элюата.

Взятые вместе, результаты, приведенные в примерах выше, демонстрируют, что разделение элюата колонки КМ-сефарозы ВСП на две фракции позволяет производить композицию, содержащую иммуноглобулин, в значительной мере свободную от прокоагулянтной активности. Это справедливо для варьирующих источников плазмы (ЕС и США) и схем обработки на предыдущих стадиях.

Потери продукта, определенные для препаратов иммуноглобулина, описанных в примерах 11-13, выше, чем наблюдаемые в примерах 1-10. В примерах 11-13, разделение пика элюата через 2,7 объемов колонки приводит к потере приблизительно 15% общего белка. Поскольку сдвиг рН элюата происходил позже в примерах 11-15, более поздняя остановка элюации должна улучшить общий выход, в существенной мере без отрицательного влияния на отделение прокоагулянтной активности.

Данные, приведенные выше, демонстрируют, что разделение элюата катионообменной хроматографии представляет собой надежный способ производства композиций, содержащих иммуноглобулин, со сниженной в значительной мере прокоагулянтной активностью.

Следует понимать, что примеры и варианты, описанные в данном описании, приведены только для иллюстративных целей, и что различные идеи модификаций или вариаций в свете изложенного будут возникать у специалистов в данной области и должны находиться в пределах духа и компетенции данной заявки и контекста прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в данном описании, таким образом, включены путем ссылки в полном объеме и для всех целей.

Claims (16)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ уменьшения содержания фактора XI (РХ1) и/или фактора Х1а (РХ1а) в композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, состоящий из следующих стадий:

   (а) обеспечение композиции, содержащей полученный из плазмы иммуноглобулин, которая содержит иммуноглобулины 1§С и РХ1 и/или РХ1а;

   (б) контакт композиции, которая содержит полученный из плазмы иммуноглобулин, со слабой катионообменной смолой, находящейся в хроматографической колонке, в условиях первого раствора, включающих рН не более 6,0 и проводимость не более 11 мСм/см, для связывания иммуноглобулинов 1§С и по меньшей мере части РХ1 и/или РХ1а с указанной катионообменной смолой;

   (в) элюация иммуноглобулинов 1§С из слабой катионообменной смолы путем контакта этой катионообменной смолы с буфером элюации, рН которого составляет по меньшей мере 7,5 и проводимость по меньшей мере 15 мСм/см, с получением элюата, содержащего раннюю фракцию и позднюю фракцию; и

   (г) сбор ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата,

   где стадия сбора ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата включает сбор элюата, рН которого составляет не более 6,0, отдельно от элюата, рН которого составляет более 6,0.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что проводимость буфера элюации составляет по меньшей мере 20 мСм/см.
3. 3. Способ по п.1 или 2, который дополнительно включает стадию промывания катионообменной смолы со связанными с ней иммуноглобулинами и РХ1 и/или РХ1а буфером для промывания, рН которого составляет не более 6,0 и проводимость менее 11 мСм/см перед элюацией иммуноглобулинов из катионообменной смолы на стадии (в).
4. 4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что слабая катионообменная смола представляет собой карбоксиметильную катионообменную смолу.
5. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что рН буфера элюации составляет от 7,5 до 8,5.
6. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что буфер элюации содержит от 200 до 300 мМ натрия хлорида.
7. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что буфер элюации содержит от 100 до 300 мМ

   - 45 030251

   глицина.
8. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что ранняя фракция элюата составляет не более 70% элюата.
9. 9. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что стадия сбора ранней фракции элюата отдельно от поздней фракции элюата включает мониторинг рН элюата.
10. 10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что стадия сбора ранней фракции элюата включает подстадии:

    (ί) мониторинг оптической плотности элюата на длине волны 280 нм (ΟΌ₂₈₀);

    (ίί) начало стадии сбора, когда ΟΌ₂₈₀ элюата составляет 50 мОЕ;

    (ίίί) окончание стадии сбора, когда ΟΌ₂₈₀ элюата снижается ниже 1 или 2 ΟΕ.
11. 11. Способ по любому из пп.3-10, отличающийся тем, что рН буфера для промывания составляет от 5,0 до 6,0.
12. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что рН буфера для промывания составляет 5,5±0,2.
13. 13. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что менее 50% РХХ и/или РХЫ, связанного с катионообменной смолой на стадии (б), присутствует в ранней фракции элюата, собранной на стадии (г).
14. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что количество РXI и/или РХЫ определяют, выполняя анализ амидолитической активности с использованием РХЫ-специфичного субстрата.
15. 15. Способ по любому из пп.1-14, отличающийся тем, что композиция, содержащая полученный из плазмы иммуноглобулин, которая предложена на стадии (а), представляет собой суспендированный осадок фракции плазмы, выбранный из группы, состоящей из осадка фракции I, осадка фракции ^Н+Ш, осадка фракции П+Ш, фракции ТУ-1, осадка А Кистлера-Нитшманна и осадка В Кистлера-Нитшманна.
16. 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что композиция, содержащая полученный из плазмы иммуноглобулин, которая предложена на стадии (а), представляет собой суспендированный осадок фракции II.

    - 46 030251